專利名稱：：通過使用單鏈多肽融合蛋白進行疼痛的治療的制作方法通過使用單鏈多肽融合蛋白進行疼痛的治療本發(fā)明涉及非細胞毒性的融合蛋白的用途，用于特定類型疼痛的治療。根據(jù)其在靶細胞上產(chǎn)生效果的類型，毒素可被一般地分為兩組。更詳細地，第一組毒素殺死它們的天然靶細胞，并因此是通常所說的細胞毒性毒素分子。這一組的毒素特別地由植物毒素，如蓖麻毒素和相思豆毒素；并由細菌毒素，如白喉毒素和假單胞菌外毒素A(PseudomonasexotoxinA)示例。細胞毒毒素在"魔法子彈"(如，免疫偶聯(lián)物(immunoconjugate)，其包含細胞毒毒素組分和與耙細胞特定標記進行結(jié)合的抗體)的設(shè)計中已經(jīng)吸引了極大的興趣，其被用于細胞紊亂和狀況，如癌癥的治療。細胞毒毒素典型地通過抑制蛋白合成的細胞過程殺死它們的耙細胞。第二組毒素，其被稱作非細胞毒性的毒素，不殺死(如它們的名字所證實)它們天然的靶細胞。非細胞毒性的毒素與它們的細胞毒性相似物相比，吸引了較少的商用興趣，并且通過抑制蛋白合成以外的細胞過程對靶細胞產(chǎn)生它們的影響。非細胞毒性的毒素通過多種植物，并通過多種微生物，如梭菌屬某一種(Clostridiumsp.)和奈瑟菌屬某一種(Neisseriasp.)產(chǎn)生。梭菌神經(jīng)毒素是典型地具有150kDa數(shù)量級分子量的蛋白。它們由多種細菌屬類物種產(chǎn)生，特別地由梭菌類產(chǎn)生，最重要地，由破傷風梭菌(C.^to"/)和肉毒梭菌(C.6o化Z/"mw)、丁酸梭菌(C.6"/)Wcwm)和阿根廷梭菌(Cwge"^7erae)的幾種菌株產(chǎn)生。目前有8種不同類型的梭菌毒素，S卩破傷風毒素，和血清型A、B、Cl、D、E、F和G的肉毒菌神經(jīng)毒素，并且它們都共享相似的結(jié)構(gòu)和作用形式。梭菌神經(jīng)毒素代表了一組主要的非神經(jīng)毒性的毒素分子，并通過宿主細菌作為單一多肽被合成，所述單一多肽通過蛋白水解剪切事件被翻譯后修飾，以形成由二硫鍵連接在一起的兩個多肽鏈。這兩條鏈被稱為具有約100kDa分子量的重鏈(H-鏈)，和具有約50kDa分子量的輕鏈(L-鏈)。L-鏈具有蛋白酶功能(鋅依靠肽鏈內(nèi)切酶活性)并顯示出對胞吐(exocytic)過程中涉及的囊泡和/或質(zhì)膜相關(guān)蛋白高的底物特異性。來自不同梭菌屬種或血清型的L-鏈可以水解三種底物蛋白之一中的不同但特異的肽鍵，所述三種底物蛋白為小突觸小泡蛋白(synaptobrevin)、突觸融合蛋白(syntaxin)或SNAP-25。這些底物是神經(jīng)分泌機制的重要組分。奈瑟菌屬，最重要地來自淋球菌(Wgom^r/zoeae)的，產(chǎn)生功能相似的非細胞毒性蛋白酶。這些蛋白酶的一個實例是IgA蛋白酶(參見W099/58571)?，F(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)明確記載毒素分子可以被重新靶向并非該毒素的天然靶細胞的細胞。當被所謂的重新靶向時，修飾的毒素能夠結(jié)合目標耙細胞，并且接下來轉(zhuǎn)運到細胞溶膠，能夠?qū)Π屑毎a(chǎn)生其效應(yīng)。所述重新耙向通過用不同的TM(靶向部分TargetingMoiety)替換該毒素的天然靶向部分(TM)完成。在這一點上，TM被選擇以便其結(jié)合目標耙細胞，并允許修飾的毒素后續(xù)進入靶細胞內(nèi)的內(nèi)涵體之內(nèi)。修飾的毒素也包含轉(zhuǎn)運區(qū)域，以使非細胞毒性的蛋白酶進入細胞溶膠。該轉(zhuǎn)運區(qū)域可以是該毒素的天然轉(zhuǎn)運區(qū)域，或其可以是從具有轉(zhuǎn)運活性的微生物蛋白中獲得的不同轉(zhuǎn)運區(qū)域。上述TM替換可以通過普通技術(shù)人員公知的傳統(tǒng)化學偶聯(lián)技術(shù)被實現(xiàn)。在這一點上，參考Hermanson,GT.(1996),Bioconjugatetechniques,AcademicPress,并參考Wong，S.S.(1991),Chemistryofproteinconjugationandcross-linking,CRCPress。然而，化學偶聯(lián)通常是不精確的。例如，偶聯(lián)之后，TM可以在多于一個連接位點被連接到該偶聯(lián)物的剩余部分?；瘜W偶聯(lián)也難以控制。例如，TM可以在蛋白酶組分和/或轉(zhuǎn)運組分的連接位點被連接到修飾毒素的剩余部分。當僅連接到所述組分之一(優(yōu)選地在單一位點)對治療效力是期望的時候，這是有問題的。因此，化學偶聯(lián)導(dǎo)致混合種類的修飾毒素分子，這是不理想的。作為化學偶聯(lián)的替代方案，TM代替可以被單一多肽融合蛋白的重組制備實現(xiàn)(參見WO98/07864)。該技術(shù)基于體內(nèi)細菌機制，通過該機制，原生梭菌神經(jīng)毒素(即，全毒素)被制備，并產(chǎn)生具有以下結(jié)構(gòu)排列的融合蛋白NH2-[蛋白酶組分]-[轉(zhuǎn)運組分]-[TM]-COOH根據(jù)WO98/07864,TM被置于朝向融合蛋白的C-末端。該融合蛋白隨后通過用蛋白酶處理被激活，所述蛋白酶在蛋白酶組分和轉(zhuǎn)運組分之間剪切。雙鏈蛋白隨后被產(chǎn)生，其包含共價連接(通過二硫鍵)到含有轉(zhuǎn)運組分加TM的另一單一多肽鏈的，作為單一多肽鏈蛋白酶組分的蛋白酶組分。盡管WO98/07864的方法遵循了(按照融合蛋白的結(jié)構(gòu)排列而言)梭菌全毒素的天然表達系統(tǒng)，但是本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)該系統(tǒng)可以導(dǎo)致某些融合蛋白的產(chǎn)生，其對預(yù)期的靶細胞具有本質(zhì)上降低的結(jié)合能力。這一問題在治療特定類型疼痛的情況下特別相關(guān)。本發(fā)明通過提供用于生產(chǎn)治療特定類型疼痛的藥物的治療分子的使用，解決了一個或多個上述問題，其中所述治療分子是單鏈的多肽融合蛋白，其包含a.非細胞毒性的蛋白酶(anon-cytotoxicprotease)或其片段，所述蛋白酶或蛋白酶片段能夠剪切疼痛感應(yīng)傳入器(或傷害感應(yīng)傳入器，nociceptivesensoryafferent)中細胞夕卜融合器(exocyticfbsionapparatus)的蛋白；b.能夠結(jié)合疼痛感應(yīng)傳入器上之結(jié)合位點(BindingSite)的耙向部分(TargetingMoiety)，所述結(jié)合位點能夠進行細胞內(nèi)吞作用，以被并入疼痛感應(yīng)傳入器中的內(nèi)涵體內(nèi)；c.蛋白酶剪切位點(proteasecleavagesite),在該位點9融合蛋白可被蛋白酶剪切，其中所述蛋白酶剪切位點位于非細胞毒性蛋白酶或其片段和耙向部分之間；和d.轉(zhuǎn)運區(qū)域(translocationdomain),其能夠?qū)⒌鞍酌富虻鞍酌钙螐膬?nèi)涵體中跨內(nèi)涵體膜轉(zhuǎn)運，并進入疼痛感應(yīng)傳入器的細胞溶膠中。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)WO98/07864的融合蛋白系統(tǒng)對需要N-末端區(qū)域與疼痛感應(yīng)傳入器上的結(jié)合位點相互作用的TMs來說不是最優(yōu)化的。這一問題對于TMs來說特別尖銳，所述TMs需要特定的N-末端氨基酸殘基或包括N-末端氨基酸殘基的特定序列的氨基酸殘基，用以與疼痛感應(yīng)傳入器上的結(jié)合位點相互作用。與WO98/07864相反，本發(fā)明采用了非細胞毒性的融合蛋白，其中所述融合體的TM組分包括內(nèi)部區(qū)域中的相關(guān)結(jié)合區(qū)域或朝向TM中部(即，線性肽序列的中部)放置的氨基酸序列，或優(yōu)選地，朝向TM的N-末端放置，或更優(yōu)選地位于或接近N-末端的氨基酸序列。所述N-末端區(qū)域能夠結(jié)合疼痛感應(yīng)傳入器上的結(jié)合位點，并且所述TM優(yōu)選地有對特定的和界定的氨基酸殘基序列有要求，以在其N-末端是游離的。本文所述的化合物可被用于治療患有一種或多種類型慢性疼痛的患者，所述慢性疼痛包括神經(jīng)性疼痛、炎癥疼痛、頭痛、身體疼痛、內(nèi)臟疼痛和牽涉性疼痛。"治療"，用在這里，表示醫(yī)學上的處理。它包括，例如，給予本發(fā)明的化合物，以預(yù)防疼痛或減輕其嚴重性。術(shù)語"疼痛"，用在這里，表示任何不愉快的感官經(jīng)歷，通常與身體疾病相關(guān)。身體疾病對醫(yī)生可能明顯或可能不明顯。疼痛有兩種類型慢性和急性。"急性疼痛"是突然發(fā)生的，短時間的疼痛。一種類型的急性疼痛，例如，是在皮膚或其它表面組織的傷口處，如由割傷或燒傷引起的，感覺到的皮膚疼痛。皮膚疼痛感受器僅終止于皮膚以下，并且由于高濃度的神經(jīng)末端，產(chǎn)生良好定義的短期局部疼痛。"慢性疼痛"是急性疼痛以外的疼痛。慢性疼痛包括神經(jīng)性疼痛、炎癥疼痛、頭痛、身體疼痛、內(nèi)臟疼痛和牽涉性疼痛。/.鵬絲疼嬤本發(fā)明所述的化合物可以被用于治療由任何以下神經(jīng)性疼痛狀況引起的或與其相關(guān)的疼痛。"神經(jīng)性疼痛"表示來自外周神經(jīng)系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)或兩者的不正常的感覺輸入，導(dǎo)致不適。A.神經(jīng)性疼痛的癥狀神經(jīng)性疼痛的癥狀可以包括持續(xù)、自發(fā)的疼痛，以及痛覺異常(allodynia)(對通常非疼痛的刺激的疼痛反應(yīng))、痛覺增敏(hyperalgesia)(對通常僅引起輕微不適的疼痛刺激，如針刺，產(chǎn)生的加重的反應(yīng))、或痛覺過敏(hyperpathia)(短暫的不適成為長期嚴重的疼痛)。B.神經(jīng)性疼痛的原因神經(jīng)性疼痛可由以下任意原因引起。1.外傷性損害，例如，如神經(jīng)壓迫傷(如，神經(jīng)壓迫、神經(jīng)拉伸、神經(jīng)卡壓(nerveentrapment)或不完整的神經(jīng)切面)；脊柱傷(如，脊柱的一半切除)；腿截肢；挫傷；炎癥(如，脊柱炎癥)；或手術(shù)過程。2.缺血性事件，包括，例如，中風和心臟病發(fā)作。3.感染物4.暴露于毒性試劑，包括，例如，藥物、酒精、重金屬(如鉛、砷、汞)、工業(yè)試劑(如，溶劑、源自膠水的煙氣)或一氧化二氮。5.疾病，包括，例如炎癥性疾病，神經(jīng)性腫瘤，獲得性免疫缺陷綜合癥(acquiredimmunedeficiencysyndrome(AIDS))，萊姆病(Lymesdisease),麻風病，代謝疾病，外周神經(jīng)疾病，如神經(jīng)瘤、單神經(jīng)病或多個中趕炳。c.神經(jīng)性疼痛的種類1.神經(jīng)痛神經(jīng)痛是沿一條或多條特異神經(jīng)路徑輻射的疼痛，通常在神經(jīng)結(jié)構(gòu)上沒有任何可顯示的病理改變。神經(jīng)痛的起因是多種多樣的?；瘜W腐蝕、炎癥、外傷(包括手術(shù))、被附近的結(jié)構(gòu)(如腫瘤)壓迫和感染都可以引發(fā)神經(jīng)痛。但是，在多種情況下，起因是未知的或不可識別的。神經(jīng)痛在老年人中最常見，但是它可以發(fā)生在任何年齡。神經(jīng)痛，包括但不限于三叉神經(jīng)痛、皰疹后神經(jīng)痛(post-herpeticneuralgia)、皰疹后神經(jīng)痛(postherpeticneuralgia)、舌咽神經(jīng)痛、坐骨神經(jīng)痛和非典型性面部疼痛。神經(jīng)痛是分布在單一神經(jīng)或多個神經(jīng)中的疼痛。實例是三叉神經(jīng)痛、非典型性面部疼痛和皰疹后神經(jīng)痛(由帶狀皰疹或皰疹引起)。受影響的神經(jīng)負責感覺從下顎到額頭的面部區(qū)域中的觸摸、溫度和壓力。該疾病通常引起短暫的劇痛，通常少于2分鐘并僅發(fā)生在面部的一側(cè)。疼痛可以多種方式描述，如"劇痛(stabbing)"、"劇烈的(sharp)"、"閃電般的(likelightning)"、"燒灼(burning)"和甚至"癢的(itchy)"。在非典型形式的三叉神經(jīng)痛中，疼痛也可以嚴重的或僅疼痛存在，并持續(xù)延長的時間。與三叉神經(jīng)痛(TN)相關(guān)的疼痛被識別為可以被經(jīng)歷的最劇烈的疼痛之一。簡單的刺激，如吃、說話、洗臉或任何輕微的觸碰或感覺可以引起發(fā)作(甚至微風的感覺)。發(fā)作可以一群發(fā)生或作為單獨的發(fā)作發(fā)生。癥狀包括位于任何位置急劇、劇烈的疼痛或持續(xù)、燒灼的疼痛，通常位于或接近身體的表面，對每個期間來說發(fā)生在相同的位置；痛沿特定神經(jīng)途徑的疼；由于疼痛受影響的身體部分受損的功能，或由于伴隨的運動神經(jīng)損傷的肌肉衰弱；提高的皮膚敏感性或受影響皮膚區(qū)域的麻木(與局部麻醉相似的感覺，如奴佛卜因注射(Novacaineshot));和被解釋為疼痛的任何觸摸或壓力。運動也可能是疼痛的。三叉神經(jīng)痛是最常見形式的神經(jīng)痛。它影響面部主要的感官神經(jīng)，三叉神經(jīng)("三叉的"文字上表示"三個起點(threeorigins)"，指的是神經(jīng)分成3個分支)。其癥狀包括嚴重的疼痛在面部的一側(cè)突然而短暫的發(fā)作，沿著該側(cè)三叉神經(jīng)所牽扯的區(qū)域。疼痛發(fā)作可能嚴重到足以引起面部扭曲，其典型地指疼痛抽筋(神經(jīng)痙攣(ticdouloureux))。有時，三叉神經(jīng)痛的起因是血管或小腫瘤壓迫神經(jīng)。疾病，諸如多發(fā)性硬化癥(影響腦和脊柱的炎癥性疾病)、某些形式的關(guān)節(jié)炎和糖尿病(高血糖)也可能引起三叉神經(jīng)痛，但并非總能識別出起因。在這種情況下，某些運動，如咀嚼、說話、吞咽或接觸面部的區(qū)域可能引發(fā)劇烈疼痛的痙攣。相關(guān)但相當不常見的神經(jīng)痛影響舌咽神經(jīng)，其為咽喉提供感覺。該神經(jīng)痛的癥狀是位于咽喉的短暫、沖擊狀發(fā)作的疼痛。神經(jīng)痛可能發(fā)生在諸如帶狀皰疹的感染之后，帶狀皰疹由帶狀皰疹病毒，一種皰疹病毒引起。這種神經(jīng)痛在帶狀皰疹的疹子痊愈后產(chǎn)生持續(xù)的灼燒疼痛。疼痛由于受影響區(qū)域的運動或與其接觸而惡化。并非所有診斷為帶狀皰疹的那些患者繼續(xù)經(jīng)歷皰疹后神經(jīng)痛，它會比帶狀皰疹更疼。疼痛和敏感可以持續(xù)數(shù)月或甚至數(shù)年。疼痛通常是對任何接觸，但特別是輕觸不可忍受的敏感形式。皰疹后神經(jīng)痛不限制在面部；它可以發(fā)生在身體的任何位置，但通常發(fā)生在帶狀皰疹疹子的部位。由于疼痛和患病期間的社交孤立，抑郁是常見的。皰疹后押經(jīng)痛可能在初始的皰疹感染的標志已經(jīng)消失很長時間后惡化?？赡芤鹕窠?jīng)痛的其它感染性疾病是梅毒和萊姆病(Lymedisease)。糖尿病是神經(jīng)痛的另一常見誘因。這一非常常見的醫(yī)學問題影響幾乎1/20的美國成年人。糖尿病損害向神經(jīng)提供循環(huán)的微小動脈，導(dǎo)致神經(jīng)纖維故障及有時的神經(jīng)損失。糖尿病可以產(chǎn)生幾乎任何神經(jīng)痛，包括三叉神經(jīng)痛、腕管綜合癥(carpaltunnelsyndrome)(手部和腕部的疼痛和麻木)和感覺異常性股痛(由于股外側(cè)皮神經(jīng)損傷引起的大腿麻木和疼痛)。血糖的嚴格控制可以預(yù)防糖尿病的神經(jīng)損傷并可以加速發(fā)生神經(jīng)痛的患者的恢復(fù)?？赡芘c神經(jīng)痛相關(guān)的其它醫(yī)學癥狀為慢性腎衰竭和卟啉癥(porphyria)——一種遺傳疾病，其中身體不能清除身體中血液正常分解后產(chǎn)生的某些物質(zhì)本身。某些藥物也可能引起這個問題。2.傳入神經(jīng)阻滯傳入神經(jīng)阻滯表示來自身體一部分的感覺輸入的缺失，并可以由外周感覺纖維或形成中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)的打斷而引起。傳入神經(jīng)阻滯疼痛癥狀包括，但不限于腦或脊柱的損傷、中風后疼痛、幻覺痛、13半身不遂、上臂神經(jīng)叢撕裂傷、腰部神經(jīng)根病(radiculopathies)。3.復(fù)雜性局部疼痛綜合癥(CRPSs)CRPS是起因于感應(yīng)維持疼痛(sympathetically-maintained)的慢性疼痛綜合癥，并以兩種形式存在。CRPS1現(xiàn)在代替術(shù)語"反射性交感神經(jīng)營養(yǎng)不良綜合癥(reflexsympatheticdystrophysyndrome)，，。它是一種慢性神經(jīng)病變，最常見發(fā)生在輕微或重大創(chuàng)傷后的胳膊和腿部。CRPS1與嚴重的疼痛；指甲、骨骼和皮膚上的變化；和對受影響肢體的觸碰提高的敏感度相關(guān)聯(lián)。CRPS2替代術(shù)語皮膚灼熱痛(causalgia)，并且其起因于識別出的對神經(jīng)的傷害。CRPS包括但不限于I型CRPS(反射性交感神經(jīng)營養(yǎng)不良綜合癥)和II型CRPS(皮膚灼熱痛)。4.神經(jīng)病變神經(jīng)病變是神經(jīng)的功能或病理改變，并且通過感覺或運動神經(jīng)元異常被臨床表征。中樞神經(jīng)病變是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的功能或病理改變。外周神經(jīng)病變是一個或多個外周神經(jīng)中的功能或病理改變。外周神經(jīng)從中樞神經(jīng)系統(tǒng)(腦和脊柱)傳遞信息給肌肉和其它器官，并從皮膚、關(guān)節(jié)和其它器官傳遞回大腦。當這些神經(jīng)無法攜帶信息往返大腦和脊柱時，外周神經(jīng)病變發(fā)生，導(dǎo)致疼痛、感覺缺失、或無法控制肌肉。在一些情況下，控制血管、腸道和其它器官的神經(jīng)的失效導(dǎo)致異常的血壓、消化問題和其它基本身體過程的缺失。神經(jīng)病變的風險因素包括糖尿病、酗酒和暴露于某些化學物質(zhì)和藥品。一些人具有神經(jīng)病變的遺傳傾向。在神經(jīng)上長時間的壓力是另一種發(fā)生神經(jīng)損傷的風險。受壓傷可能由長時間不動(如長時間的手術(shù)過程或長期患病)或由對神經(jīng)的壓迫引起。多神經(jīng)病變表示通常同等影響兩側(cè)身體的廣布過程。癥狀取決于何種類型的神經(jīng)被影響。三種主要類型的神經(jīng)為感覺、運動和自主神經(jīng)。神經(jīng)病變可以影響所有三種類型神經(jīng)的任何一種或組合。癥狀也取決于該病癥影響整個軀體或僅影響一束神經(jīng)(如源自創(chuàng)傷)。慢性炎癥性多神經(jīng)病變的原因是異常的免疫反應(yīng)。特異抗原、免疫過程和激發(fā)因子不同，并且在多種情況下是未知14的。它可能與其它癥狀關(guān)聯(lián)發(fā)生，如HIV、炎癥性腸病、紅斑狼瘡、慢性活動性肝炎和血細胞異常。外周神經(jīng)病變可能包括單一神經(jīng)或神經(jīng)束功能或病理的改變(單神經(jīng)病變)，或影響多個神經(jīng)的功能或病理改變(多神經(jīng)病變)。外周神經(jīng)病變遺傳疾病進行性腓骨肌萎縮癥(Charcot-Marie-Toothdisease)弗里德賴希氏共濟失調(diào)(Friedreich'sataxia)全身或代謝失調(diào)糖尿病(糖尿病神經(jīng)痛)，膳食缺乏(特別是維生素B-12)過量飲酒(酒精性神經(jīng)痛)尿毒癥(源自腎衰竭)癌癥感染或炎癥性病癥AIDS肝炎科羅拉多壁虱熱白喉格林-巴利綜合癥(Guillain-Barresyndrome)HIV感染而沒有AIDS發(fā)展麻風病萊姆病(Lyme)結(jié)節(jié)性多動脈炎風濕性關(guān)節(jié)炎結(jié)節(jié)病干燥綜合癥(Sjogrensyndrome)15梅毒全身紅斑狼瘡淀粉狀物質(zhì)(amyloid)暴露于有毒化合物吸入膠水或其它有毒化合物一氧化二氮工業(yè)試劑——特別是溶劑重金屬(鉛、砷、汞等)從屬于像鎮(zhèn)痛劑腎病的藥物的神經(jīng)痛多種誘因貧血(降低的氧/降低的血流)長時間暴露于冷的溫度a.