專利名稱：神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白用于預(yù)防、治療或延遲心臟缺血再灌注損傷的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白在制備用于預(yù)防、治療或延遲哺乳動物特別是人缺血再 灌注損傷的藥物中的用途。更為特別地，涉及神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白用于預(yù)防、治療或延遲心臟缺血 再灌注損傷的方法和組合物。
背景技術(shù)：
缺血后疏通血管或再造血管使組織得到血液的再灌注，本來是醫(yī)師們的目的所 在，而且事實上在大多數(shù)情況下也確能收到良好的治療效果。但在一定條件下再灌注反 而引起更加嚴(yán)重的后果。這不僅見于臨床，而且也為不同種屬(兔、大鼠、豚鼠、狗、豬等) 的大量動物實驗所證明。這是一種反?，F(xiàn)象，稱之為再灌注損傷(ischemia reperfusion injury, IRI)。自從I960年Jennings第一次提出心肌缺血再灌注損傷的概念以來，其已經(jīng)成為 心血管研究的熱點問題。心肌持續(xù)性缺血導(dǎo)致組織損傷和細(xì)胞死亡，早期再灌注能夠減輕 心肌缺血的損傷程度，但是大量的動物實驗和臨床觀察，再灌注后在改善心肌供血的同時 又加重了單純心肌缺血所造成的損傷，出現(xiàn)心律失常、梗死面積擴(kuò)大、持久性心室收縮功能 低下等狀況。病理變化可出現(xiàn)心肌細(xì)胞水腫、細(xì)胞膜和細(xì)胞器膜完整性破壞、肌纖維出現(xiàn)破 壞性斷裂超微結(jié)構(gòu)的改變、微血管損傷和無再灌注現(xiàn)象等。因此，心肌缺血再灌注損傷成為 影響患者缺血/再灌注后心臟結(jié)構(gòu)和功能恢復(fù)的主要因素。由于近年醫(yī)學(xué)的發(fā)展進(jìn)步；使缺血再灌注損傷愈益受到重視。例如斷肢再植和器 官移植就存在缺血肢體和器官的再灌注問題。又如動脈搭橋術(shù)后、溶栓療法之后，休克治療 之后均可能發(fā)生缺血與再灌注損傷。缺血再灌注損傷的機制目前仍不是非常明確?？赡艿臋C制包括氧自由基的堆積 (RuizGinesJA 等，J Cardiovasc Pharmacol, 2000, 35 (1) :109-113)，鈣離子超載(Shen AC 等,Am JPathol，1972，67(3) :441-452 ；Sjaastad I等，Acta Physiol Scand,2002,175(4) 261-269)，能量代謝障礙(谷天祥等，中華心血管病雜志，2001，四(7) =420-423 ；Nordlie MA等，J CardiovascPharmacol Ther, 2006,11 (1) 17-30)，中性粒細(xì)胞的聚集(Hoffman Jff 等，J Extra CorporTechnol，2004，36 (4) :391-411)等等。針對這些機制，可采取的用于防 治缺血再灌注損傷的手段包括盡早恢復(fù)血流，減少缺血時間；灌注時低壓、低流、低溫；清 除自由基，比如外源性SOD、黃嘌呤氧化酶抑制劑別嘌呤醇(allopurinol)、維生素E、維生 素C、過氧化氫酶、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMS0)等自由基清除劑；改善缺血組 織代謝，比如補充糖酵解底物如磷酸己糖保護(hù)缺血組織，外源性ATP恢復(fù)細(xì)胞膜功能，氫 醌、細(xì)胞色素C延長缺血組織的可逆性改變期限。神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白(Neuregul in，NRG ；Heregul in，HRG)，屬于表皮生長因子樣 (EGF-Iike)家族，是一類結(jié)構(gòu)上相似的生長分化因子，包括NRG1、NRG2、NRG3和NRG4以及它 們的異構(gòu)體，行使了一系列的生物學(xué)作用刺激乳腺癌細(xì)胞分化和乳蛋白的分泌(Lessor T等.J CellBiochem. 1998 ；70 (4) :587-595)；誘導(dǎo)神經(jīng)脊細(xì)胞分化為 khwann細(xì)胞(Topilko P等，Mol CellNeurosci. 