專利名稱：：神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白突變體及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路中EGFR酪氨酸激酶家族中ErbB受體的配體即神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白，具體涉及神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白突變體及編碼神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白突變體的核苷酸序列、表達(dá)載體、基因工程菌株及應(yīng)用。發(fā)明背景神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白(Neuregulin，NRG)是表皮生長因子受體(EGFR)酪氨酸激酶家族[EGFR家族有4個(gè)成員，即ErbB-l(HERl，EGFR)、ErbB-2(HER2，neu)、ErbB-3(HER3)和ErbB-4(服R4)]的一個(gè)重要配體,包括神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1(NRG1)、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白2(NRG2)、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白3(NRG3)、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白4(NRG4)。神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1P為一種跨膜蛋白(Holmes等，Scie/7ce256，1205-1210，1992)，膜外部分是N末端，包括免疫球蛋白類似區(qū)(Ig-likedomain)和EGF類似區(qū)(EGF-likedomain)(受體結(jié)合的必需有效部位)，膜內(nèi)部分是C末端。神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白對心臟的發(fā)育尤其重要(W00037095;CN1276381;WO03099300;WO9426298;US6444642;\TO9918976;W00064400;Zhao等，/273,10261-10269，1998)。WO0037095揭示了一定濃度的重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白(rh-neuregulin)可持續(xù)激活ERK信號通路，促進(jìn)心肌細(xì)胞的生長及分化，引導(dǎo)心肌細(xì)胞和細(xì)胞粘連處肌節(jié)和細(xì)胞骨架的重建，改善心肌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)心肌細(xì)胞的收縮。通過動(dòng)物模型研究發(fā)現(xiàn)rh-neuregulin可以降低缺血、缺氧、病毒感染等因素對心肌細(xì)胞的損害程度，修復(fù)受損的心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)，改善心臟的血流動(dòng)力學(xué)；顯著提高模型動(dòng)物的存活率，有效治療各種原因?qū)е碌膭?dòng)物心力衰竭。NRGl的受體包括ErbB3和ErbB4，NRGl雖不與ErbB2直接結(jié)合，但可誘導(dǎo)ErbB2分別與ErbB3或ErbB4形成ErbB2/ErbB3或ErbB2/ErbB4異源二聚體并進(jìn)一步啟動(dòng)這些受體下游的信號傳導(dǎo)途徑。而大量研究證明在心血管系統(tǒng)中ErbB4受體高表達(dá)，在心肌中NRG1介導(dǎo)的ErbB2/ErbB4信號傳導(dǎo)途徑是維持心臟正常生理功能的重要途徑，而ErbB3卻廣泛表達(dá)于神經(jīng)系統(tǒng)和其它各種組織。因此，NRG1在實(shí)際臨床應(yīng)用中的一個(gè)顧慮是該藥物可能會(huì)通過激活ErbB2/ErbB3信號傳導(dǎo)途徑，從而在神經(jīng)系統(tǒng)及其它各種組織中產(chǎn)生副作用。因此，確有必要改變NRG1的特性，提高NRG1激活ErbB2/ErbB4信號傳導(dǎo)途徑的活性，降低其激活ErbB2/ErbB3信號傳導(dǎo)途徑的活性，從而在提高其對心血管組織作用的同時(shí)，降低NRG1在其它系統(tǒng)及組織中產(chǎn)生的副作用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的正是提供一種對心肌細(xì)胞具有高特異性，而對其它系統(tǒng)或組織具有降低的副作用的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白突變體。在本發(fā)明的第一方面，提供了一種神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白突變體，其包含神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白EGF類似區(qū)，其特征在于，該突變體是所述神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白的第177-223位氨基酸殘基發(fā)生突變而形成的突變體，且所得突變體對ErbB2/ErbB4共表達(dá)的細(xì)胞中ErbB受體磷酸化的誘導(dǎo)活性高于神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白，而對ErbB2/ErbB3共表達(dá)的細(xì)胞中ErbB受體磷酸化的誘導(dǎo)活性低于神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白選自神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1，優(yōu)選為神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白，更優(yōu)選神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白IP1、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白102、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1P2類似物或神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白最優(yōu)選神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1P2。