多神經(jīng)病變多神經(jīng)病變是外周神經(jīng)病變，包括由多個外周神經(jīng)損傷或解體引起的運動或某一區(qū)域感覺的缺失。多神經(jīng)病變疼痛包括，但不限于脊髓灰質(zhì)炎后綜合癥、乳房切除術(shù)后綜合癥(postmastectomysyndrome)、糖尿病神經(jīng)痛、酒精性神經(jīng)痛、淀粉狀物質(zhì)(amyloid)、毒素、AIDS、甲狀腺機能減退、尿毒癥、維生素缺乏、化療引起的疼痛、2',3'-雙脫氧胞苷(ddC)治療、格林-巴利綜合癥(Guillain-Barr6syndrome)或法布瑞氏癥(Fabry'sdisease)。b.單神經(jīng)病變單神經(jīng)病變是外周神經(jīng)病變，包括由單一外周神經(jīng)或神經(jīng)束損傷或解體引起的運動或某一區(qū)域感覺的缺失。單神經(jīng)病變最常見由起因于自創(chuàng)傷或外傷的局部區(qū)域損傷引起，盡管偶爾地，全身疾病可能引起單獨的神經(jīng)損傷(如多數(shù)單神經(jīng)炎(mononeuritismultiplex))。常見的原因是直接外傷、對神經(jīng)長時間的壓迫、和由附近身體結(jié)構(gòu)的腫脹或受傷對神經(jīng)的壓迫。損傷包括神經(jīng)髓鞘(遮蓋物)的解體或部分神經(jīng)細胞(軸突)的解體。損傷減緩或阻止了沖動通過神經(jīng)的傳導(dǎo)。單神經(jīng)病變可能涉及身體的任何部分。單神經(jīng)病變痛包括，但不限于坐骨神經(jīng)功能異常、腓總神經(jīng)功能異常、橈神經(jīng)功能異常、尺神經(jīng)功能異常、顱骨單神經(jīng)病變VI、顱骨單神經(jīng)病變VII、顱骨單神經(jīng)病變III(壓迫型)、顱骨單神經(jīng)病變III(糖尿病型)、腋神經(jīng)功能異常、腕管綜合癥、股神經(jīng)功能異常、脛神經(jīng)功能異常、面神經(jīng)麻痹(Bdl'spalsy)、胸廓出口綜合癥、腕管綜合癥和第六(外展)神經(jīng)麻痹。c.普遍的外周神經(jīng)病變普遍的外周神經(jīng)病變是對稱的，并且通常是由于各種全身疾病和病痛過程，這些疾病和病痛過程影響外周神經(jīng)系統(tǒng)的整體。它們被進一步分為幾個類別i.遠端軸突病變(Distalaxonopathies)是神經(jīng)元的一些代謝或毒性錯亂的結(jié)果。它們可能由代謝疾病引起，例如糖尿病，腎衰竭，缺乏綜合癥(deficiencysyndrome),如營養(yǎng)不良和酗酒，或毒素或藥物的影響。遠端軸突病變(也被成為逆行死亡祌經(jīng)病變(dyingbackneuropathy))是一種外周神經(jīng)病變，其起因于外周神經(jīng)系統(tǒng)(PNS)神經(jīng)元的一些代謝或毒性的混亂。這是神經(jīng)對代謝或毒素紊亂的最常見反應(yīng)，并且照這樣，可由代謝疾病引起，例如糖尿病，腎衰竭，缺乏綜合癥(deficiencysyndrome),如營養(yǎng)不良和酗酒，或毒素或藥物的影響。遠端軸突病變的最常見誘因是糖尿病，并且最常見的遠端軸突病變是糖尿病神經(jīng)痛。ii.髓鞘質(zhì)病是由于髓鞘質(zhì)的主要攻擊，引起沖動傳導(dǎo)的急性失敗。最常見的誘因是急性炎癥性脫髓鞘多神經(jīng)病變(acuteinflammatorydemyelinatingpolyneutopathy(AIDP，也被稱作格林-巴利綜合癥))，雖然其它誘因包括慢性炎癥性脫髓鞘綜合癥(CIDP)、遺傳代謝紊亂(如，腦白質(zhì)營養(yǎng)不良)或毒素。髓鞘質(zhì)病是由于髓鞘或髓鞘化許旺細胞(myelinatingSchwanncells)的大部分解體，其使得軸突完整，但引起沖動傳導(dǎo)的急性衰竭。脫髓鞘化減緩或完全阻止了電沖動通過神經(jīng)的傳導(dǎo)。最常見的誘因是急性炎癥性脫髓鞘多神經(jīng)病變(AIDP，也被稱作格林-巴利綜合癥)，雖然其它誘因包括慢性炎癥性脫髓鞘綜合癥(CIDP)、遺傳代謝紊亂(如，腦白質(zhì)營養(yǎng)不良或進行性腓骨肌萎縮)或毒素。iii.神經(jīng)病變是外周神經(jīng)系統(tǒng)(PNS)神經(jīng)元破壞的結(jié)果。它們可能由運動神經(jīng)元疾病，感覺神經(jīng)病變(如，帶狀皰疹)，毒素或自主神經(jīng)功能異常。神經(jīng)毒素可能引起神經(jīng)病變，例如化學治療試劑長春新堿。神經(jīng)病變是由于外周神經(jīng)系統(tǒng)(PNS)的神經(jīng)元損傷，導(dǎo)致外周神經(jīng)病變，引起的功能異常。它可能由運動神經(jīng)元疾病，感覺神經(jīng)病變(如，帶狀皰疹)，有毒物質(zhì)或自主神經(jīng)功能異常?；加猩窠?jīng)病變的人可能以多種形式存在，取決于誘因、其影響神經(jīng)細胞的方式，和被影響最嚴重的神經(jīng)細胞的類型。iv.聚焦節(jié)流神經(jīng)病變(Focalentrapmentneuropathies)(如腕管綜合癥)本發(fā)明所述的化合物可以被用于治療由任何以下炎癥性癥狀引起的或與其相關(guān)的疼痛。A.關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)炎包括，例如，風濕性關(guān)節(jié)炎；青少年風濕性關(guān)節(jié)炎；系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE);痛風性關(guān)節(jié)炎；硬皮??；骨關(guān)節(jié)炎；牛皮癬關(guān)節(jié)炎；強直性脊柱炎；萊特氏綜合癥(Reiter'ssyndrome)(反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎)；成人斯提耳病(adultStill'sdisease);病毒感染引起的關(guān)節(jié)炎；細菌感染引起的關(guān)節(jié)炎，例如，如淋病性關(guān)節(jié)炎和非淋病性細菌關(guān)節(jié)炎(膿毒性關(guān)節(jié)炎)；三期萊姆病(TertiaryLymedisease);結(jié)核性關(guān)節(jié)炎；和真菌感染引起的關(guān)節(jié)炎，例如，如芽生菌病。B.自免疫疾病自免疫疾病包括，例如格林-巴利綜合癥、橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto'sthyroiditis)、惡性貧血、愛迪生氏病(Addison'sdisease)、I型糖尿病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、皮肌炎、干燥綜合癥(Sjogren'ssyndrome)、紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化癥、重癥肌無力、萊特氏綜合癥和格雷氏病(Grave'sdisease)。C.結(jié)締組織疾病結(jié)締組織疾病包括，例如脊柱關(guān)節(jié)炎(spondylarthritis)、皮肌炎和肌纖維痛(fibromyalgia)。D.受傷由受傷引起的炎癥可能引起慢性炎癥性疼痛，所述受傷包括，例如組織或關(guān)節(jié)的擠壓、刺穿、拉伸。E.感染由感染引起的炎癥可能引起慢性炎癥性疼痛，所述感染包括，例如肺結(jié)核或間質(zhì)性角膜炎。F.神經(jīng)炎神經(jīng)炎是影響神經(jīng)或一組神經(jīng)的炎癥性過程。癥狀取決于涉及的神經(jīng)，但可能包括疼痛、感覺異常、局部麻痹或感覺減退(麻木)。實例包括a.臂神經(jīng)炎b.眼球后神經(jīng)病變，一種炎癥性過程，其影響恰好位于眼球后的視神經(jīng)。c.視神經(jīng)病變，一種影響視神經(jīng)的炎癥性過程，在受影響的眼中引起突然下降的視力。視神經(jīng)炎的誘因未知。視神經(jīng)(連接眼睛和腦的神經(jīng))的突然發(fā)炎導(dǎo)致髓鞘的腫脹和解體。炎癥偶爾可能是病毒感染的結(jié)果，或其可能由自免疫疾病，如多發(fā)性硬化引起。風險因素與可能的誘因相關(guān)。d.前庭神經(jīng)炎，病毒感染引起的影響前庭神經(jīng)的炎癥性過程。G.關(guān)節(jié)炎癥關(guān)節(jié)的炎癥，如由粘液囊炎或肌腱炎引起的，例如，可能引起慢性炎癥性疼痛。瓜，本發(fā)明所述的化合物可以被用于治療由任何以下頭痛癥狀引起的或與其相關(guān)的疼痛。頭痛(醫(yī)學上也被稱為頭痛(cephalgia))是頭部輕微到嚴重疼痛的一種癥狀；有時頸部或上背部疼痛可能也被解釋為頭痛。它可能表明潛在的局部或全身疾病，或可能是其本身的疾病。A.肌肉/肌原性頭痛肌肉/肌原性頭痛表現(xiàn)為包括面部和頸部肌肉的收緊(tightening)或緊張(tensing);它們可能向前額輻射。緊張性頭痛是最常見形式的肌原性頭痛。緊張性頭痛是涉及頭部、頭皮或頸部疼痛或不適的癥狀，通常與這些區(qū)域的肌肉緊張相關(guān)。緊張性頭痛起因于頸部和頭皮肌肉的收縮。這一肌肉收縮的一個原因是對壓力、沮喪或緊張的反應(yīng)。導(dǎo)致頭部長時間保持在一個位置不運動的任何活動可以引起頭痛。這樣的活動包括打字或使用計算機，用手進行的精細工作和顯微鏡的使用。在寒冷的屋子中睡覺或以頸部處在不正常的位置下進行睡覺，也可能引發(fā)這一類型的頭痛。緊張型頭痛包括，但不限于陣發(fā)性緊張性頭痛和慢性緊張性頭痛。B.血管性頭痛最常見類型的血管性頭痛是偏頭痛。其它類型的血管性頭痛包括集束性頭痛，其引起緊張型頭痛的反復(fù)陣發(fā)；和高血壓導(dǎo)致的頭痛。1.偏頭痛偏頭痛是異源疾病，其通常包括反復(fù)頭痛。偏頭痛與其它頭痛不同，因為它們伴有其它癥狀發(fā)生，例如，如惡心、嘔吐或?qū)饷舾小Ｔ诖蠖鄶?shù)人中，抽動的疼痛僅在頭部一側(cè)感受得到。臨床癥狀，例如先兆20癥狀的類型、預(yù)征候的存在、或相關(guān)癥狀，如眩暈，可能在具有不同潛在病理生理和遺傳機理的患者亞組中觀察到。偏頭痛包括，但不限于沒有先兆的偏頭痛(普通偏頭痛)、具有先兆的偏頭痛(傳統(tǒng)偏頭痛)、月經(jīng)偏頭痛、等價偏頭痛(migraineequivalent)(無頭痛性的偏頭痛(acephalicheadache))、復(fù)雜型偏頭痛(complicatedmigraine)、腹型偏頭痛(abdominalmigraine)和混合型緊張偏頭痛(mixedtensionmigraine)。2.集束型頭痛集束型頭痛影響一側(cè)頭部(單側(cè)的)并且可能與眼睛流淚和鼻塞相關(guān)聯(lián)。它們集群發(fā)生，每天在相同時間反復(fù)發(fā)生，持續(xù)數(shù)周后緩和。D.高血壓頭痛E.牽引性(Traction)和炎癥性頭痛牽引性和炎癥性頭痛通常是從中風到鼻竇炎的其它病癥的癥狀。F.激素型頭痛G.反彈性頭痛反彈性頭痛，也被稱為藥物過度使用頭痛(medicationoveruseheadaches),在過度頻繁服用藥物以緩解頭痛時發(fā)生。反彈性頭痛每天經(jīng)常發(fā)生，并可會非常疼痛。H.慢性鼻竇炎頭痛鼻竇炎是鼻旁竇細菌、真菌、病毒、過敏或自免疫的炎癥。慢性鼻竇炎是普通感冒最常見的并發(fā)癥之一。癥狀包括鼻塞；面部疼痛；頭痛；發(fā)燒；全身不適；濃綠或黃鼻涕；俯身時面部"腫脹(fullness)"感惡化。在少數(shù)情況下，慢性上頜鼻竇炎也可以由牙齒感染細菌的蔓延引起。慢性增生性嗜酸性鼻竇炎(Chronichyperplasticeosinophilicsinusitis)是非感染形式的慢性鼻竇炎。I.器質(zhì)性頭痛J.猝發(fā)性頭痛猝發(fā)性頭痛是與癲癇活動關(guān)聯(lián)的頭痛。本發(fā)明所述的化合物可以被用于治療由任何以下身體疼痛狀況引起的或與其相關(guān)的疼痛。身體疼痛開始于韌帶、肌腱、骨骼、血管和甚至神經(jīng)本身。其用身體疼痛感受器檢測。在這些區(qū)域中的疼痛受體的缺乏產(chǎn)生比皮膚疼痛時間更長的，遲鈍，局部化較差的疼痛；實例包括扭傷和骨折。額外的實例包括以下。A.過度肌肉緊張過度肌肉緊張可以通過，例如扭傷或拉傷引起。B.反復(fù)性動作疾病反復(fù)性動作病可以起因于手部、腕部、肘部、肩部、頸部、背部、臀部、膝蓋、足部、腿部或腳踝的過度使用。C.肌肉疾病引起身體疼痛的肌肉疾病包括，例如，多發(fā)性肌炎、皮肌炎、狼瘡、肌纖維痛、風濕性多肌痛和橫紋肌溶解。D.肌肉痛肌肉痛是肌肉疼痛并且是多種疾病和紊亂的癥狀。肌肉痛最常見的誘因是肌肉或肌肉群的過度使用或過度拉伸。無外傷史的肌肉痛通常是由于病毒感染。較長時期的肌肉痛可能是代謝肌病、一些營養(yǎng)缺乏或慢性疲勞綜合癥的指示。E.感染感染可以引起身體疼痛。這些感染的實例包括，例如，肌肉中的膿腫，旋毛蟲病，流感，萊姆病(Lymedisease),瘧疾，落基山斑疹熱，禽流感，普通感冒，社區(qū)獲得性肺炎，腦膜炎，猴痘，嚴重急性呼吸道綜合癥，中毒性休克綜合癥，旋毛蟲病，傷寒癥和上呼吸道感染。F.藥物藥物可以引起身體疼痛。這樣的藥物包括，例如，可卡因，降低膽固醇的抑制素(statin)(如阿托伐他汀(ato腦tatin)、辛找他汀(simvastatin)和洛弗斯特丁(lovastatin))和降低血壓的ACE抑制劑(如依那普利(enalapril)和卡托普利(captopril))。22本發(fā)明所述的化合物可以被用于治療由任何以下內(nèi)臟疼痛狀況引起的或與其相關(guān)的疼痛。內(nèi)臟疼痛起始于身體的內(nèi)臟或器官。內(nèi)臟疼痛感受器被置于身體器官或內(nèi)腔中。在這些區(qū)域中疼痛感受器的進一步缺乏產(chǎn)生了通常比身體疼痛更疼且時間更長的疼痛。內(nèi)臟疼痛極其難定位，并且內(nèi)臟組織的若干損傷顯示出"牽涉性(referred)"疼痛，其中感覺被定位于與受傷位置完全無關(guān)的區(qū)域。內(nèi)臟疼痛的實例包括以下。A.功能性內(nèi)臟疼痛功能性內(nèi)臟疼痛包括，例如，腸道易激綜合癥(irritablebowelsyndrome)和慢性功能性腹痛(CFAP)，功能性便秘和功能性消化不良，非心源性胸痛(NCCP)和慢性腹痛。B.慢性胃腸炎慢性胃腸炎癥包括，例如，胃炎，腸炎，像例如，克羅恩氏病(Crohn'sdisease)、潰瘍性結(jié)腸炎、顯微鏡結(jié)腸炎、憩室炎(diverticulitis)和腸胃炎；間質(zhì)性膀胱炎；腸缺血；膽囊炎；闌尾炎；食道胃酸逆流(gastroesophagealreflux);潰瘍，腎結(jié)石，尿路感染，胰腺炎和疝氣。C.自免疫疼痛自免疫疼痛包括，例如，結(jié)節(jié)病和脈管炎。D.器質(zhì)性內(nèi)臟疼痛器質(zhì)性內(nèi)臟疼痛包括，例如，起因于腸道外傷、炎癥或病變性損傷，或由腫瘤侵入感覺神經(jīng)分布產(chǎn)生。E.治療誘導(dǎo)的內(nèi)臟疼痛治療誘導(dǎo)的內(nèi)臟疼痛包括，例如，接受化學療法的疼痛，或接受放射性療法的疼痛。本發(fā)明所述的化合物可以被用于治療由任何以下牽涉性疼痛狀況引起的或與其相關(guān)的疼痛。23牽涉性疼痛來自定位于與疼痛刺激部位不同區(qū)域的疼痛。通常，當神經(jīng)在位于或接近其起點被壓迫或損傷時，牽涉性疼痛發(fā)生。在這種情況下，疼痛的感覺一般在該神經(jīng)達到的區(qū)域被感覺到，盡管損傷起始于另外的地方。常見的實例發(fā)生在椎間盤突出，其中從脊柱伸出的神經(jīng)根部被相鄰的盤物質(zhì)壓迫。盡管疼痛可能來源于受損的椎間盤本身，疼痛也將在被壓迫神經(jīng)達到的區(qū)域(例如，大腿、膝蓋或腳)被感覺到。緩解神經(jīng)根部的壓力可能緩解牽涉性疼痛，只要永久性神經(jīng)損傷還沒有發(fā)生。心肌缺血(部分心肌組織血流的缺少)可能是被最熟知的牽涉性疼痛的實例；感覺可以發(fā)生在胸腔上部，受限的感覺(restrictedfeeling),或左肩、臂或甚至手的疼痛。本發(fā)明所述的非細胞毒性蛋白酶組分是非細胞毒性的蛋白酶或其片段，所述蛋白酶或蛋白酶片段能夠剪切以下三種底物蛋白的一種中存在的不同但特異的肽鍵，所述底物蛋白為疼痛感應(yīng)傳入器(nociceptivesensoryafferent)中胞吐融合器(exocyticfbsionapparatus)的小突觸小泡蛋白(synaptobrevin)、突觸融合蛋白(syntaxin)或SNAP-25。這些底物是神經(jīng)分泌機制的重要組分。本發(fā)明所述的非細胞毒性蛋白酶組分優(yōu)選地為奈瑟菌屬IgA蛋白酶或其片段，或梭菌屬神經(jīng)毒素L-鏈或其片段。特別優(yōu)選的非細胞毒性蛋白酶組分為肉毒菌神經(jīng)毒素(BoNT)L-鏈或其片段。本發(fā)明所述的轉(zhuǎn)運組分使非細胞毒性蛋白酶(或其片段)能夠轉(zhuǎn)運進靶細胞，以便蛋白酶活性的功能表達發(fā)生在靶細胞的細胞溶膠中。轉(zhuǎn)運組分優(yōu)選地能夠在低pH值的條件下，在脂膜上形成離子可滲透的孔。優(yōu)選地，己經(jīng)發(fā)現(xiàn)僅使用蛋白分子的那些部分能夠在內(nèi)涵體膜中形成孔。轉(zhuǎn)運部分可能從微生物蛋白來源獲得，特別地從細菌或病毒蛋白來源獲得。因此，在一種實施方式中，轉(zhuǎn)運組分是諸如細菌毒素或病毒蛋白的酶的轉(zhuǎn)運區(qū)域。本發(fā)明所述的轉(zhuǎn)運組分優(yōu)選地為梭菌屬神經(jīng)毒素H-鏈或其片段。最優(yōu)選地，它是區(qū)域Hn(或其功能組分)，其中Hw表示梭菌屬神經(jīng)毒素H-鏈的部分或片段，其約等價于H-鏈氨基端的一半，或?qū)?yīng)于完整H-鏈中該片段的區(qū)域。本發(fā)明所述的TM組分負責將本發(fā)明所述的融合蛋白結(jié)合到靶細胞的結(jié)合位點(BindingSite)。因此，TM組分簡單地是配體，通過它本發(fā)明所述的融合蛋白結(jié)合到選定的耙細胞。在本發(fā)明的文字中，耙細胞是疼痛感覺傳入器，優(yōu)選地是初級的疼痛傳入器(例如A-纖維，如AS-纖維或C-纖維)。因此，本發(fā)明所述的融合蛋白能夠抑制神經(jīng)遞質(zhì)或神經(jīng)調(diào)節(jié)物質(zhì)[如，谷氨酰胺、P物質(zhì)、降血鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin-generelatedpeptide(CGRP))和/或神經(jīng)肽Y]從疼痛感受傳入器神經(jīng)元的分散群落中的釋放。在使用中，融合蛋白降低或防止感覺傳入器信號(如神經(jīng)遞質(zhì)或神經(jīng)調(diào)控物質(zhì))從外周向中樞疼痛纖維的傳導(dǎo)；并因此具有作為治療疼痛，特別是慢性疼痛的治療分子的應(yīng)用。確定TM結(jié)合到疼痛感受傳入器是常規(guī)。例如，簡單的放射性位移實驗可能被采用，其中代表疼痛感覺傳入器的組織或細胞(如DRGs)在過量未標記配體存在的情況下被暴露給已經(jīng)標記(如氚化)的配體。在這樣的實驗中，非特異和特異結(jié)合的相對比例可以被估計，由此允許確認配體結(jié)合到疼痛感覺傳入器靶細胞。任選地，該測試可能包括一種或多種結(jié)合拮抗劑，并且該測試可能進一步包括觀察配體結(jié)合的損失。這一類型實驗的實例可以在Hulme,E.C.(1990)，Receptor-bindingstudies,abriefoutline,pp.303-311，InReceptorbiochemistry,APracticalApproach,Ed.E.C.Hulme,OxfordUniversityPress中找到。當與相應(yīng)的"游離(free)"TM比較時，本發(fā)明所述的融合蛋白通常顯示出對疼痛感覺傳入器靶細胞降低的結(jié)合親和度(在達100倍的區(qū)間)。然而，盡管有這一觀察結(jié)果，本發(fā)明所述的融合蛋白令人吃驚地顯示出良好的效力。