一種協(xié)同抑癌的前列腺癌藥物組合物的制作方法
【專利摘要】目前學(xué)術(shù)界關(guān)于黃酮對(duì)腫瘤起促進(jìn)還是抑制作用尚存在爭(zhēng)議，本發(fā)明公開了黃酮與雙氫睪酮在治療前列腺癌中的協(xié)同作用，即當(dāng)存在體內(nèi)正常濃度的雙氫睪酮時(shí)，黃酮才能正常發(fā)揮抑癌作用，本發(fā)明涉及生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明通過(guò)體外雙報(bào)告技術(shù)、MTT技術(shù)以及Western?Blot檢測(cè)技術(shù)，證明黃酮與體內(nèi)激素雙氫睪酮存在顯著的協(xié)同抑癌作用。黃酮和雙氫睪酮協(xié)同活化雌激素受體（ERβ）形成二聚體特異結(jié)合到p21WAF1/Cip1的啟動(dòng)子上，上調(diào)p21蛋白表達(dá)，顯著影響細(xì)胞周期，促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞凋亡。因此，我們的發(fā)明提供了一種黃酮與雙氫睪酮協(xié)同治療前列腺癌的新型手段和分子機(jī)制。
【專利說(shuō)明】一種協(xié)同抑癌的前列腺癌藥物組合物
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明公開了黃酮(Flavone)與雙氫睪酮(DHT)在治療前列腺癌中的協(xié)同作用，即當(dāng)存在體內(nèi)正常濃度的雙氫睪酮時(shí)，黃酮才能正常發(fā)揮抑癌作用，抑制前列腺癌增殖，并促進(jìn)前列腺癌凋亡。本發(fā)明涉及生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]前列腺癌是嚴(yán)重威脅全世界男性健康的惡性腫瘤，為老年人疾病，研究表明環(huán)境和飲食因素是影響前列腺癌發(fā)生發(fā)展的重要因素。在亞洲國(guó)家，其發(fā)病率和死亡率明顯低于西方國(guó)家。相比西方國(guó)家，亞洲飲食中更多黃酮類物質(zhì)的攝入引起了世界研究者的廣泛關(guān)注。
[0003]黃酮是類黃酮類植物雌激素的一種，關(guān)于黃酮對(duì)癌癥的作用學(xué)術(shù)界有兩種看法:有報(bào)道表明黃酮對(duì)包括前列腺癌在內(nèi)的多種腫瘤具有顯著的預(yù)防作用，但也有報(bào)道顯示黃酮對(duì)包括前列腺癌在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞增殖呈現(xiàn)促進(jìn)作用。
[0004]值得一提的是，前列腺癌是一種增齡性疾病，發(fā)病率隨著年齡增長(zhǎng)而逐漸升高，而且前列腺癌是一種潛伏癌，80歲以上人群中可達(dá)40%，可能是由于年齡增加，體內(nèi)雙氫睪酮水平下降導(dǎo)致，但雙氫睪酮與前列腺癌相關(guān)性及其分子機(jī)制尚不明確。前列腺癌早期治療采用摘除睪丸并給以雄激素拮抗劑的去勢(shì)治療，但是多數(shù)術(shù)后前列腺癌患者會(huì)病情復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)的原因和分子機(jī)制尚不明確，提示了雄激素可能的抗癌作用。
[0005]我們的研究發(fā)現(xiàn)黃酮與雙氫睪酮在治療前列腺癌中起協(xié)同作用，共同存在時(shí)發(fā)揮抑制前列腺癌的保護(hù)作用；且只有存在正常濃度的雙氫睪酮時(shí)，黃酮才能正常發(fā)揮對(duì)前列腺癌的抑癌作用，二者缺一不可。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明公開了黃酮(Flavone)與雙氫睪酮(DHT)在治療前列腺癌中的協(xié)同作用，即當(dāng)存在體內(nèi)正常濃度的雙氫睪酮時(shí)，黃酮才能正常發(fā)揮抑癌作用，抑制前列腺癌增殖，并促進(jìn)前列腺癌凋亡。
