一種抗p21ras蛋白的單鏈抗體及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種單鏈抗體及其在抑制高表達(dá)p21ras蛋白的人腫瘤細(xì)胞中的應(yīng)用。該單鏈抗體的基因片段是由p21ras蛋白免疫后的小鼠脾B淋巴細(xì)胞的輕、重鏈可變區(qū)基因片段通過(guò)柔性寡核苷酸鏈(Linker)連接而構(gòu)建。對(duì)上述單鏈抗體進(jìn)行可溶性表達(dá)，經(jīng)ELISA及免疫組化等實(shí)驗(yàn)證實(shí)該單鏈抗體對(duì)三種p21ras蛋白具有廣譜識(shí)別、特異性強(qiáng)，親和性高的特性。用該單鏈抗體構(gòu)建出的細(xì)胞內(nèi)抗體能夠抑制高表達(dá)p21ras蛋白的人腫瘤細(xì)胞的增殖及侵襲能力，并且能夠在小鼠體內(nèi)抑制高表達(dá)p21ras蛋白的人腫瘤細(xì)胞移植瘤的生長(zhǎng)。證明該單鏈抗體可用于構(gòu)建細(xì)胞內(nèi)抗體等小分子抗體，為相關(guān)腫瘤的治療研究提供一個(gè)新的途徑。
【專利說(shuō)明】一種抗p21ras蛋白的單鏈抗體及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)生物學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種廣譜抗p21ras蛋白的單鏈抗體及該抗體在p21ras基因相關(guān)的腫瘤診斷及治療方面的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]ras基因是一種重要的細(xì)胞原癌基因，其命名來(lái)自大鼠肉瘤的英文rat asrcoma。ras基因家族包括三個(gè)主要成員，即H-ras、K_ras、N-ras,分別定位于第12、11和I號(hào)染色體，編碼由188-189個(gè)氨基酸組成的分子量約為21KD的蛋白質(zhì)，即p21ras蛋白，三種p21ras蛋白的氨基酸序列約有85%的同源性。
[0003]p21ras蛋白作為及其重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)傳遞蛋白調(diào)節(jié)細(xì)胞的正常分化和增殖。p21ras蛋白合成后，其羧基端必須經(jīng)過(guò)復(fù)雜的翻譯后修飾，使其準(zhǔn)確定位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)面才能發(fā)揮其生物學(xué)功能。p21ras蛋白有自身GTP水解酶活性，可分別與GTP和GDP結(jié)合，p2Iras蛋白中GTP結(jié)合與在GTP酶激活蛋白作用下水解為GDP之間的循環(huán)形成了一種分子開(kāi)關(guān)機(jī)制，即通過(guò)鳥(niǎo)嘌呤核苷酸不同形式的結(jié)合形成不同的激酶構(gòu)象，也即ras蛋白的活性和非活性形式。P21ras蛋白在細(xì)胞外生長(zhǎng)信號(hào)刺激下與GTP結(jié)合成為活性狀態(tài)的p21ras-GTP形式，從而激活p21ras蛋白下游眾多信號(hào)通道，促進(jìn)細(xì)胞分裂、增生，抑制細(xì)胞凋亡，使細(xì)胞間接觸抑制減弱。
[0004]當(dāng)ras基因發(fā)生突變或p21ras蛋白過(guò)表達(dá)或GTP酶激活蛋白缺失或生長(zhǎng)因子受體活化及ras下游效應(yīng)子的突變或擴(kuò)增，均可導(dǎo)致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化并促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。研究表明，大約30%的人類腫瘤中存在ras基因突變或ras基因過(guò)表達(dá)，部分學(xué)者認(rèn)為p21ras蛋白主要在腫瘤形成的早期階段充當(dāng)重要作用。
[0005]用于腫瘤生物治療的完整抗體`由于分子量較大，其血管通透性弱，擴(kuò)散入腫瘤內(nèi)能力差，半衰期長(zhǎng)，毒性高而限制了其靶向傳遞及腫瘤拮抗應(yīng)用效果。利用基因工程技術(shù)構(gòu)建的單鏈抗體(single chain fragment vriable, ScFv)是用柔性寡核苷酸片段連接完整抗體的可變區(qū)構(gòu)建的線性片段，分子量只有完整抗體的I / 6;滲透力強(qiáng)；在非靶向組織中滯留時(shí)間短、易從體內(nèi)清除；且免疫原性低，用于人體幾乎不會(huì)產(chǎn)生抗鼠抗體反應(yīng)；容易在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)獲得，易于基因操作和基因工程大量生產(chǎn)，實(shí)用性強(qiáng)。將ScFv基因用病毒載體等導(dǎo)入非淋巴細(xì)胞內(nèi)，通過(guò)偶聯(lián)定位信號(hào)序列，定向表達(dá)于亞細(xì)胞器(如細(xì)胞核、細(xì)胞衆(zhòng)或內(nèi)質(zhì)網(wǎng))而構(gòu)建的抗體稱為細(xì)胞內(nèi)抗體。通過(guò)p21ras-Ant1-ScFv單鏈抗體基因制備出的細(xì)胞內(nèi)抗體，能夠在腫瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)抗p21ras蛋白產(chǎn)物,阻斷腫瘤細(xì)胞中p21ras蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，限制腫瘤的生長(zhǎng)和擴(kuò)散，可用于靶向治療過(guò)表達(dá)P21ras蛋白的腫瘤，有望達(dá)到治療p21ras蛋白過(guò)表達(dá)引起的各類腫瘤的目的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種抗p21ras蛋白的單鏈抗體p21ras-Anti_ScFv,其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。[0007]該抗p21ras蛋白單鏈抗體p21ras_Anti_ScFv是由重鏈可變區(qū)、連接肽和輕鏈可變區(qū)組成的多肽；所述連接肽位于所述重鏈可變區(qū)與所述輕鏈可變區(qū)之間；重鏈可變區(qū)如SEQ ID NO:2中第I至118位所述氨基酸殘基序列；輕鏈可變區(qū)如SEQ ID NO:2中第150位至259位所示氨基酸殘基序列。
[0008]本發(fā)明中所述編碼抗p21ras蛋白的單鏈抗體的多核苷酸的核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示，由重鏈可變區(qū)的編碼序列、連接肽的編碼序列和輕鏈可變區(qū)的編碼序列組成，重鏈可變區(qū)的編碼序列如SEQ ID NO:1中第I至354位所示核苷酸序列；所述輕鏈可變區(qū)的編碼序列如SEQ ID NO:1中第448至777位所示核苷酸序列。
[0009]本發(fā)明的另一目的是將抗p21ras蛋白的單鏈抗體應(yīng)用在制備與p21ras基因相關(guān)的腫瘤藥物中，為相關(guān)腫瘤的治療研究提供了一個(gè)新的選擇。