在另一優(yōu)選例中，所述突變體至少包括神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白IP的第177位至229位的氨基酸序列，優(yōu)選包括神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1P的第177位至237位的氨基酸片段，上述位點(diǎn)均從神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白的N端起計(jì)算。在另一優(yōu)選例中，所述突變體優(yōu)選包括神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白132的第177位至237位的氨基酸片段，上述位點(diǎn)均從神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白的N端起計(jì)算。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白的第223位氨基酸殘基N突變?yōu)榉荖的其它氨基酸殘基。在另一優(yōu)選例中，所述神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白的第223位氨基酸殘基對應(yīng)于重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白的47位。在另一優(yōu)選例中，所述的非N的其它氨基酸殘基選自R和K。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述突變體的氨基酸序列中包括SEQIDN0:2或SEQIDNO:4所示的序列。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述氨基酸序列包括序列SHLVKCAEKEKTFCVNGGECFMVKDLSNPSRYLCKCPNEFTGDRCQgYVMASFYKAEELYQ或SHLVKCAEKEKTFCVNGGECFMVKDLSNPSRYLCKCPNEFTGDRCQpVMASFYKAEELYQ。在另一優(yōu)選例中，所述突變體由SEQIDNO:2或SEQIDNO:4所示的序列組成。在本發(fā)明的第二方面，提供了本發(fā)明神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白突變體的編碼序列。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述編碼序列編碼本發(fā)明神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白突變體。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，該核苷酸序列包括SEQIDNO:1或SEQIDNO:3所示的序列。在本發(fā)明的第三方面，提供了一種包含本發(fā)明編碼序列的表達(dá)載體。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述表達(dá)載體包含序列表中SEQIDNO:l或SEQIDNO:3所示的核苷酸序列。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述表達(dá)載體為pET22b。在本發(fā)明的第四方面，提供了一種用于表達(dá)本發(fā)明神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白突變體的宿主細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述宿主細(xì)胞是原核生物細(xì)胞或真核生物細(xì)胞。在另一優(yōu)選例中，所述宿主細(xì)胞是基因工程菌株，該基因工程菌株是將本發(fā)明的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌得到的。在本發(fā)明的第五方面，提供了神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白突變體在制備治療心臟病的藥物中的用途。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述心臟病選自病毒性心肌炎、擴(kuò)張型心肌病、急性心功能不全、冠心病、肥厚性心肌病、缺血性心臟病、心功能障礙、心力衰竭、心臟毒性、心肌梗死或它們的組合。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白突變體為權(quán)利要求3所述的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白突變體。在本發(fā)明的第六方面，提供了一種藥物組合物，其包含(i)有效量的活性物質(zhì)，所述活性物質(zhì)為本發(fā)明的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白突變體；(ii)藥學(xué)上可接受的載體。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述藥物組合物用于治療心臟病。在另一個(gè)優(yōu)選例中，所述心臟病選自病毒性心肌炎、擴(kuò)張型心肌病、急性心功能不全、冠心病、肥厚性心肌病、缺血性心臟病、心功能障礙、心力衰竭、心臟毒性、心肌梗死或它們的組合。在另一優(yōu)選例中，以藥物組合物的總重量為基準(zhǔn)計(jì)，所述藥物組合物中活性物質(zhì)的含量為0.001-99.9wt%，優(yōu)選0.01-95wt%,更優(yōu)選0.1-90wt%，最優(yōu)選0.5-80wt%。本發(fā)明的突變體可在提高對心肌細(xì)胞作用效果的同時(shí)，降低對乳腺等其它組織或系統(tǒng)的副作用，有望成為較rhNRGip2更好的治療心臟病的藥物。具體實(shí)施方式己有研究證明NRG1通過EGF類似區(qū)與ErbB3或ErbB4受體結(jié)合而激活相應(yīng)的信號傳導(dǎo)途徑，因此EGF類似區(qū)是NRG1生物學(xué)活性的關(guān)鍵部位。本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，制備并篩選了大量神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白的突變體，從中獲得了一類突變體，此類突變體對ErbB2/ErbB4共表達(dá)的細(xì)胞中ErbB受體磷酸化的誘導(dǎo)活性高于神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白，且對ErbB2/ErbB3共表達(dá)的細(xì)胞中ErbB受體磷酸化的誘導(dǎo)活性低于神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白。