[0007]首先，以細(xì)胞周期重要調(diào)控基因P21WAF1MP1啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性為檢測(cè)指標(biāo)，我們發(fā)現(xiàn)黃酮和雙氫睪酮具有激活p21WAF1/apl轉(zhuǎn)錄的協(xié)同作用。進(jìn)一步，我們發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)ERβ放大這種協(xié)同效應(yīng)，而ERa或AR沒(méi)有明顯作用。通過(guò)基因ERP過(guò)表達(dá)和基因沉默實(shí)驗(yàn)，我們證明黃酮和雙氫睪酮協(xié)同活p21WAF1/eipl轉(zhuǎn)錄效應(yīng)是通過(guò)ERi3的分子靶點(diǎn)實(shí)現(xiàn)的。蛋白質(zhì)表達(dá)檢測(cè)表明，過(guò)表達(dá)ERi3顯著上調(diào)了 P21WAF1/Gipl的表達(dá)，而基因敲除ERi3則逆轉(zhuǎn)了這個(gè)作用。以上結(jié)果證明了黃酮和雙氫睪酮激活p21WAF1/eipl啟動(dòng)子是通過(guò)ERP實(shí)現(xiàn)的。
[0008]通過(guò)MTT試驗(yàn)，證明黃酮和雙氫睪酮協(xié)同抑制了前列腺癌DU145細(xì)胞的增殖，而且這種抑制作用可以被ERi3過(guò)表達(dá)所增強(qiáng)，被ERi3-shRNA所逆轉(zhuǎn)。采用碘化丙叮檢測(cè)細(xì)胞周期證明了黃酮和雙氫睪酮協(xié)同時(shí)，細(xì)胞出現(xiàn)亞Gl期細(xì)胞凋亡峰，細(xì)胞凋亡可以被ERβ過(guò)表達(dá)所增強(qiáng)，被ERi3-shRNA所逆轉(zhuǎn)。同時(shí)黃酮與雙氫睪酮的共刺激抑制了細(xì)胞增殖指標(biāo)BcL2、PCNA的蛋白表達(dá)，促進(jìn)了細(xì)胞凋亡指標(biāo)CaSpaSe3活化型的發(fā)生，這種作用可被ERi1-ShRNA所逆轉(zhuǎn)。以上結(jié)果證明黃酮與雙氫睪酮激活ERi3后顯著抑制細(xì)胞增殖，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。
[0009]本發(fā)明提供了一種治療前列腺癌的新型手段和分子機(jī)制，即黃酮與雙氫睪酮通過(guò)協(xié)同效應(yīng)激活ERβ，上調(diào)細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)基因p21WAF1/eip1，實(shí)現(xiàn)前列腺癌中的治療作用。
【具體實(shí)施方式】:
[0010]p21ffAF1/Cipl是一種細(xì)胞周期蛋白(CyciinS)依賴激酶(CDKS)的抑制蛋白(CKI)，是調(diào)控細(xì)胞周期的基因。當(dāng)DNA損傷和細(xì)胞衰老時(shí)，p53增多并誘導(dǎo)p21WAF1/eipl轉(zhuǎn)錄，p21WAF1/Cipl與相應(yīng)的CDK-Cyclin復(fù)合物結(jié)合，抑制其蛋白激酶的激活，阻滯細(xì)胞周期的運(yùn)行。目前p21ffAF1/Cipl的激活已經(jīng)成為抗腫瘤藥物發(fā)現(xiàn)的重要分子靶點(diǎn)。
[0011]首先，利用p21WAFVapl激活的啟動(dòng)子熒光素酶雙報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)，我們分別
比較了三種不同類黃酮分子-大豆苷元(daidzein)、染料木黃素(genistein)和黃酮
(flavone)，與雙氫睪酮(DHT河能激活p21WAF1/Gipl啟動(dòng)子的協(xié)同作用。如圖1所示，以不加藥組為對(duì)照，我們發(fā)現(xiàn)單獨(dú)加入各激素時(shí)P21WAF1/eipl啟動(dòng)子沒(méi)有被激活，但在黃酮和雙氫睪酮共刺激作用下，DU145細(xì)胞內(nèi)的P21WAF1/Gipl啟動(dòng)子則被顯著激活，而大豆苷元和染料木黃素沒(méi)有這種顯著的協(xié)同作用(圖1)。因此，該結(jié)果說(shuō)明了黃酮和雙氫睪酮具有激活p21WAF1/Cipl啟動(dòng)子的顯著協(xié)同作用且具有特異性。