[0010]本發(fā)明還提供了一種重組噬菌體質(zhì)粒，該重組噬菌粒由單鏈抗體基因與噬菌粒表達(dá)載體PCANTAB-5F連接而成。
[0011]本發(fā)明還提供了融合及可溶性表達(dá)目的單鏈抗體的宿主大腸桿菌TGl及BL21 (DE3)，該宿主菌分別轉(zhuǎn)化含有目的片段的重組噬菌體質(zhì)粒。
[0012]本發(fā)明還提供了一種重組腺病毒穿梭質(zhì)粒pShuttle-ScFv，該載體嵌合了所述單鏈抗體的編碼基因，能夠在與骨架質(zhì)粒PAdEasy-1重組并包裝為完整的腺病毒KGHV100后，在細(xì)胞內(nèi)編碼出具有活性的抗p21ras蛋白單鏈抗體。
[0013]本發(fā)明的上述目的通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
[0014]本發(fā)明抗p2 Iras蛋白的單鏈抗體能廣譜拮抗H_ras、K-ras、N_ras三種p21ras蛋白；該單鏈抗體作為制備雙價(jià)或多價(jià)單鏈抗體、細(xì)胞內(nèi)抗體及其他小分子抗體研究的基礎(chǔ)材料，用于ras基因相關(guān)腫瘤的診斷性研究、發(fā)病機(jī)制研究或治療性研究。
[0015]本發(fā)明抗p21ras蛋白單鏈抗體`的制備方法及其應(yīng)用，具體步驟如下:
[0016](I)利用小鼠抗體輕、重鏈混合引物，從經(jīng)過(guò)p21ras蛋白免疫后的Balb / c小鼠脾B淋巴細(xì)胞中擴(kuò)增獲得其輕、重鏈可變區(qū)基因片段。通過(guò)重疊延伸PCR，將柔性寡核苷酸鏈(Linker)和所述兩片段連接，構(gòu)建出單鏈抗體基因片段；
[0017](2)在單鏈抗體的基因片段兩端分別引入不同的酶切位點(diǎn)并與同步雙酶切的噬菌粒表達(dá)載體PCANTAB-5E連接，獲得重組噬菌粒。將鑒定連接正確的重組噬菌粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1，用輔助噬菌體M13K07進(jìn)行挽救，通過(guò)噬菌體展示技術(shù)將目的單鏈抗體基因片段與表達(dá)載體中的gill基因融合表達(dá)并展示在噬菌體尾部表面，獲得融合表達(dá)的單鏈抗體，通過(guò)間接ELISA對(duì)融合表達(dá)的單鏈抗體進(jìn)行檢測(cè)，篩選出陽(yáng)性重組噬菌粒；
[0018](3)將篩選獲得的陽(yáng)性重組噬菌粒載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)中進(jìn)行可溶性表達(dá)，從而獲得與E-tag標(biāo)簽融合表達(dá)的抗p21ras蛋白的可溶性單鏈抗體，以該單鏈抗體為一抗，以抗E-tag抗體為二抗，采用間接ELISA和免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)目的單鏈抗體的特異性及親和力，證實(shí)該單鏈抗體可特異性識(shí)別并結(jié)合三種p21ras蛋白；
[0019](4)將單鏈抗體的編碼基因克隆至腺病毒穿梭質(zhì)粒pShuttle-1RES-hrGFP-Ι (購(gòu)自Stratagene公司)，將重組穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入已存在腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-Ι (購(gòu)自Takara公司)的BJ5183-AD-1細(xì)胞(購(gòu)自Stratagene公司)內(nèi)，通過(guò)同源重組產(chǎn)生重組腺病毒載體。將重組腺病毒載體酶切線性化后轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，從而得到包裝成熟的重組腺病毒 KGHV100 ；[0020](5)將重組腺病毒KGHV100轉(zhuǎn)染至MDA-MB-231細(xì)胞，通過(guò)FLAG融合標(biāo)簽檢測(cè)其在細(xì)胞內(nèi)的定位。再將重組腺病毒轉(zhuǎn)染至高表達(dá)P21ras蛋白的腫瘤細(xì)胞內(nèi)，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞侵襲及增殖能力、流式細(xì)胞術(shù)等分析細(xì)胞內(nèi)抗體在體外對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用；
[0021](6)將腫瘤細(xì)胞接種Balb / c裸鼠，待裸鼠成瘤后，對(duì)瘤體進(jìn)行多點(diǎn)腺病毒注射。觀察腫瘤生長(zhǎng)情況，分析細(xì)胞內(nèi)抗體在體內(nèi)對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用。
[0022]本發(fā)明的有益成果:本發(fā)明創(chuàng)造性地直接從經(jīng)過(guò)p2 Iras蛋白免疫后的小鼠脾B淋巴細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增獲得抗體的輕、重鏈基因，通過(guò)噬菌體展示技術(shù)和間接ELISA簡(jiǎn)單、高效的獲得了具有高親和力與特異性的抗p21ras蛋白的ScFv片段。將該單鏈抗體基因克隆到腺病毒載體后，將包裝成熟的KGHV100病毒感染表達(dá)p21ras蛋白的腫瘤細(xì)胞，確定了單鏈抗體在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況，同時(shí)分別在體外和體內(nèi)研究了細(xì)胞內(nèi)抗體對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。結(jié)果表明其在體外可以顯著影響腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)能力、侵襲能力和增殖能力等，在體內(nèi)可以顯著抑制腫瘤的形成、生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移，并且沒(méi)有明顯的毒副作用，為今后腫瘤的診斷及治療提供了一種新途徑。
[0023]本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果:
[0024](I)本發(fā)明直接從經(jīng)過(guò)p21ras蛋白免疫后的小鼠脾B淋巴細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增獲得抗體的輕、重鏈基因。與傳統(tǒng)單鏈抗體的制備方法相比，減少了雜交瘤細(xì)胞株的制備過(guò)程。
[0025](2)本發(fā)明所篩選出的單鏈抗體,具有抗H-ras、K_ras、N-ras三種p21ras蛋白的廣譜抗性，并且抗體比目前已知的抗p21ras蛋白抗體的特異性和親和力高。
[0026](3)本發(fā)明還提供了 p21ras-Anti_ScFv單鏈抗體的原核表達(dá)系統(tǒng),表達(dá)出了具有高特異性和親和力的抗p21ras蛋白單鏈抗體。使簡(jiǎn)單、大量的制備抗p21ras蛋白抗體成為可能，能夠有效降低生產(chǎn)抗體的成本，讓p21ras-Ant1-ScFv單鏈抗體的應(yīng)用更具有前景。