在此基礎(chǔ)上完成了，發(fā)明人完成了本發(fā)明。具體而言，發(fā)明人采用常規(guī)技術(shù)使得神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白(例如rhNRGlP2)的氨基酸序列發(fā)生突變，由此獲得了多種神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白突變體。通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白EGF類似區(qū)的第223位氨基酸殘基N突變?yōu)榉荖的其它氨基酸殘基(例如突變?yōu)镽或K)的一類突變體對ErbB2/ErbB4共表達(dá)的細(xì)胞中ErbB受體磷酸化的誘導(dǎo)活性高于神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白，且對ErbB2/ErbB3共表達(dá)的細(xì)胞中ErbB受體磷酸化的誘導(dǎo)活性低于神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白。由此，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了一類比神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白對心臟的特異性更高，對其它系統(tǒng)、組織副作用更小，且更為有效的心臟病治療藥物。神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白在本發(fā)明中，術(shù)語"神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白"是指表皮生長因子受體(EGFR)酪氨酸激酶家族的一類重要配體。在較佳的實(shí)施方案中，所述神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白選自神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1(31、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1(52或神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1(53。這些神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白的氨基酸序列在EP0586607B1中已經(jīng)公開，這些序列信息全部納入本文作為參考。在本發(fā)明中，所述的"神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白EGF類似區(qū)"是指人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白EGF類似區(qū)，即neuregulinEGF類似區(qū)，簡寫NRGEGF類似區(qū)，其至少包括神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1P的第177位至223位的氨基酸序列，優(yōu)選包括神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1P的第177位至229位的氨基酸片段，更優(yōu)選包括神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白的第177位至237位的氨基酸片段，上述位點(diǎn)均從神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白的N端起計(jì)算。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白EGF類似區(qū)優(yōu)選包括神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1P2的第177位至237位的氨基酸片段(見EP0586607B1)神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白ipi、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白lp2或神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1(33的EGF類似區(qū)的氨基酸起始位置相同，但長度不同，從230開始不同，但其223位的氨基酸都是N。在本發(fā)明中，術(shù)語"包含EGF類似區(qū)的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白"包括神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白ie，而所述的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白ie優(yōu)選選自神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白iei、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白ie2、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白ie2類似物或神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白ie3;在本發(fā)明中，優(yōu)選地選擇神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白lP2。所述神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白可誘導(dǎo)ErbB2分別與ErbB3或ErbB4形成ErbB2/ErbB3或ErbB2/ErbB4異源二聚體，并進(jìn)一步啟動(dòng)這些受體下游的信號傳導(dǎo)途徑，其誘導(dǎo)作用不具有心臟選擇性。在本發(fā)明中，可對天然的包含EGF類似區(qū)的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白序列進(jìn)行突變，也可對重組的包含EGF類似區(qū)的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白序列進(jìn)行突變，例如重組人NRG1P2(rhNRGlP2)。