這可歸因于兩個主要的特征。第一，所述非細胞毒性蛋白酶組分是催化的——因此，若干這些分子的治療效果被迅速擴大。第二，在疼痛感受傳入器上存在的受體僅需要發(fā)揮用于治療進入的通路作用，而非必須需要被刺激到要求的水平，以便達到配體-受體介導(dǎo)的藥物反應(yīng)。因此，本發(fā)明所述的融合蛋白可能以比其它類型的止痛分子，如NSAIDS、嗎啡和加巴噴丁(Gabapentin)所使用低的多的劑量被給藥。后者分子典型地以高微克到毫克(甚至到數(shù)百毫克)的量被給藥，而本發(fā)明所述的融合蛋白可能以低得多的劑量給藥，典型地至少低10倍，而更典型地至少低IOO倍。25TM優(yōu)選地包含最多50個氨基酸殘基，更優(yōu)選地最多40個氨基酸殘基，特別優(yōu)選地最多30個氨基酸殘基，和最優(yōu)選地最多20個氨基酸殘基。阿片樣物質(zhì)(Opioids)代表優(yōu)選的本發(fā)明所述的TM。在肽家族內(nèi)包括腦啡肽(met和leu)、內(nèi)源性嗎啡(endomorphin)1和2、P-內(nèi)啡肽和強啡肽。阿片樣物質(zhì)肽經(jīng)常被用于臨床，以修飾對疼痛感受器和疼痛反應(yīng)中涉及的艽它細胞的活性。如三級世界衛(wèi)生組織止痛劑梯度(AnalgesicLadder),阿片樣物質(zhì)具有進入慢性癌癥和非癌癥性疼痛藥物治療的所有三個階段的切入點，強調(diào)了它們對疼痛治療的重要性。提到阿片樣物質(zhì)，包括其片段、變異體和衍生物，它們保留了結(jié)合疼痛感受傳入器的能力?！副景l(fā)明所述的TM也可以是在疼痛感受傳入器上，更特別地在初級疼痛傳入器上存在的一個或多個受體發(fā)揮"激動劑"作用的分子。傳統(tǒng)地，激動劑已經(jīng)被認為是能夠在細胞內(nèi)提高或降低活性的任何分子，即簡單地引起細胞活性改變的任何分子。例如，傳統(tǒng)方式的激動劑包括能夠與細胞上受體結(jié)合病起始反應(yīng)或活性的化學物質(zhì)，或通過激活受體引起活性反應(yīng)的藥物，無論該反應(yīng)是細胞活性的提高或降低。然而，對于本發(fā)明的目的，激動劑更特異地被界定為能夠刺激靶細胞內(nèi)胞吐融合過程(exocyticfiision)的分子，該過程容易被能夠剪切所述靶細胞中胞吐融合元件的蛋白的蛋白酶(或其片段)抑制。因此，本發(fā)明特定激動劑的定義排除了傳統(tǒng)上被認為是激動劑的多種分子。例如，在其通過結(jié)合到TrkA受體啟動神經(jīng)元分化的能力方面，神經(jīng)生長因子(NGF)是激動劑。然而，當由上述條件評估時，NGF不是激動劑，因為它不是胞吐融合體的主要誘導(dǎo)劑。此外，NGF刺激的過程(即細胞分化)不易于被非細胞毒性毒素分子的蛋白酶活性抑制。結(jié)合疼痛感受傳入器上受體的TM的激動劑的性質(zhì)可以用實施例10中所述的方法確認。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方式中，所述TM的目標是ORL,受體。該受體是G蛋白偶聯(lián)類受體的一個成員，并且具有7個跨膜域結(jié)構(gòu)。ORLi受體的性質(zhì)在Mogil&Pasternak(2001),尸/zwmaco/og/ca/ieWevw,Vol.53,No.3，pages381-415中被詳細討論。在一種實施方式中，TM是結(jié)合(優(yōu)選地特異結(jié)合)ORL,受體的分子。更優(yōu)選地，TM是ORL,受體的"激動劑"。術(shù)語"激動劑"在文中如上文定義。結(jié)合ORL,受體的TM激動劑的性質(zhì)可以用實施例10中所述的方法確認。這些方法基于前述實驗(參見，InoueeM/.1998[Proc.Natl,Acad.Sci.,95，10949-10953])，其證實了受體的天然激動劑，傷害感受肽(或者孤啡肽)(nociceptin))，引發(fā)了P物質(zhì)從疼痛感受初級傳入器神經(jīng)元釋放的誘導(dǎo)。這被以下事實支持>傷害感受肽誘導(dǎo)的反應(yīng)通過特異受體(P物質(zhì)受體)拮抗劑消除；和>用辣椒素(其耗盡小直徑初級傳入器神經(jīng)元中的P物質(zhì))預(yù)處理細胞減弱了傷害感受肽誘導(dǎo)的反應(yīng)。相似地，Inoue等人證實了A類肉毒菌神經(jīng)毒素的足底內(nèi)注射消除了傷害感受肽誘導(dǎo)的反應(yīng)。由于已知BoNT抑制P物質(zhì)從初級傳入器神經(jīng)元的釋放(Welchetal.,2000,Toxicon，38,245-258)，這證實了傷害感受肽-ORL,相互作用與P物質(zhì)的后續(xù)釋放之間的關(guān)聯(lián)。因此，如果TM引起P物質(zhì)從疼痛感覺傳入器神經(jīng)元釋放的誘導(dǎo)，TM可以被稱為在ORL,受體具有激動劑活性(參見實施例IO)。在本發(fā)明特別優(yōu)選的實施方式中，所述TM是傷害感受肽——ORL,受體的天然配體。傷害感受肽靶向ORL,受體，具有高親和度。其它優(yōu)選TMs的實例包括<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>編碼序列Ref.SEQIDNo.傷害感受肽[R14K15]1-17(在本說明書中也被稱作"變異"傷害感受肽)FGGFTGARKSARKRKNQ[3,4]49,50肽激動劑來自重組文庫方法的肽激動劑[5]Mogil&Pasternak,2001，Pharmacol.Rev"53,381-415Maile&a/"2003,Neurosci.Lett,,350,190-192Rizzi&a/.，2002,J.Pharmacol.Exp.Therap.，300,57-63Okada&a/.，2000,Biochem.Biophys.Res.Commun.,278,493-498DooleyWa/,，1997，JPharmacolExpTher.283(2)，735-41.上文識別的"變異"TM顯示出對疼痛感覺傳入器特別良好的結(jié)合親和力(當與天然傷害感受肽比較時)。這是令人吃驚的，因為氨基酸修飾發(fā)生在遠離TM的N-末端的位置。而且，修飾大多在TM的C-末端，其又被附著到大的多肽序列(即轉(zhuǎn)運區(qū)域)。一般來說，含TM的融合蛋白將顯示出相對于TM本身降低約100倍的結(jié)合能力。上述"變異"TM本身顯示出疼痛感覺傳入器對天然傷害感受肽提高了約3-10倍的結(jié)合能力(如，通過ORLl受體)。因此，含有"變異"TM的融合體被預(yù)期顯示出疼痛感覺傳入器對"游離的"傷害感受肽降低了約10倍的結(jié)合能力(如，通過ORLl受體)。然而，本發(fā)明人己經(jīng)展示了這些含有"變異"TM的融合蛋白顯示出與"游離"傷害感受肽非常接近(最令人吃驚)的結(jié)合能力——參見圖14。在本發(fā)明的情形中，術(shù)語阿片樣物質(zhì)或ORL,受體激動劑(如傷害感受肽，或上表中所列的肽的任意一種)包括與所述阿片樣物質(zhì)或激動劑具有至少70%，優(yōu)選地至少80%，更優(yōu)選地至少90%，和最優(yōu)選地至少95%同源性的分子。激動劑同源體保留了傷害感受肽在ORL,受體上的激動劑性質(zhì)，其可使用實施例10中提供的方法測試。相似地，阿片樣物質(zhì)同源體基本上保持了與其顯示高度同源性的阿片樣物質(zhì)的結(jié)合功能。本發(fā)明也包括上述TMs中任一的片段、變異體和衍生物。這些片段、變異體和衍生物基本上保留了歸因于所述TMs的性質(zhì)。除了上述阿片樣物質(zhì)和非阿片樣物質(zhì)類的TMs，多種其它多肽也適合靶向本發(fā)明所述的融合蛋白到疼痛感覺傳入器(如，到傷害感受肽)。在這一方面，特別要提到甘丙肽(galanin)和甘丙肽的衍生物。甘丙肽受體在DRGs中突觸前或突觸后被發(fā)現(xiàn)(Liu&Hokfelt,(2002),TrendsPharm.Sci.,23(10),468-74)，并且在神經(jīng)病變疼痛狀態(tài)過程中，表達被增強。蛋白酶激活的受體(proteinase-activatedreceptors(PARs))也是本發(fā)明所述的TMs的優(yōu)選組，最特別地是PAR-2。已知PAR-2的激動劑誘導(dǎo)/引起急性炎癥，部分通過神經(jīng)元性的機理。PAR2由初級脊髓傳入神經(jīng)元表達，并且PAR2激動劑刺激P物質(zhì)(substanceP(SP))和降血藥素基因相關(guān)肽(calcitoningene-relatedpeptide(CGRP))在外周組織中的釋放。本發(fā)明所述特別優(yōu)選組的TMs包括:配體參考文獻傷害感受肽Guerrini，"《/"(1997)J.Med.Chem.，40，pp.1789-1793|3-內(nèi)啡肽Blanc，"W"(1983)J.Biol.Chem.，258(13)，pp.8277-8284內(nèi)啡素-l;內(nèi)啡素-2Zadina，Wa/"(1997).Nature,386，pp.499-502強啡肽Fields&Basbaum(2002)Chapter11,InTheTextbookofPain，Wall&Melzackeds.Met-腦啡肽Fields&Basbaum(2002)Chapter11，InTheTextbookofPain，Wall&Melzackeds.Leu-腦啡肽Fields&Basbaum(2002)Chapter11，InTheTextbookofPain，Wall&Melzackeds.甘丙肽XuCa,"(2000)Neuropeptides,34(3&4),137-147PAR-2肽VergnolleWfl/.，(2001)Nat.Med,，7(7),821-82629本發(fā)明所述的蛋白酶剪切位點允許在非細胞毒性蛋白酶組分和TM組分之間的位置對融合蛋白進行剪切(優(yōu)選地為可控剪切)。該剪切反應(yīng)將融合蛋白從單鏈多肽轉(zhuǎn)化為二硫鍵連接的雙鏈多肽。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實施方式，TM通過位于該TM的C-端遠端的區(qū)域或氨基酸序列結(jié)合。例如，相關(guān)的結(jié)合區(qū)域可能包括朝向所述TM中部(即線性肽序列)放置的內(nèi)部區(qū)域或氨基酸序列。優(yōu)選地，相關(guān)結(jié)合區(qū)域位于朝向該TM的N-末端，更優(yōu)選地在或接近所述N-末端。在一種實施方式中，單鏈多肽融合體可能包括一個以上蛋白水解剪切位點。然而，在兩個或多個這樣的位點存在之處，它們是不同的，借此基本上防止在單一蛋白酶存在的情況下發(fā)生多處剪切的事件。在另一實施方式中，優(yōu)選的是單鏈多肽融合體具有單一蛋白酶剪切位點。蛋白酶剪切序列可以通過傳統(tǒng)的方法，例如通過位點定向誘變在DNA水平上引入(和/或任意內(nèi)在剪切序列的去除)。確認剪切序列存在的篩選可手工進行或用計算機軟件(如，DNASTAR,Inc公司的MapDraw程序)輔助進行。盡管可釆用任何蛋白酶剪切位點，以下是優(yōu)選的內(nèi)含肽(intein)也被術(shù)語蛋白酶剪切位點包括，它是自剪切序列。自剪接反應(yīng)是可控的，例如，通過改變存在的還原試劑的濃度。在使用中，蛋白酶剪切位點被剪切，并且TM的N-末端區(qū)域(優(yōu)選地為N-末端)成為暴露的。產(chǎn)生的多肽具有TM，其帶有基本游離于融合蛋白其余部分的N-末端區(qū)域或內(nèi)部區(qū)域。這一排列保證了該TM的N-末端組分(或內(nèi)部區(qū)域)可直接與靶細胞上的結(jié)合位點腸激酶Xa因子(DDDDK4)(IEGR丄/IDGR4)TEvc);因草蝕紋病毒)凝血酶(ENLYFQ丄G)(LVPR丄GS)(LEVLFQ丄GP)相互作用。在優(yōu)選的實施方式中，TM和蛋白酶剪切位點在該融合蛋白中由最多IO個氨基酸殘基分隔開，更優(yōu)選地由最多5個氨基酸殘基分隔，并且最優(yōu)選地由0個氨基酸殘基分隔。因此，蛋白酶剪切位點被剪切之后，向融合體提供具有N-末端區(qū)域的TM，所述N-末端區(qū)域基本游離于該融合體的其余部分。這一排列保證了靶向部分(TargetingMoiety)的N-末端組分可直接與靶細胞上的結(jié)合位點相互作用。與上述激活步驟相關(guān)的一個好處在于，一旦融合蛋白的蛋白水解剪切已經(jīng)發(fā)生，所述TM僅對N-末端降解易感。此外，特異蛋白酶剪切位點的選擇允許多肽融合體的選擇性激活，成為雙鏈構(gòu)型。"本發(fā)明所述的單鏈多肽融合體的構(gòu)建將蛋白酶剪切位點置于TM和非細胞毒性蛋白酶組分之間。優(yōu)選的是在單鏈融合體中，TM位于蛋白酶剪切位點和轉(zhuǎn)運組分之間。這保證了TM被連接到轉(zhuǎn)運區(qū)域(即，如原生梭菌全毒素所發(fā)生的)，盡管在本發(fā)明的情況下，兩種組分的順序相對于原生全毒素被逆轉(zhuǎn)。這一排列的另一優(yōu)點在于，TM被置于融合蛋白暴露的環(huán)形區(qū)域中，這對融合蛋白的構(gòu)型具有最小的結(jié)構(gòu)影響。在這一方面，所述環(huán)被不同地稱作接頭、激活環(huán)、域間環(huán)或僅僅是表面暴露的環(huán)(SchiavoW2000，Phys.Rev.，80，717-766;Turtonea/"2002，TrendsBiochem.Sci"27，552-558}。在一種實施方式中，在單鏈多肽中，非細胞毒性蛋白酶組分和轉(zhuǎn)運組分被二硫鍵連接在一起。因此，在蛋白酶剪切位點被剪切后，該多肽被認為是雙鏈構(gòu)型，其中所述蛋白酶和轉(zhuǎn)運區(qū)域通過二硫鍵保持連接在一起。為此，優(yōu)選的是蛋白酶和轉(zhuǎn)運組分在單鏈融合蛋白中由最多100個氨基酸殘基彼此分隔開，更優(yōu)選地最多80個氨基酸殘基，特別優(yōu)選地最多60個氨基酸殘基，和最優(yōu)選地最多50個氨基酸殘基彼此分隔開。在一種實施方式中，非細胞毒性蛋白酶組分與融合蛋白的轉(zhuǎn)運組分形成二硫鍵。例如，形成二硫鍵的蛋白酶組分的氨基酸殘基位于蛋白酶組分最后20個，優(yōu)選地最后10個C-末端氨基酸殘基之內(nèi)。相似地，在轉(zhuǎn)運組分中形成二硫鍵第二部分的氨基酸殘基位于轉(zhuǎn)運組分前20個，優(yōu)選地前10個N-末端氨基酸殘基之內(nèi)。可選地，在單鏈多肽中，非細胞毒性蛋白酶組分和TM可被二硫鍵連接在一起。在這一方面，TM中形成二硫鍵的氨基酸殘基優(yōu)選地位于該TMN-末端的遠端，更優(yōu)選地朝向該TM的C-末端。在一種實施方式中，非細胞毒性蛋白酶組分與融合蛋白的TM組分形成二硫鍵。在這一方面，形成二硫鍵的蛋白酶組分的氨基酸殘基優(yōu)選地位于蛋白酶組分最后20個，優(yōu)更選地最后10個C-末端氨基酸殘基之內(nèi)。相似地，在TM組分中形成二硫鍵第二部分的氨基酸殘基優(yōu)選地位于TM最后20個，更優(yōu)選地最后10個C-末端氨基酸殘基之內(nèi)。上述二硫鍵排列具有這樣的優(yōu)點蛋白酶和轉(zhuǎn)運組分以與原生梭菌神經(jīng)毒素相似的方式排列。通過比較的方式，參考原生梭菌神經(jīng)毒素的一級氨基酸序列，每個半胱氨酸氨基酸殘基由8到27個氨基酸殘基分隔——摘自Popoff,MR&Marvaud,J-C，1999,Structural&genomicfeaturesofclostridialneurotoxins,Chapter9，inTheComprehensiveSourcebookofBacterialProteinToxins,Ed.Alouf&Freer:血清型1序列C-C之間的"原生"長度BoNT/AlCVRGIITSKTKS——LDKGYNKALNDLC23BoNT/A2CVRGIIPFKTKS----LDEGYNKALNDLC23BoNT/BCKSVKAPG-------------------IC8BoNT/CCHKAIDGRS----------LYNKTLDC15BoNT/DCLRLTK---------------NSRDDSTC12BoNT/ECKN-IVSVK----------GIRK—-SIC13BoNT/FCKS-VIPRK----------GTKAPP-RLC15BoNT/GCKPVMYKNT----------GKSE—-QC13TeNTCKKIIPPTNIRENLYNRTASLTDLGGELC27i僅來自蛋白水解菌株的信息32融合蛋白可以包含一個或多個純化標記，它們位于蛋白酶組分的N-末端和/或轉(zhuǎn)運組分的C-末端。盡管可采用任何純化標記，以下是優(yōu)選的His-標記(如6個組氨酸)，優(yōu)選地作為C-末端和/或N-末端標記MBP-標記(麥芽糖結(jié)合蛋白)，優(yōu)選地作為N-末端標記GST-標記(谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶)，優(yōu)選地作為N-末端標記His-MBP-標記，優(yōu)選地作為N-末端標記GST-MBP-標記，優(yōu)選地作為N-末端標記硫氧還蛋白-標記，優(yōu)選地作為N-末端標記CBD-標記(幾丁質(zhì)結(jié)合域)，優(yōu)選地作為N-末端標記根據(jù)本發(fā)明進一步的實施方式，一個或多個肽間隔分子可被包含在融合蛋白中。例如，肽間隔分子可在純化標記和融合蛋白分子的剩余部分之間使用(例如，在N-末端純化標記和本發(fā)明的蛋白酶組分之間；和/或在C-末端純化標記和本發(fā)明的轉(zhuǎn)運組分之間)。肽間隔分子也可在本發(fā)明的TM和轉(zhuǎn)運組分之間使用。多種不同的間隔分子可被用于本發(fā)明所述的任意融合蛋白中。這些間隔分子的實例包括圖28和29所示的那些。本文特別提到了GS15、GS20、GS25和Hx27——參見圖28和29。本發(fā)明人出乎意料地發(fā)現(xiàn)當間隔分子的大小被選擇，以便(在使用中)TM的C-末端與轉(zhuǎn)運組分的N-末端彼此分開40-105埃，優(yōu)選地50-100埃，且更優(yōu)選地50-90埃時，本發(fā)明所述的融合蛋白(如CPNv/A)可顯示出對疼痛感覺傳入器提高的結(jié)合活性。在另一實施方式中，優(yōu)選的間隔分子具有11-29個氨基酸殘基，優(yōu)選地15-27個氨基酸殘基，并且更優(yōu)選地20-27個氨基酸殘基的氨基酸序列。合適的間隔分子可根據(jù)Crasto,C丄andFeng,J.A.(2000)May,13(5),pp.309-312常規(guī)地識別和獲得——也參見http:〃www.fccc./edu/research/labs/feng/limker.html。根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供了編碼上述單鏈多肽的DNA序列。在本發(fā)明優(yōu)選的方面，該DNA序列作為DNA載體的一部分被制備，其中該載體包含啟動子和終止子。在優(yōu)選的實施方式中，該載體具有選自以下的啟動子啟動子誘導(dǎo)試劑典型的誘導(dǎo)條件Tac(雜交體)IPTGAraBADL-阿拉伯糖0.2mM(0.05-2.0mM)0.2%(0.002-0.4%)丁7-/^>操縱子IPTG0.2mM(0.05-2.0mM)本發(fā)明所述的DNA構(gòu)建體優(yōu)選地用計算機模擬(&^7/co)設(shè)計，并隨后通過傳統(tǒng)的DNA合成技術(shù)合成。上述DNA序列信息根據(jù)采用的最終宿主細胞(如，大腸桿菌)表達系統(tǒng)被任選地針對密碼子偏好而修飾。DNA骨架優(yōu)選地針對任何內(nèi)在的核酸序列被篩選，當被轉(zhuǎn)錄和翻譯時，所述核酸序列可產(chǎn)生對應(yīng)于蛋白酶剪切位點的氨基酸序列，所述剪切位點由第二肽編碼序列編碼。所述篩選可手工進行或用計算機軟件(如，DNASTAR，Inc公司的MapDraw程序)輔助進行。根據(jù)本發(fā)明進一步的實施方式，提供了制備非細胞毒性試劑的方法，包括a.使本發(fā)明所述的單鏈多肽融合蛋白與能夠剪切蛋白酶剪切位點的蛋白酶接觸；b.剪切所述蛋白酶剪切位點，并由此形成雙鏈融合蛋白。這方面提供了雙鏈多肽，其通常模擬梭菌全毒素的結(jié)構(gòu)。更詳細地，產(chǎn)生的雙鏈多肽典型地具有這樣的結(jié)構(gòu)，其中a.