[0027](4)本發(fā)明還提供了在p21ras-An`ti_ScFv單鏈抗體基礎(chǔ)之上的細(xì)胞內(nèi)抗體，為p21ras-Ant1-ScFv單鏈抗體在細(xì)胞內(nèi)的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)，也為高表達(dá)p21ras蛋白腫瘤的治療研究提供了一個(gè)新的途徑。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0028]圖1為本發(fā)明p21ras蛋白免疫Balb / c小鼠的脾B淋巴細(xì)胞總RNA電泳圖，M:DL2000，泳道1、2為平行樣品；
[0029]圖2為本發(fā)明小鼠脾B淋巴細(xì)胞cDNA擴(kuò)增的輕、重鏈可變區(qū)片段電泳圖，M:DNAMaker I，泳道1_3為擴(kuò)增出的重鏈可變區(qū)條帶，泳道4_5為擴(kuò)增出的輕鏈可變區(qū)條帶；
[0030]圖3為本發(fā)明構(gòu)建的單鏈抗體基因片段，M:DL2000,泳道1:單鏈抗體條帶；
[0031]圖4為本發(fā)明含單鏈抗體基因重組噬菌體表達(dá)載體的Sfi 1.Not I雙酶切鑒定電泳圖，M:DL2000，泳道1-4:雙酶切后的重組噬菌粒條帶，均為平行樣品；
[0032]圖5為本發(fā)明SDS-PAGE檢測(cè)可溶性表達(dá)單鏈抗體的電泳圖，M:14.4_94KDa蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道1-2:可溶性單鏈抗體，均為平行樣品；
[0033]圖6為本發(fā)明重組穿梭質(zhì)粒的Bgl IKXho I雙酶切鑒定電泳圖，M:DL2000,1:未酶切的pShuttle-1RES-hrGFP質(zhì)粒，2:雙酶切含單鏈抗體的重組穿梭質(zhì)粒條帶；
[0034]圖7為本發(fā)明含有單鏈抗體重組腺病毒載體的Pac I酶切鑒定電泳圖，M: λ HindIII，1:未酶切的重組腺病毒載體，2:經(jīng)過(guò)Pac I酶切的重組腺病毒載體條帶；[0035]圖8為本發(fā)明單鏈抗體在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的激光共聚焦定位圖，綠色熒光為Flag標(biāo)簽蛋白的分布，紅色熒光為單鏈抗體的分布；
[0036]圖9為本發(fā)明細(xì)胞內(nèi)抗體對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的克隆形成率的影響；
[0037]圖10為本發(fā)明細(xì)胞內(nèi)抗體對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的侵襲能力的影響；
[0038]圖11為本發(fā)明細(xì)胞內(nèi)抗體對(duì)BEL-7402腫瘤細(xì)胞在小鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)的影響；
[0039]圖12為本發(fā)明細(xì)胞內(nèi)抗體對(duì)SW480腫瘤細(xì)胞在小鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)的影響。
【具體實(shí)施方式】
[0040]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但本發(fā)明保護(hù)范圍不局限于所述內(nèi)容，本發(fā)明中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法。以下實(shí)施例中的定量實(shí)驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。
[0041]實(shí)施例1:單鏈抗體基因片段的制備
[0042]1、p21ras蛋白免疫Balb / c小鼠:取5只鼠齡在6-8周的Balb / c小鼠(購(gòu)自重慶第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，每只注射100 μ g的本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)過(guò)原核表達(dá)純化后的p21ras-K蛋白(p21ras_K蛋白的制備方法參照論文《重組p21ras蛋白的表達(dá)、鑒定與純化及其多克隆抗體的制備》)，初次注射加等量的完全弗氏佐劑，皮下5點(diǎn)注射。兩周后進(jìn)行第二次注射，劑量同第一次，加等量不完全弗氏佐劑，皮下5點(diǎn)注射。兩周后進(jìn)行第三次注射，劑量同第一次，不加佐劑，腹腔注射。兩周后進(jìn)行第四次注射，劑量同第一次，不加佐劑，腹腔注射。3天后取其脾臟，用IOml滅菌的D-Hank’s液沖洗研碎的脾臟。用滴管吸取培養(yǎng)皿內(nèi)細(xì)胞的懸液，移入50ml離心管中，1000g離心10分鐘，棄上清，沉淀即為所需要的小鼠脾B淋巴細(xì)胞。
[0043]2、小鼠脾B淋巴細(xì)胞總RNA的提取和逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA:將已分離得到的小鼠脾B淋巴細(xì)胞，使用傳統(tǒng)的Trizol法提取總RNA。提取的具體步驟參照分子克隆指南(第三版)。最后將提取出的RNA盡快放在-80°C冰箱中。提取出的RNA進(jìn)行I %瓊脂糖凝膠電泳，電泳條件為90伏，30分鐘?？梢?jiàn)提取的總RNA的28S、18S、5S亞基大小正確，條帶清晰無(wú)明顯雜帶，可用于下游的反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)。電泳圖見(jiàn)附圖1。
[0044]反轉(zhuǎn)錄使用購(gòu)自Fermentas公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒,具體步驟參見(jiàn)說(shuō)明書(shū)操作。反轉(zhuǎn)錄出的cDNA可保存于_20°C冰箱。
[0045]3、重疊延伸PCR合成單鏈抗體基因片段:擴(kuò)增小鼠輕、重鏈可變區(qū)引物和重疊延伸PCR構(gòu)建單鏈抗體的Linker引物等均使用購(gòu)自GE healthcare公司的重組曬菌體抗體系統(tǒng)(Recombinant Phage Antibody System,RPAS)。首先在PCR管內(nèi)加入下列試劑進(jìn)行輕鏈可變區(qū)擴(kuò)增:小鼠脾B淋巴細(xì)胞cDNA4y I ； 10 X PCR Buffer5 μ I ；dNTP (IOmM) 5 μ I ;輕鏈引物混合液1 μ I ；rTaq酶0.5 μ I ;滅菌去離子水34.5 μ I。另一只PCR管內(nèi)加入下列試劑進(jìn)行重鏈可變區(qū)擴(kuò)增:小鼠脾B淋巴細(xì)胞cDNA4y I ； 10 X PCR Buffer5 μ I ；dNTP (IOmM) 5 μ I ；重鏈引物混合液I P I ;rTaq酶0.5 μ I ;滅菌去離子水34.5 μ I。將上述體系配制好后放入PCR儀經(jīng)95°C，5分鐘；(94°C 30秒，55°C 45秒，72°C I分鐘，30個(gè)循環(huán));72°C 10分鐘，結(jié)束反應(yīng)。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，電泳條件為90伏，30分鐘?？梢?jiàn)擴(kuò)增的重鏈可變區(qū)大小約為350bp，輕鏈可變區(qū)大小約330bp，與預(yù)期一致，電泳圖見(jiàn)附圖2。