神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白突變體本發(fā)明中，術(shù)語"神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白突變體"或"突變體"是指在神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白的第177-223位氨基酸殘基發(fā)生突變而形成的突變體，且所得突變體對ErbB2/ErbB4共表達(dá)的細(xì)胞中ErbB受體磷酸化的誘導(dǎo)活性高于神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白，而對ErbB2/ErbB3共表達(dá)的細(xì)胞中ErbB受體磷酸化的誘導(dǎo)活性低于神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白。本文中的"神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白突變體"可包括在下述蛋白或多肽中發(fā)生突變而形成的突變體包含神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白EGF類似區(qū)的全長神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白、至少包含神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白EGF類似區(qū)的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白部分區(qū)域、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白EGF類似區(qū)、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白中的第177-223位氨基酸序列(優(yōu)選神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白中的第177-229位氨基酸序列、更優(yōu)選第177-237位氨基酸序列)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，在包含EGF類似區(qū)的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白的氨基酸序列第223位由殘基N突變?yōu)榉荖的其它氨基酸殘基而形成的一類突變體。優(yōu)選地，所述的非N的其它氨基酸殘基選自Gin;His;Lys;Arg。在更佳的實(shí)施方案中，所述非N的其它氨基酸殘基選自賴氨酸(Lys，R)或精氨酸(Arg，K)。在本發(fā)明的較佳實(shí)施方案中，所述神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白突變體相對于天然神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白而言，其區(qū)別僅僅在于EGF類似區(qū)，更佳的僅僅在于第223位氨基酸。在另一較佳實(shí)施方案中，所述突變體至少包含神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白中的177-237位氨基酸序列，更優(yōu)選僅包含神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白的177-237位氨基酸序列。在本發(fā)明中，優(yōu)選對rhNRGlP2的177-237(SHLVKCAEKEKTFCVNGGECFMVKDLSNPSRYLCKCPNEFTGDRCQNYVMASFYKAEELYQ)之間的氨基酸殘基進(jìn)行突變，獲得一種重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白突變體(rh-neuregulinlP2突變體，rhNRGl突變體)，這種重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白突變體對ErbB2/ErbB4異源二聚體的誘導(dǎo)激活比重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白(rhNRGlP2)本身具有更高的活性，從而有望成為比rhNRGl32更為有效的新一代藥物。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白突變體是指重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白的第47位從N突變?yōu)镽的氨基酸序列，該神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白突變體簡寫為rhNRGl(32-N47R，包括SEQIDNO:2所示的序列，即SHLVKCAEKEKTFCVNGGECFMVKDLSNPSRYLCKCPNEFTGDRCQpVMASFYKAEELYQ。在本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方式中，神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白突變體還指重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白EGF類似區(qū)的第47位從N突變?yōu)镵的氨基酸序列，該神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白突變體簡寫為rhNRGl卩2-N47K，包括SEQIDNO:4所示的序列，gp:SHLVKCAEKEKTFCVNGGECFMVKDLSNPSRYLCKCPNEFTGDRCQpVMASFYKAEELYQ。神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白突變體的編碼序列、表達(dá)載體及宿主細(xì)胞在本發(fā)明中，術(shù)語"神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白突變體的編碼序列"是指編碼所述突變體的核苷酸序列。所述序列可為在天然神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白的編碼序列基礎(chǔ)上進(jìn)行誘變(例如定點(diǎn)突變)而得到的序列，也可為人工合成的序列，只要其表達(dá)產(chǎn)物為本發(fā)明的突變體蛋白。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述編碼序列包括SEQIDNO:l或SEQIDNO:3所示的序列。在另一優(yōu)選實(shí)施方式中，所述編碼序列編碼的突變體包括序列SHLVKCAEKEKTFCVNGGECFMVKDLSNPSRYLCKCPNEFTGDRCQpVMASFYKAEELYQ或SHLVKCAEKEKTFCVNGGECFMVKDLSNPSRYLCKCPNEFTGDRCQpVMASFYKAEELYQ。