1996 ；8 (2-3) :71-75)；刺激骨骼肌細(xì)胞內(nèi)乙酰膽堿受體的合成 (Altiok N等，EMB0J. 1995 ；14(17) =4258-4266)；以及促進(jìn)心肌細(xì)胞成活和 DNA 合成(Zhao YY等，J Biol Chem. 1998 ；273 (17) 10261-10269) 用NRG基因嚴(yán)重缺陷的小鼠胚胎做的 活體研究證明NRG對于心臟和神經(jīng)發(fā)育是必需的。NRG的受體屬于EGF受體家族，包括EGFR，ErbB2, ErbB3和ErbB4，它們在多種細(xì) 胞功能比如細(xì)胞生長、分化和存活中發(fā)揮了重要的作用。它們屬于絡(luò)氨酸激酶受體，有胞 外的配體結(jié)合功能區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)的絡(luò)氨酸激酶功能區(qū)組成。當(dāng)NRG結(jié)合到ErbB3或 ErbB4的胞外區(qū)后，引起其構(gòu)象改變從而導(dǎo)致ErbB3/ErbB4或ErbB2/ErbB3異二聚體的形成 或ErtB4/ErbB4同二聚體的形成，并且引起其C末端的磷酸化。磷酸化的C末端可以進(jìn)一 步結(jié)合胞內(nèi)的下游信號蛋白，激活A(yù)KT和(或)ERK信號通路，并最終引起一系列的細(xì)胞反 應(yīng)比如刺激或抑制細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞遷移或細(xì)胞黏附。在這些受體中，在 心臟組織表達(dá)的主要是 ErbB2 和 ErbB4(Zhao YY 等，Circ Res. 1999 ；84 (12) :1380-1387) 已有的證據(jù)表明，NRG-I的EGF樣結(jié)構(gòu)域，包含50到64個氨基酸，足以結(jié)合并激活受體 (Culouscou JM 等，J Biol Chem. 1995 ；270 (21) :12857-12863) NRG-1 β 可以以較高的親 和力結(jié)合到ErbB3和ErbB4。而ErbB2可與ErbB3或ErbB4形成異源二聚體，其與配體的 親和力高于ErbB3或ErbB4同源二聚體與配體的親和力。神經(jīng)發(fā)育學(xué)的研究證實交感神 經(jīng)系統(tǒng)的形成需要NRG-I β、ErbB2和ErbB3的信號傳導(dǎo)(Britsch S等，Genes Dev. 1998 ； 12(12) =1825-1836)。而干擾NRG-I β或ErbB2或ErbB4的表達(dá)將由于心臟發(fā)育的缺陷引起 胚胎死亡(Gassmann M等，Nature. 1995 ；378 (6555) :390-394)。最近的研究強調(diào)，NRG-1 β、 ErbB2和ErbB4不僅對心臟發(fā)育至關(guān)重要，同時對成年心臟的功能維持也起到非常重要的 作用(Kuramochi Y 等，J Mol Cell Cardiol. 2006 ；41 (2) :228-235)。NRG-1 β 被證明可 以加強成年心肌細(xì)胞肌小節(jié)的形成。在多種心衰動物模型中發(fā)現(xiàn)，NRG-I β EGF樣結(jié)構(gòu)域 的攝入可以顯著提高心臟功能，防止心功能的惡化(Liu等，J Am Coll Cardiol. 2006 ；48 1438-1447)。在臨床試驗中，NRG也顯示了對各種病因引起的慢性心力衰竭患者的治療作 用，顯著提高了其心臟功能(CN200910057390. 5)。在大腦缺血再灌注動物模型中，NRG-I 也顯示了對腦細(xì)胞顯著的保護(hù)性作用，抑制腦細(xì)胞凋亡，增強神經(jīng)功能，減小梗死面積(Li Q等，Neurosci Lett. 2008 ；443 (3) =155-159) 雖然有證據(jù)表明，心臟缺血再灌注誘導(dǎo) 7 NRG-I的釋放，激活心肌細(xì)胞NRG/ErbB信號通路(Kuramochi Y等，J Biol Chem. 2004 ； 279(49) :51141-51147)，但NRG-I在心臟缺血再灌注損傷中的作用仍然沒有清楚地闡明。 本發(fā)明提供了上述需求的方法和組合物。

發(fā)明內(nèi)容