[0046]將大小正確的條帶進(jìn)行切膠純化，膠回收的步驟按天根離心柱型DNA純化試劑盒說(shuō)明書(shū)操作；將純化后的條帶再次取2μ I進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，電泳條件為90伏，30分鐘，確定膠回收后DNA的質(zhì)量和大致濃度。
[0047]用Linker引物連接擴(kuò)增的輕重鏈可變區(qū)并在連接產(chǎn)物兩端引入Sfi I和Not I酶切位點(diǎn):通過(guò)重疊延伸PCR法用Linker混合物將純化后的相同摩爾量的輕重鏈可變區(qū)片段進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物在RS Primers (酶切位點(diǎn)引物)作用下在重鏈的5’末端加上SfiI限制性位點(diǎn)和輕鏈的3’末端加上Not I酶切位點(diǎn)，可用于后續(xù)與有相同酶切位點(diǎn)的表達(dá)載體pCANTAB_5E (購(gòu)自Pharmacia公司)進(jìn)行連接。具體步驟參照GE healthcare公司的RPAS系統(tǒng)說(shuō)明書(shū)。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，可見(jiàn)單鏈抗體條帶大小約780bp，與預(yù)期一致，條帶集中，清晰無(wú)雜帶，電泳圖見(jiàn)附圖3。目的條帶進(jìn)行切膠純化及純化后的濃度測(cè)定。對(duì)所構(gòu)建好的單鏈抗體命名為p21ras-Ant1-ScFv。[0048]4、單鏈抗體基因片段的克隆:將構(gòu)建出的單鏈抗體片段p21ras-Anti_ScFv連入PMD-18T載體(購(gòu)自TAKARA公司)，構(gòu)建出pMD-ScFv重組質(zhì)粒。在200 μ I PCR管中配制如下連接體系:pMD-18T 載體 I μ I ;目的片段 DNA0.lpmol-0.3pmol ；Solution I 補(bǔ)足 10 μ I。金屬浴16°C反應(yīng)4小時(shí)。將連接產(chǎn)物加入到100 μ I DH5a感受態(tài)中，冰浴30分鐘。42°C熱激90秒后立即冰浴90秒。加入900 μ I LB液體培養(yǎng)基，37°C，80rpm,振蕩培養(yǎng)I小時(shí)。取200 μ I培養(yǎng)物涂布于含有X-Gal的LB / Amp平板上37°C倒置培養(yǎng)10小時(shí)。
[0049]5、菌液PCR鑒定陽(yáng)性重組子:挑取LB / Amp平板上的單菌落，溶于50 μ I的ddH20中，98°C熱裂解10分鐘后13000rpm離心I分鐘，所得上清即為PCR的模板。在200微升PCR反應(yīng)管內(nèi)加入 10XPCR Buffer2.5μ I ；dNTP Mix (2.5mM each) 2 μ I ；M13F (10 μ M) 0.5 μ I,M13R(10yM)0.5μ I ;菌液 5μ I ;rTaq 酶 0.5 μ I ;ddH2014y I。設(shè)置 PCR 反應(yīng)程序?yàn)轭A(yù)變性940C 4分鐘。(940C I分鐘，57°C I分鐘，72°C I分鐘，30個(gè)循環(huán))，72°C延伸10分鐘，4°C保存。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳，可見(jiàn)在預(yù)期的930bp處出現(xiàn)條帶，確定為陽(yáng)性重組克隆。
[0050]實(shí)施例2:單鏈抗體庫(kù)的建立及篩選鑒定
[0051]1、重組噬菌粒的構(gòu)建
[0052]1.1重組pMD-ScFv載體及表達(dá)載體的雙酶切:將經(jīng)PCR鑒定正確的陽(yáng)性pMD_ScFv克隆提取質(zhì)粒，提取步驟按天根質(zhì)粒小提試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。將重組的PMD-ScFv質(zhì)粒及表達(dá)載體質(zhì)粒PCANTAB-5E (購(gòu)自Pharmacia公司)分別先進(jìn)行Sfi I酶切，在200 μ I PCR反應(yīng)管內(nèi)分別加入表達(dá)載體質(zhì)粒/ pMD-ScFv載體各30 μ I ；Sfi I酶(10U / μ 1)4μ I ；IOXBuffer Μ5 μ 1，ddH2011 μ 1，上述體系配置好后50°C反應(yīng)4小時(shí)。將酶切產(chǎn)物經(jīng)過(guò)膠回收純化后，在新的200 μ IPCR反應(yīng)管中加入純化產(chǎn)物30 μ l，Not I酶(10U / μ 1)2μ I,IOXBuffer Η5μ 1，BSA2 μ 1，Trion Χ-1002 μ 1，ddH209 μ I，上述體系配置好后 37°C 反應(yīng) 4小時(shí)。酶切產(chǎn)物全部加樣進(jìn)行I %瓊脂糖凝膠電泳，重組的PMD-ScFv質(zhì)粒雙酶切后在780bp處出現(xiàn)目的條帶，表達(dá)載體質(zhì)粒雙酶切后在3.5kb處出現(xiàn)目的條帶。目的條帶分別進(jìn)行切膠純化，步驟按天根離心柱型DNA純化試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。
[0053]1.2重組表達(dá)載體的連接:將經(jīng)過(guò)Sfi I和Not I同步雙酶切后的表達(dá)載體PCANTAB-5E與ScFv目的片段按摩爾比1: 5進(jìn)行連接，從而構(gòu)建出含有單鏈抗體基因的重組表達(dá)載體pCANTAB-ScFv。連接總體積為10 μ 1，16°C反應(yīng)4小時(shí)。將連接產(chǎn)物全部加入100 μ I的TGl感受態(tài)中，冰浴30分鐘。42°C熱激90秒后再冰浴90秒。加入900 μ I LB液體培養(yǎng)基，37°C，80rpm,振蕩培養(yǎng)I小時(shí)。取200 μ I培養(yǎng)物涂布于LB / Amp平板上37°C倒置培養(yǎng)10小時(shí)。
[0054]1.3重組表達(dá)載體的鑒定:挑取LB / Amp平板上的單菌落，溶于50 μ I的ddH20中，98°C熱裂解10分鐘后13000rpm離心I分鐘，所得上清即為PCR反應(yīng)的模板。PCR鑒定插入片段使用表達(dá)載體PCANTAB-5E的通用引物，SlF:CAACGTGAAAAAATTATTATTCGC,S6R:GTAAATGAATTTTCTGTATGAGG。在 200 微升 PCR 反應(yīng)管內(nèi)加入 10XPCR Buffer2.5 μ I ;dNTPs(2.5mM each) 2 μ I ；S1F(10 μ Μ) 0.5 μ I, S6R(10 μ Μ) 0.5 μ I ；菌液 5 μ I ;rTaq 酶
