專利名稱：：脂多糖結(jié)合蛋白和其單克隆抗體、以及制備方法和用途的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及發(fā)明涉及基因重組工程，特別是涉及脂多糖結(jié)合蛋白及其單克隆抗體、以及脂多糖結(jié)合蛋白及其單克隆抗體的制備方法和用途。
背景技術：
：脂多糖結(jié)合蛋白(lipopolysaccharidebindingprotein，LBP)，是主要由肝細胞(腎近曲小管上皮細胞、肺泡壁II型細胞也可少量合成)產(chǎn)生的一種介導內(nèi)毒素與靶細胞受體結(jié)合的急性期應激反應蛋白，它能顯著促進脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)與單核/巨噬細胞膜表面的CD14(mCD14)結(jié)合，形成LPS-LBP-CD14復合物，經(jīng)單核/巨噬細胞膜上的Toll-LikeReceptor4(TLR4)-MyeloidDifferentiationProtein2(MD-2)-MYD88識別復合物轉(zhuǎn)導，再經(jīng)多顯性轉(zhuǎn)錄核因子(nuclearfactorkappaB，NF-kappaB)向胞核內(nèi)傳遞信號，激活單核-巨噬細胞，促進炎性因子的分泌及炎癥的發(fā)生、發(fā)展，導致肝、肺、腎等重要臟器發(fā)生嚴重損害。人脂多糖結(jié)合蛋白(LBP)基因全長28.5Kb，位于人染色體20q11.23-q12上，含有14個外顯子，編碼與脂多糖結(jié)合部位的基因位于第3、4外顯子(即成熟完整LBP的N端區(qū))，基因5′端含有急性期反應蛋白所共有的啟動子急性期反應元件/信號傳導轉(zhuǎn)錄活化3(APRE/STAT-3)，啟動子與外顯子之間還含有促炎癥轉(zhuǎn)錄因子活化蛋白1(AP-1)和C/EBP轉(zhuǎn)錄因子，3′端為富含AATAAA的非編碼區(qū)，因此LBP基因能在急性期被激活、分泌表達。成熟完整脂多糖結(jié)合蛋白的相對分子量(Mr)60kDa，其家族包括人脂多糖結(jié)合蛋白、殺菌通透性增強蛋白(BactericidalPermeability-Increasingprotein，BPI)、血漿膽固醇脂轉(zhuǎn)移蛋白(PlasmaCholesterylEsterTransferProtein，CETP)、磷脂轉(zhuǎn)移蛋白(phospholipidtransferprotein，PLTP)等。脂多糖結(jié)合蛋白的N端在空間上形成兩個無極性的脂性結(jié)合位點，為人脂多糖結(jié)合蛋白與脂多糖的結(jié)合點，人脂多糖結(jié)合蛋白與CD14的結(jié)合部位則位于脂多糖結(jié)合蛋白的C-末端。脂多糖結(jié)合蛋白能顯著的促進脂多糖與mCD14結(jié)合，Nanbo等人發(fā)現(xiàn)人脂多糖結(jié)合蛋白可將機體對脂多糖識別的敏感度提高1000倍，在炎癥急性反應早期，當血清脂多糖濃度相對較低時，就已有微量脂多糖結(jié)合蛋白參與，并且只有在脂多糖結(jié)合蛋白存在情況下機體才能對小劑量的脂多糖或細菌產(chǎn)生反應，從而增強機體抗感染作用，但在急性炎癥反應中后期，當血清脂多糖結(jié)合蛋白含量升高時，脂多糖結(jié)合蛋白會導致單核/巨噬細胞過度活化，大量分泌白細胞介素(IL)-1β、IL-6、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等細胞因子，這些因子又強烈地加速脂多糖結(jié)合蛋白基因的轉(zhuǎn)錄和脂多糖結(jié)合蛋白多肽的合成，進而導致機體嚴重損害，出現(xiàn)感染性休克、彌漫性毛細血管內(nèi)凝血(DIC)、多臟器衰竭(MOF)(見EurJBiochem1999，260(1)183-191)等，因此如何抑制過度的炎癥反應和防止彌漫性毛細血管內(nèi)凝血、多臟器衰竭的發(fā)生已成為當今臨床工作中的一個重要研究方向?，F(xiàn)有技術認為患者血液中脂多糖結(jié)合蛋白濃度可作為判斷損傷、預后的一個重要參考指標，如急性重度胰腺炎患者血液中脂多糖結(jié)合蛋白濃度會明顯升高，并且脂多糖結(jié)合蛋白濃度越高，機體損傷越重、預后越差，Berner發(fā)現(xiàn)在新生兒發(fā)生敗血癥早期，臍血或外周血中脂多糖結(jié)合蛋白水平升高顯著，并持續(xù)達24h以上，因此可將脂多糖結(jié)合蛋白水平作為指標監(jiān)測新生兒感染是否加重(Clin-Diagn-Lab-Immunol，2002，9440-445)。Uesugi等人進一步發(fā)現(xiàn)脂多糖結(jié)合蛋白能加重酒精對肝臟的損害(見J-Immunol，2002，1682963-2969.)，這是因為酒精導致肝細胞中脂多糖結(jié)合蛋白、CD14的含量升高，從而對脂多糖的損傷更敏感。如何對應脂多糖結(jié)合蛋白在機體內(nèi)變化規(guī)律，使得在一定濃度水平下不會導致過度炎癥反應的損害，也成為當今臨床工作中需要解決的一個重要問題。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術問題之一在于提供一種脂多糖結(jié)合蛋白氨基端片段；本發(fā)明所要解決的技術問題之二在于提供一種抗脂多糖結(jié)合蛋白氨基端片段單克隆Fab抗體；本發(fā)明所要解決的技術問題之三在于提供一種抗脂多糖結(jié)合蛋白氨基端片段的dsFv抗體；本發(fā)明所要解決的技術問題之四在于提供一種脂多糖結(jié)合蛋白氨基端片段的制備方法；本發(fā)明所要解決的技術問題之五在于提供一種一種抗脂多糖結(jié)合蛋白氨基端片段單克隆Fab抗體的制備方法；本發(fā)明所要解決的技術問題之六在于提供一種抗脂多糖結(jié)合蛋白氨基端片段的dsFv抗體的制備方法；本發(fā)明所要解決的技術問題之七在于提供一種抗脂多糖結(jié)合蛋白氨基端片段單克隆Fab抗體和dsFv抗體的應用；本發(fā)明所要解決的技術問題之八在于提供一種抗脂多糖結(jié)合蛋白氨基端片段單克隆Fab抗體和dsFv抗體的應用(與之七重復，應去除)。為實現(xiàn)本發(fā)明目的而提供的一種脂多糖結(jié)合蛋白氨基端片段，編碼所述脂多糖結(jié)合蛋白氨基端片段的DNA序列為Atgggggccttggccagagccctgccgtccatactgctggcattgctgcttacgtccaccccagaggctctgggtgccaaccccggcttggtcgccaggatcaccgacaagggactgcagtatgcggcccaggaggggctattagctctgcagagtgagctgctcaggatcacgctgcctgacttcaccggggacttgaggatcccccacgtcggccgtgggcgctatgagttccacagcctgaacatccacagctgtgagctgcttcactctgcgctgaggcctgtccctggccagggcctgagtctcagcatctccgactcctccatccgggtccagggcaggtggaaggtgcgcaagtcattcttcaaactacagggctcctttgatgtcagtgtcaagggcatcagcatttcggtcaacctcctgttgggcagcgagtcctccgggaggcccacagttactgcctccagctgcagcagtgacatcgctgacgtggaggtggacatgtcgggagacttggggtggctgttgaacctcttccacaaccagattgagtccaagttccagaaagtactggagagcaggatttgcgaaatgatccagaaatcggtgtcctccgatcatcagccttattctcaaactctg其中，下劃線區(qū)為編碼信號肽序列；以基因數(shù)據(jù)庫上脂多糖結(jié)合蛋白序列為標準，發(fā)生點突變的有G(144)→A(144)；T(626)→A(626)；A(627)→T(627)；C(637)→T(637)；T(638)→C(638)；C(639)→T(639)。為實現(xiàn)本發(fā)明目的還提供一種脂多糖結(jié)合蛋白氨基端片段，所述脂多糖結(jié)合蛋白氨基端片段的氨基酸序列為MGALARALPSILLALLLTSTPEALGANPGLVARITDKGLQYAAQEGLLALQSELLRITLPDFTGDLRIPHVGRGRYEFHSLNIHSCELLHSALRPVPGQGLSLSISDSSIRVQGRWKVRKSFFKLQGSFDVSVKGISISVNLLLGSESSGRPTVTASSCSSDIADVEVDMSGDLGWLLNLFHNQIESKFQKVLESRICEMIQKSVSSDHQPYSQTL其中，下劃線區(qū)為信號肽的序列；以基因數(shù)據(jù)庫上脂多糖結(jié)合蛋白氨基酸序列為標準，發(fā)生點突變的有L(209)→H(209)；L(213)→S(213)。為實現(xiàn)本發(fā)明目的還提供一種抗脂多糖結(jié)合蛋白氨基端片段單克隆Fab抗體，所述Fab抗體輕重鏈VL和VH的可變區(qū)基因序列及氨基酸序列如下輕鏈VL的基因序列為κ輕鏈ACCCAGTCTCCATCCTCCCTTTCTGCATCTGTCGGAGACAGAGTCACCACCACTACGCGGGCAAGTCAGGTAATTAGCAGTTCTTTAGCCTGGTATCAGCAAAAACCAGGCAAAGCCCCTAAACTCCTGATCTACGGTGCGTCCACTTACAAATTGGGGTCCCTTTACGGTTCAGCGGCAGTGGGTCTGGGACCGATTTCACTCTCACCATTGACGTCCCGCAGCCTGAAGATTCTGCAACTTATTACT對應氨基酸序列為TQSPSSLSASVGDRVTTTTRASQVISSSLAWYQQKPGKAPKLLIYGASTYKLGSLYGSAAVGLGPISLSPLTSRSLKILQLIT重鏈VH的基因序列為VH3亞群GGAGGCTTAGTTCAACCGGGGGGGTCACTTACACTCTCCTGTGCAGCATCTGGATTCCCATTCAGTACGTACTGGATGCACTGGGTCCGTCAAGGTCCAGGGAAGCGGCCGGTGTGGGTCTCTCGTGTCCACAGTGAAGGGAGTGCCCGAAGTTACGCGGGCGCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGGGACAACGCCAGGAACACCGTCTATCTGCAGATGAATAGTCTGACAGACGAAGACACGGGTGTCTATTATTGTGCGAGA對應氨基酸序列為GGLVQPGGSLTLSCAASGFPFSTYWMHWVRQGPGKRPVWVSRVHSEGSARSYAGAVKGRFTISRDNARNTVYLQMNSLTDEDTGVYYCAR其中，下劃線為CDRS區(qū)。