A.發(fā)明概述本發(fā)明是基于NRG對心臟發(fā)育至關(guān)重要，對成年心臟的功能維持也起到非常重要 的作用的科學(xué)發(fā)現(xiàn)；基于NRG可以加強心肌細(xì)胞肌小節(jié)和細(xì)胞骨架以及細(xì)胞間連接的形成 的科學(xué)發(fā)現(xiàn)；基于NRG在各種動物模型和臨床試驗中可以提高心衰動物或病人的心臟功能 的科學(xué)發(fā)現(xiàn)；基于NRG在大腦缺血再灌注動物模型中顯示對腦細(xì)胞的保護(hù)作用的科學(xué)發(fā) 現(xiàn)。NRG，NRG多肽，NRG突變體或其它具有NRG樣功能的復(fù)合物都屬于本發(fā)明的范疇。
本發(fā)明的第一個方面，是提供了一種預(yù)防、治療或延遲哺乳動物特別是人心臟缺 血再灌注損傷的藥物制劑。該藥物制劑包含有效量的NRG或其功能片段，或編碼NRG或其 功能片段的核酸，或提高NRG產(chǎn)量和/或功能的物質(zhì)，以及藥學(xué)上可以接受的載體、賦形劑 等。該藥物制劑可以和其它可用于預(yù)防、治療或延緩缺血再灌注損傷的藥物一起使用。本發(fā)明的第二個方面，是提供了一種預(yù)防、治療或延遲哺乳動物特別是人心臟缺 血再灌注損傷的方法。包括對需要或希望預(yù)防、治療或延遲心臟缺血再灌注損傷的哺乳動 物特別是人施用有效量的NRG或其功能片段，或編碼NRG或其功能片段的核酸，或提高NRG 產(chǎn)量和/或功能的物質(zhì)，從而達(dá)到預(yù)防、治療或延遲心臟缺血再灌注損傷的效果。本發(fā)明的另一個方面，是提供了一種用于預(yù)防、治療或延遲哺乳動物特別是人心 臟缺血再灌注損傷的組合物。該組合物包含了本發(fā)明所提供的用于預(yù)防、治療或延遲哺乳 動物心臟缺血再灌注損傷的藥物制劑，以及其它預(yù)防、治療或延緩缺血再灌注損傷的藥物。本發(fā)明還提供了一種用于預(yù)防、治療或延遲哺乳動物特別是人心臟缺血再灌注損 傷的藥盒，其中包含了一次或多次使用劑量的上述預(yù)防、治療或延遲心臟缺血再灌注損傷 的藥物制劑或組合物，以及如何使用該藥物制劑或組合物的說明書。本發(fā)明所提供的藥物制劑或組合物，可以在缺血再灌注損傷發(fā)生前、發(fā)生時或發(fā) 生后給予。當(dāng)用于預(yù)防時，一般在缺血再灌注損傷發(fā)生前給藥。當(dāng)用于治療時，一般在缺血 再灌注損傷發(fā)生后給藥。在一個實施方案中，本發(fā)明所提供的藥物制劑或組合物，在缺血發(fā) 生之前給藥。在一個實施方案中，本發(fā)明所提供的藥物制劑或組合物，在心臟缺血發(fā)生后， 再灌注之前給藥。在另一個實施方案中，本發(fā)明所提供的藥物制劑或組合物，在再灌注發(fā)生 后給藥。B.釋義除另有定義，這里使用的所有科技術(shù)語與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員理 解含義相同。所有專利文獻(xiàn)、專利申請文獻(xiàn)、公開的專利文獻(xiàn)和其它出版物均作為參考。如 本節(jié)闡述的定義與上述參考文獻(xiàn)所述的定義不一致或相反時，以本節(jié)闡述的定義為準(zhǔn)。除非特別指明，在此所用“一個”的意思是“至少一個”或“一個或多于一個”。此處 所用“神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白”或“neuregulin”或“NRG”是指能夠結(jié)合并激活ErbB2、ErbB3、ErbB4 或其異源或同源二聚體的蛋白或多肽，包括神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白的異構(gòu)體、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白中的EGF 樣功能域、包含神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白EGF樣功能域的多肽、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白的突變體或衍生物以及 其它能夠激活上述受體的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白樣的基因產(chǎn)物。神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白還包括NRG-l，NRG-2， NRG-3和NRG-4蛋白、多肽、片段以及具有NRG樣功能的復(fù)合物。優(yōu)選的，神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白是可 以結(jié)合并激活ErbB2/ErbB4或ErbB2/ErbB3異源二聚體的蛋白或多肽。