在本發(fā)明中，術(shù)語"神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白突變體的表達(dá)載體"是指負(fù)載有本發(fā)明的編碼序列，且在基因操作中可用于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的復(fù)制子，包括但不限于質(zhì)粒、病毒或噬菌體。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，所述表達(dá)載體為pET22b。在本發(fā)明中，術(shù)語"用于表達(dá)神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白突變體的宿主細(xì)胞"或"宿主細(xì)胞"可互換使用，均是指能夠接收和容納重組分子，并在其中實(shí)現(xiàn)重組基因的擴(kuò)增和表達(dá)的細(xì)胞。在本發(fā)明中，所述宿主細(xì)胞可以是原核生物細(xì)胞或真核生物細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述宿主細(xì)胞是基因工程菌株，該基因工程菌株是用本發(fā)明的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌得到的。以上表達(dá)載體及宿主細(xì)胞的選擇和獲得均可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所知曉的常規(guī)方法得以實(shí)現(xiàn)。藥物組合物本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，所述的組合物含有有效量的本發(fā)明的突變體，以及藥學(xué)上可接受的載體。在較佳的實(shí)施方案中，所述藥物組合物可用于治療與現(xiàn)有技術(shù)中已知可由神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白所能治療的各種疾病，例如與ERK信號通路相關(guān)聯(lián)的疾病，包括心臟病，例如病毒性心肌炎、擴(kuò)張型心肌病、急性心功能不全、冠心病、肥厚性心肌病、缺血性心臟病、心功能障礙、心力衰竭、心臟毒性、心肌梗死或它們的組合。如本文所用，術(shù)語"含有"或"包括"包括了"包含"、"基本上由……構(gòu)成"、禾B"由……構(gòu)成"。如本文所用，術(shù)語"藥學(xué)上可接受的"成分是適用于人和/或動(dòng)物而無過度不良副反應(yīng)(如毒性、刺激和變態(tài)反應(yīng))的，即有合理的效益/風(fēng)險(xiǎn)比的物質(zhì)。如本文所用，術(shù)語"有效量"是指可對人和/或動(dòng)物產(chǎn)生功能或活性的且可被人和/或動(dòng)物所接受的量。如本文所用，術(shù)語"藥學(xué)上可接受的載體"指用于治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。該術(shù)語指這樣一些藥劑載體它們本身并不是必要的活性成分，且施用后沒有過分的毒性。合適的載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。在《雷明頓藥物科學(xué)》(Remington'sPharmaceuticalSciences,MackPub.Co.,N丄1991)中可找到關(guān)于藥學(xué)上可接受的賦形劑的充分討論。在組合物中藥學(xué)上可接受的載體可含有液體，如水、鹽水、甘油和乙醇。另外，這些載體中還可能存在輔助性的物質(zhì)，如填充劑、崩解劑、潤滑劑、助流劑、泡騰劑、潤濕劑或乳化劑、矯味劑、pH緩沖物質(zhì)等。通常，可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8，較佳地，pH約為6-8。本發(fā)明的組合物中神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白突變體有效成分占組合物總重量的0.00199.9wt%;優(yōu)選為組合物總重量的l95wt。/。，較優(yōu)選為590wt。/。，更優(yōu)選1080wt。/。。余量為藥學(xué)上可接受的載體以及其它添加劑等物質(zhì)。如本文所用，術(shù)語"單位劑型"是指為了服用方便，將本發(fā)明的組合物制備成單次服用所需的劑型，包括但不限于各種固體劑(如片劑)、液體劑、膠囊劑、緩釋劑。在本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方式中，所述組合物為單位劑型或多劑型，且其中神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白突變體的含量為0.012000mg/劑，優(yōu)選0.11500mg/劑，更優(yōu)選l1000mg/劑。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選例中，每天施用16劑本發(fā)明的組合物，優(yōu)選施用13劑；最優(yōu)選的，每天服用的劑量為l劑。應(yīng)理解，所用神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白突變體的有效劑量可隨待施用或治療的對象的嚴(yán)重程度而變化。具體情況根據(jù)對象的個(gè)體情況(例如對象體重、年齡、身體狀況、所需達(dá)到的效果)來決定，這在熟練醫(yī)師可以判斷的范圍內(nèi)。本發(fā)明的組合物，可以為固態(tài)(如顆粒劑、片劑、凍干粉、栓劑、膠囊、舌下含片)或液態(tài)(如口服液)或其它合適的形狀。此外，本發(fā)明的組合物中還可含有用于改善和治療心臟病的其它活性物質(zhì)，所述的其它活性物質(zhì)選自下組ACE抑制劑、P腎上腺素阻斷劑和/或地高辛。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于篩選了大量神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白突變體，并獲得了較未突變的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白而言，能增強(qiáng)誘導(dǎo)ErbB2/ErbB4共表達(dá)細(xì)胞中ErbB受體的磷酸化，同時(shí)降低誘導(dǎo)ErbB2/ErbB3共表達(dá)細(xì)胞中ErbB受體的磷酸化的突變體。在此基礎(chǔ)上，開發(fā)出一類對心肌細(xì)胞具有提高的作用效果，而對于乳腺、神經(jīng)系統(tǒng)等其它組織或系統(tǒng)具有降低的副作用，并有望成為較rhNRGl卩2更好的治療心臟病的藥物。實(shí)施例下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件、或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。