為實現(xiàn)本發(fā)明目的還提供了一種抗脂多糖結(jié)合蛋白氨基端片段的dsFv抗體，所述dsFv抗體輕鏈rVL的可變區(qū)基因序列及氨基酸序列為ACCCAGTCTCCATCCTCCCTTTCTGCATCTGTCGGAGACAGAGTCACCACCACTACGCGGGCAAGTCAGGTAATTAGCAGTTCTTTAGCCTGGTATCAGCAAAAACCAGGCAAAGCCCCTAAACTCTGTATCTACGGTGCGTCCACTTACAAATTGGGGTCCCTTTACGGTTCAGCGGCAGTGGGTCTGGGACCGATTTCACTCTCACCATTGACGTCCCGCAGCCTGAAGATTCTGCAACTTATTACT對應氨基酸序列為TQSPSSLSASVGDRVTTTTRASQVISSSLAWYQQKPGKAPKLCIYGASTYKLGSLYGSAAVGLGPISLSPLTSRSLKILQLIT其中，下劃線為CDRS區(qū)。為實現(xiàn)本發(fā)明目的而提供的一種脂多糖結(jié)合蛋白氨基端片段的制備方法，提取編碼脂多糖結(jié)合蛋白氨基端片段的cDNA序列，通過病毒表達系統(tǒng)，采用細胞制備了脂多糖結(jié)合蛋白氨基端片段。所述病毒表達系統(tǒng)為BAC-TO-BAC桿狀病毒表達系統(tǒng)；所述細胞為昆蟲sf21細胞。所述的脂多糖結(jié)合蛋白氨基端片段的制備方法，具體包括下列步驟從感染休克死亡患者的肝細胞內(nèi)提取信使RNA(mRNA)，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA文庫，以特異引物5′-GTCGACTGGAGTGGGAATCTAGGA-3′；5′-AAGCTTATTCTGTGTTGTAACTGG-3′擴增出編碼人脂多糖結(jié)合蛋白氨基端片段的雙鏈DNA序列，并與pMD19-TSimpleVector連接，轉(zhuǎn)入感受態(tài)DH-5a菌中；測試正確后以SalI、HindIII行雙酶切，目的序列回收、純化，并與相同酶處理的載體pFASTBAC連接，構(gòu)建質(zhì)粒pFASTBAC-NH-LBP；將pFASTBAC-NH-LBP轉(zhuǎn)入DH10BAC菌中，通過基因轉(zhuǎn)位，構(gòu)建穿梭質(zhì)粒pBacmid-NH-LBP，在測序正確后，將pBacmid-NH-LBP感染昆蟲細胞sf21，則sf21細胞釋放出編碼脂多糖結(jié)合蛋白氨基端片段蛋白的病毒顆粒；以病毒顆粒感染對數(shù)生長期的sf21細胞，在無血清培養(yǎng)基Sf900IISFM表達脂多糖結(jié)合蛋白氨基端片段蛋白質(zhì)，并脂多糖結(jié)合蛋白氨基端片段蛋白質(zhì)以TALON柱芯進行梯度親和純化，得到脂多糖結(jié)合蛋白氨基端片段。為實現(xiàn)本發(fā)明目的還提供了一種抗脂多糖結(jié)合蛋白氨基端片段單克隆Fab抗體的制備方法，所述建立噬菌體抗體庫，以脂多糖結(jié)合蛋白氨基端片段為抗原進行了篩選，制備抗脂多糖結(jié)合蛋白氨基端片段單克隆Fab抗體。所述建立噬菌體抗體庫，具體包括下列步驟從健康志愿者的外周血中分離獲得單核細胞，從單核細胞中提取DNA序列，分別以7對引物擴增編碼抗體重鏈IgVH的可變區(qū)序列、4對引物擴增編碼抗體輕鏈IgVκ的可變區(qū)序列、5對引物擴增編碼抗體輕鏈IgVλ的可變區(qū)序列，分別以SacI+XbaI、XhoI+SpeI消化，以pComb3H噬菌粒為載體，于XL1-Blue桿菌內(nèi)建立了人源噬菌體抗體文庫Fab。所述以脂多糖結(jié)合蛋白氨基端片段為抗原進行了篩選，具體包括下列步驟將脂多糖結(jié)合蛋白氨基端片段作為抗原包被酶聯(lián)板，洗板后加入噬菌體抗體庫，結(jié)合后洗板，然后洗下已結(jié)合的噬菌體，重新感染XL1-Blue菌并擴增抗體庫，擴增的噬菌體抗體庫進行下一輪的篩選。所述制備抗脂多糖結(jié)合蛋白氨基端片段單克隆Fab抗體，具體包括下列步驟通過聚合酶鏈式反應法，從陽性單克隆菌株的pComb3H中，將編碼抗體輕重鏈的VH和VL分別擴增出，分別置于載體pET-30a(+)，構(gòu)建表達質(zhì)粒pET-30a(+)-VH和pET-30a(+)-VL，分別電轉(zhuǎn)入BL21star(DE3)菌中，以IPTG誘導表達，將表達的VH和VL多肽以TALON親和純化后，進行共同復性、折疊，形成Fab抗體。為實現(xiàn)本發(fā)明目的還進一步提供一種抗脂多糖結(jié)合蛋白氨基端片段的dsFv抗體的制備方法，在抗脂多糖結(jié)合蛋白氨基端片段單克隆Fab抗體的輕鏈基因骨架區(qū)FWR2中引入編碼Cys的基因密碼子，構(gòu)建基因序列rVL，然后將改變的rVL序列置于載體pET-30a(+)中，構(gòu)建表達質(zhì)粒pET-30a(+)-rVL，并電轉(zhuǎn)入BL21star(DE3)菌中，以IPTG誘導表達并純化而制備。所述在抗脂多糖結(jié)合蛋白氨基端片段單克隆Fab抗體的輕鏈基因骨架區(qū)FWR2中引入編碼Cys的基因密碼子，是通過應用mega-primerPCR方法而實現(xiàn)的。為實現(xiàn)本發(fā)明目的而提供的一種抗脂多糖結(jié)合蛋白氨基端片段單克隆Fab抗體的應用，所述的抗脂多糖結(jié)合蛋白氨基端片段單克隆Fab抗體在制備治療炎癥藥物中的應用。所述炎癥為燒傷腸源性感染或者菌痢等G-桿菌所致的感染。為實現(xiàn)本發(fā)明目的而提供的一種抗脂多糖結(jié)合蛋白氨基端片段的dsFv抗體的應用，所述抗脂多糖結(jié)合蛋白氨基端片段的dsFv抗體在制備治療炎癥藥物中的應用。所述炎癥為燒傷腸源性感染或者菌痢等G-桿菌所致的感染。為實現(xiàn)本發(fā)明目的而提供的一種抗脂多糖結(jié)合蛋白氨基端片段單克隆Fab抗體的應用，所述抗脂多糖結(jié)合蛋白氨基端片段單克隆Fab抗體在制備檢測體內(nèi)脂多糖結(jié)合蛋白水平的藥物中的應用。為實現(xiàn)本發(fā)明目的還提供了一種抗脂多糖結(jié)合蛋白氨基端片段的dsFv抗體的應用，所述抗脂多糖結(jié)合蛋白氨基端片段的dsFv抗體在制備檢測體內(nèi)脂多糖結(jié)合蛋白水平的藥物中的應用。為實現(xiàn)本發(fā)明目的而提供的一種抗脂多糖結(jié)合蛋白氨基端片段單克隆Fab抗體的應用，所述藥物中包括如權利要求3中所述抗脂多糖結(jié)合蛋白氨基端片段單克隆Fab抗體，并混合一種或一種以上醫(yī)藥上可接受的載體或添加劑。為實現(xiàn)本發(fā)明目的還提供了一種抗脂多糖結(jié)合蛋白氨基端片段的dsFv抗體的應用，所述藥物中包括如權利要求4中所述抗脂多糖結(jié)合蛋白氨基端片段的dsFv抗體，并混合一種或一種以上醫(yī)藥上可接受的載體或添加劑。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明通過從人脂多糖結(jié)合蛋白氨基端片段(NH-LBP)入手，從人肝細胞中提取編碼NH-LBP的cDNA片段，采用昆蟲sf21細胞制備了NH-LBP蛋白，并通過pComb3H噬菌粒建立了人源噬菌體抗體庫，以NH-LBP為抗原進行了篩選，從而制備了抗NH-LBP人源單克隆抗體(monoclonalantibody，mAb)Fab抗體，以及dsFv抗體。該Fab抗體，以及dsFv抗體能特異性地與人完整脂多糖結(jié)合蛋白的N端結(jié)合，從而競爭性地抑制了脂多糖結(jié)合蛋白與脂多糖的結(jié)合，使得機體對脂多糖的敏感性下降，降低脂多糖導致的過度炎癥反應，并促進機體對脂多糖的降解，從而抑制過度的炎癥反應和防止彌漫性毛細血管內(nèi)凝血、多臟器衰竭的發(fā)生。圖1A是昆蟲sf21細胞培養(yǎng)照片圖；圖1B是昆蟲sf21細胞分泌表達NH-LBP照片圖；圖2是用TALON(針對6×His)柱芯對NH-LBP多肽的親和純化圖；圖3是TALON親和純化NH-LBP蛋白質(zhì)的Tricine-SDS-PAGE鑒定結(jié)果圖；圖4是人源噬菌體抗體庫的構(gòu)建及酶切鑒定結(jié)果圖；圖5是人源噬菌體抗體庫結(jié)構(gòu)圖；圖6是構(gòu)建Fab抗體時所擴增的輕重鏈基因(VH和VL)圖；圖7是用TALON(針對6×His)柱芯對輕鏈蛋白質(zhì)片段VL的親和純化結(jié)果圖；圖8是TALON親和純化輕重鏈蛋白質(zhì)片段(VL和VH)的Tricine-SDS-PAGE鑒定結(jié)果圖；圖9是生理鹽水對照組、dsFv抗體治療組或Fab抗體治療組、LPS注射損傷組體內(nèi)活性檢測結(jié)果圖。具體實施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實施例，對本發(fā)明的脂多糖結(jié)合蛋白及其單克隆抗體、以及脂多糖結(jié)合蛋白及其單克隆抗體的制備方法和用途進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。本發(fā)明涉及基因重組工程，特別是利用真核表達系統(tǒng)表達人脂多糖結(jié)合蛋白氨基端片段(NH-LBP)、原核表達系統(tǒng)構(gòu)建人源抗體庫及抗NH-LBP單克隆抗體的的制備方法和用途。針對如何抑制脂多糖(LPS)誘導的過度炎癥反應，對信號傳導途徑，包括多顯性轉(zhuǎn)錄核因子(nuclearfactorkappaB，NF-kappaB)等信號的傳遞途徑進行了分析，發(fā)現(xiàn)若抑制傳遞途徑的多顯性轉(zhuǎn)錄核因子，則將導致細胞的其它功能改變，因此不能對多顯性轉(zhuǎn)錄核因子進行抑制。同時在分析中也發(fā)現(xiàn)人體內(nèi)脂多糖的清除是不需要脂多糖結(jié)合蛋白參與的，并且脂多糖結(jié)合蛋白與脂多糖的結(jié)合并不會促進機體對脂多糖的降解，不會降低脂多糖導致的過度炎癥反應的發(fā)生，因此機體內(nèi)有無脂多糖結(jié)合蛋白發(fā)揮生物學功能，對脂多糖在體內(nèi)的清除無明確影響。所以本發(fā)明從人脂多糖結(jié)合蛋白氨基端片段(N-terminalfragmentofhumanlipopolysaccharide-bindingprotein，NH-LBP)入手，從人肝細胞中提取編碼NH-LBP的cDNA片段，通過BAC-TO-BAC桿狀病毒表達系統(tǒng)(BAC-TO-BACbaculovirusexpressionsystem，NO10359016，購自Invitrogen公司。它利用輔助質(zhì)粒helperplasmid、轉(zhuǎn)座載體pFastBac1(HT)系列和含有桿狀病毒AcNPV全基因組的穿梭載體Bacmid共同進行重組病毒的篩選)，采用昆蟲sf21(NO11497-013，購自GIBCO公司)細胞制備了NH-LBP蛋白，并通過pComb3H噬菌粒建立了人源噬菌體抗體庫，以NH-LBP為抗原進行了篩選，從而制備了抗NH-LBP人源單克隆抗體mAb?？