第一條鏈包含非細胞毒性的蛋白酶或其片段，所述蛋白酶或蛋白酶片段能夠剪切疼痛感應(yīng)傳入器(apparatus)的蛋白；b.第二條鏈包含TM和轉(zhuǎn)運區(qū)域，其能夠?qū)⒌鞍酌富虻鞍酌钙螐膬?nèi)涵體中跨內(nèi)涵體膜轉(zhuǎn)運進入疼痛感應(yīng)傳入器的細胞溶膠中；并且第一和第二條鏈被二硫鍵連接在一起。在使用中，本發(fā)明所述的單鏈或雙鏈多肽治療、預(yù)防或緩解疼痛。在使用中，治療有效量的本發(fā)明所述單鏈或雙鏈多肽被給(nociceptivesensoryafferent)中胞吐融合器34予患者。本發(fā)明解決了廣泛的疼痛癥狀，特別地慢性疼痛癥狀。優(yōu)選的病癥包括癌癥性和非癌癥性疼痛，炎癥性疼痛和神經(jīng)病變性疼痛。本申請所述的阿片樣物質(zhì)-融合體特別適合解除炎癥性疼痛，盡管其可能適合解除神經(jīng)病變性疼痛的能力較差。甘丙肽-融合體更適合解除神經(jīng)病變性疼痛。在使用中，本發(fā)明所述的多肽典型地以聯(lián)合藥物載體、稀釋劑和/或賦形劑的藥物組合物的形式被使用，盡管組合物確切的形式可根據(jù)給藥模式改變。給藥優(yōu)選地給予哺乳動物，更優(yōu)選地給予人類。該多肽可以，例如，以用于關(guān)節(jié)內(nèi)給藥或顱骨內(nèi)給藥的無菌溶液的形式被使用。脊柱注射(如，硬膜外或髓鞘內(nèi))是優(yōu)選的。本發(fā)明所述多肽給藥的劑量范圍是產(chǎn)生期望的治療效果的那些。應(yīng)該認識到，需要的劑量范圍取決于所述組分精確的性質(zhì)；給藥的途徑；制劑的特征；患者的年齡；患者病癥的特征、程度或嚴重性；是否有任何禁忌癥；和診斷醫(yī)生的判斷。合適的每日劑量在0.0001-lmg/kg范圍內(nèi)，優(yōu)選地0.0001-0.5mg/kg，更優(yōu)選地0.002-0.5mg/kg，和特別優(yōu)選地0.004-0.5mg/kg。單位劑量可以從小于1毫克到30毫克變化，但是典型地在每劑0.01到lmg的范圍內(nèi)，這可被每天給藥或優(yōu)選地更不頻繁地給藥，如每周或每6個月。特別優(yōu)選的給藥方案是基于2.5ng融合蛋白(如CPNv/A)作為lx藥劑。在這方面，優(yōu)選的劑量在lx-100x(即2.5-250ng)范圍內(nèi)。這一劑量范圍明顯低于(即，至少低10倍，典型地低100倍)其它類型止痛劑分子，如NSAIDS、嗎啡和加巴噴丁(Gabapentin)采用的劑量。而且，當在摩爾的基礎(chǔ)上進行相同比較時，上述差異被顯著增大——這是因為本發(fā)明所述的融合蛋白具有比傳統(tǒng)"小"分子療法大得多的分子量(Mw)。然而，在所要求劑量中的多種變化被預(yù)期，其取決于所述組分的精確性質(zhì)和各種給藥途徑不同的效率。這些劑量水平中的變化可以使用用于優(yōu)化的標準經(jīng)驗途徑調(diào)整，它們在本領(lǐng)域內(nèi)被公知。適合注射的組合物可以是溶液、懸液或乳劑、或干燥粉末的形式，所述粉末在使用前溶解或懸浮在適當載體中。液態(tài)單位劑量形式典型地使用無致熱物(pyrogen-free)的無菌載體制備。取決于載體和使用的濃度，活性成分可以溶解或懸浮在載體中。在制備可給藥溶液時，多肽可以被溶解在載體中，如果必要，該溶液通過加入氯化鈉被制成等滲的，并在灌入合適的無菌小瓶或安瓿和封裝前，使用無菌技術(shù)通過經(jīng)由無菌過濾器過濾而滅菌。可選地，如果溶液的穩(wěn)定性足夠，該溶液在其密封容器中可通過高壓滅菌被滅菌。有利的添加劑，如緩沖液、增溶劑、穩(wěn)定劑、防腐劑或殺菌劑、懸浮劑或乳化劑可被溶解在載體中。使用前溶解或懸浮在適當載體中的干燥粉末可在無菌區(qū)域中使用無菌技術(shù)，通過向無菌容器中灌入預(yù)先滅菌的藥物物質(zhì)和其它成分制備?？蛇x地，多肽和其它成分可被溶解在水性載體中，該溶液通過過濾滅菌，并在滅菌區(qū)域中使用無菌技術(shù)分裝進合適的容器。產(chǎn)品隨后被冷凍干燥并且容器被無菌封裝。非口服(腸胃外)懸液，適合用于肌肉內(nèi)、皮下或真皮內(nèi)注射，以基本相同的方式制備，除了無菌組分懸浮在無菌載體中替代了被溶解，且滅菌不能通過過濾完成。所述組分可在無菌狀態(tài)下分離，或可選地，其可在分離后滅菌，例如通過Y輻射。有利地，諸如聚乙烯吡咯烷酮的懸浮劑可被包含在組合物中，以促進所述組分的均一分布。定義部分耙向部分(TargetingMoiety(TM))表示與試劑相關(guān)的任何化學結(jié)構(gòu)，所述試劑與結(jié)合位點功能上相互作用，引起所述試劑與靶細胞表面的物理聯(lián)系。在本發(fā)明的文字中，靶細胞是疼痛感覺傳入器(nociceptivesensoryafferent)。術(shù)語TM包括能夠結(jié)合靶細胞上結(jié)合位點的任何分子(即，天然發(fā)生的分子，或其化學/物理修飾的變異體)，36所述結(jié)合位點能夠內(nèi)化(internalisation)(如，內(nèi)涵體的形成)——也被稱為受體介導(dǎo)的細胞內(nèi)吞。TM可能具有內(nèi)涵體膜轉(zhuǎn)運功能，在這種情況下，分離的TM和轉(zhuǎn)運區(qū)域(TranslocationDomain)組分不需要存在于本發(fā)明的試劑中。本發(fā)明所述的TM結(jié)合(優(yōu)選地特異結(jié)合)疼痛感覺傳入器(如初級疼痛傳入器)。在這一方面，特異結(jié)合表示TM以比其結(jié)合諸如非疼痛傳入器的其它神經(jīng)元和/或運動神經(jīng)元(即，梭菌神經(jīng)毒素全毒素的天然目標)更大的親和力，結(jié)合到疼痛感覺傳入器(如，初級疼痛傳入器)。術(shù)語"特異結(jié)合"也可以表示給定的TM以106M''或更高，優(yōu)選地1(^M"或更高，更優(yōu)選地108M—i或更高，和最優(yōu)選地1(^M—'或更高的結(jié)合親和力(Ka)結(jié)合到給定受體，例如ORL,受體。出于本發(fā)明的目的，激動劑被定義為能夠刺激靶細胞內(nèi)胞吐(exocytic)融合過程的分子，該過程容易被能夠剪切所述靶細胞中胞吐融合元件的蛋白的蛋白酶(或其片段)抑制。因此，本發(fā)明特定激動劑的定義排除了傳統(tǒng)上被認為是激動劑的多種分子。例如，在其通過結(jié)合到TrkA受體啟動神經(jīng)元分化的能力方面，神經(jīng)生長因子(nervegrowthfactor(NGF))是激動劑。然而，當由上述條件評估時，NGF不是激動劑，因為它不是胞吐融合體的主要誘導(dǎo)劑。此外，NGF刺激的過程(即細胞分化)不易于被非細胞毒性毒素分子的蛋白酶活性抑制。術(shù)語"片段"，當用于蛋白時，表示具有至少35個，優(yōu)選地至少25個，更優(yōu)選地至少20個，和最優(yōu)選地至少10個所述蛋白的氨基酸殘基的肽。術(shù)語"變異體"，當用于蛋白時，表示含有一個或多個氨基酸類似物(如，非天然氨基酸)或替代的連接的蛋白的肽或肽片段。術(shù)語"衍生物"，當用于蛋白時，表示含有所述蛋白和其它肽序列的蛋白。所述其它肽序列應(yīng)該優(yōu)選地不干擾基本折疊和由此產(chǎn)生的初始蛋白的構(gòu)型結(jié)構(gòu)。兩個或多個肽(或片段，或變異體)可能被連接在一起形成衍生物?？蛇x地，肽(或片段，或變異體)可與不相關(guān)分子(如第二個不相關(guān)的肽)連接。衍生物可被化學合成，但典37型地通過重組核酸的方法被制備。其它組分，如脂質(zhì)、和/或多糖、禾口/或聚酮組分可被包括。在本說明書中，提到"ORL,受體"包括所有ORL,受體家族的成員。ORL,受體家族的成員典型地具有7個跨膜域結(jié)構(gòu)，并與Gj和Go家族的G蛋白偶聯(lián)。確定ORL,受體的配體的G-蛋白刺激活性的方法在實施例12中給出。測量ORLr激活后細胞cAMP水平的降低的方法在實施例11中給出。ORL,受體家族成員的進一步的特征在于，它們典型地能夠結(jié)合傷害感受肽(ORL,的天然配體)。舉例來說，所有ORL,受體的選擇性剪接變異體是ORL,受體家族的成員。術(shù)語"非細胞毒性的"表示討論議題中的所述蛋白酶分子不殺死其重新耙向的靶細胞。"本發(fā)明所述的蛋白酶包括所有天然發(fā)生的非細胞毒性蛋白酶，其能夠剪切真核細胞中胞吐融合器的一個或多個蛋白。本發(fā)明所述的蛋白酶優(yōu)選地為細菌蛋白酶(或其片段)。更優(yōu)選地，所述細菌蛋白酶選自梭菌屬(C/o^^^m)或奈瑟菌屬(A^'wen'fl)(例如，梭菌L-鏈，或優(yōu)選地來自淋球菌(TV.gowo;r/2oeae)的奈瑟菌IgA蛋白酶)。本發(fā)明也包括修飾的非細胞毒性蛋白酶，其包含非天然發(fā)生的氨基酸序列和/或合成的氨基酸殘基，只要修飾的蛋白酶仍顯示出上述蛋白酶活性。本發(fā)明所述的蛋白酶優(yōu)選地顯示出絲氨酸或金屬蛋白酶活性(如，肽鏈內(nèi)切酶活性)。蛋白酶優(yōu)選地對SNARE蛋白(如SNAP-25、小突觸泡蛋白AVAMP或突觸融合蛋白)具有特異性。特別提及的是神經(jīng)毒素的蛋白酶區(qū)域，例如細菌祌經(jīng)毒素的蛋白酶區(qū)域。因此，本發(fā)明包含天然發(fā)生的神經(jīng)毒素區(qū)域的使用，以及所述天然發(fā)生的神經(jīng)毒素的重組制備版本的使用。示例性的神經(jīng)毒素通過梭菌產(chǎn)生，并且術(shù)語"梭菌神經(jīng)毒素，，包括由破傷風梭菌(C.^tow')(TeNT)和由肉毒梭菌(C6of^柳m)(BoNT)血清型A-G產(chǎn)生的神經(jīng)毒素，以及與由巴氏梭菌(C.^ra^')和丁酸梭菌(C.Z^o^cwm)產(chǎn)生的、緊密相關(guān)的BoNT樣神經(jīng)毒素。上述縮寫貫穿本說明書使用。例如，命名法BoNT/A表示神經(jīng)毒素的來源為BoNT(血清型A)。相應(yīng)的命名法也適用于其它BoNT血清型。術(shù)語"L-鏈片段"表示神經(jīng)毒素L-鏈的組分，該片段顯示出金屬蛋白酶的活性并能夠蛋白水解地剪切細胞胞吐中涉及的囊泡和/或質(zhì)膜相關(guān)蛋白。轉(zhuǎn)運區(qū)域是使蛋白酶(或其片段)能夠轉(zhuǎn)運進靶細胞、以便蛋白酶活性的功能表達發(fā)生在靶細胞的細胞溶膠中的分子。任何分子(如，蛋白或肽)是否具有本發(fā)明所述必須的轉(zhuǎn)運功能可通過多種傳統(tǒng)測試中任一確認。例如，ShoneC.(1987)描述了采用脂質(zhì)體的體外測試，其使用測試分子刺激。必須轉(zhuǎn)運功能的存在通過K+和/或標記的NAD從脂質(zhì)體中的釋放確定，這可被容易地檢測[參見ShoneC.(1987)Eur.J.Biochem;vol.167(1):pp.175-180]。BlausteinR.(1987)提供了另一實例，其描述了采用平面磷脂雙層膜簡單的體外測試。該膜用測試分子刺激，并且必須的轉(zhuǎn)運功能通過跨所述膜傳導(dǎo)性的提高確認[參見Blaustein(1987)FEBSLetts;vol.226,no.l:pp.115-120]。能夠評估膜融合體，并由此識別適合用于本發(fā)明的轉(zhuǎn)運區(qū)域的其它方法由MethodsinEnzymologyVol220and221，MembraneFusionTechniques,PartsAandB，AcademicPress1993提供。轉(zhuǎn)運區(qū)域優(yōu)選地能夠在低pH值的條件下，在脂膜上形成離子可滲透的孔。優(yōu)選地，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)僅使用蛋白分子的那些部分能夠在內(nèi)涵體膜中形成孔。轉(zhuǎn)運區(qū)域可以從微生物蛋白來源獲得，特別地從細菌或病毒蛋白來源獲得。因此，在一種實施方式中，轉(zhuǎn)運區(qū)域是諸如細菌毒素或病毒蛋白的酶的轉(zhuǎn)運區(qū)域。已經(jīng)有充分記載細菌毒素分子的某些區(qū)域能夠形成這樣的孔。也已知在病毒內(nèi)表達的膜融合蛋白的某些轉(zhuǎn)運區(qū)域能夠形成這樣的孔。這些區(qū)域可被用在本發(fā)明中。所述轉(zhuǎn)運區(qū)域可能是梭菌源的，即HN區(qū)域(或其功能組分)。Hw表示梭菌屬神經(jīng)毒素H-鏈的部分或片段，其約等價于H-鏈氨基端的一半，或?qū)?yīng)于完整H-鏈中的片段的區(qū)域。優(yōu)選的是H-鏈基本上缺少H-鏈的Hc:組分天然的結(jié)合功能。在這一方面，Hc功能可通過Hc氨基酸序列的刪除(通過核酸酶或蛋白酶處理，或者在DNA合成水平，或者在合成后水平)而被除去?？蛇x地，Hc;功能可通過化學或生物處理而失活。因此，H-鏈優(yōu)選地不能結(jié)合靶細胞上的結(jié)合位點，而原生梭菌神經(jīng)毒素(即全毒素)結(jié)合該位點。在一種實施方式中，轉(zhuǎn)運區(qū)域是梭菌神經(jīng)毒素的Hn區(qū)域(或其片段)。合適的梭菌轉(zhuǎn)運區(qū)域的實例包括肉毒菌A型神經(jīng)毒素-氨基酸殘基(449-871)肉毒菌B型神經(jīng)毒素-氨基酸殘基(441-858)肉毒菌c型神經(jīng)毒素-氨基酸殘基(442-866)肉毒菌D型神經(jīng)毒素-氨基酸殘基(446-862)肉毒菌E型神經(jīng)毒素-氨基酸殘基(423-845)肉毒菌F型神經(jīng)毒素-氨基酸殘基(440-864)肉毒菌G型神經(jīng)毒素-氨基酸殘基(442-863)破傷風神經(jīng)毒素-氨基酸殘基(458-879)對于在肉毒梭菌和破傷風梭菌中產(chǎn)生毒素的遺傳基礎(chǔ)的細節(jié)，我們參考Hendersonef(1997)in77eC7osf〃'(i/a.'Afo/ec"/ar5z.o/ogy尸af/20gewe5^,/4cacfewz,cpress。術(shù)語"Hw"包括天然發(fā)生的神經(jīng)毒素的Hn部分和修怖的Hn部分，其具有非天然發(fā)生的氨基酸序列和/或合成的氨基酸殘基，只要修飾的HN部分仍顯示出上述轉(zhuǎn)運功能?？蛇x地，轉(zhuǎn)運區(qū)域可能是非梭菌源的(參見表4)。非梭菌轉(zhuǎn)運區(qū)域源的實例包括，但不限制于白喉毒素的轉(zhuǎn)運區(qū)域[OKeefeeZa/.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)89，6202-6206;Silverman"a/"J.Biol.Chem.(1993)269，22524-22532;和London,E.(1992)5zoc/2綴所op/^.^cto,^M;^.25-57]，假單胞菌外毒素A類型的轉(zhuǎn)運區(qū)域[Priorefa/.Biochemistry(1992)31,3555-3559]，炭疽病毒素的轉(zhuǎn)運區(qū)域[Blanke^a/.Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1996)93，8437-8442]，多種具有轉(zhuǎn)運功能的融合或疏水肽[Plankea/.J.Biol.Chem.(1994)269,12918-12924;和Wagnere"/(1992)尸A^S,卵,7934-7WS]，及兩親肽[Murata"a/(1992)所oc/zew.，W，//./7卯2]。所述轉(zhuǎn)運區(qū)域可模擬天然生成的蛋白中的轉(zhuǎn)運區(qū)域，或可能包括氨基酸變異，只要該變異不破壞該轉(zhuǎn)運區(qū)域的轉(zhuǎn)運能力。適合用于本發(fā)明的病毒轉(zhuǎn)運區(qū)域的特定實例包括病毒表達的膜融合蛋白的某些轉(zhuǎn)運區(qū)域。例如，Wagnere,a/.(1992)和MurataWfl/.(1992)描述了從流感病毒血凝素的N-末端區(qū)域衍生的多個融合和兩親肽的轉(zhuǎn)運(即，膜融合和囊泡形成)功能。已知具有期望轉(zhuǎn)運活性的其它病毒表達的膜融合蛋白是塞姆利基森林病毒(SemlikiForestVirus(SFV))融合肽的轉(zhuǎn)運區(qū)域，水泡性口炎病毒(vesicularstomatitisvirus(VSV))糖蛋白G的轉(zhuǎn)運區(qū)域，SER病毒F蛋白的轉(zhuǎn)運區(qū)域和泡沫病毒包膜糖蛋白的轉(zhuǎn)運區(qū)域。病毒編碼的刺突(Aspike)蛋白在本發(fā)明的背景下具有特定的應(yīng)用，例如，SFV的E1蛋白和VSV的G蛋白。表(下文)中所列的轉(zhuǎn)運區(qū)域的用途包括其序列變異體的用途。變異體可能包含一個或多個保守核酸置換和/或核酸刪除或插入，條件是該變異體具有必須的轉(zhuǎn)運功能。變異體也可能包含一個或多個氨基酸置換和/或氨基酸刪除或插入，只要該變異體具有必須的轉(zhuǎn)運功轉(zhuǎn)運區(qū)域來源氨基酸殘基參考文獻白喉毒素194-380SilvermanWa/.，1994,J.Biol.Chem.269,22524-22532LondonE.,1992，Biochem.Biophys.Acta"1113,25-51假單胞菌外毒素的區(qū)域II405-613Priore/1992,Biochemistry31,3555-3559Kihara&Pastan,1994,BioconjChem.5，532-53841轉(zhuǎn)運區(qū)域來源氨基酸殘基參考文獻流感病毒血凝素GLFGAIAGF正NGWEGMIDGWYG及其變異體Plank"fl/"1994,J.Biol.Chem.269,12918-12924WagnerC1992，PNAS,89,7934-7938Murata"fl/.，1992,Biochemistry31，1986-1992塞姆利基森林病毒融合蛋白轉(zhuǎn)運區(qū)域KielianWfl,.,1996，JCellBiol.134(4)，863-872水泡性口炎病毒糖蛋白G118-139Yao"fl/"2003，Viro!ogy310(2)，319-332SER病毒F蛋白轉(zhuǎn)運區(qū)域Sethfl/"2003，JVirol77(11)6520-6527泡沫病毒包膜糖蛋白轉(zhuǎn)運區(qū)域Picard-Maureau"a,"2003,JVirol,77(8),4722-4730附圖圖1LC/A-傷害感受肽-HWA融合蛋白的純化圖2傷害感受肽-LC/A-HN/A融合蛋白的純化圖3LC/C-傷害感受肽-HK/C融合蛋白的純化圖4LC/A-met腦啡肽-HN/A融合蛋白的純化圖5LC/A-傷害感受肽-HN/A融合蛋白和傷害感受肽-LC/A-HN/A融合蛋白的結(jié)合效力的比較圖6'LC/A-傷害感受肽-H^A融合蛋白的體外催化活性圖7LC/A-傷害感受肽變異體-Hw/A融合蛋白的純化42圖8LC/A-傷害感受肽-HWA融合蛋白和LC/A-傷害感受肽變異體-Hn/A融合蛋白融的結(jié)合效力的比較圖9表達/純化的具有可變間隔長度產(chǎn)物的LC/A-傷害感受肽-HwZA融合蛋白家族圖10SP釋放和SNAP-25被CPN-A剪切的抑制圖11DRG暴露于CPN-A后，SP釋放和SNAP-25的剪切的在延長的時間段內(nèi)的抑制圖12SNAP-25被CPNv-A的剪切圖13.DRG暴露于CPNv-A后，NAP-25在延長的時間段內(nèi)的剪切圖14CPNv-A融合體介導(dǎo)的[3H]-傷害感受肽結(jié)合的替換圖15表達/純化的CPNv(Ek)-A產(chǎn)物圖16SNAP-25被CPNv(Ek)-A的剪切圖17表達/純化的CPNv-C產(chǎn)物圖18突觸融合蛋白被CPNv-C的剪切圖19CPN-A在急性辣椒素誘導(dǎo)的機械痛覺異常模型中的效力圖20CPN-A在鏈脲霉素(STZ)誘導(dǎo)的外周糖尿病神經(jīng)病變(神經(jīng)病變性疼痛)模型中的效力圖21CPNv-A在急性辣椒素誘導(dǎo)的機械痛覺異常模型中的效力圖22表達/純化的LC/A-CPLE-HN/A產(chǎn)物圖23表達/純化的LC/A-CPBE-HN/A產(chǎn)物圖24表達/純化的CPOP-A產(chǎn)物圖25表達/純化的CPOPv-A產(chǎn)物圖26DRG細胞模型中SNAP-25的體外剪切圖27表達/純化的CPNv-A-FXa-HT(可去除his-標記)圖28具有可變間隔長度的LC/A-傷害感受肽-H^A融合蛋白的43體外效力，由配體競爭測試評估圖29具有可變間隔長度的LC/A-傷害感受肽-IVA融合蛋白的體外效力，由體外SNAP-25剪切評估在附圖現(xiàn)在被更詳細地描述。