0.5 μ I ；ddH2014 μ I。設(shè)置PCR反應(yīng)程序?yàn)轭A(yù)變性94°C 4分鐘。(94°C I分鐘，58°C I分鐘，720C I分鐘，30個(gè)循環(huán))，72°C延伸10分鐘，4°C保存。PCR產(chǎn)物進(jìn)行I %的瓊脂糖凝膠電泳，可見(jiàn)在預(yù)期的950bp處出現(xiàn)條帶。將重組表達(dá)載體pCANTAB-ScFv進(jìn)行Sfi I和Not I分步雙酶切，可見(jiàn)在3.5kb和780bp處有酶切條帶，確認(rèn)為陽(yáng)性重組克隆，電泳圖見(jiàn)附圖4。
[0055]2噬菌體抗體庫(kù)的富集和篩選
[0056]2.1噬菌體抗體庫(kù)的富集:按細(xì)菌數(shù)量與輔助噬菌體數(shù)量1: 20的比例加入輔助噬菌體M13K07 (購(gòu)自GE healthcare公司)于鑒定為陽(yáng)性含有pCANTAB-ScFv的重組子菌液內(nèi)，放恒溫?fù)u床內(nèi)37°C，150rpm,培養(yǎng)2小時(shí)。當(dāng)看到液體變渾濁時(shí)，放入離心機(jī)內(nèi)，室溫下1500g離心25分鐘，棄上清。用2XYTAK液重懸沉淀，37°C，200rpm，過(guò)夜振蕩培養(yǎng)。所得的液體即為經(jīng)過(guò)富集后的噬菌體培養(yǎng)液。
[0057]2.2間接ELISA法篩選單鏈抗體的特異性:將所得培養(yǎng)液室溫下低速離心25分鐘，吸取上清，上清內(nèi)加入I / 5體積的10%脫脂奶粉封閉液，室溫下放置10分鐘。用PH9.6的0.05M碳酸鹽緩沖液將p21ras-H、N、K蛋白分別稀釋至5μ g / ml，在每個(gè)酶標(biāo)板孔內(nèi)加入10 0 μ I稀釋后蛋白液，4°C冰箱內(nèi)過(guò)夜包被。第二天棄孔內(nèi)液體，每孔加入0.15MPBS-Tweenz (磷酸鹽-吐溫)洗滌緩沖液300 μ 1，置振蕩搖床上振搖3分鐘，棄孔內(nèi)液體，重復(fù)洗滌3次。每孔加入1% BSA-PBS封閉液100μ 1，置37°C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)孵育I小時(shí)，洗板三次。每孔加入100 μ I適當(dāng)稀釋的融合表達(dá)的單鏈重組噬菌體克隆上清為一抗，置濕盒內(nèi)37°C恒溫孵育I小時(shí)后洗板三次，同時(shí)設(shè)置空白、陰性、陽(yáng)性對(duì)照。每孔加入1: 2000稀釋的酶標(biāo)二抗(HRP標(biāo)記的抗M13gSp蛋白)100μ1新鮮配制的TMB(四甲基聯(lián)苯胺)底物液，避光作用5-10分鐘，當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照明顯呈藍(lán)色而空白、陰性對(duì)照呈無(wú)色時(shí)即可每孔加入2Μ H2S0450 μ I終止反應(yīng)。使用酶標(biāo)儀讀取OD45tl值，凡待測(cè)孔值/陰性對(duì)照孔值≥2即為陽(yáng)性。
[0058]3、單鏈抗體的可溶性表達(dá)及鑒定
[0059]3.1單鏈抗體的可溶性表達(dá):將經(jīng)過(guò)ELISA篩選出的含有陽(yáng)性重組噬菌體的菌液重新擴(kuò)大培養(yǎng)至0D_~0.8。將培養(yǎng)好的菌液提取質(zhì)粒，步驟按QIAGEN質(zhì)粒小提試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。將3μ1各個(gè)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化至100μΙ BL21(DE3)感受態(tài)中。挑取陽(yáng)性單克隆接于5ml的LB / Amp液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，取前一次的培養(yǎng)菌液按I / 100比例加入到IL新的LB / Amp液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至0D_~0.8。收集培養(yǎng)后的菌體，用滅菌PBS緩沖液重懸菌體，加入100U / μ I溶菌酶使溶菌酶終濃度達(dá)到IU / μ 1，室溫放置15分鐘，4°C，12000rpm，離心30分鐘后收集上清。
[0060]3.2可溶性表達(dá)單鏈抗體的鑒定
[0061]3.2.1SDS-PAGE確定單鏈抗體的相對(duì)分子量:在上一步所得的上清中加入一定量的2X SDS上樣緩沖液，使蛋白的終濃度為3-4mg / ml，混合液在沸水浴中加熱10分鐘，冷卻后即可上樣進(jìn)行電泳。電泳完畢，取出分離膠放在盛有去離子水的容器中，加熱沸騰后取出。加入快速染色液浸沒(méi)分離膠即可，在脫色搖床上搖10分鐘，當(dāng)?shù)鞍讞l帶已可見(jiàn)時(shí)棄染色液。再次加入約50ml的水，加熱沸騰2分鐘，停止加熱繼續(xù)在脫色搖床上搖30分鐘后觀察結(jié)果。結(jié)果可見(jiàn)在30KDa處出現(xiàn)目的條帶，與預(yù)期一致，電泳圖見(jiàn)附圖5。
[0062]3.2.2免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)可溶性表達(dá)的單鏈抗體與腫瘤細(xì)胞株的結(jié)合特異性及敏感性:采用人肝癌細(xì)胞株H印G2，人肝癌細(xì)胞株QGY-7703，人胃癌細(xì)胞株BGC-853，人胃癌細(xì)胞株MKN-28，人結(jié)腸直腸癌細(xì)胞株HCTl 16，人卵巢癌細(xì)胞株SK0V3，人宮頸癌細(xì)胞株Hela,人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231，人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-435，人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7共10種腫瘤細(xì)胞株；將呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的10種腫瘤細(xì)胞株收集于離心管內(nèi)，離心棄上清，用生理鹽水重懸細(xì)胞沉淀，離心棄上清，用95%乙醇重懸細(xì)胞沉淀，離心后讓細(xì)胞沉淀在95%乙醇中固定3小時(shí)，小心取出腫瘤細(xì)胞沉淀塊按常規(guī)組織脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、脫蠟、水化及高壓抗原修復(fù)后，加入制備的可溶性單鏈抗體作為一抗，抗E-tag抗體作為二抗(購(gòu)自Abcam公司)，通過(guò)SP法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞表達(dá)p21ras蛋白的情況。結(jié)果顯示制備的可溶性單鏈抗體可與上述所有腫瘤細(xì)胞株呈不同程度的陽(yáng)性反應(yīng)，顯示了良好的廣泛的抗腫瘤細(xì)胞株譜系。