筃H-LBP人源單克隆抗體mAb能特異性地與人完整脂多糖結(jié)合蛋白的N端結(jié)合，從而競爭性地抑制了脂多糖結(jié)合蛋白的與脂多糖的結(jié)合，使得機體對脂多糖的敏感性下降，降低脂多糖導致的過度炎癥反應，并促進機體對脂多糖的降解。(代理人理解，為了使本領域技術人員能夠理解本發(fā)明的制備過程，對制備過程中使用的儀器設備，煩請發(fā)明人盡可能說明其制備儀器的名稱和來源，特別是購自國外的專用儀器，應當予以說明，本方法中，所用儀器不多，但很多載體及菌株購自國外，現(xiàn)已列出)實施例一人脂多糖結(jié)合蛋白氨基端片段的制備及鑒定(11)獲得編碼人NH-LBP的cDNA序列，并構(gòu)建表達病毒從感染休克死亡患者的肝細胞內(nèi)提取信使RNA(mRNA)，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA文庫，以特異引物5′-GTCGACTGGAGTGGGAATCTAGGA-3′；5′-AAGCTTATTCTGTGTTGTAACTGG-3′擴增出編碼人NH-LBP的雙鏈DNA序列，并與pMD19-TSimpleVector連接，轉(zhuǎn)入感受態(tài)DH-5a菌中，測試正確后以SalI、HindIII行雙酶切，目的序列回收、純化，并與相同酶處理的載體pFASTBAC連接，構(gòu)建質(zhì)粒pFASTBAC-NH-LBP。將pFASTBAC-NH-LBP轉(zhuǎn)DH10BAC菌中，通過基因轉(zhuǎn)位，構(gòu)建穿梭質(zhì)粒pBacmid-NH-LBP，測序正確后，將pBacmid-NH-LBP感染昆蟲細胞sf21，則sf21細胞釋放出編碼目的蛋白的病毒顆粒，通過病毒空斑實驗，測定病毒效價(滴度)。具體方法過程如下111)從感染休克死亡患者的肝組織內(nèi)分離肝細胞，按常規(guī)方法使用RNA提取試劑盒(TRIzolreagent)提取肝細胞內(nèi)RNA序列，使用RT-PCR的隨機引物(random9mers，RNAPCRkit，購自TaKaRa公司)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA序列。合成引物5′-GTCGACTGGAGTGGGAATCTAGGA-3′含SalI酶切位點，5′-AAGCTTATTCTGTGTTGTAACTGG-3′含HindIII酶切位點。112)以如下條件進行聚合酶鏈式反應(PolymeraseChainReaction，PCR)cDNA庫5ng，引物各1μL(濃度20μmol/l)，ExTaq酶0.3μL(濃度5mmol/L)，MgCl24μL，dNTP(各濃度2.5mmol/L)5μL，加水至總體積50μL。113)按如下擴增條件進行擴增擴增條件94℃預變性5min，此后94℃45s，54℃45s，72℃2min，30個循環(huán)，72℃延伸5min。PCR產(chǎn)物10g/L凝膠電泳，可見擴增出長約695bp的片段。114)將聚合酶鏈式反應的產(chǎn)物切下，采用硝酸纖維吸附純化及去離子水溶解，并與pMD19-TSimpleVector連接。連接條件為PCR片段0.3pmol，PMD19-TSimpleVector1μl，LigationMix5μl，無菌去離子水補足體積10μl，在16℃連接3小時，加入100ulDH-5a感受態(tài)細胞，鋪于含有0.04mg/mlX-gal、0.024mg/mlIPTG的LB平板上進行藍白斑篩選。115)挑取白色菌落，在LB(LactoseBroth)培養(yǎng)基(含Amp20ug/ml)中培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒，進行聚合酶鏈式反應(PCR)鑒定。116)如果序列正確，無移碼突變的質(zhì)粒，則進行SalI、HindIII雙酶切，并以相同方法酶切的pFASTBAC載體連接，構(gòu)建質(zhì)粒pFASTBAC-NH-LBP，質(zhì)粒轉(zhuǎn)入DH-5a感受態(tài)細胞內(nèi)，鋪于含有Amp40ug/ml的LB培養(yǎng)基平板上進行抗性篩選。117)挑取菌落、擴增、提取質(zhì)粒并進行基因序列測定。將2ng質(zhì)粒pFASTBAC-NH-LBP與100μlDH10BAC感受態(tài)細胞混勻，進行熱休克轉(zhuǎn)然，鋪于含有0.04mg/mlX-gal、0.024mg/mlIPTG、20ug/mltet、20ug/mlKan、20ug/mlgen的LB培養(yǎng)基平板上進行藍白斑篩選，挑取白色菌落，在LB培養(yǎng)基(含20ug/mltet、20ug/mlKan、20ug/mlgen)中培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒，然后再進行聚合酶鏈式反應(PCR)鑒定，序列正確的即為穿梭質(zhì)粒pBacmid-NH-LBP。118)將10μl質(zhì)粒pBacmid-NH-LBP與6μlCELLFECTIN(GIBCO)混勻，加入100μlSf-900IISFM(無血清培養(yǎng)基)，并加入對數(shù)生長期的昆蟲細胞sf21中(3×106)，感染sf21細胞，培養(yǎng)72h后，其上清即含有重組病毒，將重組病毒重新感染sf21細胞，重新擴增2次，第3次擴增的病毒其空斑數(shù)為31×10-6，感染復數(shù)為8，達到要求，并且基因序列測定正確。119)病毒空斑實驗的具體方法為于6孔培養(yǎng)板內(nèi)接種1×1016sf21細胞，加入Grace培養(yǎng)基于28℃培養(yǎng)4-6hrs，此后每孔加入500uL不同稀釋度的病毒，于28℃孵育1hrs后吸去病毒液，加入溫度＜35℃的含Grace培養(yǎng)基的已融化1％低熔點瓊脂糖凝膠，于28℃培養(yǎng)4-5days，每孔加入1mL0.03％中性紅，28℃放置1-2hrs后吸出染色液，于28℃暗處放置2-3hrs，數(shù)出空斑數(shù)計算病毒滴度。(12)進行NH-LBP制備表達、純化以病毒顆粒感染對數(shù)生長期的sf21細胞，并于無血清培養(yǎng)基Sf900IISFM表達目的蛋白質(zhì)，目的蛋白質(zhì)以TALON柱芯進行梯度親和純化，得到脂多糖結(jié)合蛋白氨基端片段。如圖1A，圖1B所示，為昆蟲sf21細胞培養(yǎng)及分泌表達NH-LBP照片圖(其均為HE×100)；其中，圖1A顯示，昆蟲細胞sf21在對數(shù)生長期，細胞大小均勻一致，胞漿透亮；而圖1B顯示，昆蟲細胞sf21在感染病毒并表達NH-LBP72h后，細胞大小不一，出現(xiàn)“巨細胞”，胞漿內(nèi)見大量顆粒。如圖2所示為用TALON(針對6×His)柱芯對NH-LBP多肽的親和純化圖；其中，B峰、C峰、D峰為用10mmol/L、150mmol/L、300mmol/L的咪唑分別洗脫下的蛋白質(zhì)吸收峰。以第3次擴增病毒顆粒感染對數(shù)生長期的sf21細胞，在無血清培養(yǎng)基Sf900IISFM中培養(yǎng)、表達目的蛋白質(zhì)48～72h，此后將表達上清以TALON柱芯進行梯度親和純化，其條件為平衡液1XPBS液(含100mmol/LNaCl、50mmol/LNa2HPO4.12H20及50mmol/LNaH2PO4.2H20，pH7.4)，洗脫A、B、C液分別為含10、150、300mmol/LImidazole的1×PBS液。各個洗脫蛋白質(zhì)峰分別回收、脫鹽、凍干，得到脂多糖結(jié)合蛋白氨基端片段。所獲得編碼NH-LBP的DNA序列為(其中下劃線區(qū)為編碼信號肽的序列)為Atgggggccttggccagagccctgccgtccatactgctggcattgctgcttacgtccaccccagaggctctgggtgccaaccccggcttggtcgccaggatcaccgacaagggactgcagtatgcggcccaggaggggctattagctctgcagagtgagctgctcaggatcacgctgcctgacttcaccggggacttgaggatcccccacgtcggccgtgggcgctatgagttccacagcctgaacatccacagctgtgagctgcttcactctgcgctgaggcctgtccctggccagggcctgagtctcagcatctccgactcctccatccgggtccagggcaggtggaaggtgcgcaagtcattcttcaaactacagggctcctttgatgtcagtgtcaagggcatcagcatttcggtcaacctcctgttgggcagcgagtcctccgggaggcccacagttactgcctccagctgcagcagtgacatcgctgacgtggaggtggacatgtcgggagacttggggtggctgttgaacctcttccacaaccagattgagtccaagttccagaaagtactggagagcaggatttgcgaaatgatccagaaatcggtgtcctccgatcatcagccttattctcaaactctg其中，以基因數(shù)據(jù)庫(Genebank)上LBP序列為標準(NM_004139)，發(fā)生點突變的有G(144)→A(144)；T(626)→A(626)；A(627)→T(627)；C(637)→T(637)；T(638)→C(638)；C(639)→T(639)。所獲得的NH-LBP的氨基酸序列為(其中下劃線區(qū)為信號肽的序列)MGALARALPSILLALLLTSTPEALGANPGLVARITDKGLQYAAQEGLLALQSELLRITLPDFTGDLRIPHVGRGRYEFHSLNIHSCELLHSALRPVPGQGLSLSISDSSIRVQGRWKVRKSFFKLQGSFDVSVKGISISVNLLLGSESSGRPTVTASSCSSDIADVEVDMSGDLGWLLNLFHNQIESKFQKVLESRICEMIQKSVSSDLQPYLQTL其中，以基因數(shù)據(jù)庫(Genebank)上LBP氨基酸序列為標準(NM_004139)，發(fā)生點突變的有L(209)→H(209)；L(213)→S(213)。(13)NH-LBP的鑒定利用Tricine-SDS-PAGE方法和毛細管電泳方法鑒定NH-LBP純度。首先利用液相質(zhì)譜測定NH-LBP分子量，利用流式細胞分選(FluorescenceActivatedCellSorting，F(xiàn)ACS)方法和生物傳感器結(jié)合方法，鑒定NH-LBP與脂多糖(LPS)的結(jié)合力。