[0012]接下來(lái)，為了證明 黃酮和雙氫睪酮的這種顯著的協(xié)同作用是通過(guò)哪種激素受體實(shí)現(xiàn)的，我們?cè)贒U145細(xì)胞里分別過(guò)表達(dá)了雌激素受體β (ERi3)，雌激素受體a (ERa)或雄激素受體(AR-WT)。如圖2所示，以加入vector組為對(duì)照，只有過(guò)表達(dá)ERP時(shí)黃酮和雙氫睪酮協(xié)同激活p21WAF1/eipl啟動(dòng)子的作用被顯著放大，而過(guò)表達(dá)ERa或AR則削弱了這種協(xié)同作用。進(jìn)一步采用基因干涉實(shí)驗(yàn)沉默ER β后，我們發(fā)現(xiàn)ERi3不表達(dá)顯著逆轉(zhuǎn)了黃酮和雙氫睪酮對(duì)p21WAF1/eipl啟動(dòng)子的激活作用(圖3)。蛋白質(zhì)表達(dá)檢測(cè)表明，過(guò)表達(dá)ERi3顯著上調(diào)了 p21WAF1/eipl的表達(dá)，而基因敲除ERP則逆轉(zhuǎn)了這個(gè)作用(圖4)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，黃酮和雙氫睪酮協(xié)同激活P21WAF1/eipl啟動(dòng)子是通過(guò)ERi3實(shí)現(xiàn)的。
[0013]因?yàn)樾奂に胤且蕾囆颓傲邢侔┘?xì)胞系DU145內(nèi)僅表達(dá)ERi3，我們?cè)贒U145空細(xì)胞內(nèi)加入黃酮和雙氫睪酮之后，分別在加藥當(dāng)天、加藥第2天、第4天以及加藥第6天，檢測(cè)各組活細(xì)胞數(shù)目。我們發(fā)現(xiàn)，不加藥、只加入雙氫睪酮或只加入黃酮時(shí)細(xì)胞不斷增殖，但是黃酮和雙氫睪酮同時(shí)加入時(shí)從加藥第二天起就出現(xiàn)顯著的細(xì)胞增殖抑制現(xiàn)象(圖5)。因此說(shuō)明，黃酮和雙氫睪酮協(xié)同作用顯著抑制細(xì)胞增殖。
[0014]通過(guò)過(guò)表達(dá)和基因沉默實(shí)驗(yàn)，我們證明黃酮和雙氫睪酮協(xié)同抑癌效應(yīng)是通過(guò)ERi3的分子靶點(diǎn)實(shí)現(xiàn)的。過(guò)表達(dá)ERi3時(shí)，黃酮和雙氫睪酮協(xié)同作用顯著抑制細(xì)胞增殖的作用被增強(qiáng)，而基因沉默ERi3則逆轉(zhuǎn)了這種作用(圖6)。說(shuō)明黃酮和雙氫睪酮協(xié)同激活ERi3抑制細(xì)胞增殖。
[0015]采用碘化丙啶檢測(cè)細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測(cè)了黃酮和雙氫睪酮對(duì)前列腺癌凋亡誘導(dǎo)的協(xié)同效應(yīng)。我們發(fā)現(xiàn)，不加藥組、只加入雙氫睪酮組或只加入黃酮組，前列腺癌DU145細(xì)胞不出現(xiàn)凋亡峰，但是黃酮和雙氫睪酮同時(shí)加入時(shí)，細(xì)胞出現(xiàn)明顯的亞Gl期細(xì)胞凋亡峰(7.22%)，且過(guò)表達(dá)ERβ促使細(xì)胞凋亡峰面積增大(12.26%)，而基因沉默ERβ后細(xì)胞凋亡峰消失(圖7)。細(xì)胞周期檢測(cè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果證實(shí)并確認(rèn)了黃酮和雙氫睪酮協(xié)同激活ERi3促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞凋亡。