圖1-LC/A-傷害感受肽-HN/A融合蛋白的純化使用實施例9所概括描述的方法，LC/A-傷害感受肽-H^A融合蛋白從大腸桿菌BL21細胞中被純化。簡單地說，細胞破碎后獲得的可溶產(chǎn)物被加樣到裝有鎳的親和捕獲柱上。結(jié)合的蛋白用100mM咪唑洗脫，用因子Xa處理以激活融合蛋白并除去麥芽糖結(jié)合蛋白(maltose-bindingprotein(MBP))標記，隨后重加樣到第二個裝有鎳的親和捕獲柱上。來自純化步驟的樣品通過SDS-PAGE(圖A)和蛋白質(zhì)印跡(圖B)評估?？箓Ω惺茈牡目寡?從Abcam獲得)被用作蛋白質(zhì)印跡蛋白質(zhì)印跡的一抗。在還原劑不存在和存在下，最終純化的材料分別在標記有[-]和[+]的泳道中被識別。圖2-傷害感受肽-LC/A-HN/A融合蛋白的純化使用實施例9所述的方法，傷害感受肽-LC/A-HN/A融合蛋白從大腸桿菌BL21細胞中被純化。簡單地說，細胞破碎后獲得的可溶產(chǎn)物被加樣到裝有鎳的親和捕獲柱上。結(jié)合的蛋白用100mM咪唑洗脫，用因子Xa處理以激活融合蛋白并除去麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)標記，隨后重加樣到第二個裝有鎳的親和捕獲柱上。來自純化步驟的樣品通過SDS-PAGE(圖A)和蛋白質(zhì)印跡蛋白質(zhì)印跡(圖B)評估。抗傷害感受肽的抗血清(從Abcam獲得)被用作蛋白質(zhì)印跡蛋白質(zhì)印跡的一抗。在還原劑不存在和存在下，最終純化的材料分別在標記[-]和[+]的泳道中被識別。圖3-LC/C-傷害感受肽-HWC融合蛋白的純化使用實施例9所述的方法，LC/C-傷害感受肽-HN/C融合蛋白從大腸桿菌BL21細胞中被純化。簡單地說，細胞破碎后獲得的可溶產(chǎn)物被加樣到裝有鎳的親和捕獲柱上。結(jié)合的蛋白用lOOmM咪唑洗脫，用因子Xa處理以激活融合蛋白并除去麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)標記，隨后重加樣到第二個裝有鎳的親和捕獲柱上。來自純化步驟的樣品通過SDS-PAGE(圖A)和蛋白質(zhì)印跡(圖B)評估?？箓Ω惺茈牡目寡?從Abeam獲得)被用作蛋白質(zhì)印跡的一抗。在還原試劑不存在和存在下，最終純化的材料分別在標記[-]和[+]的泳道中被識別。圖4-LC/A-met腦啡肽-Hw/A融合蛋白的純化使用實施例9所述的方法，LC/A-met腦啡肽-Hw/A融合蛋白從大腸桿菌BL21細胞中被純化。簡單地說，細胞破碎后獲得的可溶產(chǎn)物被加樣到裝有鎳的親和捕獲柱上。結(jié)合的蛋白用100mM咪唑洗脫，用因子Xa處理以激活融合蛋白并除去麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)標記，隨后重加樣到第二個裝有鎳的親和捕獲柱上。來自純化步驟的樣品通過SDS-PAGE評估。在還原劑不存在和存在下，最終純化的材料分別在標記[-]和[+]的泳道中被識別。圖5-LC/A-傷害感受肽-HN/A融合蛋白和傷害感受肽-LC/A-HN/A融合蛋白的結(jié)合效力的比較傷害感受肽融合體結(jié)合ORL1受體的能力使用簡單的基于競爭的測試評估。背根神經(jīng)節(jié)(dorsalrootganglia(DRG))的原始培養(yǎng)物在1nM的[3H]-傷害感受肽存在的情況下被暴露于各種濃度的測試材料。放射性標記配體的特異結(jié)合的降低通過閃爍計數(shù)評估，并且與未標記配體(Tocris傷害感受肽)的效力比較繪圖。清楚的是LC/A-傷害感受肽-HN/A融合體在與ORL1受體相互作用方面遠比傷害感受肽-LC/A-HN/A融合體出眾。圖6-LC/A-傷害感受肽-Hw/A融合蛋白的體外催化活性純化的LC/A-傷害感受肽-HN/A融合蛋白的體外肽鏈內(nèi)切酶活性本質(zhì)上根據(jù)Chaddocketal2002，Prot.ExpressPurif.25,219-228所述確定。簡單地說，固定在ELISA平板上的SNAP-25肽在37。C被暴露于多種濃度的融合蛋白1小時。一系列的洗滌之后，被剪切的SNAP-25肽的量通過用與特定抗血清的反應(yīng)性進行定量。圖7-LC/A-傷害感受肽變異體-Hw/A融合蛋白的純化使用實施例9所述的方法，LC/A-傷害感受肽變異體-IVA融合蛋白從大腸桿菌BL21細胞中被純化。簡單地說，細胞破碎后獲得的可溶產(chǎn)物被加樣到裝有鎳的親和捕獲柱上。結(jié)合的蛋白用100mM咪唑洗脫，用因子Xa處理以激活融合蛋白并除去麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)標記，隨后重加樣到第二個裝有鎳的親和捕獲柱上。來自純化步驟的樣品通過SDS-PAGE評估。在還原劑不存在和存在下，最終純化的材料分別在標記[-]和[+]的泳道中被識別。圖8-LC/A-傷害感受肽-Hw/A融合蛋白和LC/A-傷害感受肽變異體-HN/A融合蛋白的結(jié)合效力的比較傷害感受肽融合體結(jié)合ORL,受體的能力使用簡單的基于競爭的測試評估。背根神經(jīng)節(jié)(DRG)的原始培養(yǎng)物在1nM的[3H]-傷害感受肽存在的情況下被暴露于各種濃度的測試材料。放射性標記配體的特異結(jié)合的降低通過閃爍計數(shù)評估，并且與未標記配體(Tocris傷害感受肽)的效力比較繪圖。清楚的是LC/A-傷害感受肽變異體-PVA融合體(CPNv-LHA)在與ORI^受體相互作用方面遠比LC/A-傷害感受肽變異體-HN/A融合體(CPN-LHA)出眾。圖9-表達/純化具有可變間隔長度產(chǎn)物的LC/A-傷害感受肽-I^/A融合蛋白家族使用實施例9所述的方法，含有GSIO、GS30和HX27的LC/A-CPN-Hw/A融合蛋白從大腸桿菌細胞漿(cellpaste)中被純化。來自LC/A-CPN(GS10)-HN/A、LC/A-CPN(GS15)-HN/A、LC/A-CPN(GS25)-HN/A、LC/A-CPN(GS30)-HN/A和LC/A-CPN(HX27)-HN/A辨化的樣品在用考馬斯藍(CoomassieBlue)染色前，通過SDS-PAGE評估。電泳圖樣表明CPBE-A預(yù)期分子量的二硫鍵雙鏈種類的純化。上部圖面M=標準分子量標記；S=大腸桿菌總蛋白可溶部分；FT=不結(jié)合N產(chǎn)-裝載的瓊脂糖柱的蛋白；FUSION=通過加入咪唑洗脫的融合蛋白。底圖:泳道1=標準分子量標記；泳道2=大腸桿菌總蛋白的可溶部分；泳道3=在>^2+-裝載的瓊脂糖上初始捕獲后純化的材料；泳道4=在N嚴-裝載瓊脂糖上最終捕獲前用因子Xa處理的材料；泳道5=用因子Xa(5jul)激活后純化的最終材料；泳道6=用因子Xa(10^il)激活后純化的最終材料；泳道7=用因子乂&(2(^1)激活后純化的最終材料;泳道8=用因子Xa+DTT(5nl)激活后純化的最終材料；泳道9=用因子Xa+DTT(10nl)激活后純化的最終材料；泳道10=用因子Xa+DTT(20pl)激活后純化的最終材料。圖10-SP釋放和SNAP-25被CPN-A剪切的抑制簡單地說，背根神經(jīng)節(jié)(DRG)的原始培養(yǎng)物被暴露于各種濃度的CPN-A中24小時。細胞蛋白通過SDS-PAGE、蛋白質(zhì)印跡分離，并用抗-SNAP-25標記，以促進SNAP-25剪切的評估。被剪切的SNAP-25的百分比通過密度計量分析計算，并相對融合體濃度繪圖(短劃線)。也被回收，用于使用特定EIA試劑盒進行P物質(zhì)含量的分析。P物質(zhì)釋放的抑制由實線顯示。達到50%最大SNAP-25剪切所需的融合體濃度估計為6.30±2.48nM。圖11-DRG暴露于CPN-A后，SP釋放和SNAP-25的剪切在延長的時間段內(nèi)的抑制背根神經(jīng)節(jié)(DRG)的原始培養(yǎng)物被暴露于各種濃度的CPN-A中24小時。肉毒菌神經(jīng)毒素(BoNT/A)被用作對照。初始的暴露后，細胞外物質(zhì)通過清洗被除去，并且細胞在37'C下培養(yǎng)不同的時間段。在特定的時間點，細胞蛋白通過SDS-PAGE、蛋白質(zhì)印跡分離，并用抗-SNAP-25標記，以促進SNAP-25剪切的評估。被剪切的SNAP-25的百分比通過密度計分析計算并由虛線顯示。材料也被回收，用于使用特定EIA試劑盒進行的P物質(zhì)含量的分析。P物質(zhì)釋放的抑制由實線顯示。47圖12-SNAP-25被CPNv-A的剪切背根神經(jīng)節(jié)(DRG)的原始培養(yǎng)物被暴露于各種濃度的CPNv-A中24小時。細胞蛋白通過SDS-PAGE、蛋白質(zhì)印跡分離，并用抗-SNAP-25標記，以促進SNAP-25剪切的評估。被剪切的SNAP-25的百分比通過密度計分析計算。達到50%最大SNAP-25剪切所需的融合體濃度估計為1.38士0.36nM。圖13-DRG暴露于CPNv-A后，NAP-25在延長的時間段內(nèi)的剪切背根神經(jīng)節(jié)(DRG)的原始培養(yǎng)物被暴露于各種濃度的CPNv-A中24小時。CPN-A被用作對照。初始的暴露后，細胞外物質(zhì)通過清洗被除去，并且細胞在37'C培養(yǎng)不同的時間段。在特定的時間點，細胞蛋白通過SDS-PAGE、蛋白質(zhì)印跡分離，并用抗-SNAP-25標記，以促進SNAP-25剪切的評估。被剪切的SNAP-25的百分比通過密度計分析計算。圖14-CPNv-A融合體介導(dǎo)的[3H-傷害感受肽結(jié)合的替代傷害感受肽融合體結(jié)合ORL,受體的能力使用簡單的基于競爭的測試評估。背根神經(jīng)節(jié)(DRG)的原始培養(yǎng)物在lnM的[3H]-傷害感受肽存在的情況下被暴露于各種濃度的測試材料。放射性標記配體的特異結(jié)合的降低通過閃爍計數(shù)評估，并且與未標記配體(Tocris傷害感受肽)的效力比較繪圖。清楚的是LC/A-傷害感受肽變異體-HN/A融合體(標記為CPNv-LHnA)在與ORL,受體相互作用方面比LC/A-傷害感受肽-HN/A融合體(標記為CPN-LHnA)出眾。圖15-表達/純化CPNv(Ek)-A產(chǎn)物48蛋白在用考馬斯藍染色前接受SDS-PAGE。電泳圖譜表明預(yù)期分子量的CPNv(Ek)-A二硫鍵結(jié)合的雙鏈種類的純化。泳道1=標準分子量標記；泳道2=大腸桿菌總蛋白可溶部分；泳道3-在N產(chǎn)-裝載的瓊脂糖上初始捕獲后純化的物質(zhì)；泳道4=用腸激酶(5pl)激活后純化的最終物質(zhì)；泳道5-用腸激酶(l(Hil)激活后純化的最終物質(zhì)；泳道6=用腸激酶(2(^1)激活后純化的最終物質(zhì)；泳道7=用腸激酶+0丁丁(5pl)激活后純化的最終物質(zhì)；泳道8^用腸激酶+DTT(10pl)激活后純化的最終物質(zhì)；泳道9=用腸激酶+0丁丁(20^1)激活后純化的最終物質(zhì)。圖16-SNAP-25被CPNv(Ek)-A的剪切背根神經(jīng)節(jié)(DRG)的原始培養(yǎng)物被暴露于各種濃度的CPNv(Ek)-A中24小時。細胞蛋白通過SDS-PAGE、蛋白質(zhì)印跡分離，并用抗-SNAP-25標記，以促進SNAP-25剪切的評估。被剪切的SNAP-25的百分比通過密度計分析計算。實施例9中制備的CPNv-A被用作比較的目的。SNAP-25被CPNv(Ek)-A(標記為En激活的)和CPNv-A(標記為Xa激活的)剪切的百分比被顯示出。圖17-表ii/純化CPNv-C產(chǎn)物蛋白在用考馬斯藍染色前進行SDS-PAGE。電泳圖譜表明預(yù)期分子量的CPNv-C的二硫鍵連接雙鏈種類的純化。泳道1=標準分子量標記；泳道2=大腸桿菌總蛋白可溶部分；泳道3=在N產(chǎn)-裝載的瓊脂糖上初始捕獲后純化的物質(zhì);泳道4:N產(chǎn)-裝載的瓊脂糖上最終捕獲前因子Xa處理的物質(zhì)；泳道5=在N產(chǎn)-裝載的瓊脂糖上第二次捕獲后純化的物質(zhì)；泳道6=最終純化的物質(zhì)；泳道7=最終純化的物質(zhì)+DTT;泳道8=標準分子量標記。49圖18-突觸融合蛋白被CPNv-C的剪切背根神經(jīng)節(jié)(DRG)的原始培養(yǎng)物被暴露于各種濃度的CPNv-C中24小時。細胞蛋白通過SDS-PAGE、蛋白質(zhì)印跡分離，并用抗-突觸融合蛋白標記，以促進SNAP-25剪切的評估。被剪切的突觸融合蛋白的百分比通過密度計分析計算。達到50%最大突觸融合蛋白的剪切所需的融合體濃度估計為3.13士1.96nM。圖19-CPN-A在急性辣椒素誘導(dǎo)的機械痛覺異常模型中的效力LC/A-傷害感受肽-Hw/A融合體(CPN/A)抑制急性辣椒素誘導(dǎo)的機械痛覺異常的能力在大鼠后爪的皮下足底內(nèi)注射后被評估。在招入本研究之前(預(yù)處理)，在用CPN/A皮下足底內(nèi)注射后、但在辣椒素刺激之前(Pre-CAP)，和在CPN/A注射后且用辣椒素刺激后(平均反應(yīng)為15'和30';CAP),實驗動物被評估爪在對10gVonFrey纖絲刺激系列(10刺激x3次試驗)的爪回縮頻度(pawwithdrawalfrequency(PWF%))。辣椒素刺激通過10pL的0.3%溶液的注射完成。樣品稀釋物在0.5%的BSA/鹽水中制備。圖20-CPN-A在鏈脲霉素(Streptozotocin(STZ))誘導(dǎo)的外周糖尿病神經(jīng)病變(神經(jīng)病變性疼痛)模型中的效力雄性Sprague-Dawley大鼠(250-300g)用65mg/kg溶解在檸檬酸鹽緩沖液中的STZ處理(I.V.)，并且血糖和脂質(zhì)被每周測量以確定該模型的準備狀態(tài)。爪回縮閾值(PawWithdrawalThreshold(PWT))根據(jù)一段時間內(nèi)響應(yīng)于VonFrey纖絲刺激系列的反應(yīng)被測量。當兩個連續(xù)測量日(間隔l周)的PWT測量在尺度上低于6g時，疼痛異常被稱為已建立。在這時，大鼠被隨機分配到鹽水組(陰性效力對照)、加巴噴丁(Gabapentin)組(陽性效力對照)或測試組(CPN/A)。測試物質(zhì)(20-25pl)作為單一注射劑被皮下注射(不包括加巴噴丁)，并且PWT在治療1天后被測量，并在這之后的兩周時間內(nèi)定期測量。加巴噴丁(30mg/kgi.p.，3ml/kg注射體積)在開始PWT測試之前2小時，被每天注射。圖21-CPNv-A在急性辣椒素誘導(dǎo)的機械痛覺異常模型中的效力LC/A-傷害感受肽變異體-Hw/A融合體(CPNv/A)抑制辣椒素誘導(dǎo)的機械性疼痛異常的能力在大鼠后爪皮下足底內(nèi)注射后被評估。在招入研究之前(預(yù)處理)，在用CPNv/A皮下足底內(nèi)注射后但在辣椒素刺激之前(Pre-CAP)，和在CPN/A注射后且用辣椒素刺激后(平均反應(yīng)為15鄰30';CAP)，實驗動物被評估爪在對10gVonFrey纖絲刺激系列(10刺激x3次試驗)反應(yīng)的爪回縮頻度(PWF%)。辣椒素刺激通過lOpL的0.3%溶液的注射完成。樣品稀釋物在0.5%的BSA/鹽水中制備。這些數(shù)據(jù)被表示為標準化的爪回縮頻度差異，其中峰值反應(yīng)(辣椒素之后)和基線反應(yīng)(辣椒素之前)之間的差異被表示為百分比。用該分析，可以看出CPNv/A比CPN/A更有效，因為達到應(yīng)用CPN/A所看到的相似止痛效果需要較低劑量的CPNv/A。圖22-表達/純化LC/A-CPLE-HN/A產(chǎn)物蛋白在用考馬斯藍染色前接受SDS-PAGE。電泳圖譜表明預(yù)期分子量的CPLE-A的二硫鍵連接雙鏈種類的純化。泳道l=標準分子量標記；泳道2=大腸桿菌總蛋白可溶部分；泳道3=在N產(chǎn)-裝載的瓊脂糖上初始捕獲后純化的物質(zhì)；泳道4=N產(chǎn)-裝載的瓊脂糖上最終捕獲前因子Xa處理的物質(zhì)；泳道5=在N嚴-裝載的瓊脂糖上第二次捕獲后純化的物質(zhì)；泳道6=最終純化的物質(zhì)；泳道7=最終純化的物質(zhì)+DTT。圖23-表達/純化LC/A-CPBE-HN/A產(chǎn)物蛋白在用考馬斯藍染色前接受SDS-PAGE。電泳圖譜表明預(yù)期分子量的CPBE-A的二硫鍵連接的雙鏈種類的純化。泳道l=大腸桿菌總蛋白的可溶部分；泳道2=在N產(chǎn)-裝載的瓊脂糖上初始捕獲后純化的材料；泳道3=在N產(chǎn)-裝載瓊脂糖上最終捕獲前用因子Xa處理的材料；泳道4=用因子Xa(5vil)激活后純化的最終材料；泳道5=用因子Xa(10nl)激活后純化的最終材料；泳道6=用因子Xa(20pl)激活后純化的最終材料；泳道7=用因子Xa+DTT(5pl)激活后純化的最終材料；泳道8=用因子Xa+DTT(l(Hd)激活后純化的最終材料；泳道9=用因子Xa+DTT(2(^1)激活后純化的最終材料；泳道10=標準分子量標記。圖24-表達/純化CPOP-A產(chǎn)物蛋白在用考馬斯藍染色前進行SDS-PAGE。電泳圖譜表明預(yù)期分子量的CPOP-A的二硫鍵連接的雙鏈種類的純化。泳道l=標準分子量標記；泳道2=在N產(chǎn)-裝載的瓊脂糖上初始捕獲后純化的材料；泳道3=在N產(chǎn)-裝載瓊脂糖上最終捕獲前用因子Xa處理的材料；泳道4=在N產(chǎn)-裝載瓊脂糖上第二次捕獲后純化的材料；泳道5=用因子Xa(5nl)激活后純化的最終材料；泳道6=用因子Xa(lO(il)激活后純化的最終材料；泳道7=用因子Xa(20nl)激活后純化的最終材料；泳道8=用因子Xa+DTT(5nl)激活后純化的最終材料；泳道9=用因子Xa+DTT(10nl)激活后純化的最終材料；泳道10=用因子Xa+DTT(20pl)激活后純化的最終材料。圖25-表達/純化CPOPv-A產(chǎn)物52蛋白在用考馬斯藍染色前進行SDS-PAGE。電泳圖譜表明預(yù)期分子量的CPOPv-A的二硫鍵連接的雙鏈種類的純化。泳道1=標準分子量標記；泳道2=大腸桿菌總蛋白的可溶部分；泳道3-在N產(chǎn)-裝載的瓊脂糖上初始捕獲后純化的材料；泳道4=在N產(chǎn)-裝載瓊脂糖上最終捕獲前用因子Xa處理的材料；泳道5=用因子Xa(5pl)激活后純化的最終材料；泳道6=用因子Xa(l(Hil)激活后純化的最終材料；泳道7=用因子Xa(2(^1)激活后純化的最終材料；泳道8=用因子Xa+DTT(5ial)激活后純化的最終材料；泳道9=用因子Xa+DTT(10pl)激活后純化的最終材料；泳道10=用因子Xa+DTT(20pl)激活后純化的最終材料。圖26-DRG細胞模型中SNAP-25的體外剪切背根神經(jīng)節(jié)(DRG)的原始培養(yǎng)物被暴露于各種濃度的CPOPv-A中24小時。細胞蛋白質(zhì)通過SDS-PAGE、蛋白質(zhì)印跡分離，并用抗-SNAP-25標記，以促進SNAP-25剪切的評估。被剪切的SNAP-25的百分比通過密度計量分析計算。圖27-表達/純化CPNv-A-FXa-HT(可去除his-標記)蛋白在用考馬斯藍染色前進行SDS-PAGE。電泳圖樣表明預(yù)期分子量的CPNv-A-FXa-HT的二硫鍵雙鏈種類的純化。泳道1=標準分子量標記；泳道2=大腸桿菌總蛋白的可溶部分；泳道3=在Ni2+-裝載瓊脂糖上最終捕獲前用因子Xa處理的材料；泳道4=用因子Xa激活后純化的最終材料；泳道5=用因子Xa+DTT激活后純化的最終材料。圖28-具有可變間隔長度的LC/A-傷害感受肽-I^/A融合蛋白的體外效力，由配體競爭測試評估可變間隔分子長度的LC/A-傷害感受肽-I^/A融合體結(jié)合ORL,受體的能力使用簡單的基于競爭的測試評估。背根神經(jīng)節(jié)(DRG)的原始培養(yǎng)物在1nM的[3H]-傷害感受肽存在的情況下被暴露于各種濃度的測試材料。放射性標記配體的特異結(jié)合的降低通過閃爍計數(shù)評估，并且與未標記配體(Tocris傷害感受肽)的效力比較繪圖。上圖顯示了GS0、GS20、GS30和Hx27間隔分子的替換特性，而下圖顯示了由GSIO、GS15和GS25間隔的融合蛋白達到的移位。結(jié)論是在傷害感受肽替換0RL1受體方面，GSO和GS30間隔分子是無效的，且GS10是較不有效的。圖29-具有可變間隔長度的LC/A-傷害感受肽-F^/A融合蛋白的體外效力，由體外SNAP-25剪切評估背根神經(jīng)節(jié)(DRG)的原始培養(yǎng)物被暴露于各種濃度的CPN-A(具有可變間隔分子長度)中24小時。