如圖3所示為TALON親和純化NH-LBP蛋白質(zhì)的Tricine-SDS-PAGE鑒定結(jié)果圖；其中，1蛋白質(zhì)標記(97.4、66.2、43、31、20.1、14.4KDa)；210mmol/L咪唑洗脫下的B峰；3150mmol/L咪唑洗脫下的C峰；4300mmol/L咪唑洗脫下的D峰；可見C峰內(nèi)含有分子量約為27kDa的蛋白質(zhì)帶，經(jīng)Westernblot鑒定，證明為NH-LBP蛋白質(zhì)。其具體過程如下131)將NH-LBP與完全弗氏佐劑或不完全弗氏佐劑混合，前后三次分別注入兔皮下，45天后取全血，制備血清。采用酶聯(lián)接免疫吸附劑測定(Enzyme-LinkedImmunosorbnentAssay，ELISA)方法，以NH-LBP為抗原，標96孔板，以不同稀釋度的兔免疫血清為一抗，以HRP-鼠抗兔IgG抗體為二抗，以四甲基聯(lián)苯胺(TMB)試劑為底物顯色，測定血清抗體效佳，發(fā)現(xiàn)兔血清稀釋到1∶6000和1∶10000時，仍能檢測出抗原NH-LBP，初步證明NH-LBP具有較好的抗原性。132)如圖3所示，進行Tris-Tricine電泳及Westernblot鑒定，從圖中可以證明150mmol/L咪唑洗脫下的C峰中含有NH-LBP，其分子量為27KDa。然后以毛細管電泳鑒定NH-LBP純度為97％，流式細胞分選方法實驗和生物傳感器結(jié)合實驗證明NH-LBP與脂多糖的結(jié)合力，并且其結(jié)合力與人完整脂多糖結(jié)合蛋白相近。將NH-LBP注入兔皮下，測定血清抗體效價，然后用酶聯(lián)接免疫吸附劑測定(ELISA)方法，證明效價達1∶3000，初步證明NH-LBP具有抗原性。實施例二人源噬菌體抗體文庫的制備從健康志愿者的外周血中分離獲得單核細胞，從單核細胞中提取DNA序列，分別以7對引物擴增編碼抗體重鏈IgVH的可變區(qū)序列(Fd)、4對引物擴增編碼抗體輕鏈IgVκ的可變區(qū)序列、5對引物擴增編碼抗體輕鏈IgVλ的可變區(qū)序列，分別以SacI+XbaI、XhoI+SpeI消化，以pComb3H噬菌粒為載體，于XL1-Blue桿菌內(nèi)建立了人源噬菌體抗體文庫Fab。如圖4所示為人源噬菌體抗體庫的構(gòu)建及酶切鑒定結(jié)果圖，其中1DNA標記(15000、10000、7500、5000、2500、1000、250bp)；2κbankcontainingpCOmb3H/SacI+XbaI(切下輕鏈基因序列)；3(κ+Fd)bankcontainingpCOmb3H/SacI+XbaI(切下輕鏈基因序列)；4(κ+Fd)bankcontainingpCOmb3H/XhoI+SpeI(切下重鏈基因序列)所構(gòu)建的抗體文庫(含(κ+Fd)基因文庫與(λ+Fd)基因文庫)滴度為5.0×108菌落(colonyformingunits，CFU)。在本實施例中，通過健康志愿者3名，各抽取外周全血約100mL，用淋巴單核細胞分離液離心(5000g)分離單個核細胞(PeripheralBloodMononuclearCell，PBMC)，抽提單個核細胞的總RNA，再以隨機引物逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，最后以抗體輕重鏈引物分別進行聚合酶鏈式反應(PCR)擴增，得到人源噬菌體抗體庫，如圖5所示。具體方法過程如下(21)聚合酶鏈式反應所用引物，根據(jù)Kang等人(見MethodsCompanionMethodsEnzymol，19912111-120.)設計進行適當改動，即①擴增人IgVH基因5′的引物(含XhoI酶切位點)；②擴增人IgVH基因3′的引物(含SpeI酶切位點)；③擴增人IgVκ基因5′的引物(含SacI酶切位點)；④擴增人IgCKld基因3′的引物(含XbaI酶切位點)；⑤擴增人IgVλ基因5′的引物(含SacI位點)；⑥擴增人IgCL2基因3′的引物(含XbaI酶切位點)。補添的引物序列如下HumanHeavyChainVariableDomain5’primer(含XhoI位點)VH1a5’-CATCTGTAGCTCGAGCAGTCTGGG-3’VH1f5’-CATCTGTAGCTGCTCGAGTCTGGG-3’VH2f5’-CATCTGTAGCTACTCGAGTCGGG-3’VH3a5’-GATCTGTAGCTCGAGGAGTCTGGG-3’VH3f5’-GAGGTGCAGCTGCTCGAGTCTGGG-3’VH4f5’-CATCTGTAGCTGCTCGAGTCGGG-3’VH6a5’-CATCTGTAGCTCGAGCAGTCAGG-3’HumanHeavyChainVariableDomain3’primer(含SpeI位點)IgG15’-GTCAGTACTAGTTTTGTCACACGCTTTGGG-3’HumanKappaChain(κ)VariableDomain5’primer(含SacI位點)VK1a5’-CGAATCGAGCTCACCCAGTCTCCA-3’VK1s5’-CGAATCGAGCTCACCCAGTCTCC-3’VK2a5’-CGAATCGAGCTCACTCAGTCTCCA-3’VK3a5’-CGAATCGAGCTCACGCAGTCTCCA-3’HumanKappaCK1dConstantDomain3’primer(含XbaI位點)5’-ACGGTGTCTAGAACTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTTTGTGACGGGCGAACTCAG-3’HumanLambdaChain(λ)VariableDomain5’primer(含SacI位點)VL15’-AATGTGGAGCTCACTCAGCCCCAC-3’VL25’-TATGCCGAGCTCCAGCCTGCCTCCGTG-3’VL35’-GATTTTGAGCTCCAGCCGCCCTCAGTG-3’VL45’-GAATCTGAGCTCCAGGACCCTGTTGTGTCTGTG-3’VL55’-GCATCTGAGCTCACGCAGCCGCCC-3’HumanLambdaCL2ConstantDomain3’primer(含XbaI位點)5’-AGTCGTCTAGAATTATGAACATTCTGTAGG-3’分別以上述7對引物擴增編碼抗體重鏈IgVH的可變區(qū)序列(Fd)、4對引物擴增編碼抗體輕鏈IgVκ的可變區(qū)序列、5對引物擴增編碼抗體輕鏈IgVλ的可變區(qū)序列。(22)抗體文庫的構(gòu)建將載體pComb3H與聚合酶鏈式反應(PCR)擴增獲得的κ鏈基因分別經(jīng)SacI+XbaI消化，利用瓊脂糖凝膠進行電泳分離、純化后，以T4DNA連接酶進行連接，并通過電轉(zhuǎn)化為感受態(tài)XL1-Blue菌。將所述轉(zhuǎn)化的感受態(tài)XL1-Blue菌菌加入到3mLSOC培養(yǎng)基中于37℃振蕩培養(yǎng)1h，再加入15mLSB培養(yǎng)基(Amp50mg/L及Tet20mg/L)于37℃培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，即獲得κ鏈基因文庫。將κ鏈基因文庫質(zhì)粒和聚合酶鏈式反應(PCR)擴增的重鏈基因片段(Fd)，分別以XhoI+SpeI進行消化、純化及連接，并再次電轉(zhuǎn)化為空XL1-Blue細菌。然后將再次電轉(zhuǎn)化的空XL1-Blue細菌加入到3mLSOC培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)1h。此后加入15mLSB培養(yǎng)基(Amp20mg/L及Tet20mg/L)中培養(yǎng)1h，補足Amp至50mg/L，繼續(xù)搖菌1h。加入100mLSB(Amp50mg/L及Tet20mg/L)和輔助噬菌體VCSM1350μL(1×1012PFU)，于37℃振蕩培養(yǎng)2h，再加入Kan至70mg/L于37℃振蕩培養(yǎng)過夜。此后將菌液離心，收集上清加入PEG8000和NaCl至終濃度分別為4％和3％，冰浴30min后離心(10000×g15min)。棄上清，以1.5mLPBS液(含1g/LBSA)溶解沉淀，再以24000×g離心4min。收集上清即為(Fd+κ)鏈抗體基因文庫(Fab)。以同樣方法構(gòu)建(Fd+λ)鏈抗體文庫。將(Fd+κ)鏈文庫及(Fd+λ)鏈文庫混合，即為完整人源噬菌體抗體庫Fab。如圖4所示，將人源噬菌體抗體庫進行酶切鑒定結(jié)果圖，證明含有輕重鏈序列，完整的抗體庫其滴度為4.6×108菌落(CFU)。實施例三人源抗NH-LBP單克隆Fab抗體和dsFv抗體的制備(31)以NH-LBP為抗原對噬菌體抗體庫Fab進行篩選和單菌株鑒定將NH-LBP作為抗原包被酶聯(lián)板，洗板后加入噬菌體抗體庫，結(jié)合2h后洗板，洗下已結(jié)合的噬菌體，重新感染XL1-Blue菌并擴增抗體庫，擴增的噬菌體抗體庫進行下-輪的篩選，共篩選5輪。經(jīng)5輪篩選后，攜帶抗NH-LBP抗體的噬菌體得到明顯的富集，結(jié)合性提高了1.65×104倍，證明篩選是成功的。將每個單菌落擴增、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG)誘導、分泌表達Fab抗體，以NH-LBP標板，以Fab為一抗，HRP-鼠抗人Fab單克隆抗體為二抗，以四甲基聯(lián)苯胺(TMB)為反應底物，通過酶聯(lián)接免疫吸附劑測定(ELISA)法鑒定Fab與NH-LBP的結(jié)合力。共鑒定出6個單克隆菌株，其編碼的Fab可與NH-LBP顯著結(jié)合。其具體過程如下將NH-LBP與碳酸緩沖液(pH9.6)混合后包被酶聯(lián)板4℃過夜。以聚丁二酸丁二醇酯(PBS)洗滌及30g/L雙三甲硅基乙酰胺(BSA)封閉1h后，再加入90μL/孔噬菌體抗體庫結(jié)合2h，以PBS/Tween20液洗板1次(隨篩選輪數(shù)，洗板次數(shù)遞增致10次)，再以PBS洗板5次，加入100μL洗脫液(0.1mol/LHCI，1g/LBSA，pH2.2)靜置10min，稍吹打后加入6μLTris液(2mol/L)中和。最后，取10μL回收的噬菌體液作1∶100等比稀釋測定其滴度。其余回收的噬菌體液加入2mL新鮮XL1-Blue菌液，擴增噬菌體(方法同建庫)并進行下一輪的篩選，共篩選5輪。經(jīng)5輪篩選后，攜帶抗NH-LBP抗體的噬菌體得到明顯的富集，結(jié)合性提高了1.65×104倍，證明篩選是成功的。以第5輪篩選回收的噬菌體感染XL1-Blue菌并擴增，提取質(zhì)粒切除geneIII后，噬菌自身環(huán)化，并電轉(zhuǎn)入XL1-Blue菌中，SOC培養(yǎng)基中培養(yǎng)，鋪LB板(含Amp50ug/mL、Tet10ug/mL)，37℃靜置培養(yǎng)過夜。挑單菌落(50個)接種于3mLSB(含Amp50ug/mL、Tet10ug/mL)中，于37℃振蕩培養(yǎng)6h，直至OD600＝0.6～0.8，加入IPTG至終濃度1mmol/L，37℃振蕩培養(yǎng)6h或30℃振蕩培養(yǎng)過夜(14h-16h左右)，過夜后菌液4℃離心10000rpm×5min，上清中則含有可溶性分泌抗體，此上清以0.05mol/lPBS液脫鹽，脫鹽后上清放入干燥機中濃縮，則含有Fab抗體。