[0016]以上結(jié)果證明黃酮和雙氫睪酮通過(guò)ERi3協(xié)同抑制前列腺癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞凋亡。最后，我們檢測(cè)了細(xì)胞增殖指標(biāo)BcL2、PCNA以及細(xì)胞凋亡指標(biāo)CaSpaSe3的表達(dá)情況。我們發(fā)現(xiàn)，在黃酮和雙氫睪酮的共同刺激下，細(xì)胞增殖標(biāo)志物BcL2和PCNA的表達(dá)顯著降低，細(xì)胞凋亡標(biāo)志物CaSpaSe3出現(xiàn)活化型，而基因沉默ERβ逆轉(zhuǎn)了這種作用(圖8)。
[0017]我們的研究發(fā)現(xiàn)黃酮與雙氫睪酮在治療前列腺癌中起協(xié)同作用，共同起保護(hù)作用，當(dāng)存在體內(nèi)正常濃度的雙氫睪酮時(shí)，黃酮才能正常發(fā)揮抑癌作用，二者缺一不可。黃酮和雙氫睪酮協(xié)同活化ERi3 二聚體，活化的ERi3 二聚體特異結(jié)合到P21WAF1/Gipl的啟動(dòng)子上，上調(diào)p21WAF1/eipl蛋白表達(dá)，顯著影響細(xì)胞周期，促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞凋亡。因此，我們的發(fā)明提供了治療前列腺癌的新型分子機(jī)制，即黃酮與雙氫睪酮在治療前列腺癌中的協(xié)同作用，其中雌激素受體ERP為協(xié)同作用的靶點(diǎn)、細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)基因p21WAF1/eipl為協(xié)同作用的靶基因，我們的發(fā)明為前列腺癌的治療提供了新型分子靶向和新思路。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】:
[0018]圖1顯示黃酮和雙氫睪酮協(xié)同激活DU145細(xì)胞內(nèi)P21WAF1/Gipl啟動(dòng)子；
[0019]圖2顯示黃酮和雙氫睪酮通過(guò)ERβ協(xié)同激活DU145細(xì)胞內(nèi)p21WAFlMpl啟動(dòng)子；
[0020]圖3顯示基因沉默ERi3逆轉(zhuǎn)黃酮和雙氫睪酮對(duì)于DU145細(xì)胞內(nèi)P21WAF1/Gipl的激活；
[0021]圖4顯示基因沉默ERi3降低黃酮和雙氫睪酮作用下DU145細(xì)胞內(nèi)p21WAFVapl的表達(dá)；
[0022]圖5顯示黃酮和雙氫睪酮顯著協(xié)同抑制DU145細(xì)胞增殖；
[0023]圖6顯示黃酮和雙氫睪酮通過(guò)ER β抑制DU145細(xì)胞增殖；
[0024]圖7為碘化丙叮檢測(cè)細(xì)胞周期；
[0025]圖8為Western blot檢測(cè)細(xì)胞增殖指標(biāo)BcL2和PCNA以及凋亡指標(biāo)活化型caspase3。
【權(quán)利要求】
1.一種協(xié)同抑癌的藥物組合物，所述組合物包括:黃酮(Flavone)和雙氫睪酮(DHT)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，黃酮(Flavone)和雙氫睪酮(DHT)在治療前列腺癌中的協(xié)同效應(yīng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中所述黃酮與雙氫睪酮發(fā)揮協(xié)同作用的靶點(diǎn)為 ER3。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中所述黃酮與雙氫睪酮發(fā)揮協(xié)同作用的靶基因?yàn)?p21WAF1/Cip1。
5.權(quán)利要求1所述的藥物組`合物在預(yù)防或治療前列腺癌中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K31/5685GK103877098SQ201410003979
【公開日】2014年6月25日 申請(qǐng)日期:2014年1月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月3日
【發(fā)明者】李曉萌, 劉舒, 許瑩 申請(qǐng)人:東北師范大學(xué)