細胞蛋白通過SDS-PAGE、蛋白質(zhì)印跡分離，并用抗-SNAP-25標記，以促進SNAP-25剪切的評估。被剪切的SNAP-25的百分比通過密度計量分析計算。GS10間隔的融合蛋白的較不有效的結(jié)合特性(參見圖28)反映為需要較高濃度融合體，以達到細胞內(nèi)SNAP-25的剪切。GSO和GS30間隔的融合蛋白完全無效(數(shù)據(jù)未顯示)。GS15、20和25間隔的融合蛋白差不多一樣有效。SEOIDNOsSEQID1LC/A的DNA序列SEQID2HN/A的DNA序列SEQID3LC/B的DNA序列SEQID4HN/B的DNA序列SEQID5LC/C的DNA序列SEQID6HN/C的DNA序列SEQID7CPN-A接頭的DNA序列SEQID8A接頭的DNA序列SEQID9N-末端呈遞傷害感受肽插入體的DNA序列SEQID10CPN-C接頭的DNA序列SEQID11CPBE-A接頭的DNA序列SEQID12CPNvar-A接頭的DNA序列SEQID13LC/A-CPN-HN/A融合體的DNA序列SEQID14LC/A-CPN-HN/A融合體的蛋白序列SEQID15N-LC/A-HN/A融合體的DNA序列SEQID16N-LC/A-HN/A融合體的蛋白序列SEQID17LC/C-CPN-Hn/C融合體的DNA序列SEQID18LC/C-CPN-Hn/C融合體的蛋白序列SEQID19LC/C-CPN-HN/C(A-接頭)融合體的DNA序列SEQID20LC/C-CPN-HN/C(A-接頭)融合體的蛋白序列SEQID21LC/A-CPME-HN/A融合體的DNA序列SEQID22LC/A-CPME-Hn/A融合體的蛋白序列SEQID23LC/A-CPBE-HN/A融合體的DNA序列SEQID24LC/A-CPBE-HN/A融合體的蛋白序列SEQID25LC/A-CPNv-HN/A融合體的DNA序列SEQID26LC/A-CPNv-HN/A融合體的蛋白序列SEQID27LC/A-CPN[1-11]-HN/A融合體的DNA序列SEQID28LC/A-CPN[1-11]-HN/A融合體的蛋白序列SEQID29LC/A-CPN[[Y10]1-11]-HN/A融合體的DNA序列SEQID30LC/A-CPN[[Y10]1-11]-HN/A融合體的蛋白序列55SEQID31LC/A-CPN[[Y1l]l-l1]-HN/A融合體的DNA序列SEQID32LC/A-CPN[[Y11]1-11]-HN/A融合體的蛋白序列SEQID33LC/A-CPN[[Y14]1-17]-HN/A融合體的DNA序列SEQID34LC/A-CPN[[Y14]1-17]-HN/A融合體的蛋白序列SEQID35LC/A-CPN[1-13]-HN/A融合體的DNA序列SEQID36LC/A-CPN[1-13]-HN/A融合體的蛋白序列SEQID37CPN[1-17]的DNA序列SEQID38CPN[1-17]的蛋白序列SEQID39CPN[1-1l]的DNA序列SEQID40CPN[l-ll]的蛋白序列SEQID41CPN[[Y10]1-11]的DNA序列SEQID42CPN[[YlO]l-ll]的蛋白序列SEQID43CPN[[Yll]l-ll]的DNA序列SEQID44CPN[[Yll]l-ll]的蛋白序列SEQID45CPN[[Y14]1-17]的DNA序列SEQID46CPN[[Y14]1-17]的蛋白序列SEQID47CPN[1-13]的DNA序列SEQID48CPN[1-13]的蛋白序列SEQID49CPNv(也稱作N[[R14K15]1-17])的DNA序列SEQID50CPNv(也稱作N[[R14K15]1-17])的蛋白序列SEQID51傷害感受肽-間隔分子-LC/A-Hn/A融合體的DNA序列SEQID52傷害感受肽-間隔分子-LC/A-hn/A融合體的蛋白序列SEQID53CPN-AGS10接頭的DNA序列SEQID54CPN-AGS15接頭的DNA序列SEQID55CPN-AGS25接頭的DNA序列SEQID56CPN-AGS30接頭的DNA序列56SEQID57CPN-AHX27接頭的DNA序列SEQID58LC/A-CPN(GS15)-HN/A融合體的DNA序列SEQID59LC/A-CPN(GS15)-HN/A融合體的蛋白序列SEQID60LC/A-CPN(GS25)-HN/A融合體的DNA序列SEQID61LC/A-CPN(GS25)-HN/A融合體的蛋白序列SEQID62CPNvar-A腸激酶可激活接頭的DNA序列SEQID63LC/A-CPNv(Ek)-HN/A融合體的DNA序列SEQID64LC/A-CPNv(Ek)-HN/A融合體的蛋白序列SEQID65CPNvar-A接頭的DNA序歹i丄SEQID66LC/C-CPNv-HN/C融合體(act.A)的DNA序列SEQID67LC/C-CPNv-HN/C融合體(act.A)的蛋白序列SEQID68LC/A-CPLE-HN/A融合體的DNA序列SEQID69LC/A-CPLE-HN/A融合體的蛋白序列SEQID70LC/A-CPOP-HN/A融合體的DNA序列SEQID71LC/A-CPOP-Hn/A融合體的蛋白序列SEQID72LC/A-CPOPv-HN/A融合體的DNA序列SEQID73LC/A-CPOPv-Hn/A融合體的蛋白序列SEQID74IgA蛋白酶的DNA序列SEQID75IgA-CPNv-HN/A融合體的DNA序列SEQID76gA-CPNv-HN/A融合體的蛋白序列SEQID77FXa-HT的DNA序列SEQID78CPNv-A-FXa-HT的DNA序列SEQID79CPNv-A-FXa-HT融合體的蛋白序列SEQID80DT轉(zhuǎn)運區(qū)域的DNA序列SEQID81CPLE-DT-A的DNA序列SEQID82CPLE-DT-A融合體的蛋白序列SEQID83TeNTLC的DNA序列SEQID84CPNv-TENTLC的DNA序列SEQID85CPNV-TeNTLC融合體的蛋白序列SEQID86CPNvar-C接頭的DNA序列SEQID87LC/C-CPNv-HN/C融合體(act.C)的DNA序列SEQID88LC/C-CPNv-HN/C融合體(act.C)的蛋白序列實施例實施例1-LC/A和HN/A骨架克隆的制備以下步驟產(chǎn)生了用作多區(qū)域融合表達物組分骨架的LC和Hn片段。本實施例基于血清型A基克隆(SEQID1和SEQID2)的制備，雖然該過程和方法可以同等地應(yīng)用于其它血清型[由血清型B(SEQID3和SEQID4)和血清型C(SEQID5和SEQID6)的序列表所示例說明]?？耍梯d鄉(xiāng)敘備pCR4(Invitrogen)被選為標準克隆載體，其被選擇是由于在載體和相鄰的測序引物位點內(nèi)缺少限制性序列，以便用于構(gòu)建體容易確認。表達載體基于pMAL(NEB)表達載體，其在多克隆位點內(nèi)具有正確順序的期望限制性序列，用以構(gòu)建體插入(^^^1-^/1-/^1-歷"(1111)。表達載體的片段已經(jīng)被移除，以產(chǎn)生不可移動的質(zhì)粒，并且多種不同的融合標簽已經(jīng)被插入，以增加純化的選擇方案。^^糜0^/7丄C60薪A沐游敘備LC/A(SEQIDl)通過以下兩種方式之一產(chǎn)生該DNA序列通過LC/A氨基酸序列[從免費可用的數(shù)據(jù)庫來源，如GenBank(登錄號P10845)或Swissprot(登陸基因座BXA1—CLOBO)獲得，使用多種反向翻譯軟件工具之一(例如，EditS叫bestE.colireversetranslation(DNASTARInc,)或Backtranslationtoolv2.0(Entelechon))]的反向翻譯設(shè)計。&附^//5<3//識別序列分別被插入該序列的5'和3'端，58保持正確的讀碼框。DNA序列針對反向翻譯過程中被插入的限制性酶剪切序列被篩選(使用諸如MapDraw,DNASTARInc.的軟件)。被發(fā)現(xiàn)對克隆系統(tǒng)要求的那些常見的任意剪切序列，從提議的編碼序列中被手工移除，所述編碼序列保證了常見大腸桿菌密碼子選擇(使用)被保持。大腸桿菌密碼子選擇通過軟件程序，如GraphicalCodonUsageAnalyser(Geneart)被評估，并且。/。GC含量和密碼子使用比例通過參考公開的密碼子使用表(例如，GenBankRelease143，2004年9月13曰)來評估。含有LC/A開放讀碼框的，優(yōu)化的DNA序列隨后被商業(yè)合成(例如，通過Entelechon，Geneart或Sigma-Genosys)，并在pCR4載體中被提供?？蛇x的方法是使用BamHI和Sail限制性酶序列分別插入5'和3'端的PCR引物，對已存在的DNA序列使用PCR擴增。互補的寡核苷酸引物由供應(yīng)商(如MWG或Sigma-Genosys)化學合成，以便每個引物具有與梭菌目標DNA伸展側(cè)翼的相反鏈(其3'端彼此"相對")雜交的能力，一個寡核苷酸對應(yīng)兩條DNA鏈的每一個。要產(chǎn)生PCR產(chǎn)物，一對特異針對梭菌DNA序列的短寡核苷酸引物與梭菌DNA模板和其它反應(yīng)組分混合，并被置于能夠自動改變反應(yīng)試管溫育溫度的儀器中("PCR儀")，該儀器的溫度在約9《C(用于變性)、55°C(用于寡核苷酸退火)和72匸(用于合成)之間循環(huán)。用于PCR產(chǎn)物擴增要求的其它試劑包括DNA聚合酶(如或P/w聚合酶)，等摩爾量(50-200|iM)的四種核苷酸dNTP——DNA構(gòu)建單元，和適合該酶、對Mg&濃度(0.5-5mM)優(yōu)化的緩沖液。擴增產(chǎn)物被克隆進pCR4，使用用于71^PCR產(chǎn)物的TOPOTA克隆，或用于尸/wPCR產(chǎn)物的ZeroBluntTOPO克隆(兩種試劑盒都可從Invitrogen購買)。產(chǎn)生的克隆通過測序檢查。與該克隆系統(tǒng)不相容的任意其它限制性序列隨后使用位點定向誘變[例如，使用Quickchange(StratageneInc.)]被除去。総0^7//aJ薪A赫劍備Hw/A(SEQID2)通過以下兩種方式之一產(chǎn)生該DNA序列通過HN/A氨基酸序列[從免費可用的數(shù)據(jù)庫來源，如GenBank(登錄號P10845)或Swissprot(登陸基因座BXA1—CLOBO)獲得，使用多種反向翻譯軟件工具之一(例如，EditSeqbest￡.co//reversetranslation(DNASTARInc.)或Backtranslationtoolv2.0(Entelechon))]的反向翻譯設(shè)計。/MI限制性序列被加入N-末端，并且WaI-終止子-///"dill被加入C-末端以保證正確的讀碼框被保持。DNA序列針對反向翻譯過程中被插入的限制性酶剪切序列被篩選(使用諸如MapDmw,DNASTARInc.的軟件)。被發(fā)現(xiàn)對克隆系統(tǒng)要求的那些常見的任意序列，從提議的編碼序列中被手工移除，所述編碼序列保證了常見大腸桿菌密碼子使用被保持。大腸桿菌密碼子使用通過軟件程序，如GraphicalCodonUsageAnalyser(Geneart)被評估，并且。/。GC含量和密碼子使用比例通過參閱公開的密碼子使用表(例如，GenBankRelease143，2004年9月13日)來評估。優(yōu)化的DNA序列隨后被商業(yè)合成(例如，通過Entelechon,Geneart或Sigma-Genosys)，并在pCR4載體中被提供?？蛇x的方法是對已存在的DNA序列使用PCR擴增，并以i^I和^1-終止子-歷"(1111限制性酶序列分別插入到5'和3'端的PCR引物中。PCR擴增按上文所述進行。PCR產(chǎn)物被插入pCR4載體并通過測序檢查。與該克隆系統(tǒng)不相容的任意其它限制性序列隨后使用位點定向誘變[例如，使用Quickchange(Stratagenelnc.)]被除去。實施例2-LC/A-傷害感受肽-I^/A融合蛋白的制備(傷害感受肽是HN-鏈的N-末端)敘-娜好薪乂欽,備LC-HN接頭可以根據(jù)第一原則，使用已存在的用于接頭作為模板的序列信息被設(shè)計。例如，血清型A接頭(在這種情況下，被定義為存在于LC和Hw之間的二硫鍵橋的半胱氨酸之間的區(qū)域間的多肽區(qū)域)是23個氨基酸的長度，并且具有序列VRGIITSKTKSLDKGYNKALNDL。在該序列中，應(yīng)該理解，天然的蛋白水解激活產(chǎn)生了具有N-末端序列ALNDL的HN區(qū)域。這一序列信息可免費地從可用數(shù)據(jù)庫資源獲得，如GenBank(登錄號P10845)或Swissprot(登陸基因座BXA1—CLOBO)。在該接頭內(nèi)，插入了因子Xa位點、傷害感受肽和間隔分子；并使用多種反向翻譯軟件工具[例如，EditSeqbestco//reversetranslation(DNASTARInc.)或Backtranslationtoolv2.0(Entelechon)]，確定編碼接頭-配體-間隔分子區(qū)域的DNA序列。限制性位點隨后被插入DNA序列，并能夠被排列為5amffl-^/I-接頭-蛋白酶位點-傷害感受肽-iV/^I-間隔分子-^el-Afl-^al-終止子-州"dIII(SEQID7)。重要的是確保用于間隔分子、傷害感受肽和限制性序列的正確讀碼框被保持，和^al序列前面沒有堿基，TC;如果這樣的話，可能導(dǎo)致DAM甲基化。DNA序列針對限制性序列的插入被篩選，并且任何其它序列從剩余的序列中被手工移除，以保證了常見大腸桿菌密碼子使用被保持。大腸桿菌密碼子使用通過軟件程序，如GraphicalCodonUsageAnalyser(Geneart)被評估，并且。/。GC含量和密碼子使用比例通過參考公開的密碼子使用表(例如，GenBankRelease143，2004年9月13日)來評估。優(yōu)化的DNA序列隨后被商業(yè)合成(例如，通過Entelechon，Geneart或Sigma-Genosys)，并在pCR4載體中被提供。丄G^-傷害感受嚴-7/A/4激合體游劍備為了產(chǎn)生LC-接頭-傷害感受肽-間隔分子-Hw構(gòu)建體(SEQID13)，編碼接頭(SEQID7)的pCR4載體用5,HI+Sa/I限制性酶剪切。剪切的載體隨后作為接受載體，用于被5amHI+Sa/I剪切的LC/ADNA(SEQID1)的插入和連接。產(chǎn)生的質(zhì)粒DNA隨后用PWl+Wal限制性酶剪切，并作為接受載體，用于被尸WI+^aI剪切的HN/ADNA(SEQID2)的插入和連接。最終的構(gòu)建體包含LC-接頭-傷害感受肽-間隔分子-HwORF(SEQIDB)，用于轉(zhuǎn)染進表達載體進行表達，以產(chǎn)生SEQID14所示序列的融合蛋白。實施例3-傷害感受肽-LC/A-EWA融合蛋白的制備(傷害感受肽是LC-鏈的N-末端)LC/A-KWA骨架按照實施例2所述，使用帶有用于激活的因子Xa加入的合成的A血清型接頭被構(gòu)建，排列為萬"附111-&/1-接頭-61蛋白酶位點-接頭-尸"I-J^al-終止子-歷"din(SEQID8)。LC/A-HN/A骨架及合成的N-末端呈遞傷害感受肽插入體(SEQID9)用BomHI+限制性酶剪切，其被凝膠純化并連接到一起，以產(chǎn)生傷害感受肽-間隔分子-LC-接頭-HN。該ORF(SEQID15)隨后用限制性酶^val十;^al切出，用于轉(zhuǎn)染進表達載體中表達，以產(chǎn)生SEQID16所示序列的融合蛋白。實施例4-LC/C-傷害感受肽-HN/C融合蛋白的制備按照實施例1和2中使用的方法，LC/C(SEQID5)和HN/C(SEQID6)被產(chǎn)生并被插入C血清型接頭，排列為SamHI-Sa/I-接頭-蛋白酶位點-傷害感受肽間隔分子-5^I-i^I-^>aI-終止子-歷"dIII(SEQIDIO)。最終的構(gòu)建體包含LC-接頭-傷害感受肽-間隔分子-HwORF(SEQID17)，用于轉(zhuǎn)染進表達載體表達，以產(chǎn)生SEQID18所示序列的融合蛋白。實施例5-帶有血清型A激活序列的LC/C-傷害感受肽-HN/C融合蛋白的制備按照實施例1和2中使用的方法，LC/C(SEQID5)和HN/C(SEQID6)被產(chǎn)生并被插入A血清型接頭，排列為&附111-&/1-接頭-蛋白酶位點-傷害感受肽間隔分子終止子-州"dIII(SEQID7)。最終的構(gòu)建體包含LC-接頭-傷害感受肽-間隔分子-HNORF(SEQID19)，用于轉(zhuǎn)染進表達載體表達，以產(chǎn)生SEQID20所示序列的融合蛋白。實施例6-LC/A-met腦啡肽-HN/A融合蛋白的純化由于小的，5個氨基酸的，met-腦啡肽配體的尺寸，LC/A-met腦啡肽-H^A融合體通過位點定向誘變[例如，使用Quickchange(StratageneInc.)]，使用LC/A-傷害感受肽-HN/A融合體(SEQID13)作為模板產(chǎn)生。編碼YGGFMmet-腦啡肽的肽的寡核苷酸被設(shè)計，保證標準大腸桿菌密碼子的使用被保持，并且沒有其它限制性酶位點被插入，由與LC/A-傷害感受肽-Hw/A融合體任意一側(cè)上傷害感受肽部分的接頭區(qū)域互補的序列在其側(cè)翼。SDM產(chǎn)物通過測序檢查，并且最終的構(gòu)建體包含LC-接頭-met腦啡肽-間隔分子-HwORF(SEQID21)用以表達SEQID22所示序列的蛋白。實施例7-LC/A-p內(nèi)啡肽-I^/A融合蛋白的制備按照實施例1和2中使用的方法，LC/A(SEQID1)和Hn/A(SEQID2)被產(chǎn)生并被插入A血清型(3內(nèi)啡肽接頭，排列為^3wHI-Sa/I-接頭-蛋白酶位點-卩內(nèi)啡肽-MzeI-間隔分子-5^1-尸"1￥^1-終止子-歷"dIII(SEQIDll)。最終的構(gòu)建體包含LC-接頭-P內(nèi)啡肽-間隔分子-HnORF(SEQID23)，用以表達SEQID24所示序列的蛋白。實施例8-LC/A-傷害感受肽變異體-I^/A融合蛋白的制備按照實施例1和2中使用的方法，LC/A(SEQID1)和HN/A(SEQID2)被產(chǎn)生并被插入A血清型傷害感受肽變異體接頭，排列為&mHI-&z/I-接頭-蛋白酶位點-傷害感受肽變異體-A^el-間隔分子-5^1-尸對1-^^1-終止子-歷"(1111(SEQID12)。最終的構(gòu)建體包含LC-接頭-傷害感受肽變異體-間隔分子-HNORF(SEQID25)，用以表達SEQID26所示序列的蛋白。實施例9-LC/A-傷害感受肽-Hw/A融合蛋白的純化方法解凍裝有25ml50mMHEPESpH7.2、200mMNaCl和大約10g大腸桿菌BL21細胞漿(cellpaste)的falcon管。用50mM的HEPESpH7.2、200mM的NaCl將融解的細胞漿補充到80ml，并在以22微米的功率冰上超聲波處理，30秒開，30秒關(guān)，IO個循環(huán)，以保證樣品保持冷凍。在4。C，18000rpm下，離心裂解的細胞30分鐘。將上清液加樣到用50rnMHEPESpH7.2、200mMNaCl平衡的，裝有0.1MNiS04的螯合柱上(20-30ml的柱是足夠的)。使用10到40mM咪唑的濃度梯度洗去非特異結(jié)合的蛋白，并用100mM咪唑洗脫融合蛋白。用5L的50rnMHEPESpH7.2、200mMNaCl在4。C滲析洗脫的融合蛋白過夜，并測量滲析的融合蛋白的0D。每100pg融合蛋白中加入1個單位的因子Xa，并在25"C穩(wěn)定溫育過夜。加樣到用50mMHEPESpH7.2、200mMNaCl平衡的，裝有0.1MNiS04的螯合柱上(20-30ml的柱足夠)。用50mMHEPESpH7.2、200mMNaCl清洗該柱到基線。使用10到40mM咪唑的濃度梯度洗去非特異結(jié)合的蛋白，并用100mM咪唑洗脫融合蛋白。用5L的50mMHEPESpH7.2、200mMNaCl在4°C透析洗脫的融合蛋白過夜，并濃縮該融合體到約2mg/ml，將樣品分成等量小樣并在-20。C冷凍。用OD、BCA、純度分析和SNAP-25評估測試純化的蛋白。實施例10-通過測量P物質(zhì)從神經(jīng)元細胞培養(yǎng)物中的釋放確定TM激動劑的活性糊P物質(zhì)EIA從R&DSystems,UK獲得。方法eDRG的原代神經(jīng)元培養(yǎng)物按前述(Duggan2002)建立。P物質(zhì)從培養(yǎng)物中的釋放通過EIA，基本根據(jù)前述(Duggan"a/.,2002)評估。