[0063]4、將鑒定結(jié)果正確的單鏈抗體進(jìn)行測(cè)序:將可溶性表達(dá)結(jié)果正確含有單鏈抗體基因重組pMD-ScFv載體的菌液送測(cè)序公司測(cè)序，DNA測(cè)序結(jié)果表明單鏈抗體的基因序列排列方式為V11-Linker-VL,與小鼠免疫球蛋白可變區(qū)序列數(shù)據(jù)庫(kù)Kabat比對(duì)后發(fā)現(xiàn)序列符合小鼠輕重鏈可變區(qū)基因結(jié)構(gòu)，具體序列見(jiàn)SEQ ID N0:1。
[0064]實(shí)施例3:細(xì)胞內(nèi)抗體的構(gòu)建及對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制實(shí)驗(yàn)
[0065]1、重組腺病毒載體的構(gòu)建
[0066]1.1重組穿梭質(zhì)粒pShuttle-ScFv的構(gòu)建:以連接有單鏈抗體編碼基因的pMD-ScFv重組質(zhì)粒為模板，用末端分別帶有Bgl II和Xho I酶切位點(diǎn)的正向引物(5，-GAAGATCTCCGGA CATGGACCAGGTGAA-3’ )和反向引物(5，-CCCTCGAGACCTAGCGCGTCTGCGGCTG C-3’ )擴(kuò)增單鏈抗體基因片段。擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，使用DNA純化回收試劑盒回收純化780bp大小長(zhǎng)度的目的條帶。使用Bgl II和Xho I分別同時(shí)雙酶切PCR產(chǎn)物和穿梭質(zhì)粒pShuttle-1RES-hrGFP-l (購(gòu)自Stratagene公司)，I %瓊脂糖電泳檢測(cè)酶切是否完全，使用天根DNA純化試劑盒切膠回收完全雙酶切的PCR產(chǎn)物和穿梭質(zhì)粒。使用T4DNALigase連接回收后的PCR產(chǎn)物和酶切后的穿梭質(zhì)粒，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于LB / Kan平板，37°C培養(yǎng)12小時(shí)，構(gòu)建出重組穿梭質(zhì)粒pShuttle-ScFv。挑取單菌落，用穿梭質(zhì)粒載體的通用引物pShuttle-F(5’ -CTCACGGGGATTTCCAAGTC-3’ )和 pShuttle-R(5’-ATGCAGTCGTCGAGGAATTG-3’ )進(jìn)行菌落 PCR 鑒定。將鑒定為陽(yáng)性的重組克隆接于5ml的LB / Kan液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至0D_~0.8左右，使用天根質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒。使用Bgl II和Xho I對(duì)提取的質(zhì)粒做進(jìn)一步的酶切鑒定，酶切結(jié)果見(jiàn)附圖6。對(duì)酶切鑒定陽(yáng)性的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，選擇沒(méi)有突變的含有插入片段的重組穿梭質(zhì)粒進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
[0067]1.2重組腺病毒載體的構(gòu)建:將鑒定結(jié)果正確的重組穿梭質(zhì)粒pShuttle-ScFv進(jìn)行Pme I酶切，將線性化的重組穿梭質(zhì)?；厥占兓?，使用小牛堿性磷酸酶(購(gòu)自TAKARA公司)去磷酸化。將去磷酸化的線性重組穿梭質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化BJ5183-AD-1 (購(gòu)自Stratagene公司)感受態(tài)，轉(zhuǎn)化菌液涂布LB / Kan平板，37 °C培養(yǎng)12小時(shí)。線性的重組穿梭質(zhì)粒pShuttle-ScFv與BJ5183-AD-1細(xì)胞內(nèi)已存在的骨架質(zhì)粒pAdEasy-Ι發(fā)生同源重組，產(chǎn)生重組腺病毒載體。使用天根質(zhì)粒小提試劑盒提取重組腺病毒載體，用Pac I對(duì)重組腺病毒載體進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，鑒定酶切后的片段大小。線性重組穿梭質(zhì)粒pShuttle-ScFv與骨架質(zhì)粒pAdEasy-Ι同源重組后，能夠產(chǎn)生約30kb和4.5kb或3kb大小的Pac I酶切片段，酶切結(jié)果見(jiàn)附圖7。
[0068]2、重組腺病毒KGHV100的制備
[0069]2.1重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染293細(xì)胞:用50 μ I高糖DMEM稀釋0.8 μ g上一步過(guò)程中純化的經(jīng)Pac I酶切產(chǎn)生的約30kb大小的重組片段，再用50 μ I高糖DMEM稀釋2 μ I的Lipofectamine?2000 (購(gòu)自Invitrogen公司),室溫孵育5分鐘。將稀釋的酶切片段和Lipofectamine?2000混合，混勻后室溫孵育20分鐘。取出鋪好的24孔培養(yǎng)板，棄原培養(yǎng)液，換為400 μ I無(wú)血清的高糖DMEM，然后向每孔滴加100 μ I轉(zhuǎn)染混合物，混勻后將培養(yǎng)板放回培養(yǎng)箱內(nèi)。培養(yǎng)6小時(shí)后，吸除舊培養(yǎng)液，每孔更換500 μ I含5% FBS的高糖DMEM。轉(zhuǎn)染后24小時(shí),熒光顯微鏡下觀察有無(wú)綠色熒光。[0070]2.2病毒原液的制備及純化:將經(jīng)過(guò)觀察有綠色熒光的轉(zhuǎn)染細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)10-14天，當(dāng)幾乎所有細(xì)胞呈現(xiàn)腫脹、變圓、脫落,聚集成團(tuán)，即細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathiceffect,CPE)時(shí)，收集細(xì)胞，制備病毒原液。取出細(xì)胞培養(yǎng)板，吹打培養(yǎng)液制備細(xì)胞懸液，吸入離心管，1000rpm離心5分鐘，棄上清，再用少量PBS重懸細(xì)胞沉淀。將細(xì)胞懸液于_80°C甲醇浴/ 37°C水浴反復(fù)凍融4次，每次冷凍或解凍約5分鐘，每次解凍后劇烈渦旋振蕩十秒。12000g尚心10分鐘，所得上清即為病毒原液。將收集的病毒液，用腺病毒純化試劑盒(購(gòu)自CELL B10LABS公司)回收重組腺病毒。由于試劑盒純化腺病毒滴度過(guò)低，無(wú)法滿足下一步實(shí)驗(yàn)要求，所以通過(guò)雙重氯化銫密度梯度離心法純化濃縮重組腺病毒。先用不連續(xù)密度梯度離心將細(xì)胞污染物和一些缺陷性病毒顆粒去除，然后用連續(xù)密度梯度離心將感染性病毒顆粒和缺陷性病毒顆粒完全分開(kāi)。最后用透析法去除濃縮病毒液中的氯化銫，該法所得重組腺病毒KGHV100滿足進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的要求。