以NH-LBP標板，以Fab為一抗，HRP-鼠抗人Fab單克隆抗體為二抗，以四甲基聯(lián)苯胺(TMB)為反應底物，通過酶聯(lián)接免疫吸附劑測定(ELISA)法鑒定Fab與NH-LBP的結(jié)合力。(32)抗NH-LBP的Fab抗體制備及鑒定通過聚合酶鏈式反應(PCR)法，從陽性單克隆菌株的pComb3H中，將編碼抗體輕重鏈的VH和VL分別擴增出，分別置于載體pET-30a(+)，構(gòu)建表達質(zhì)粒pET-30a(+)-VH和pET-30a(+)-VL，分別電轉(zhuǎn)入BL21star(DE3)菌中，以IPTG誘導表達。如圖6所示為構(gòu)建Fab抗體時所擴增的輕重鏈基因(VH和VL)圖；其中，1DNA標記(2000、1000、750、500、250、100bp)；2～4擴增的輕鏈基因(VL)；5～7擴增的重鏈基因(VH)。將表達的VH和VL多肽以TALON親和純化后，進行共同復性、折疊，形成Fab抗體。如圖7所示為用TALON(針對6×His)柱芯對輕鏈蛋白質(zhì)片段VL的親和純化結(jié)果圖，其中A峰、B峰分別為含5mmol/L、150mmol/LImidazole的1×PBS液所洗脫下的個蛋白質(zhì)吸收峰。如圖8所示為TALON親和純化輕重鏈蛋白質(zhì)片段(VL和VH)的Tricine-SDS-PAGE鑒定結(jié)果圖，其中1蛋白質(zhì)標記(97.4、66.2、43、29、20.1、14.3KDa)；2～3VH表達蛋白用TALON柱芯純化洗下的蛋白質(zhì)峰“A，B”，其中B峰中含有VH蛋白；4～5VL表達蛋白用TALON柱芯純化洗下的蛋白質(zhì)峰“A，B”，其中B峰中含有VL蛋白。具體過程如下①采用常規(guī)聚合酶鏈式反應(PCR)法，以pComb3H-Fab質(zhì)粒為模板，分別以VL5和VL3，VH5和VH3為一對引物進行聚合酶鏈式反應。具體過程如下采用質(zhì)粒DNA5ng，引物各1μL(濃度20μmol/l)，ExTaq酶0.3μL(濃度5mmol/L)，MgCl24μL，dNTP(各濃度2.5mmol/L)5μL，加水至總體積50μL。擴增條件為94℃預變性5min，此后94℃30s，60℃30s，72℃1min，30個循環(huán)，72℃5min。利用18g/L凝膠進行電泳，得到聚合酶鏈式反應產(chǎn)物，對聚合酶鏈式反應產(chǎn)物采用硝酸纖維吸附純化及去離子水溶解。然后將VL和VH基因分別與pMD19-TSimpleVector連接，轉(zhuǎn)入感受態(tài)DH-Sa菌中，于LB培養(yǎng)板(X-gal0.04g/L、IPTG0.024g/L、Amp10mg/L)行藍白斑篩選。挑取白色菌落擴增、抽提質(zhì)粒并進行基因測序鑒定，對序列正確的質(zhì)粒進行SacI、HindIII雙酶切，并將目的片段與相同酶切的表達載體pET-30a(+)相連接，構(gòu)建表達質(zhì)粒pET-30a(+)-VH和pET-30a(+)-VL，然后轉(zhuǎn)入感受態(tài)DH-5a菌中，于LB培養(yǎng)板進行抗卡那霉素(kanamycin)篩選(濃度50mg/L)。然后將單克隆細菌進行擴增，抽提質(zhì)粒，再進行聚合酶鏈式反應(引物T7Promoterprimer、T7terminatorprimer)及SacI、HindIII雙酶切鑒定，對序列正確的質(zhì)粒進行電轉(zhuǎn)得到感受態(tài)BL21star(DE3)菌，其中，電轉(zhuǎn)條件為2mm電擊杯、2.5KV、電容50μF、平行電阻200Ω。然后鋪LB培養(yǎng)板(Kan50mg/L)，挑選單菌落進行擴增，抽提質(zhì)粒，利用8g/L凝膠進行電泳，并進行質(zhì)粒基因序列測定(雙向測定，引物T7Promoterprimer、T7terminatorprimer)，如果目的序列正確、無堿基突變的單菌株，可利用其進行誘導表達。②VL和VH蛋白質(zhì)的表達和純化將含有輕鏈可變區(qū)(VL)或抗體重鏈可變區(qū)(VH)的BL21star(DE3)菌在A600nm為0.6～0.8時，以1mmol/LIPTG誘導于LB培養(yǎng)基中表達目的蛋白，表達時間為4h、6h、8h、10h和12h，尋找最佳表達時相點，并與含有空載體pET-30a(+)的BL21star(DE3)菌進行比較。將表達BL21star菌進行反復凍融、溶菌酶處理及超聲粉碎，提取其可溶性蛋白質(zhì)及包涵體。將可溶性蛋白質(zhì)及溶解后的包涵體分別以親合交換柱芯TALON進行梯度純化，條件為平衡液1XPBS液(含6mol/L鹽酸胍、300mmol/LNaCl、50mmol/LNa2HPO4.12H20及50mmol/LNaH2PO4.2H20，pH7.4)，洗脫的A、B、C液分別為含5、150、300mmol/LImidazole的1×PBS液。如圖6、7所示，各個洗脫蛋白質(zhì)峰分別回收、脫鹽、凍干并進行Westernblot鑒定后，得到VL和VH蛋白質(zhì)的表達和純化。③VL、VH蛋白復性、折疊及純化首先將VL和VH蛋白復性，具體過程如下將VL和VH蛋白溶于復性緩沖液(50mmol/LKH2PO4，1mmol/LEDTA，2mmol/LReducedGlutathione，1mmol/LOxidizedGlutathione)，用KOH調(diào)pH10.7，冰上攪拌50min，再調(diào)pH為8.0，于4℃過夜。將液體于4℃下離心11500g×15min，收集上清，裝入透析袋脫鹽并濃縮。其次，將VL和VH蛋白折疊，具體過程如下將VL和VH蛋白共同溶于折疊緩沖液(100mmol/LTris.HCl，500mmol/LArginine，2mmol/LEDTA，0.9mmol/LOxidizedGlutathione，pH8.5)，于10℃放置36h，再加入同量氧化谷胱甘肽，10℃放置12h，此后溶液置于透析袋中(截留Mr8～10000u)脫掉鹽及氧化谷胱甘肽并濃縮。最后，純化Fab蛋白具體過程如下將SephadexTMG-25用5mmol/L的PB液(pH7.4)發(fā)脹、平衡48h后裝柱、壓緊，往純化柱內(nèi)加入折疊后的抗體溶液，再以5mmol/LPB洗脫(流速100cm/h)，收集最先洗脫出的蛋白質(zhì)峰(含有Fab抗體)，以1mmol/LPB(pH7.3)脫鹽、低溫凍干，并進行蛋白質(zhì)印跡(Westernblot)等鑒定。所獲得Fab抗體輕重鏈VL和VH的可變區(qū)基因序列及氨基酸序列(其中，下劃線為互補決定區(qū)域(ConplementarityDeterminingRegions，CDRS))①輕鏈VL(VLgene)的基因序列(為κ輕鏈)為ACCCAGTCTCCATCCTCCCTTTCTGCATCTGTCGGAGACAGAGTCACCACCACTACGCGGGCAAGTCAGGTAATTAGCAGTTCTTTAGCCTGGTATCAGCAAAAACCAGGCAAAGCCCCTAAACTCCTGATCTACGGTGCGTCCACTTACAAATTGGGGTCCCTTTACGGTTCAGCGGCAGTGGGTCTGGGACCGATTTCACTCTCACCATTGACGTCCCGCAGCCTGAAGATTCTGCAACTTATTACT對應氨基酸序列為TQSPSSLSASVGDRVTTTTRASQVISSSLAWYQQKPGKAPKLLIYGASTYKLGSLYGSAAVGLGPISLSPLTSRSLKILQLIT②重鏈VH(VHgene)的基因序列(為VH3亞群)為GGAGGCTTAGTTCAACCGGGGGGGTCACTTACACTCTCCTGTGCAGCATCTGGATTCCCATTCAGTACGTACTGGATGCACTGGGTCCGTCAAGGTCCAGGGAAGCGGCCGGTGTGGGTCTCTCGTGTCCACAGTGAAGGGAGTGCCCGAAGTTACGCGGGCGCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGGGACAACGCCAGGAACACCGTCTATCTGCAGATGAATAGTCTGACAGACGAAGACACGGGTGTCTATTATTGTGCGAGA對應氨基酸序列為GGLVQPGGSLTLSCAASGFPFSTYWMHWVRQGPGKRPVWVSRVHSEGSARSYAGAVKGRFTISRDNARNTVYLQMNSLTDEDTGVYYCAR(33)抗NH-LBP的dsFv抗體制備及鑒定本發(fā)明實施例的抗NH-LBP的dsFv抗體制備，通過應用mega-primerPCR方法，在抗NH-LBP單克隆Fab抗體的輕鏈基因骨架區(qū)FWR2中引入編碼Cys的基因序列，改變點為第43位氨基酸，CTG(L43)→TGT(C43)，然后將改變的rVL序列置于載體pET-30a(+)，構(gòu)建表達質(zhì)粒pET-30a(+)-rVL，并電轉(zhuǎn)入BL21star(DE3)菌中，以IPTG誘導表達并純化而制備。因抗NH-LBP單克隆Fab抗體的重鏈基因骨架區(qū)FWR1中已含有Cys，因此，在制備抗NH-LBP單克隆Fab抗體的過程中，不需要再引入突變。具體的過程如下331)dsFvVL突變基因的構(gòu)建為將pComb3H-Fab質(zhì)粒中κ輕鏈基因突變?yōu)閐sFvrVL基因，設計如下引物VL55′-CGGATCTGAGCTCACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCT-3′(位于1～24bp，劃線處為SacI酶切位點)；VLM5′-GGACGCACCGTAGATACAGAGTTTAGGGGCTTTGCCTGG-3′(位于40～78bp，劃線處為突變位點)；VL35′-ATCCGGAAGCTTATTAACACTCTCCCCTGTTGA-3′(位于612～633bp，劃線處為HindIII酶切位點)。然后，應用mega-primerPCR方法，在抗NH-LBP單克隆Fab抗體的輕鏈基因骨架區(qū)FWR2中引入編碼Cys的基因序列，改變點為第43位氨基酸，CTG(L43)→TGT(C43)。332)對dsFvVL表達質(zhì)粒的構(gòu)建以及dsFvVL表達及純化將dsFvrVL基因與pMD19-TSimpleVector連接，電轉(zhuǎn)入感受態(tài)DH-5a菌中，按常規(guī)行藍白斑篩選。挑取白色菌落擴增，并測定基因序列，對序列突變正確的質(zhì)粒進行SacI、HindIII雙酶切，將目的片段與相同酶切的表達載體pET-30a(+)相連接，構(gòu)建表達質(zhì)粒pET-30a(+)-rVL，再電轉(zhuǎn)入感受態(tài)DH-5a菌中，在LB培養(yǎng)板進行抗卡那霉素(kan)篩選(Kan50μg/ml)。