實(shí)施例1編碼rhNRGl(J2突變體(rhNRGlp2N47R，rhNRGip2N47K)的質(zhì)粒的構(gòu)建、表達(dá)和rhNRGip2突變體的純化參照Stratagene公司QuikChangeSite-Directedmutagenesiskit的使用手冊，用在目標(biāo)位點(diǎn)已引入編碼突變氨基酸密碼子的2個(gè)互補(bǔ)核苷酸序列(長30個(gè)核苷酸左右)作為正反向引物，以含編碼人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白61個(gè)氨基酸片段的核苷酸序列的重組質(zhì)粒pET22b-rhNRGl(i2(參見中國專利申請CN03811866.1及TO2003/099300的實(shí)施例l)為模板，用PfuTurboDNA聚合酶(Stratagene公司)進(jìn)行PCR環(huán)形擴(kuò)增，隨后用DpnI酶解掉甲基化的初始模板，剩下合成的帶點(diǎn)突變的有缺口的雙鏈DNA，將該雙鏈DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a以修復(fù)缺口并擴(kuò)增，純化得到含有編碼NRG突變體的質(zhì)粒。將少量純化的質(zhì)粒送上海博亞生物技術(shù)公司測序。將序列正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21，接種到含氨芐卡霉素的瓊脂板上，37'C過夜培養(yǎng)，挑單菌落轉(zhuǎn)入LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD,約為0.40.6時(shí)加入IPTG(異丙基硫代-P-D-半乳糖苷)(終濃度為O.3,ol/L)，37X:誘導(dǎo)表達(dá)3小時(shí)。4°C、8,000rpm離心IO分鐘收集菌體，將收取的菌體用PBS洗一遍，重懸于PBS中超聲破菌。4°C、8000r/分鐘離心IO分鐘，分別收集上清和沉淀。取少量上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE,發(fā)現(xiàn)目標(biāo)蛋白主要在沉淀中，即在包涵體中。在沉淀中加入適量清洗液(lOOmMTris，pH7.0，5mMEDTA，5mMDTT，1.5M尿素，2%TritonX-IOO)后超聲，離心收集沉淀。在沉淀中加入溶解液(20mMNa2HP04-NaH2P04，pH8.0，6M尿素，5mMDTT)室溫溶解包涵體30分鐘，所得溶液于17000g離心10分鐘后收集上清。將上清與復(fù)性液以1:8的比例(v/v)混合[復(fù)性液10mMNa2HP04-C6H807，pH8.0,0.5mMGSSG(氧化型谷胱甘肽)，0.5mMGSH(谷胱甘肽)，lmMEDTA]，先于室溫放置2小時(shí)，再置于4。C過夜。將混合液上SPS印haroseHP離子交換柱(GEhealthcare)后，用NaCl梯度洗脫液(10mMNa2HP04-CBH807，PH6.O)洗脫，收集主洗脫峰。將收集的蛋白溶液和4M的NaCl溶液等體積混合，隨后上Phenyl疏水柱(GEhealthcare),再用低鹽洗脫液(10mMNa2HP04-C6H807，pH8.0)洗脫，收集洗脫液即得純化的rhNRGl(J2突變體(rhNRGl卩2N47R或rhNRGip2N47K)。實(shí)施例2rhNRGlp2突變體(rhNRGl卩2N47R,rhNRGip2N47K)誘導(dǎo)ErbB2/ErbB4共表達(dá)細(xì)胞中ErbB磷酸化的活性測定在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，接種穩(wěn)定表達(dá)ErbB2、ErbB4的CHO細(xì)胞(用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染篩選獲得)，置于37。C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)后，用無血清IMDM培養(yǎng)液再培養(yǎng)24小時(shí)。吸去培養(yǎng)液，然后各孔分別加入100pl不同濃度的rhNRGlP2或rhNRGlP2突變體溶液(rhNRGlP2或其突變體最高濃度為2ug/mL，取適量該溶液用無血清IMDM稀釋3倍，再取適量稀釋后的溶液稀釋3倍，重復(fù)上述操作5次，得到由高到低8個(gè)濃度的rhNRGlP2或其突變體蛋白溶液)，其中兩孔僅加無血清培養(yǎng)液作陰性對照，37。C保溫20分鐘后，吸去培養(yǎng)液，用PBS洗1次后加入100^1細(xì)胞裂解液(50mMTris，pH7.4，150mMNaCl，1%TritonX-100,5mMEDTA，50mMNaF，2mM釩酸鈉，2mMPMSF，cocktail蛋白酶抑制劑(Roche，每25ml溶液加一片))，將板放在振蕩器上于4'C冰箱振蕩30分鐘，再于4。C，15000rpm離心15分鐘，從而使得培養(yǎng)板小孔中澄清的細(xì)胞裂解液和沉淀完全分離。用鼠抗人ErbB2單克隆抗體(用常規(guī)的單克隆抗體制備方法獲得)包被酶標(biāo)板，置于4'C過夜。用PBS洗板5次后，以含5y。脫脂奶粉的PBS封閉。再用PBS洗板5次，每孔分別加入90nl上述澄清的細(xì)胞裂解液，于37'C保溫1小時(shí)。吸去各孔的細(xì)胞裂解液，用PBS洗板5次，每孔加入10(^1稀釋了500倍的HRP偶聯(lián)鼠抗人磷酸化酪氨酸抗體[p-Tyr(PY99):sc-7020HRP(SantaCruzBiotechnology)],于37'C保溫1小時(shí)。吸去抗體溶液，洗板5次，每孔加入100(al底物溶液[9ml底物緩沖液(50mM檸檬酸，100mMNa2HP04，pH5.0，0.2mg/ml3,3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，0.003%HA]，于37。C保溫10分鐘后，每孔再加入50^12NH2S04。將板置于酶標(biāo)儀中，在測定波長450nm，參比波長655nm分別測OD值。以rhNRG1(32或rhNRG1(32突變體濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的OD值差值為縱坐標(biāo)，以GraphPadPrism軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行非線性回歸分析并作S型劑量一效應(yīng)曲線。分別計(jì)算rhNRGl卩2或其突變體的半效劑量(ECj，再按下式計(jì)算效價(jià)比rhNRGlP2突變體的效價(jià)=rhNRGie2突變體的ECsoNRG1P2的效價(jià)NRG1P2的ECmj實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1:表1rhNRGl02及其突變體誘導(dǎo)ErbB2/ErbB4共表達(dá)細(xì)胞_之ErbB受體磷酸化的ECs。