目標TM被加入神經(jīng)元培養(yǎng)物(處理前至少2周建立)；64對照培養(yǎng)物通過加入載體代替TM平行進行。對照和TM處理的培養(yǎng)物的P物質(zhì)的刺激UOOmMKC1)和基線釋放，與總細胞裂解物含量一起獲得。P物質(zhì)的免疫反應(yīng)性使用P物質(zhì)酶免疫測試試劑盒(SubstancePEnzymeImmunoassayKits)(CaymanChemicalCompany,USAorR&DSystems,UK)，根據(jù)制造商的說明測量。神經(jīng)元細胞在目標TM存在的情況下釋放P物質(zhì)的量，與存在和不存在lOOmMKCl的情況下獲得的釋放比較。由上述目標TM刺激產(chǎn)生的P物質(zhì)釋放與基線釋放表明，目標TM是如本說明書中定義的"激動劑配體"。如果希望，由目標TM刺激產(chǎn)生的P物質(zhì)釋放可以與用天然ORL-1受體配體，傷害感受肽(Tocris)產(chǎn)生的標準P物質(zhì)釋放曲線比較。實施例11—通過測量福斯高林(forskolin)刺激的cAMP生產(chǎn)確認ORI^受體激活通過以下測試提供了給定TM通過ORI^受體被激活的確認，其中TMs抑制福斯高林刺激的cAMP生產(chǎn)的能力被評估。[3H]腺嘌呤和["C]cAMP從GEHealthcare獲得膽測試基本上按照Meunier"a/.[Isolationandstructureoftheendogenousagonistofopioidreceptor-likeORLireceptor.Nature377:532-535,1995]的先前所述予以進行，是在完整的，在24孔塑料盤中接種的，被轉(zhuǎn)染的CHO細胞中進行。向所述細胞中以0.4ml培養(yǎng)基的形式加入[3H]腺嘌呤(1.0^Ci)。細胞在37i:保存2小時，以允許腺嘌呤進入細胞內(nèi)ATP池。2小時后，細胞用溫育緩沖液清洗一次，該緩沖液含有130mMNaCI、4.8mMKC1、1.2mMKH2P04、1.3mMCaCl2、1.2mMMgS04、10mM葡萄糖、lmg/ml牛血清白蛋白和25mMHEPESpH7.4，并用含有福斯高林(10pM)和異丁基甲基黃嘌呤(50nM)在含有和不含目標TM的情況下進行替換。10分鐘后，培養(yǎng)基被吸出并用0.5ml的0.2MHCl代替。大約1000cpm的["C]cAMP被加入每個孔，并被用作內(nèi)部標準?？字械膬?nèi)含物隨后被轉(zhuǎn)移到0.65g干燥鋁粉的柱中。該柱用4ml的5mMHC1、0.5ml的0.1M醋酸銨，隨后額外2毫升的醋酸銨洗脫。最終的洗脫物被收集到閃爍管中并對"C和氚計數(shù)。收集的量針對["C]cAMP的恢復(fù)被修正。ORL，受體激動劑的TMs引起由福斯高林反應(yīng)產(chǎn)生的cAMP水平的降低。實施例12-使用GTPYS結(jié)合功能測試確認OR"受體激活給定TM通過OR"受體作用的確認也由以下測試，GTPyS結(jié)合功能測試提供。微[35S]GTPYS從GEHealthcare獲得小麥芽凝集素包被(Wheatgermagglutinin-coated(SPA))的珠從GEHealthcare獲得誠本測試基本上根據(jù)Traynor禾BNahorski[Modulationby(i畫opioidagonistsofguanosine扁5-0-(3-[S]thio)triphosphatebindingtomembranesfromhumanneuroblastomaSH-SY5Ycells.Mol.Pharmacol.47:848-854,1995]所述進行。細胞從組織培養(yǎng)盤中被刮入20mMHEPES、lmM乙二胺四乙酸中，隨后500xg離心10分鐘。細胞被重懸浮在該緩沖液中，并用Polytron勻質(zhì)器(Homogenizer)均一化。勻漿在27，000xg離心15分鐘，并且沉淀物在緩沖液A中重懸浮，該緩沖液含有20mMHEPES、10mMMgCl2、100mMNaCl,pH7.4。懸液在20，000xg離心并再次被懸浮在緩沖液A中。對于結(jié)合測試，膜(8-15叫蛋白)與[35S]GTPS(50pM)、GDP(10pM)，在含有和不含目標TM的情況下，在總體積1.0ml中25t溫育60分鐘。樣品在玻璃纖維過濾器中被過濾，并根據(jù)結(jié)合測試中所述計數(shù)。66實施例13-LC/A-傷害感受肽-Hw/A融合蛋白的制備(傷害感受肽是Hw-鏈的N-末端)接頭-傷害感受肽-間隔分子插入體按實施例2所述制備。丄0^-傷夢感受嚴-//;/4巌合沐游敘備為了產(chǎn)生LC-接頭-傷害感受肽-間隔分子-Hw構(gòu)建體(SEQID13)，編碼接頭(SEQID7)的pCR4載體用Sa加HI+限制性酶剪切。剪切的載體隨后作為接受體，用于被SamHI+^/I剪切的LC/ADNA(SEQID1)的插入和連接。產(chǎn)生的質(zhì)粒DNA隨后被SamHI+///"dl1限制性酶剪切，并且LC/A-接頭片段被插入到被相似剪切的載體中，該載體包含Bamffl、Afl和州wdn的獨特多克隆位點，如pMAL載體(NEB)。HN/ADNA(SEQID2)隨后被尸"I+限制性酶剪切，并被插入被相似剪切的pMAL-LC/A-接頭構(gòu)建體。最終的構(gòu)建體包含LC-接頭-傷害感受肽-間隔分子-HNORF(SEQID13)，用于轉(zhuǎn)染進表達載體表達，以產(chǎn)生SEQID14所示序列的蛋白。實施例14-傷害感受肽-LC/A-HN/A融合蛋白的制備(傷害感受肽是LC-鏈的N-末端)為了產(chǎn)生傷害感受肽-間隔分子-LC/A-H^A構(gòu)建體，使用帶有用于激活的因子Xa加入的A血清型接頭，排列為5amHI-^/I-接頭-蛋白酶位點-接頭-尸"1-^^1-終止子-///"犯1(8￡(^108)，按實施例13所述被合成。編碼該接頭的pCR4載體用SamHI+&/I限制性酶剪切。剪切的載體隨后作為接受體，用于被5amHI+剪切的LC/ADNA(SEQID1)的插入和連接。產(chǎn)生的質(zhì)粒DNA隨后被^mHI+/f!'"^ni限制性酶剪切，并且LC/A-接頭片段被插入被相似剪切的載體，該載體包含合成的N-末端呈遞的傷害感受肽插入體(SEQID9)。該構(gòu)建體隨后用/4val+剪切，并被插入表達載體，如pMAL質(zhì)粒(NEB)。HN/ADNA(SEQID2)隨后被PWI+限制性酶剪切，并被插入被相似剪切的pMAL-傷害感受肽-LC/A-接頭構(gòu)建體。最終的構(gòu)建體包含傷害感受肽-間隔分子-LC/A-HN/AORF(SEQID51)，用于轉(zhuǎn)染進表達載體表達，以產(chǎn)生SEQID52所示序列的蛋白質(zhì)。實施例15-具有可變間隔長度產(chǎn)物的LC/A-傷害感受肽-Hw/A融合蛋白家族的表達和純化使用如實施例2中采用的策略，一系列編碼傷害感受肽和間隔分子的DNA接頭被制備。使用多種反向翻譯軟件工具之一[例如，EditSeqbestco//reversetranslation(DNASTARInc.)或Backtranslationtoolv2.0(Entelechon)]，編碼接頭-配體-間隔分子區(qū)域的DNA序列被確定。限制性位點隨后被插入DNA序列，并能夠被排列為BamHInSWI-接頭-蛋白酶位點-傷害感受肽-A%el-間隔分子-S^I-PM-^Z^I-終止子-歷"dIII(SEQID53到SEQID57)。重要的是確保用于間隔分子、傷害感受肽和限制性序列的正確讀碼框被保持，和^Z>d序列的前面沒有堿基TC;如果有堿基TC的話，可能導(dǎo)致DAM甲基化。DNA序列針對限制性序列的插入被篩選，并且任何其它序列從剩余的序列中被手工移除，以保證了常見大腸桿菌密碼子使用被保持。大腸桿菌密碼子使用通過軟件程序，如GraphicalCodonUsageAnalyser(Geneart)被評估，并且n/。GC含量和密碼子使用比例通過參考公開的密碼子使用表(例如，GenBankRelease143，2004年9月13日)來評估。優(yōu)化的DNA序列隨后被商業(yè)合成(例如，通過Entelechon，Geneart或Sigma-Genosys)，并在pCR4載體中被提供。所產(chǎn)生的間隔分子包括:編碼接頭的蛋白序列接頭DNA的SE(JIDGS10ALAGGGGSALVLQ53GS15ALAGGGGSGGGGSALVLQ54GS25ALAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSALVLQ55GS30ALAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSALVLQ56HX27ALAAEAAAKEAAAKEAAAKAGGGGSALVLQ57表l68通過實施例的方式，為了產(chǎn)生LC/A-CPN(GS15)-HN/A融合構(gòu)建體(SEQID58)，編碼接頭(SEQID54)的pCR4載體用BamHI+&/I限制性酶剪切。剪切的載體隨后作為接受體，用于被^^mHI+&/1剪切的LC/ADNA(SEQID1)的插入和連接。產(chǎn)生的質(zhì)粒DNA隨后被Sa附HI+///"dl1限制性酶剪切，并且LCZA-接頭片段被插入被相似剪切的載體，該載體包含j^mHI、i^I和/7/m/in獨特的多克隆位點，如pMAL載體(NEB)。HN/ADNA(SEQID2)隨后被尸"I+限制性酶剪切，并被插入被相似剪切的pMAL-LC/A-接頭構(gòu)建體。最終的構(gòu)建體包含LC/A-CPN(GS15)-HN/AORF(SEQID58)，用于表達SEQID59所示序列的蛋白。作為一個進一步的實例，要產(chǎn)生LC/A-CPN(GS25)-HN/A融合構(gòu)建體(SEQID60),編碼接頭(SEQID55)的pCR4載體用5，HI+限制性酶剪切。剪切的載體隨后作為接受載體，用于被^mffl+剪切的LC/ADNA(SEQID1)的插入和連接。產(chǎn)生的質(zhì)粒DNA隨后被^W2HI+i/z'"cffll限制性酶剪切，并且LC/A-接頭片段被插入被相似剪切的載體，該載體包含SamHI、尸MI和//z'"dl1獨特的多克隆位點，如pMAL載體(NEB)。HN/ADNA(SEQID2)隨后被尸"I+歷"Jin限制性酶剪切，并被插入被相似剪切的pMAL-LC/A-接頭構(gòu)建體。最終的構(gòu)建體包含LC/A-CPN(GS25)-HN/AORF(SEQID60)，用于表達SEQID61所示序列的蛋白。含有GSIO、GS30和HX27的LC/A-CPN-HN/A融合體的變異體被相似地構(gòu)建。使用實施例9所述的純化方法，融合蛋白從大腸桿菌細胞漿中被純化。圖9顯示了在LC/A-CPN(GS10)-HN/A、LC/A-CPN(GS15)-HN/A、LC/A-CPN(GS25)-HN/A、LC/A-CPN(GS30)-HN/A和LC/A-CPN(HX27)-HN/A情況下獲得的純化廣叩o實施例16-LC/A-傷害感受肽-Hw/A融合體的體外活性的評估根據(jù)實施例2和9制備的融合蛋白在eDRG神經(jīng)元細胞模型中被評估。P物質(zhì)釋放和SNAP-25剪切抑制的評估已經(jīng)在此前報告(Dugganea/"2002，J編.C/z亂，277，34846-34852)。簡單地說，背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元從15天大的胎兒Sprague-Dawley大鼠中收集，并且分離的細胞以lxl06細胞/孔的密度在Matrigel包被的24孔板中接種。接種一天后，細胞用lOpM胞嘧啶(3-D-呋喃阿拉伯糖苷(arabinofUranoside)處理48小時。細胞被保存在補充有5%熱失活的胎牛血清、5mML-谷氨酰胺、0.6%D-葡萄糖、2%B27補充劑和100ng/ml2.5S小鼠神經(jīng)生長因子的Dulbecco，s基本必須培養(yǎng)基中。力口入測試物質(zhì)前，培養(yǎng)被保持在37。C，95%空氣/5%(:02的環(huán)境中2周。P物質(zhì)從eDRG的釋放由酶聯(lián)免疫吸收測試(enzyme-linkedimmunosorbentassay)評估。簡單地說，eDRG細胞用低鉀平衡的鹽溶液(BSS:5mMKC1、137rnMNaCl、1.2mMMgCl2、5mM葡萄糖、0.44mMKH2P04、20mMHEPES,pH7.4、2mMCaCl2)沖洗兩次?；€樣品通過用lml的低鉀BBS溫育每個孔5分鐘獲得。去除該緩沖液后，細胞通過與lml高鉀緩沖液(如上述BBS，修改為包括用NaCl等滲平衡的100mMKCl)溫育被刺激以釋放。稀釋的樣品被評估P物質(zhì)的含量。P物質(zhì)的免疫反應(yīng)性使用P物質(zhì)酶免疫測試試劑盒(SubstancePEnzymeImmunoassayKits)(CaymanChemicalCompany或R&DSystems),根據(jù)制造商的說明測量。P物質(zhì)被表示為相對于平行進行的標準P物質(zhì)曲線的pg/ml。SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡分析使用標準的步驟(Novex)進行。SNAP-25蛋白在12%的Tris/甘氨酸聚丙烯酰胺凝膠(Novex)上分離并隨后被轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。該膜用識別受剪切的和完整的SNAP-25的單克隆抗體(SMI-81)檢測。特異結(jié)合使用過氧化物酶偶聯(lián)的二抗和化學熒光檢測系統(tǒng)觀察。SNAP-25的剪切通過掃描密度計(MolecularDynamicsPersonalSI，ImageQuant數(shù)據(jù)分析軟件)量化。SNAP-25剪切的百分比根據(jù)下式計算(剪切的SNAP-25/(剪切的+完整的SNAP-25))x100。eDRG神經(jīng)元暴露于LC/A-傷害感受肽-HN/A融合體(稱作CPN-A)后，P物質(zhì)釋放和SNAP-25的剪切的抑制均被觀察到(圖10)。暴露于融合體24小時后，最大SNAP-25剪切的50%通過融合體濃度70為6.3士2.5nM而達到。該融合體的效果也在eDRG暴露于CPN-A16小時后在確定的時間點評估。圖11顯示了CFN-A融合蛋白延長的作用時間，可測量活性在暴露后28天仍可被觀察到。實施例17-LC/A-傷害感受肽變異體-Hw/A融合體的體外活性的評估根據(jù)實施例8和9制備的融合蛋白使用實施例16所述的方法，在eDRG神經(jīng)元細胞模型中被評估。eDRG神經(jīng)元暴露于LC/A-傷害感受肽變異體-HWA融合體(稱作CPNv-A)后，P物質(zhì)釋放和SNAP-25的剪切之抑制均被觀察到。暴露于融合體24小時后，最大SNAP-25剪切的50%通過融合體濃度1.4土0.4nM達到(圖12)。該融合體的效果也在eDRG暴露于CPN-A16小時后在確定的時間點評估。圖13顯示了CPN-A融合蛋白延長的作用時間，可測量活性在暴露后24天仍可被觀察到。CPNv-A融合蛋白的結(jié)合能力也與CPN-A融合體比較評估。圖14顯示了競爭實驗確定在0RL-1受體結(jié)合效力的結(jié)果。CPNv-A被顯示替代了[3H]-傷害感受肽，由此確定了用中央呈遞形式的配體可能到達該受體。實施例18—通過腸激酶處理激活的LC/A-傷害感受肽變異體-HN/A融合蛋白的制備按照實施例1和2中使用的方法，LC/A(SEQID1，HN/A(SEQID2)被產(chǎn)生并被插入A血清型傷害感受肽變異體接頭，排列為B。mffl-^/I-接頭-腸激酶蛋白酶位點-傷害感受肽變異間隔分子-5^I-尸WlY&al-終止子-歷dni(SEQID62)。最終的構(gòu)建體包含LC-接頭-傷害感受肽變異體-間隔分子-HNORF序列(SEQID63)，用以表達SEQID64所示序列的蛋白。該融合蛋白被稱為CPNv(Ek)-A。圖15顯示了根據(jù)實施例9中使用的方法，但使用每100pg融合蛋白0.00064嗎腸激酶激活，從大腸桿菌中純化CPNv(Ek)-A。實施例19—已經(jīng)通過腸激酶處理激活的LC/A-傷害感受肽變異體-HN/A融合體體外效力的評估實施例18中制備的CPNv(Ek)-A以純化的形式獲得，并且被加樣到eDRG細胞模型以評估SNAP-25的剪切(使用實施例16的方法)。圖16顯示了eDRG暴露于CPNv(Ek)-A24小時后SNAP-25的剪切。剪切效率據(jù)觀察與實施例17中記載的，使用因子Xa剪切物質(zhì)所達到的效率相似。實施例20-帶有從血清型A衍生的因子Xa激活接頭的LC/C-傷害感受肽變異體-Hp^/C融合蛋白的制備按照實施例4中使用的方法，LC/C(SEQID5)和Hn/C(SEQID6)被產(chǎn)生并被插入A血清型股啡肽變異體接頭，排列為5awHI-&/I-接頭-傷害感受肽變異體-涵61-間隔分子-印61-/^1-^^1-終止子-///"(1111(SEQID65)。最終的構(gòu)建體包含LC-接頭-傷害感受肽變異體-間隔分子-HNORF序列(SEQID66),用以表達SEQID67所示序列的蛋白。該融合蛋白被稱為CPNv-C(act.A)。圖17顯示了CPNv-C產(chǎn)物(act.A)按照實施例9中使用的方法從大腸桿菌中純化。實施例21-LC/C-傷害感受肽變異體-Hw/C融合蛋白體外效力的評估根據(jù)實施例9使用的方法，實施例20中制備的CPNv-C(act.A)以純化的形式獲得，并且被加樣到eDRG細胞模型以評估SNAP-25的剪切(使用實施例16的方法)。暴露于融合體24小時后，最大SNAP-25剪切的50%通過融合體濃度3.1±2.0nM達到。圖18顯示了eDRG暴露于CPNv-C(act.A)24小時后，突觸融合蛋白的剪切。實施例22-LC/A-傷害感受肽-Hw/A融合體的體內(nèi)活性的評估LC/A-傷害感受肽-IVA融合體(CPN/A)抑制急性辣椒素誘導(dǎo)的機械痛覺異常的能力，在大鼠后爪的皮下足底內(nèi)注射后被評估。在招入研究之前(預(yù)處理)，在用CPN/A皮下足底內(nèi)注射后但在辣椒素刺激之前(Pre-CAP)，和在CPN/A注射后且用辣椒素刺激后(平均反應(yīng)為15'和30';CAP),實驗動物被評估對10gVonFrey纖絲刺激系列72(10剌激x3次試驗)的爪回縮頻度(PWF%)。辣椒素剌激通過lOpL的0.3%溶液的注射完成。樣品稀釋物在0.5。/。的BSA/鹽水中制備。圖19顯示了通過用一系列濃度的LC/A-傷害感受肽-HN/A融合體對動物預(yù)處理達到的機械性痛覺異常的逆轉(zhuǎn)。LC/A-傷害感受肽-Hw/A融合體(CPN/A)抑制鏈脲酶素(STZ)在大鼠中誘導(dǎo)的機械性痛覺異常的能力，被評估。STZ-誘導(dǎo)的大鼠機械性痛覺異常通過鏈脲酶素的注射(i.p.或i.v.)達到，鏈脲酶素導(dǎo)致胰腺P細胞的解體和伴隨的代謝壓力(高血糖癥和高血脂癥)，(3細胞的解體導(dǎo)致胰島素產(chǎn)生的缺失。因此，STZ誘導(dǎo)I型糖尿病。此外，STZ處理導(dǎo)致神經(jīng)病變的逐步發(fā)展，其發(fā)揮帶有痛覺過敏和痛覺異常的慢性疼痛的模型，其可能反映了糖尿病患者中觀察到的標志(外周糖尿病神經(jīng)痛)。雄性Sprague-Dawley大鼠(250-300g)用65mg/kg溶解在擰檬酸鹽緩沖液中的STZ處理(I.V.)，并且血糖和脂質(zhì)被每周測量以確定該模型的準備狀態(tài)。爪回縮閾值(PWT)根據(jù)一段時間內(nèi)響應(yīng)于VonFrey纖絲刺激系列的反應(yīng)被測量。當兩個連續(xù)測量日(間隔1周)的PWT測量在尺度上低于6g時，疼痛異常被稱為已建立。在這時，大鼠被隨機分配到鹽水組(陰性效力對照)、加巴噴丁(Gabapentin)組(陽性效力對照)或測試組(CPN/A)。測試物質(zhì)(20-25jul)作為單一注射劑被皮下注射(不包括加巴噴丁)，并且PWT在治療1天后被測量，并在這之后的兩周時間內(nèi)定期測量。加巴噴丁(30mg/kgi.p.@3ml/kg注射體積)在開始PWT測試之前2小時，被每天注射。圖20顯示了通過用750ng的CPN/A對動物進行預(yù)處理達到的痛覺異常的逆轉(zhuǎn)。數(shù)據(jù)是在CPN/A單次注射后2周的時間段內(nèi)獲得。