其后，進行單克隆細菌擴增，抽提質(zhì)粒并測序(引物T7Promoterprimer、T7terminatorprimer)，對序列正確的質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入感受態(tài)BL21star(DE3)菌。其后將含有pET-30a(+)-rVL的BL21star(DE3)菌在D(600)0.6～0.8時，以IPTG1mmol/L誘導表達，尋找最佳表達時相點，并與空BL21star(DE3)菌及含有空載體pET-30a(+)菌進行比較。其后將表達BL21star菌進行凍融、溶菌酶處理及超聲粉碎，提取其可溶性蛋白質(zhì)及包涵體。再將可溶性蛋白質(zhì)及溶解后的包涵體分別以親合交換柱芯TALON進行梯度純化，純化條件為平衡液1XPBS液(含鹽酸胍6mol/l、NaCl300mmol/l、Na2HPO4.12H20及NaH2PO4.2H20分別50mmol/l，PH7.4)，洗脫A、B、C液分別為含Imidazole5、150及300mmol/L的1XPBS液。然后，各個洗脫蛋白質(zhì)峰分別回收、脫鹽、凍干，并以抗6×HismAb為一抗行Westernblotting等鑒定，得到dsFvVL表達質(zhì)粒。(333)rVL、VH蛋白復性、折疊及純化首先，對rVL和VH蛋白復性，具體過程如下將VL和VH蛋白溶于復性緩沖液(50mmol/LKH2PO4，1mmol/LEDTA，2mmol/LReducedGlutathione，1mmol/LOxidizedGlutathione)，用KOH調(diào)pH10.7，冰上攪拌50min，再調(diào)pH為8.0，于4℃過夜。再將液體于4℃下離心11500g×15min，收集上清，裝入透析袋脫鹽并濃縮。其次，對rVL和VH蛋白折疊，具體過程如下將rVL和VH蛋白共同溶于折疊緩沖液(100mmol/LTris.HCl，500mmol/LArginine，2mmol/LEDTA，0.9mmol/LOxidizedGlutathione，pH8.5)，于10℃放置36h，再加入同量氧化谷胱甘肽，10℃放置12h，此后溶液置于透析袋中(截留Mr8～10000u)脫掉鹽及氧化谷胱甘肽并濃縮。最后，純化dsFv蛋白，具體過程如下將SephadexTMG-25用5mmol/L的PB液(pH7.4)發(fā)脹、平衡48h后裝柱、壓緊，往純化柱內(nèi)加入折疊后的抗體溶液，再以5mmol/LPB洗脫(流速100cm/h)，收集最先洗脫出的蛋白質(zhì)峰(含有Fab抗體)，以1mmol/LPB(pH7.3)脫鹽、低溫凍干，并進行Westernblot等鑒定。將表達的VH和rVL多肽進行共同復性、折疊，通過二硫鍵的形成來形成dsFv抗體。所獲得dsFv抗體輕鏈rVL的可變區(qū)基因序列及氨基酸序列(其中，下劃線為CDRS區(qū))為ACCCAGTCTCCATCCTCCCTTTCTGCATCTGTCGGAGACAGAGTCACCACCACTACGCGGGCAAGTCAGGTAATTAGCAGTTCTTTAGCCTGGTATCAGCAAAAACCAGGCAAAGCCCCTAAACTCTGTATCTACGGTGCGTCCACTTACAAATTGGGGTCCCTTTACGGTTCAGCGGCAGTGGGTCTGGGACCGATTTCACTCTCACCATTGACGTCCCGCAGCCTGAAGATTCTGCAACTTATTACT對應氨基酸序列為TQSPSSLSASVGDRVTTTTRASQVISSSLAWYQQKPGKAPKLCIYGASTYKLGSLYGSAAVGLGPISLSPLTSRSLKILQLIT實施例四Fab抗體及dsFv抗體的體外活性檢測將Fab抗體或dsFv抗體與NH-LBP按摩爾比1∶1比例混合后37℃水浴1min，進行普通聚丙烯酰胺凝膠電泳，觀察抗體是否能與NH-LBP結(jié)合；以2mg/LLBP為抗原標96孔板，以Fab抗體或dsFv抗體為第一抗體，以HRP-鼠抗人kappa鏈為第二抗體，并以人血白蛋白為陰性對照，通過酶聯(lián)接免疫吸附劑測定(ELISA)法，檢測Fab抗體或dsFv抗體與NH-LBP的結(jié)合能力(當A450nm值為陰性對照的兩倍以上時則為陽性)。Fab抗體及dsFv抗體均能與人全長(天然)LBP顯著結(jié)合，F(xiàn)ab抗體稀釋到0.1mg/L，dsFv抗體稀釋到0.2mg/L，均仍可與LBP有效結(jié)合，具體數(shù)據(jù)見表1和表2。表1復性后Fab與LBP結(jié)合活性表2復性后dsFv與LBP結(jié)合活性<tablesid="table3"num="003"><tablewidth="805">LBPHumanAlbumin0.20±0.060.02±0.010.17±0.050.03±0.010.08±0.030.03±0.020.04±0.030.03±0.010.04±0.040.04±0.02</table></tables>實施例五Fab抗體及dsFv抗體的體內(nèi)活性檢測將Bab-C小鼠按雌雄各半分為三組，每組10只；分別為生理鹽水對照組、dsFv抗體治療組或Fab抗體治療組、LPS注射損傷組，分別腹腔注射生理鹽水、LPS、LPS+dsFv或LPS+Fab；注射72h后斷頭處死，立即取血、分離血清，用TNF-a放射免疫試劑盒檢測血中TNF-a含量，并測量其肝功能三項指標(ALT\AST\ALB)；用SPSS軟件進行統(tǒng)計學分析，并將所獲得的腦、心、肺、肝、腎等器官固定、制作蘇木精-伊紅(haemat0xylin-eosin，HE)切片，光鏡下觀察其形態(tài)學改變。研究發(fā)現(xiàn)脂多糖(LPS)對肝和肺的損傷最為明顯；其次是腎與腦；而心和脾改變不大；對照組與治療對照組比較，各主要器官損傷均較輕，說明Fab抗體及dsFv抗體確實能在一定程度上減輕機體主要器官的損傷，具體數(shù)據(jù)見表3。表3dsFv治療前后72h小鼠體內(nèi)肝功能的變化<tablesid="table4"num="004"><tablewidth="861">例數(shù)ALTASTALBTNF-a鹽水對照組2058±46.74※▲64.3±21.52※▲38.19±16.42※△9.53±29.37※▲LPS注射組20112±36.40※★161±17.20※☆30.1±6.34※☆26.36±7.56※★dsFv治療組2085.1±49.95※★115±31.57※☆36.18±22.01*☆14.13±12.33※★</table></tables>其中*表示生理鹽水組與LPS注射組比較P＜0.05；※表示生理鹽水組與LPS注射組比較P＜0.01；△表示生理鹽水組與dsFv治療組比較P＜0.05；▲表示生理鹽水組與dsFv治療組比較P＜0.01；☆表示LPS注射組與dsFv治療組比較P＜0.005；★表示LPS注射組與dsFv治療組比較P＜0.01。三組關系如圖9所示，其中，1.00生理鹽水對照組；2.00LPS注射組；3.00dsFv治療組。實施例六人源抗NH-LBP單克隆Fab抗體和dsFv抗體的應用(1)Fab抗體、dsFv抗體可與人全長LBP的N端結(jié)合，競爭性地抑制LPS與LBP的結(jié)合，從而使得LBP無法促進LPS與mCD14的結(jié)合，從而顯著抑制LPS導致的過度炎癥反應。該類抗體可用于感染患者，特別是重征感染的患者，如臨床燒傷腸源性感染患者、菌痢患者等，可防止過度炎癥反應的發(fā)生。(2)Fab抗體、dsFv抗體為人源抗體，對人體無種屬排斥性，可應用于人體，不會導致腎等重要臟器的損害。該類人源抗體在BABC小鼠(6-8周齡，體重18-22g)體內(nèi)未導致溶血反應，也未導致明確的肝腎肺等臟器損害。Fab抗體、dsFv抗體作用于小鼠體內(nèi)，72小時后斷頭，取血并對重要臟器制片。病理切片觀察，發(fā)現(xiàn)Fab抗體、dsFv抗體對肝、肺、腎、腦等重要臟器無明確的病理損害。其中肝功等指標測定，測定數(shù)據(jù)見表4，測定值無明顯差異，證明Fab抗體、dsFv抗體對小鼠肝無明確損害。表4dsFv抗體和Fab抗體在小鼠體內(nèi)的毒性作用dsFv抗體和Fab抗體作用72h肝功能的變化其中P＞0.05(3)Fab抗體、dsFv抗體可用于檢測患者體內(nèi)脂多糖結(jié)合蛋白(LBP)水平，提前預報敗血癥的發(fā)生。臨床利用Fab抗體、dsFv抗體檢測，得到慢性重型乙肝患者血清脂多糖結(jié)合蛋白(LBP)的濃度約為(2314.06±942.25)nmol/L，急性細菌性痢疾患者血清脂多糖結(jié)合蛋白(LBP)的濃度約為(1452.37±463.49)nmol/L，正常人血清脂多糖結(jié)合蛋白(LBP)的濃度為(137.46±93.43)nmol/L。(4)應用途徑包括靜脈注射。本發(fā)明通過從人脂多糖結(jié)合蛋白氨基端片段(NH-LBP)入手，從人肝細胞中提取編碼NH-LBP的cDNA片段，采用昆蟲sf21細胞制備了NH-LBP蛋白，并通過pComb3H噬菌粒建立了人源噬菌體抗體庫，以NH-LBP為抗原進行了篩選，從而制備了抗NH-LBP人源單克隆抗體(mAb)Fab抗體，以及dsFv抗體。Fab抗體，以及dsFv抗體能特異性地與人完整脂多糖結(jié)合蛋白的N端結(jié)合，從而競爭性地抑制了脂多糖結(jié)合蛋白的與脂多糖的結(jié)合，使得機體對脂多糖的敏感性下降，降低脂多糖導致的過度炎癥反應，并促進機體對脂多糖的降解，從而抑制過度的炎癥反應和防止彌漫性毛細血管內(nèi)凝血、多臟器衰竭的發(fā)生。本實施例是為了更好地理解本發(fā)明進行的詳細的描述，并不是對本發(fā)明所保護的范圍的限定，因此，本領域普通技術人員不脫離本發(fā)明的主旨未經(jīng)創(chuàng)造性勞動而對本明所做的改變在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。序列表<110>中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學西南醫(yī)院病理學研究所<120>脂多糖結(jié)合蛋白和其單克隆抗體、以及制備方法和用途<160>4<170>PatentInVersion3.1<210>1<211>648<212>DNA<213>人工序列<220><221>CDS<222>(1)..(75)<223>編碼人脂多糖結(jié)合蛋白(humanlipopolysaccharide-bindingprotein，HLBP)信號肽序列<220><221>CDS<222>(76)..(648)<223>編碼人脂多糖結(jié)合蛋白氨基端片段(NH-LBP)序列<220><221>mutation<222>(144)..(144)<223>GtoA<220><221>mutation<222>(626)..(626)<223>TtoA<220><221>mutation<222>(627)..