[0071]3、細(xì)胞內(nèi)抗體的定位:單鏈抗體片段末端帶有Flag標(biāo)簽蛋白，可用兔源性的抗Flag抗體作為一抗，以羅丹明標(biāo)記的山羊抗兔IgG作為二抗檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)抗體在高表達(dá)p21ras蛋白腫瘤細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)、定位情況。將貼壁生長(zhǎng)的MDA-MB-231細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化后收集，以合適的細(xì)胞密度(IO5 /張)將細(xì)胞接種于載玻片上。待細(xì)胞貼壁良好時(shí)按MOI=IOO加入上一步已制備好的腺病毒KGHV100，病毒感染24h后取出玻片。4%多聚甲醛固定后0.25 %、0.5% Tween-20透化細(xì)胞、封閉液封閉、加入一抗Ant1-FLAG (R)M2Antibody (購(gòu)自 Cell Signaling Technology 公司)4°C孵育過(guò)夜，再加入二抗 Rhodamine-Conjugated Goat Ant1-Rabbit IgG (購(gòu)自 Biomarket 公司)室溫下避光孵育2小時(shí)后封片。在奧林巴斯共聚焦顯微鏡下分別觀察hrGFP和Rhodamine所激發(fā)的綠色熒光和紅色熒光，以確定細(xì)胞內(nèi)抗體的表達(dá)及定位情況。結(jié)果顯示綠色熒光均勻分布于MDA-MB-231細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，說(shuō)明所構(gòu)建的細(xì)胞內(nèi)抗體進(jìn)入細(xì)胞，并且綠色熒光蛋白正確表達(dá)；紅色熒光主要分布于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，說(shuō)明細(xì)胞內(nèi)抗體在細(xì)胞膜內(nèi)表達(dá)。同時(shí)，p21ras蛋白定位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，說(shuō)明細(xì)胞內(nèi)抗體表達(dá)的位置與p21ras蛋白在細(xì)胞膜內(nèi)的分布一致，激光共聚焦掃描圖見(jiàn)附圖8。
[0072]4、細(xì)胞內(nèi)抗體的體外抑瘤實(shí)驗(yàn)
[0073]4.1細(xì)胞增殖能力的檢測(cè):克隆形成實(shí)驗(yàn)是測(cè)定單個(gè)細(xì)胞增殖能力的有效方法之一，其基本原理是單個(gè)細(xì)胞在體外持續(xù)分裂增殖6次以上，其后代所組成的細(xì)胞群體，稱為克隆或集落。一般情況下，每個(gè)克隆可含有50個(gè)以上的細(xì)胞，大小在0.3~1.0mm2之間。通過(guò)計(jì)數(shù)克隆形成率，可對(duì)單個(gè)細(xì)胞的增值能力做定量分析。本次實(shí)驗(yàn)取生長(zhǎng)良好、匯合度達(dá)到80%的細(xì)胞，對(duì)其進(jìn)行腺病毒KGHV100的感染，同時(shí)設(shè)立空載體病毒組對(duì)照。實(shí)驗(yàn)細(xì)胞包括MDA-MB-231細(xì)胞、BEL-7402細(xì)胞、SW480細(xì)胞和0VCAR3細(xì)胞。腺病毒感染24h后使用
0.25%的胰蛋白酶消化貼壁細(xì)胞，用含20%胎牛血清(購(gòu)自Gibco公司)的RPMI1640(購(gòu)自Hyclone公司)培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，以200、500、800個(gè)細(xì)胞的密度分別接種于6孔板，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)，培養(yǎng)2-3周，當(dāng)出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的克隆時(shí)終止培養(yǎng)。用PBS緩沖液漂洗細(xì)胞，甲醇固定，吉姆薩染液染色后，顯微鏡下計(jì)數(shù)大于50個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)，計(jì)算克隆形成率。分析比較腫瘤細(xì)胞感染腺病毒KGHV100后表達(dá)的細(xì)胞內(nèi)抗體對(duì)其增值能力的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示上述高表達(dá)p21ras的腫瘤細(xì)胞，感染腺病毒KGHV100后形成的克隆數(shù)目明顯減少，克隆形成率大大降低，只有感染空載體病毒對(duì)照組的一半。這表明所表達(dá)的細(xì)胞內(nèi)抗體能有效降低高表達(dá)p21ras腫瘤細(xì)胞系的克隆形成能力，高度抑制細(xì)胞增殖活性，結(jié)果見(jiàn)附圖9。
[0074]4.2細(xì)胞侵襲能力的檢測(cè):腫瘤細(xì)胞通過(guò)膜表面特定受體與基質(zhì)或基底膜的層連蛋白(laminin, LN)、纖維連接蛋白(fibronectin, FN)和IV型膠原等相連,然后腫瘤細(xì)胞可釋放蛋白水解酶激活基質(zhì)中已存在的酶原，使基質(zhì)成分降解，最后腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)而填充到被水解的基質(zhì)的空隙 處，如此三個(gè)過(guò)程不斷重復(fù)腫瘤細(xì)胞不斷向深層侵襲。具有侵襲能力的細(xì)胞在趨化劑誘導(dǎo)下可穿過(guò)多孔濾膜而附著在膜的下室側(cè)面，通過(guò)給細(xì)胞染色、鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞、進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較以確定腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。
[0075]按試劑使用說(shuō)明，用提前預(yù)冷的PBS緩沖液將50mg / L的Matrigel (購(gòu)自BDMatrigelTM公司)稀釋后包被細(xì)胞小室Transwell微孔膜，每孔加入60 μ I。用腺病毒KGHV100分別感染MDA-MB-231細(xì)胞、BEL-7402細(xì)胞、SW480細(xì)胞和0VCAR3細(xì)胞。感染24小時(shí)后使用0.25%的胰蛋白酶消化細(xì)胞，離心收集細(xì)胞沉淀，用含2%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，以3 X IO4個(gè)細(xì)胞的密度接種于基質(zhì)膠Matrigel包被的Transwell微孔膜上表面。在嵌套Transwell微孔膜的24孔板中加入含20%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)48小時(shí)。用棉簽輕輕擦去微孔膜上層細(xì)胞后，使用95%乙醇固定微孔膜下層細(xì)胞15分鐘。蘇木素染色后，無(wú)水乙醇、蒸餾水漂洗，室溫晾干后顯微鏡下計(jì)數(shù)微孔膜下層細(xì)胞數(shù)目。分析比較腫瘤細(xì)胞感染腺病毒KGHV100后表達(dá)的細(xì)胞內(nèi)抗體對(duì)其侵襲能力的影響。結(jié)果顯示上述高表達(dá)p21ras的腫瘤細(xì)胞感染腺病毒KGHV100后腫瘤侵襲能力下降至對(duì)照組的一半左右，與對(duì)照組相比具有顯著的統(tǒng)計(jì)意義(P〈0.05)，結(jié)果見(jiàn)附圖10。