實施例23-LC/A-傷害感受肽變異體-I^/A融合體的體內(nèi)效力的評估LC/A-傷害感受肽變異體-H^A融合體(CPNv/A)抑制辣椒素誘導(dǎo)的機械性疼痛異常的能力，在大鼠后爪皮下足底內(nèi)注射后被評估。在招入研究之前(預(yù)處理)，在用CPNv/A皮下足底內(nèi)注射后但在辣椒素刺激之前(Pre-CAP)，和在CPNv/A注射后且用辣椒素刺激后(平均反應(yīng)為15'和30';CAP)，實驗動物被評估在對10gVonFrey纖絲刺激系列(10刺激X3次試驗)的爪回縮頻度(PWF%)。辣椒素刺激通過10pL的0.3%溶液的注射完成。樣品稀釋物在0.5%的BSA/鹽溶液中制備。圖21顯示了通過用一系列濃度的LC/A-傷害感受肽變異體-HN/A融合體對動物預(yù)處理達到的機械性痛覺異常的逆轉(zhuǎn)，與通過加入LC/A-傷害感受肽-HN/A融合體達到的逆轉(zhuǎn)的比較。這些數(shù)據(jù)被表示為標準化的爪回縮頻度差異，其中峰值反應(yīng)(辣椒素之后)和基線反應(yīng)(辣椒素之前)之間的差異被表示為百分比。用該分析，可以看出CPNv/A比CPN/A更有效，因為達到相似止痛效果需要比CPN/A低劑量的CPNv/A。實施例24-LC/A-leu腦啡肽-H^A融合蛋白的制備由于小的、5個氨基酸的、leu-腦啡肽配體的尺寸，則LC/A-leu腦啡肽-Hw/A融合體通過位點定向誘變[例如，使用Quickchange(StratageneInc,)]，使用LC/A-傷害感受肽-HN/A融合體(SEQID13)作為模板產(chǎn)生。編碼YGGFMleu-腦啡肽的肽的寡核苷酸被設(shè)計，保證標準大腸桿菌密碼子的使用被保持，并且沒有其它限制性酶位點被插入，由與LC/A-傷害感受肽-Hw/A融合體(SEQID13)任意一側(cè)上傷害感受肽部分的接頭區(qū)域互補的序列在其側(cè)翼。SDM產(chǎn)物通過測序檢査，并且最終的構(gòu)建體包含LC-接頭-leu腦啡肽-間隔分子-HNORF(SEQID68)用以表達SEQID69所示序列的蛋白。該融合蛋白被稱為CPLE-A。圖22顯示了根據(jù)實施例9中使用的方法，從大腸桿菌中純化CPLE-A。實施例25-LC/A-p內(nèi)啡肽-Hw/A融合蛋白的表達和純化使用實施例9所述的方法，并使用實施例7中產(chǎn)生的LC/A-卩內(nèi)啡肽-Hw/A融合蛋白(被稱為CPBE-A)，CPBE-A從大腸桿菌中被純化。圖23顯示了通過SDS-PAGE分析的純化蛋白。實施例26-LC/A-傷害感受肽變異體-I^/A融合蛋白的制備由于單一氨基酸改變對將傷害感受肽序列第1位置的Phe誘變?yōu)門yr是必要的，LC/A-傷害感受肽變異體-EWA融合體通過位點定向誘變[例如，使用Quickchange(StratageneInc.)]，使用LC/A-傷害感受肽-Hw/A融合體(SEQID13)作為模板產(chǎn)生。編碼傷害感受肽序列中第1位酪氨酸的寡核苷酸被設(shè)計，保證標準大腸桿菌密碼子的使用被保持，并且沒有其它限制性酶位點被插入，由與LC/A-傷害感受肽-H^A融合體(SEQID13)任意一側(cè)上傷害感受肽部分的接頭區(qū)域互補的序列在其側(cè)翼。SDM產(chǎn)物通過測序檢査，并且最終的構(gòu)建體包含LC/A-傷害感受肽誘變體-間隔分子-IVA融合體ORF(SEQID70)用以表達SEQID71所示序列的蛋白。該融合蛋白被稱為CPOP-A。圖24顯示了根據(jù)實施例9中使用的方法，從大腸桿菌中純化CPOP-A。實施例27-LC/A-傷害感受肽變異誘變體-Hw/A融合蛋白的制備和評估由于單一氨基酸改變對將傷害感受肽序列第1位置的Phe誘變?yōu)門yr是必要的，LC/A-傷害感受肽變異誘變體-H^/A融合體通過位點定向誘變[例如，使用Quickchange(StratageneInc.)]，使用LC/A-傷害感受肽變異體-H^A融合體(SEQID25)作為模板產(chǎn)生。編碼傷害感受肽序列中第1位酪氨酸的寡核苷酸被設(shè)計，保證標準大腸桿菌密碼子的使用被保持，并且沒有其它限制性酶位點被插入，由與LC/A-傷害感受肽變異體-Hw/A融合體(SEQID25)任意一側(cè)上傷害感受肽部分的接頭區(qū)域互補的序列在其側(cè)翼。SDM產(chǎn)物通過測序檢查，并且最終的構(gòu)建體包含LC/A-傷害感受肽誘變體-間隔分子-Hn/A融合體ORF(SEQID72)用以表達SEQID73所示序列的蛋白。該融合蛋白被稱為CPOPv-A。圖25顯示了根據(jù)實施例9中使用的方法，從大腸桿菌中純化CPOPv-A。使用實施例16所述的方法，CPOPv-A被評估其在eDRG細胞模型中剪切SNAP-25的能力。圖26顯示了CPOPv-A能夠在eDRG模型中剪切SNAP-25，細胞暴露于約5.9nM融合體24小時后，達到50%的最大SNAP-25剪切。實施例28-IgA蛋白酶-傷害感受肽變異體-Hw/A融合蛋白的制備IgA蛋白酶的氨基酸序列從免費可用的數(shù)據(jù)庫資源，如GenBank(登錄號P09790)獲得。關(guān)于淋球菌IgA蛋白酶基因結(jié)構(gòu)的信息在文獻(Pohlnerea/"Genestructureandextracellularsecretionof7Ve/,n'agoww/zoeaeIgAprotease,Atowre，1987,325(6103),458-62)中可找到。使用Backtranslationtoolv2.0(Entelechon)，編碼為大腸桿菌表達所修飾的IgA蛋白酶的DNA序列被確定。SamHI識別序列被插入5'端，并且編碼半胱氨酸氨基酸的密碼子和6^/1識別序列被插入IgADNA的3'端。DNA序列針對反向翻譯過程中被插入的限制性酶剪切序列使用諸如MapDraw(DNASTARInc.)被篩選。被發(fā)現(xiàn)對克隆系統(tǒng)要求的那些常見的任意剪切序列從提議的編碼序列中被手工移除，以保證常見大腸桿菌密碼子選擇被保持。大腸桿菌密碼子選擇通過軟件程序，如圖像密碼子使用分析儀(GraphicalCodonUsageAnalyser(Geneart))被評估，并且。/。GC含量和密碼子使用比例通過公開的密碼子使用表來評估。含有IgA開放讀碼框(ORF)的優(yōu)化的DNA序列(SEQID74)隨后被商業(yè)合成。IgA(SEQID74)使用5amHI和&/I限制性酶被插入LC-接頭-傷害感受肽變異體-間隔分子-hnORF(SEQID25)，以用IgA蛋白酶DNA代替LC。最終的構(gòu)建體包含IgA-接頭-傷害感受肽變異體-間隔分子-HnORF(SEQID75)，用以表達SEQID76所示序列的蛋白。實施例29—耙向帶有可去除組氨酸純化標記的肽鏈內(nèi)切酶融合蛋白的傷害感受肽的制備和評估編碼因子Xa可去除his-標記(his-6)的DNA被制備，雖然明顯的是可選的蛋白酶位點，如腸激酶，和可選的純化標記，如更長的組氨酸標記，也是可能的。使用多種反向翻譯軟件工具之一[例如，EditSeqbest五.co/z'reversetranslation(DNASTARInc.)或Backtranslationtoolv2.0(Entelechon)]，編碼因子Xa可去除his-標記區(qū)域的DNA序列被確定。限制性位點隨后被插入DNA序列，并能夠被排列為A7^I-接頭-5^1-/^1-7^/4-^^1-丄￡/￡(7^(^77///7/////終止子-i^'"din(SEQID77)。DNA序列針對限制性序列的插入被篩選，并且任何其它序列從剩余的序列中被手工移除，以保證了常見大腸桿菌密碼子使用被保持。大腸桿菌密碼子使用通過軟件程序，如圖像密碼子使用分析儀(GraphicalCodonUsageAnalyser(Geneart))被評估，并且。/。GC含量和密碼子使用比例通過參考已經(jīng)公開的密碼子使用表(例如，GenBankRelease143，2004年9月13日)來評估。優(yōu)化的DNA序列隨后被商業(yè)合成(例如，通過Entelechon，Geneart或Sigma-Genosys)，并在pCR4載體中被提供。為了產(chǎn)生CPNv-A-FXa-HT(SEQID78,可去除his-標記的構(gòu)建體)，編碼可去除his-標記的pCR4載體用ATzel和/^m/m剪切。7W2el-//y"^m片段隨后被插入也已經(jīng)用JV/2el禾P///"dll剪切的LC/A-CPNv-HN/A載體(SEQID25)。最終的構(gòu)建體包含LC/A-接頭-傷害感受肽變異體-間隔分子-HN-FXa-His標記-///"^11ORF序列(SEQID78)，用以表達SEQID79所示序列的蛋白。圖27顯示了按照實施例9中使用的方法從大腸桿菌中純化的CPNv-A-FXa-HT。實施例30-靶向含有從白喉毒素衍生的轉(zhuǎn)運區(qū)域的肽鏈內(nèi)切酶融合蛋白的leu-腦啡肽的制備該DNA序列通過白喉毒素轉(zhuǎn)運區(qū)域的氨基酸序列(從免費可用的數(shù)據(jù)庫來源，如GenBank(登錄號1XDTT)獲得)，使用多種反向翻譯軟件工具之一(例如，EditSeqbestco//reversetranslation(DNASTARInc.)或Backtranslationtoolv2.0(Entelechon))]的反向翻譯設(shè)計。限制性位點隨后被插入DNA序列，并能夠被排列為A^el-接頭-5^1-尸^1-白喉轉(zhuǎn)運區(qū)域-^^1-終止子-歷"(1111(SEQID80)。i^I/Wal識別序列分別被插入轉(zhuǎn)運區(qū)域的5'和3'端，保持正確的讀碼框。DNA序列針對反向翻譯過程中被插入的限制性酶剪切序列被篩選(使用諸如MapDraw,DNASTARInc.的軟件)。被發(fā)現(xiàn)對克隆系統(tǒng)要求的那些常見的任意剪切序列，從提議的編碼序列中被手工移除，所述編碼序列保證了常見大腸桿菌密碼子選擇被保持。大腸桿菌密碼子選擇通過軟件程序，如圖像密碼子使用分析儀(GraphicalCodonUsageAnalyser(Geneart))被評估，并且。/。GC含量和密碼子使用比例通過參考公開的密碼子使用表(例如，GenBankRelease143，2004年9月13日)來評估。含有白喉轉(zhuǎn)運區(qū)域的優(yōu)化的DNA序列隨后被商業(yè)合成為MzeI-接頭-5^1-尸"1-白喉轉(zhuǎn)運區(qū)域-^^1-終止子-///"(1111(例如，通過Entelechon,77Geneart或Sigma-Genosys)，并在pCR4載體中被提供。編碼白喉轉(zhuǎn)運區(qū)域的pCR4載體用7Wzel和J^al剪切。M2el-片段隨后被插入也已經(jīng)用Mzel和JK)aI剪切的LC/A-CPLE-HN/A載體(SEQID68)。最終的構(gòu)建體包含LC/A-leu-腦啡肽-間隔分子-白喉轉(zhuǎn)運區(qū)域ORF序列(SEQID81)，用以表達SEQID82所示序列的蛋白。實施例31-靶向含有從破傷風毒素衍生的LC區(qū)域的肽鏈內(nèi)切酶融合蛋白的傷害感受肽變異體的制備該DNA序列通過破傷風毒素LC氨基酸序列(從免費可用的數(shù)據(jù)庫來源，如GenBank(登錄號X04436)獲得)，使用多種反向翻譯軟件工具之一(例如，EditSeqbestreversetranslation(DNASTARInc.)或Backtranslationtoolv2.0(Entelechon))]的反向翻譯設(shè)計。SamHIA^/I識別序列分別被插入該序列的5'和3'端，保持正確的讀碼框(SEQID83)。DNA序列針對反向翻譯過程中被插入的限制性酶剪切序列被篩選(使用諸如MapDraw,DNASTARInc.的軟件)。被發(fā)現(xiàn)對克隆系統(tǒng)要求的那些常見的任意剪切序列，從提議的編碼序列中被手工移除，所述編碼序列保證了常見大腸桿菌密碼子選擇被保持。大腸桿菌密碼子選擇通過軟件程序，如圖像密碼子使用分析儀(GraphicalCodonUsageAnalyser(Geneart))被評估，并且。/。GC含量和密碼子使用比例通過公開的密碼子使用表(例如，GenBankRelease143，2004年9月13日)來評估。含有破傷風毒素LC開放讀碼框的，優(yōu)化的DNA序列隨后被商業(yè)合成(例如，通過Entelechon,Geneart或Sigma-Genosys)，并在pCR4載體(invitrogen)中被提供。編碼TeNTLC的pCR4載體用BamHI和剪切。5amHI—&/I片段隨后被插入也已經(jīng)用5amHI和5^/1剪切的LC/A-CPNv-HN/A載體(SEQID25)。最終的構(gòu)建體包含TeNTLC-接頭-傷害感受肽變異體-間隔分子-HNORF序列(SEQID84)，用以表達SEQID85所示序列的蛋白。實施例32-帶有對因子Xa剪切易感的原生血清型C接頭的LC/C-傷害感受肽變異體-HWC融合蛋白的制備按照實施例4中使用的方法，LC/C(SEQID5)和HN/C(SEQ78ID6)被產(chǎn)生并被插入C血清型股啡肽變異體接頭，排列為JamHI-Sa/I-接頭-傷害感受肽變異體-M2el-間隔分子-S;el-i^I-^al-終止子-州"din(SEQID86)。最終的構(gòu)建體包含LC-接頭-傷害感受肽變異體-間隔分子-HNORF序列(SEQID87)，用以表達SEQID88所示序列的蛋白。該融合蛋白被稱為CPNv-C(actC)。權(quán)利要求1.治療分子用于生產(chǎn)治療特定類型疼痛的藥物的用途，其中所述治療分子是單鏈的多肽融合蛋白，其包含a.非細胞毒性的蛋白酶或其片段，所述蛋白酶或蛋白酶片段能夠剪切疼痛感應(yīng)傳入器中胞吐融合器的蛋白；b.能夠結(jié)合所述疼痛感應(yīng)傳入器上之結(jié)合位點的靶向部分，所述結(jié)合位點能夠進行細胞內(nèi)吞作用，以被并入位點疼痛感應(yīng)傳入器中的內(nèi)涵體內(nèi)；c.蛋白酶剪切位點，在該位點所述融合蛋白可被蛋白酶剪切，其中所述蛋白酶剪切位點位于所述非細胞毒性蛋白酶或其片段與所述靶向部分之間；和d.轉(zhuǎn)運區(qū)域，其能夠?qū)⑺龅鞍酌富虻鞍酌钙螐膬?nèi)涵體中跨內(nèi)涵體膜轉(zhuǎn)運，并進入疼痛感應(yīng)傳入器的細胞溶膠中。2.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中所述靶向部分和所述蛋白酶剪切位點由最多IO個氨基酸殘基分隔，更優(yōu)選地由最多5個氨基酸殘基分隔，并且最優(yōu)選地由最多O個氨基酸殘基分隔。3.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的用途，其中所述靶向部分位于所述蛋白酶剪切位點和所述轉(zhuǎn)運區(qū)域之間。4.根據(jù)任一前述權(quán)利要求的用途，其中所述非細胞毒性蛋白酶是梭菌神經(jīng)毒素L-鏈或IgA蛋白酶。5.根據(jù)任一前述權(quán)利要求的用途，其中所述轉(zhuǎn)運區(qū)域是梭菌神經(jīng)毒素的Hw區(qū)域。6.根據(jù)任一前述權(quán)利要求的用途，其中所述靶向部分包含最多50個氨基酸殘基，優(yōu)選地最多40個氨基酸殘基，更優(yōu)選地最多30個氨基酸殘基，并且最優(yōu)選地最多20個氨基酸殘基。7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項的用途，其中所述靶向部分是阿片樣物質(zhì)。8.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項的用途，其中所述靶向部分是疼痛感應(yīng)傳入器上存在的受體的激動劑。9.根據(jù)權(quán)利要求8的用途，其中所述靶向部分是初級疼痛感應(yīng)傳入器上存在的受體的激動劑。10.根據(jù)權(quán)利要求l-6中任一項的用途，其中所述靶向部分結(jié)合ORL,受體。11.根據(jù)權(quán)利要求10的用途，其中所述靶向部分特異地結(jié)合ORL,受體。12.根據(jù)權(quán)利要求10或11的用途，其中所述靶向部分是ORL,受體的激動劑。13.根據(jù)權(quán)利要求10-12中任一項的用途，其中所述靶向部分與SEQIDNo.38或其片段具有至少70。/。的同源性。14.根據(jù)權(quán)利要求13的用途，其中所述靶向部分與SEQIDNo.38或其片段具有至少80%的同源性。15.根據(jù)權(quán)利要求14的用途，其中所述靶向部分與SEQIDNo.38或其片段具有至少90%的同源性。16.根據(jù)權(quán)利要求15的用途，其中所述靶向部分與SEQIDNo.38或其片段具有至少95%的同源性。17.根據(jù)權(quán)利要求10-12中任一項的用途，其中所述靶向部分是SEQIDNo.38或其片段。18.根據(jù)權(quán)利要求10-12中任一項的用途，其中所述靶向部分是SEQIDNos:40、42、44、46、48或50之一。19.根據(jù)權(quán)利要求10-12中任一項的用途，其中所述靶向部分是傷害感受肽。20.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項的用途，其中所述靶向部分選自傷害感受肽、P-內(nèi)啡肽、內(nèi)啡素-K內(nèi)啡素-2、強啡肽、met-腦啡肽、leu-腦啡肽、甘丙肽和PAR-2肽。21.根據(jù)任一前述權(quán)利要求的用途，其中所述融合蛋白包含純化標記。22.根據(jù)權(quán)利要求21的用途，其中所述融合蛋白包含純化標記，其存在于所述融合蛋白的N-末端和/或C-末端。23.根據(jù)權(quán)利要求21或22的用途，其中所述純化標記通過肽間隔分子被連接到所述融合蛋白。24.根據(jù)任一前述權(quán)利要求的用途，其中所述轉(zhuǎn)運區(qū)域由肽間隔分子與所述靶向部分分隔。25.根據(jù)任一前述權(quán)利要求的用途，其中所述多肽融合蛋白包含SEQIDNOs:14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、52、59、61、64、67、69、71、73、76、79、82、85或88中任一。26，制備非細胞毒性的融合蛋白的方法，包括a.使權(quán)利要求1-25中任意一項所定義的單鏈多肽融合蛋白與能夠剪切所述蛋白酶剪切位點的蛋白酶接觸；b.剪切所述蛋白酶剪切位點；并由此形成雙鏈融合蛋白。27.非細胞毒性的融合蛋白，可通過權(quán)利要求26所述的方法獲得，其中所述蛋白是雙鏈多肽，并且其中a.所述第一條鏈包含非細胞毒性的蛋白酶或其片段，所述蛋白酶或蛋白酶片段能夠剪切疼痛感應(yīng)傳入器中所述胞吐融合器的蛋白；b.所述第二條鏈包含TM和轉(zhuǎn)運區(qū)域，其能夠?qū)⒌鞍酌富虻鞍酌钙螐膬?nèi)涵體中跨內(nèi)涵體膜轉(zhuǎn)運并進入所述疼痛感應(yīng)傳入器的所述細胞溶膠中；并且所述第一和第二條鏈被二硫鍵連接在一起。28.根據(jù)權(quán)利要求27的融合蛋白用于藥物生產(chǎn)的用途，所述藥物用于治療、預(yù)防或緩解特定類型的疼痛。29.治療、預(yù)防或緩解受治療者中特定類型的疼痛的方法，包括給予所述患者治療有效量的，如權(quán)利要求1-27中任一項所定義的融合蛋白。全文摘要治療分子的使用，用于特定疼痛病狀的治療，其中所述治療分子是單鏈的多肽融合蛋白，其包含非細胞毒性的蛋白酶，或其片段，所述蛋白酶或蛋白酶片段能夠剪切疼痛感應(yīng)傳入器中胞吐融合器的蛋白；能夠結(jié)合所述疼痛感覺傳入器上結(jié)合位點的靶向部分，所述結(jié)合位點能夠進行細胞內(nèi)吞，以便被并入到所述疼痛感覺傳入器的內(nèi)涵體中；蛋白酶剪切位點，在該位點所述融合蛋白可被蛋白酶剪切，其中所述蛋白酶剪切位點位于所述非細胞毒性的蛋白酶或其片段和所述靶向部分之間；和轉(zhuǎn)運區(qū)域，其能夠從內(nèi)涵體中轉(zhuǎn)運所述蛋白酶或蛋白酶片段，跨內(nèi)涵體膜并進入所述疼痛感覺傳入器的細胞溶膠。文檔編號A61K38/48GK101495135SQ200780028089公開日2009年7月29日申請日期2007年6月1日優(yōu)先權(quán)日2006年6月1日發(fā)明者J·弗朗西斯,J·查多克,K·R·奧基,K·福斯特,L·斯圖爾德,P·斯坦庫姆,P·馬科斯申請人:賽恩泰新公司;愛力根公司