(627)<223>AtoT<220><221>mutation<222>(637)..(637)<223>CtoT<220><221>mutation<222>(638)..(638)<223>TtoC<220><221>mutation<222>(639)..(639)<223>CtoT<400>1atgggggccttggccagagccctgccgtccatactgctggcattgctg48MetGlyAlaLeuAlaArgAlaLeuProSerIleLeuLeuAlaLeuLeu151015cttacgtccaccccagaggctctgggtgccaaccccggcttggtcgcc96LeuThrSerThrProGluAlaLeuGlyAlaAsnProGlyLeuValAla202530aggatcaccgacaagggactgcagtatgcggcccaggaggggctatta144ArgIleThrAspLysGlyLeuGlnTyrAlaAlaGlnGluGlyLeuLeu354045gctctgcagagtgagctgctcaggatcacgctgcctgacttcaccggg192AlaLeuGlnSerGluLeuLeuArgIleThrLeuProAspPheThrGly505560gacttgaggatcccccacgtcggccgtgggcgctatgagttccacagc240AspLeuArgIleProHisValGlyArgGlyArgTyrGluPheHisSer65707580ctgaacatccacagctgtgagctgcttcactctgcgctgaggcctgtc288LeuAsnIleHisSerCysGluLeuLeuHisSerAlaLeuArgProVal859095cctggccagggcctgagtctcagcatctccgactcctccatccgggtc336ProGlyGlnGlyLeuSerLeuSerIleSerAspSerSerIleArgVal100105110cagggcaggtggaaggtgcgcaagtcattcttcaaactacagggctcc384GlnGlyArgTrpLysValArgLysSerPhePheLysLeuGlnGlySer115120125tttgatgtcagtgtcaagggcatcagcatttcggtcaacctcctgttg432PheAspValSerValLysGlyIleSerIleSerValAsnLeuLeuLeu130135140ggcagcgagtcctccgggaggcccacagttactgcctccagctgcagc480GlySerGluSerSerGlyArgProThrValThrAlaSerSerCysSer145150155160agtgacatcgctgacgtggaggtggacatgtcgggagacttggggtgg528SerAspIleAlaAspValGluValAspMetSerGlyAspLeuGlyTrp165170175ctgttgaacctcttccacaaccagattgagtccaagttccagaaagta576LeuLeuAsnLeuPheHisAsnGlnIleGluSerLysPheGlnLysVal180185190ctggagagcaggatttgcgaaatgatccagaaatcggtgtcctccgat624LeuGluSerArgIleCysGluMetIleGlnLysSerValSerSerAsp195200205catcagccttattctcaaactctg648HisGlnProTyrSerGlnThrLeu210215<210>2<211>249<212>DNA<213>人工序列<220><221>CDS<222>(58)..(90)<223>編碼人源抗NH-LBP單克隆Fab抗體中κ輕鏈基因的CDRS區(qū)<220><221>CDS<222>(136)..(156)<223>編碼人源抗NH-LBP單克隆Fab抗體中κ輕鏈基因的CDRS區(qū)<400>2ACCCAGTCTCCATCCTCCCTTTCTGCATCTGTCGGAGACAGAGTCACC48ThrGlnSerProSerSerLeuSerAlaSerValGlyAspArgValThr151015ACCACTACGCGGGCAAGTCAGGTAATTAGCAGTTCTTTAGCCTGGTAT96ThrThrThrArgAlaSerGlnValIleSerSerSerLeuAlaTrpTyr202530CAGCAAAAACCAGGCAAAGCCCCTAAACTCCTGATCTACGGTGCGTCC144GlnGlnLysProGlyLysAlaProLysLeuLeuIleTyrGlyAlaSer354045ACTTACAAATTGGGGTCCCTTTACGGTTCAGCGGCAGTGGGTCTGGGA192ThrTyrLysLeuGlySerLeuTyrGlySerAlaAlaValGlyLeuGly505560CCGATTTCACTCTCACCATTGACGTCCCGCAGCCTGAAGATTCTGCAA240ProIleSerLeuSerProLeuThrSerArgSerLeuLysIleLeuGln65707580CTTATTACT249LeuIleThr<210>3<211>270<212>DNA<213>人工序列<220><221>CDS<222>(67)..(81)<223>編碼人源抗NH-LBP單克隆Fab抗體中重鏈VH基因的CDRS區(qū)<220><221>CDS<222>(124)..(174)<223>編碼人源抗NH-LBP單克隆Fab抗體中重鏈VH基因的CDRS區(qū)<400>3GGAGGCTTAGTTCCGCCGGGGGGGTCACTTACACTCTCCTGTGCAGCA48GlyGlyLeuValGlnProGlyGlySerLeuThrLeuSerCysAlaAla151015TCTGGATTCCCATTCAGTACGTACTGGATGCACTGGGTCCGTCAAGGT96SerGlyPheProPheSerThrTyrTrpMetHisTrpValArgGlnGly202530CCAGGGCGGCGGCCGGTGTGGGTCTCTCGTGTCCACAGTGAAGGGAGT144ProGlyLysArgProValTrpValSerArgValHisSerGluGlySer354045GCCCGAAGTTACGCGGGCGCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGG192AlaArgSerTyrAlaGlyAlaValLysGlyArgPheThrIleSerArg505560GACAACGCCAGGAACACCGTCTATCTGCAGATGAATAGTCTGACAGAC240AspAsnAlaArgAsnThrValTyrLeuGlnMetAsnSerLeuThrAsp65707580GAAGACACGGGTGTCTATTATTGTGCGAGA270GluAspThrGlyValTyrTyrCysAlaArg8590<210>4<211>249<212>DNA<213>人工序列<220><221>CDS<222>(58)..(90)<223>編碼人源抗NH-LBP單克隆dsFv抗體中輕鏈rVL基因的CDRS區(qū)<220><221>CDS<222>(136)..(156)<223>編碼人源抗NH-LBP單克隆dsFv抗體中輕鏈rVL基因的CDRS區(qū)<400>4ACCCAGTCTCCATCCTCCCTTTCTGCATCTGTCGGAGACAGAGTCACC48ThrGlnSerProSerSerLeuSerAlaSerValGlyAspArgValThr151015ACCACTACGCGGGCAAGTCAGGTAATTAGCAGTTCTTTAGCCTGGTAT96ThrThrThrArgAlaSerGlnValIleSerSerSerLeuAlaTrpTyr202530CAGCAAAAACCAGGCAAAGCCCCTAAACTCTGTATCTACGGTGCGTCC144GlnGlnLysProGlyLysAlaProLysLeuCysIleTyrGlyAlaSer354045ACTTACAAATTGGGGTCCCTTTACGGTTCAGCGGCAGTGGGTCTGGGA192ThrTyrLysLeuGlySerLeuTyrGlySerAlaAlaValGlyLeuGly505560CCGATTTCACTCTCACCATTGACGTCCCGCAGCCTGAAGATTCTGCAA240ProIleSerLeuSerProLeuThrSerArgSerLeuLysIleLeuGln65707580CTTATTACT249LeuTleThr權利要求1.一種脂多糖結(jié)合蛋白氨基端片段，其特征在于，編碼所述脂多糖結(jié)合蛋白氨基端片段的DNA序列為Atgggggccttggccagagccctgccgtccatactgctggcattgctgcttacgtccaccccagaggctctgggtgccaaccccggcttggtcgccaggatcaccgacaagggactgcagtatgcggcecaggaggggctattagctctgcagagtgagctgctcaggatcacgctgcctgacttcaccggggacttgaggatcccccacgtcggccgtgggcgctatgagttccacagcctgaacatccacagctgtgagctgcttcactctgcgctgaggcctgtccctggccagggcctgagtctcagcatctccgactcctccatccgggtccagggcaggtggaaggtgcgcaagtcattcttcaaactacagggctcctttgatgtcagtgtcaagggcatcagcatttcggtcaacctcctgttgggcagcgagtcctccgggaggeccacagttactgcctccagctgcagcagtgacatcgctgacgtggaggtggacatgtcgggagacttggggtggctgttgaacctcttccacaaccagattgagtccaagttccagaaagtactggagagcaggatttgcgaaatgatccagaaatcggtgtcctccgatcatcagccttattctcaaactctg其中，下劃線區(qū)為編碼信號肽序列；以基因數(shù)據(jù)庫上脂多糖結(jié)合蛋白序列為標準，發(fā)生點突變的有G(144)→A(144)；T(626)→A(626)；A(627)→T(627)；C(637)→T(637)；T(638)→C(638)；C(639)→T(639)。2.