[0076]4.3細(xì)胞周期的檢測(cè):通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)碘化丙唳PI (購(gòu)自Beckman公司)染色法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)DNA含量，將不同細(xì)胞周期時(shí)相區(qū)分為Gl / GO期，S期，G2 / M期，通過(guò)專業(yè)軟件計(jì)算各時(shí)相的百分率。用腺病毒KGHV100分別感染MDA-MB-231細(xì)胞、BEL-7402細(xì)胞、SW480細(xì)胞和0VCAR3細(xì)胞。感染48h后使用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，并吹打成單細(xì)胞懸液。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組取I X IO6個(gè)細(xì)胞，經(jīng)4°C預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2次，用預(yù)冷的75%乙醇4°C固定細(xì)胞過(guò)夜，再次使用預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2次。加入PI染液0.5ml對(duì)細(xì)胞進(jìn)行避光染色30min。使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞PI熒光信號(hào)，其中激發(fā)光波長(zhǎng)為488nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為620nm，每個(gè)樣品收集多于10000個(gè)熒光信號(hào)。使用MultiCycle DNA軟件分析細(xì)胞熒光強(qiáng)度、細(xì)胞周期分布，并計(jì)算細(xì)胞增殖指數(shù)。分析比較腫瘤細(xì)胞感染腺病毒KGHV100后表達(dá)的細(xì)胞內(nèi)抗體對(duì)其細(xì)胞周期分布的影響。結(jié)果顯示上述高表達(dá)p21ras蛋白的腫瘤細(xì)胞在感染腺病毒KGHV100后，GO / Gl期細(xì)胞比例明顯增高、S期和G2 / M期比例降低。表明細(xì)胞的增殖指數(shù)明顯降低，相對(duì)于對(duì)照組具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈0.05)。
[0077]5細(xì)胞內(nèi)抗體的體內(nèi)抑瘤實(shí)驗(yàn)
[0078]5.1裸鼠移植瘤模型的建立:實(shí)驗(yàn)細(xì)胞BEL-7402和SW480生長(zhǎng)良好、匯合度達(dá)到80%時(shí)，使用胰蛋白酶消化，離心收集細(xì)胞，PBS緩沖液洗滌細(xì)胞后將細(xì)胞密度調(diào)整成IO7個(gè)細(xì)胞/ 200 μ 1，作為單次注射用量。將制備好的細(xì)胞注射接種于SPF級(jí)4周齡雌性Balb /c裸鼠,每種腫瘤細(xì)胞接種10只，觀察裸鼠成瘤后所制備的細(xì)胞內(nèi)抗體對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的體內(nèi)抑制實(shí)驗(yàn)。
[0079]5.2細(xì)胞內(nèi)抗體對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的體內(nèi)抑制實(shí)驗(yàn):對(duì)成瘤后的裸鼠進(jìn)行分組,每組5只。當(dāng)瘤體平均直徑達(dá)到0.5cm時(shí)，進(jìn)行瘤內(nèi)多點(diǎn)腺病毒KGHV100注射，同時(shí)設(shè)立空載體腺病毒組對(duì)照。腺病毒注射量為3 X IO8Pfu /只，每3天注射I次，共注射7次。注射后對(duì)裸鼠進(jìn)行觀察，每隔一天稱量裸鼠體重，并測(cè)量裸鼠瘤體長(zhǎng)、短徑，計(jì)算瘤體體積，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。分析比較注射重組腺病毒KGHV100后表達(dá)的細(xì)胞內(nèi)抗體對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制情況。結(jié)果顯示在上述高表達(dá)p21ras蛋白腫瘤細(xì)胞的成瘤裸鼠中，實(shí)驗(yàn)組腫瘤生長(zhǎng)速度明顯減慢，說(shuō)明瘤內(nèi)注射的腺病毒KGHV100能夠顯著抑制腫瘤的生長(zhǎng)，與對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Ρ〈0.05)，結(jié)果見(jiàn)附圖11、12。
[0080]瘤體體積=I / 2長(zhǎng)徑X短徑2`。
【權(quán)利要求】
1.一種抗p21ras蛋白的單鏈抗體,其特征在于:其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
2.編碼權(quán)利要求1所述抗p21ras蛋白的單鏈抗體的多核苷酸,其特征在于:其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
3.權(quán)利要求1所述抗p21ras蛋白的單鏈抗體在制備與p21ras基因相關(guān)的腫瘤藥物中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述抗p21ras蛋白的單鏈抗體在制備與p21ras基因相關(guān)的腫瘤藥物中的應(yīng)用，其特征在于:與p21ras基因相關(guān)的腫瘤細(xì)胞包括肝癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞、結(jié)腸直腸癌細(xì)胞、宮頸 癌細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞。
【文檔編號(hào)】A61K39/395GK103880959SQ201410069496
【公開(kāi)日】2014年6月25日 申請(qǐng)日期:2014年2月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月28日
【發(fā)明者】楊舉倫, 甄時(shí)建, 劉杜先, 胡奇嬋, 周云剛, 陳玥 申請(qǐng)人:成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院