值__^_效價(jià)比r固Gl卩2N47Rrh腦l320.00570.058210.24rh跳l卩2N47KrhNRGlP20.01570.05693.62由表1可知，重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白突變體rhNRG1(32N47R誘導(dǎo)ErbB2/ErbB4共表達(dá)細(xì)胞中ErbB受體磷酸化的活性為rhNRG1(32的10.24倍，rhNRGlp2N47R的活性也為rhNRG1(32的3.62倍，均較rhNRG1(32的活性有顯著提高。結(jié)果提示對心肌細(xì)胞使用這兩種突變體可顯著降低蛋白濃度，預(yù)期在用這兩種突變體治療心血管疾病時(shí)也可顯著降低用藥劑量，同時(shí)也能降低藥物的副作用。實(shí)施例3rhNRGl卩2突變體(rhNRGl卩2N47R，rhNRGl(32N47K)誘導(dǎo)ErbB2/ErbB3共表達(dá)細(xì)胞中ErbB磷酸化的活性測定在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，接種表達(dá)ErbB2、ErbB3的C0S7細(xì)胞(用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染獲得)，置于37。C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)后，用無血清DMEM培養(yǎng)液再培養(yǎng)24小時(shí)。吸去培養(yǎng)液，然后各孔分別加入100pl不同濃度的rhNRGlP2或rhNRGle2突變體溶液(rhNRGlP2或其突變體最高濃度為2yg/mL，取適量該溶液用無血清DMEM稀釋3倍，再取適量稀釋后的溶液稀釋3倍，重復(fù)上述操作5次，得到由高到低8個(gè)濃度的rhNRGlP2或其突變體蛋白溶液)，其中兩孔僅加無血清培養(yǎng)液作陰性對照，37'C保溫20分鐘后，吸去培養(yǎng)液，用PBS洗1次后加入lOO(il細(xì)胞裂解液(50mMTris，pH7.4，150mMNaCl，1%TritonX-IOO，5mMEDTA，50mMNaF,2mM釩酸鈉，2mMPMSF，cocktail蛋白酶抑制劑(Roche，每25ml溶液加一片))，將板放在振蕩器上于4。C冰箱振蕩30分鐘，再于4°C，15000rpm離心15分鐘，從而使得培養(yǎng)板小孔中澄清的細(xì)胞裂解液和沉淀完全分離。用鼠抗人ErbB3單克隆抗體(R&Dsystems)包被酶標(biāo)板，置于4'C過夜。用PBS洗板5次后，以含5呢脫脂奶粉的PBS封閉。再用PBS洗板5次，每孔分別加入90^1上述澄清的細(xì)胞裂解液，于37'C保溫1小時(shí)。吸去各孔的細(xì)胞裂解液，用PBS洗板5次，每孔加入100pl稀釋了500倍的HRP偶聯(lián)鼠抗人磷酸化酪氨酸抗體[P-Tyr(PY99):sc-7020HRP(SantaCruzBiotechnology)]'于37。C保溫1小時(shí)。吸去抗體溶液，洗板5次，每孔加入100^1底物溶液[9ml底物緩沖液(50mM檸檬酸，lOOmMNa2HP04，pH5.0，0.2mg/ml3，3',5，5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB),0.003%H202)，于37。C保溫10分鐘后，每孔再加入50pl2NH孤。將板置于酶標(biāo)儀中，在測定波長450nm，參比波長655nm分別測0D值。rhNRGlp2或rhNRGl卩2突變體誘導(dǎo)ErbB3磷酸化活性的效價(jià)計(jì)算方法同實(shí)施例2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2:<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>由表2可知，重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白突變體rh服Gip2N47R誘導(dǎo)ErbB2/ErbB3共表達(dá)細(xì)胞中ErbB受體磷酸化的活性為rhNRGl(i2的0.34倍，rhNRGip2N47K的活性也僅為rhNRGl(i2的0.57倍，均較rhNRGl(J2的活性有顯著降低。因此，與同濃度的rhNRGlp2相比，這兩種突變體對表達(dá)ErbB2/ErbB3的非心肌細(xì)胞的作用明顯降低。也就是說，當(dāng)用這兩種突變體治療心血管疾病時(shí)可明顯降低藥物對非心臟組織的副作用。實(shí)施例4包含rhNRGip2突變體(rhNRG1(52N47R,rhNRGlp2N47K)注射劑的制備取實(shí)施例1中制備得到的純化的rhNRGl|32突變體(rhNRGl(52N47R或rhNRGip2N47K)，加入無菌緩沖液(10niMNa2HP04-C6H807，pH8.0)，并分裝到安瓿瓶中，每瓶0.75mL，即得包含rh腦lP2突變體(rhNRGle2N47R，rhNRGlP2N47K)的注射劑。根據(jù)實(shí)施例2、3所述的方法測定該注射劑的效價(jià)。結(jié)果表明，與同濃度的rh服Gip2相比，含有兩種突變體的注射液對心肌細(xì)胞的活性顯著提高，而對表達(dá)ErbB2/ErbB3的非心肌細(xì)胞的作用明顯降低。該結(jié)果提示，包含rhNRGlp2突變體(rhNRG1(J2N47R，rhNRGl(i2N47K)的藥物組合物可用于高特異性地治療心臟病，而對其它組織具有降低的副作用。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。序列表<110〉上海澤生科技開發(fā)有限公司<120〉神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白突變體<130〉075431<160>4<170〉Patentlnversion3.3<210〉1<211〉183〈212〉DNA<213>人工序列<220><221〉CDS<222〉(1)..(183)<柳〉1agecatcttgtaaaatgtgcggagaaggagaaaactttctgtgtgaat48SerHisLeuValLysCysAlaGluLysGluLysThrPheCysValAsn151015ggaggggagtgcttcatggtgaaagaccttteaaacccctegagatac96GlyGlyGluCysPheMetValLysAspLeuSerAsnProSerArgTyr202530ttgtgcaagtgcccaaatgagtttactggtgatcgctgccaacgctac144LeuCysLysCysProAsnGluPheThrGlyAspArgCysGinArgTyr354045gtaatggccagettctacaaggcggaggagctgtaccag183ValMetAlaSerPheTyrLysAlaGluGluLeuTyrGin505560<210>2<211〉61<212〉PRT<213〉人工序列<400〉2SerHisLeuValLysCysAlaGluLysGluLysThrPheCysValAsn151015GlyGlyGluCysPheMetValLysAspLeuSerAsnProSerArgTyr202530UuCysLysCysProAsnGluPheThrGlyAspArgCysGinArgTyr354045ValMetAlaSerPheTyrLysAlaGluGluLeuTyrGin505560<210〉<211〉<212〉<213〉3183DNA人工序列〈220〉<221〉<222〉CDS(l)..