一種脂多糖結(jié)合蛋白氨基端片段，其特征在于，所述脂多糖結(jié)合蛋白氨基端片段的氨基酸序列為MGALARALPSILLALLLTSTPEALGANPGLVARITDKGLQYAAQEGLLALQSELLRITLPDFTGDLRIPHVGRGRYEFHSLNIHSCELLHSALRPVPGQGLSLSISDSSIRVQGRWKVRKSFFKLQGSFDVSVKGISISVNLLLGSESSGRPTVTASSCSSDIADVEVDMSGDLGWLLNLFHNQIESKFQKVLESRICEMIQKSVSSDHQPYSQTL其中，下劃線區(qū)為信號肽的序列；以基因數(shù)據(jù)庫上脂多糖結(jié)合蛋白氨基酸序列為標準，發(fā)生點突變的有L(209)→H(209)；L(213)→S(213)。3.一種抗脂多糖結(jié)合蛋白氨基端片段單克隆Fab抗體，其特征在于，所述Fab抗體輕重鏈VL和VH的可變區(qū)基因序列及氨基酸序列如下輕鏈VL的基因序列為κ輕鏈ACCCAGTCTCCATCCTCCCTTTCTGCATCTGTCGGAGACAGAGTCACCACCACTACGCGGGCAAGTCAGGTAATTAGCAGTTCTTTAGCCTGGTATCAGCAAAAACCAGGCAAAGCCCCTAAACTCCTGATCTACGGTGCGTCCACTTACAAATTGGGGTCCCTTTACGGTTCAGCGGCAGTGGGTCTGGGACCGATTTCACTCTCACCATTGACGTCCCGCAGCCTGAAGATTCTGCAACTTATTACT對應氨基酸序列為TQSPSSLSASVGDRVTTTTRASQVISSSLAWYQQKPGKAPKLLIYGASTYKLGSLYGSAAVGLGPISLSPLTSRSLKILQLIT重鏈VH的基因序列為VH3亞群GGAGGCTTAGTTCAACCGGGGGGGTCACTTACACTCTCCTGTGCAGCATCTGGATTCCCATTCAGTACGTACTGGATGCACTGGGTCCGTCAAGGTCCAGGGAAGCGGCCGGTGTGGGTCTCTCGTGTCCACAGTGAAGGGAGTGCCCGAAGTTACGCGGGCGCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGGGACAACGCCAGGAACACCGTCTATCTGCAGATGAATAGTCTGACAGACGAAGACACGGGTGTCTATTATTGTGCGAGA對應氨基酸序列為GGLVQPGGSLTLSCAASGFPFSTYWMHWVRQGPGKRPVWVSRVHSEGSARSYAGAVKGRFTISRDNARNTVYLQMNSLTDEDTGVYYCAR其中，下劃線為CDRS區(qū)。4.一種抗脂多糖結(jié)合蛋白氨基端片段的dsFv抗體，其特征在于，所述dsFv抗體輕鏈rVL的可變區(qū)基因序列及氨基酸序列為ACCCAGTCTCCATCCTCCCTTTCTGCATCTGTCGGAGACAGAGTCACCACCACTACGCGGGCAAGTCAGGTAATTAGCAGTTCTTTAGCCTGGTATCAGCAAAAACCAGGCAAAGCCCCTAAACTCTGTATCTACGGTGCGTCCACTTACAAATTGGGGTCCCTTTACGGTTCAGCGGCAGTGGGTCTGGGACCGATTTCACTCTCACCATTGACGTCCCGCAGCCTGAAGATTCTGCAACTTATTACT對應氨基酸序列為TQSPSSLSASVGDRVTTTTRASQVISSSLAWYQQKPGKAPKLCIYGASTYKLGSLYGSAAVGLGPISLSPLTSRSLKILQLIT其中，下劃線為CDRS區(qū)。5.一種脂多糖結(jié)合蛋白氨基端片段的制備方法，其特征在于，提取編碼脂多糖結(jié)合蛋白氨基端片段的cDNA序列，通過病毒表達系統(tǒng)，采用細胞制備了脂多糖結(jié)合蛋白氨基端片段。6.根據(jù)權利要求5所述的脂多糖結(jié)合蛋白氨基端片段的制備方法，其特征在于，所述病毒表達系統(tǒng)為BAC-TO-BAC桿狀病毒表達系統(tǒng)；所述細胞為昆蟲sf21細胞。7.根據(jù)權利要求5或6所述的脂多糖結(jié)合蛋白氨基端片段的制備方法，其特征在于，所述方法具體包括下列步驟從感染休克死亡患者的肝細胞內(nèi)提取信使RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA文庫，以特異引物5′-GTCGACTGGAGTGGGAATCTAGGA-3′；5′-AAGCTTATTCTGTGTTGTAACTGG-3′擴增出編碼人脂多糖結(jié)合蛋白氨基端片段的雙鏈DNA序列，并與pMD19-TSimpleVector連接，轉(zhuǎn)入感受態(tài)DH-5a菌中；測試正確后以SalI、HindIII行雙酶切，目的序列回收、純化，并與相同酶處理的載體pFASTBAC連接，構(gòu)建質(zhì)粒pFASTBAC-NH-LBP；將pFASTBAC-NH-LBP轉(zhuǎn)入DH10BAC菌中，通過基因轉(zhuǎn)位，構(gòu)建穿梭質(zhì)粒pBacmid-NH-LBP，在測序正確后，將pBacmid-NH-LBP感染昆蟲細胞sf21，則sf21細胞釋放出編碼脂多糖結(jié)合蛋白氨基端片段蛋白的病毒顆粒；以病毒顆粒感染對數(shù)生長期的sf21細胞，在無血清培養(yǎng)基Sf900IISFM表達脂多糖結(jié)合蛋白氨基端片段蛋白質(zhì)，并脂多糖結(jié)合蛋白氨基端片段蛋白質(zhì)以TALON柱芯進行梯度親和純化，得到脂多糖結(jié)合蛋白氨基端片段。8.一種抗脂多糖結(jié)合蛋白氨基端片段單克隆Fab抗體的制備方法，其特征在于，所述建立噬菌體抗體庫，以脂多糖結(jié)合蛋白氨基端片段為抗原進行了篩選，制備抗脂多糖結(jié)合蛋白氨基端片段單克隆Fab抗體。9.根據(jù)權利要求8所述的抗脂多糖結(jié)合蛋白氨基端片段單克隆Fab抗體的制備方法，其特征在于，所述建立噬菌體抗體庫，具體包括下列步驟從健康志愿者的外周血中分離獲得單核細胞，從單核細胞中提取DNA序列，分別以7對引物擴增編碼抗體重鏈IgVH的可變區(qū)序列、4對引物擴增編碼抗體輕鏈IgVκ的可變區(qū)序列、5對引物擴增編碼抗體輕鏈IgVλ的可變區(qū)序列，分別以SacI+XbaI、XhoI+SpeI消化，以pComb3H噬菌粒為載體，于XL1-Blue桿菌內(nèi)建立了人源噬菌體抗體文庫Fab。10.根據(jù)權利要求8所述的抗脂多糖結(jié)合蛋白氨基端片段單克隆Fab抗體的制備方法，其特征在于，所述以脂多糖結(jié)合蛋白氨基端片段為抗原進行了篩選，具體包括下列步驟將脂多糖結(jié)合蛋白氨基端片段作為抗原包被酶聯(lián)板，洗板后加入噬菌體抗體庫，結(jié)合后洗板，然后洗下已結(jié)合的噬菌體，重新感染XL1-Blue菌并擴增抗體庫，擴增的噬菌體抗體庫進行下一輪的篩選。11.根據(jù)權利要求8至10任一項所述的抗脂多糖結(jié)合蛋白氨基端片段單克隆Fab抗體的制備方法，其特征在于，所述制備抗脂多糖結(jié)合蛋白氨基端片段單克隆Fab抗體，具體包括下列步驟通過聚合酶鏈式反應法，從陽性單克隆菌株的pComb3H中，將編碼抗體輕重鏈的VH和VL分別擴增出，分別置于載體pET-30a(+)，構(gòu)建表達質(zhì)粒pET-30a(+)-VH和pET-30a(+)-VL，分別電轉(zhuǎn)入BL21star(DE3)菌中，以IPTG誘導表達，將表達的VH和VL多肽以TALON親和純化后，進行共同復性、折疊，形成Fab抗體。12.一種抗脂多糖結(jié)合蛋白氨基端片段的dsFv抗體的制備方法，其特征在于，在抗脂多糖結(jié)合蛋白氨基端片段單克隆Fab抗體的輕鏈基因骨架區(qū)FWR2中引入編碼Cys的基因序列rVL，然后將改變的rVL序列置于載體pET-30a(+)中，構(gòu)建表達質(zhì)粒pET-30a(+)-rVL，并電轉(zhuǎn)入BL21star(DE3)菌中，以IPTG誘導表達并純化而制備。13，根據(jù)權利要求12所述的抗脂多糖結(jié)合蛋白氨基端片段的dsFv抗體的制備方法，其特征在于，所述在抗脂多糖結(jié)合蛋白氨基端片段單克隆Fab抗體的輕鏈基因骨架區(qū)FWR2中引入編碼Cys的基因序列rVL，是通過應用mega-primerPCR方法而實現(xiàn)的。14.一種抗脂多糖結(jié)合蛋白氨基端片段單克隆Fab抗體的應用，其特征在于，所述的抗脂多糖結(jié)合蛋白氨基端片段單克隆Fab抗體在制備治療炎癥藥物中的應用。15.根據(jù)權利要求14所述的抗脂多糖結(jié)合蛋白氨基端片段單克隆Fab抗體的應用，其特征在于，所述炎癥為燒傷腸源性感染或者菌痢等G-桿菌所致的感染。16.一種抗脂多糖結(jié)合蛋白氨基端片段的dsFv抗體的應用，其特征在于，所述抗脂多糖結(jié)合蛋白氨基端片段的dsFv抗體在制備治療炎癥藥物中的應用。17.根據(jù)權利要求16所述的抗脂多糖結(jié)合蛋白氨基端片段的dsFv抗體的應用，其特征在于，所述炎癥為燒傷腸源性感染或者菌痢等G-桿菌所致的感染。18.一種抗脂多糖結(jié)合蛋白氨基端片段單克隆Fab抗體的應用，其特征在于，所述抗脂多糖結(jié)合蛋白氨基端片段單克隆Fab抗體在制備檢測體內(nèi)脂多糖結(jié)合蛋白水平的藥物中的應用。19.一種抗脂多糖結(jié)合蛋白氨基端片段的dsFv抗體的應用，其特征在于，所述抗脂多糖結(jié)合蛋白氨基端片段的dsFv抗體在制備檢測體內(nèi)脂多糖結(jié)合蛋白水平的藥物中的應用。20.一種抗脂多糖結(jié)合蛋白氨基端片段單克隆Fab抗體的應用，其特征在于，所述藥物中包括如權利要求3中所述抗脂多糖結(jié)合蛋白氨基端片段單克隆Fab抗體，并混合一種或一種以上醫(yī)藥上可接受的載體或添加劑。21.一種抗脂多糖結(jié)合蛋白氨基端片段的dsFv抗體的應用，其特征在于，所述藥物中包括如權利要求4中所述抗脂多糖結(jié)合蛋白氨基端片段的dsFv抗體，并混合一種或一種以上醫(yī)藥上可接受的載體或添加劑。全文摘要本發(fā)明公開了一種脂多糖結(jié)合蛋白和其單克隆抗體、以及制備方法和用途。通過從人肝細胞中提取編碼NH－LBP的cDNA片段，采用昆蟲sf21細胞制備了NH－LBP蛋白，并通過pComb3H噬菌粒建立了人源噬菌體抗體庫，以NH－LBP為抗原進行了篩選，從而制備了抗NH－LBP人源單克隆抗體Fab抗體，以及dsFv抗體。該Fab抗體以及dsFv抗體能特異性地與人完整脂多糖結(jié)合蛋白的N端結(jié)合，競爭性地抑制了LBP與LPS的結(jié)合，使得機體對LPS的敏感性下降，降低LPS導致的過度炎癥反應，并促進機體對LPS的降解，從而抑制過度的炎癥反應和防止彌漫性毛細血管內(nèi)凝血、多臟器衰竭的發(fā)生。文檔編號A61P29/00GK101081863SQ200710078119公開日2007年12月5日申請日期2007年1月11日優(yōu)先權日2007年1月11日發(fā)明者葛曉冬申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院