(183)<400〉agecatSerHis13cttgtaaaatgtgcgLeuValLysCysAla5gagaaggaga犯actttctgtgtg33tGluLysGluLysThrPheCysValAsn101548ggaggggagtgcUcatggtgGlyGlyGluCysPheMetVal20aaagaccttteaaacccctegagatacLysAspLeuSerAsnProSerArgTyr253096ttgtgcaagtgcccaaatgagLeuCysLysCysProAsnGlu35tttactggtgatcgctgccaaaagtacPheThrGlyAspArgCysGinLysTyr4045144gtaatggccagettctacaagValMetAlaSerPheTyrLys5055gcggaggagctgtaccagAlaGluGluLeuTyrGin60183<210〉4<211>61<212>PRT<213>人工序列<400〉4SerHisLeuValLysCysAlaGluLysGluLysThrPheCysValAsn151015GlyGlyGluCysPheMetValLysAspLeuSerAsnProSerArgTyr202530UuCysLysCysProAsnGluPheThrGlyAspArgCysGinLysTyr354045ValMetAlaSerPheTyrLysAlaGluGluLeuTyrGin505560權(quán)利要求1.一種神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白突變體，其包含神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白EGF類似區(qū)，其特征在于，該突變體是所述神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白的第177-223位氨基酸殘基發(fā)生突變而形成的突變體，上述位點(diǎn)從神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白的N端起計(jì)算，且所得突變體對ErbB2/ErbB4共表達(dá)的細(xì)胞中ErbB受體磷酸化的誘導(dǎo)活性高于神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白，而對ErbB2/ErbB3共表達(dá)的細(xì)胞中ErbB受體磷酸化的誘導(dǎo)活性低于神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白。2.如權(quán)利要求1所述的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白突變體，其特征在于，所述神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白的第223位氨基酸殘基N突變?yōu)榉荖的其它氨基酸殘基。3.如權(quán)利要求1所述的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白突變體，其特征在于，所述突變體的氨基酸序列中包括SEQIDNO:2或SEQIDNO:4所示的序列。4.權(quán)利要求1所述的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白突變體的編碼序列。5.如權(quán)利要求4所述的編碼序列，其特征在于，該核苷酸序列包括SEQIDN0:1或SEQIDNO:3所示的序列。6.—種包含權(quán)利要求4所述的編碼序列的表達(dá)載體。7.如權(quán)利要求6所述的表達(dá)載體，其特征在于，所述表達(dá)載體為pET22b。8.—種用于表達(dá)權(quán)利要求1所述的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白突變體的宿主細(xì)胞。9.權(quán)利要求1或3所述的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白突變體在制備治療心臟病的藥物中的用途。10.—種藥物組合物，其包含(i)有效量的活性物質(zhì)，所述活性物質(zhì)選自權(quán)利要求1或3所述的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白突變體；(ii)藥學(xué)上可接受的載體。全文摘要本發(fā)明涉及一種包含EGF類似區(qū)的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白突變體，其在神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白的第177-223位氨基酸殘基發(fā)生突變，且所得突變體對ErbB2/ErbB4共表達(dá)的細(xì)胞中ErbB受體磷酸化的誘導(dǎo)活性高于神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白，而對ErbB2/ErbB3共表達(dá)的細(xì)胞中ErbB受體磷酸化的誘導(dǎo)活性低于神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白。本發(fā)明還公開了神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白突變體的編碼序列、表達(dá)載體、和宿主細(xì)胞及其用途。本發(fā)明的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白突變體誘導(dǎo)ErbB4磷酸化的活性都明顯提高，同時(shí)它們誘導(dǎo)ErbB3磷酸化的活性都有所降低。因而，在能用較低濃度的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白突變體治療心血管疾病的同時(shí)，也降低了其對其它組織的副作用。文檔編號A61K38/17GK101397337SQ200710046358公開日2009年4月1日申請日期2007年9月25日優(yōu)先權(quán)日2007年9月25日發(fā)明者周明東申請人:上海澤生科技開發(fā)有限公司