作為例子，但并非 為了限制的目的，本發(fā)明的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白是NRG-I β 2異構(gòu)體的一個片段，即177-237位氨 基酸片段，其中包含了 EGF樣功能域。該片段的氨基酸序列為SHLVKCAEKEKTFCVNGGECFMVK DLSNPSRYLCKCPNEFTGDRCQNYVMASFYKAEELYQ(SEQ IDNO :1)。本發(fā)明所用神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白可以 激活上述受體并調(diào)節(jié)它們的生物學(xué)功能，比如刺激骨骼肌細(xì)胞合成乙酰膽堿受體；促進(jìn)心 肌細(xì)胞的分化、存活以及DNA合成。神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白還包括那些具有并不實質(zhì)性影響生物學(xué) 功能的保守性突變的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白突變體。本技術(shù)領(lǐng)域中普通技術(shù)人員熟知，非關(guān)鍵區(qū)域 的單個氨基酸的突變一般不會引起該蛋白或多肽的生物學(xué)功能的改變(參見Watson等人， Molecular Biology of the Gene,4th Edition，1987，The Bejacmin/Cummings Pub. co.,P. 224)。本發(fā)明所用神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白可以從天然的來源分離得到，或者通過重組技術(shù)、人工合 成或其它手段得到。此處所用“EGF樣功能域”或“EGF-like domain”是指由neuregulin基因所編碼 的可以結(jié)合并激活ErbB2、ErbB3、ErbB4或其異源或同源二聚體的多肽片段，并且與下述 參考文獻(xiàn)中描述的EGF受體結(jié)合區(qū)域具有結(jié)構(gòu)相似性W0 00/64400 ；Holmes等，Science, 256 :1205-1210(1992)；美國專利 5，530，109 和 5，716，930 ；Hijazi 等，Int. J. Oncol.， 13 :1061-1067(1998) ；Chang 等，Nature, 387 :509-512(1997) ；Carraway 等，Nature, 387 512-516(1997) ；Higashiyama 等，J. Biochem.，122 :675-680 (1997)；以及 WO 97/09425。在 某些實施方案中，EGF樣功能域結(jié)合并激活ErbB2/ErbB4或ErbB2/ErbB3異源二聚體。在 某些實施方案中，EGF樣功能域包含NRG-I的受體結(jié)合區(qū)氨基酸。在某些實施方案中，EGF 樣功能域是指NRG-I的第177-2 位、177-237位或177-240位氨基酸。在某些實施方案 中，EGF樣功能域包含NRG-2的受體結(jié)合區(qū)氨基酸。在某些實施方案中，EGF樣功能域包含 NRG-3的受體結(jié)合區(qū)氨基酸。在某些實施方案中，EGF樣功能域包含NRG-4的受體結(jié)合區(qū) 氨基酸。在某些實施方案中，EGF樣功能域包含美國專利5，834，229中描述的氨基酸序列 Ala Glu Lys Glu Lys Thr Phe CysValAsn Gly Gly Glu Cys Phe Met Val Lys Asp Leu Ser Asn Pro。缺血再灌注損傷是指缺血組織或器官重獲血流灌注或氧供后，對組織和器官所產(chǎn) 生的損傷作用，涉及氧自由基的產(chǎn)生，鈣離子超載，中性粒細(xì)胞損傷區(qū)浸潤等多重病理生理 改變。此處所用“其它用于治療缺血再灌注損傷的藥物”是指已知的可用于治療缺 血再灌組損傷的藥物，包括自由基清除劑，比如外源性SOD、黃嘌呤氧化酶抑制劑別嘌呤 醇(allopurinol)、維生素E、維生素C、過氧化氫酶、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMS0)；改善缺血組織代謝的藥物，比如糖酵解底物如磷酸己糖，外源性ATP，氫醌、細(xì)胞色
素C等。


圖1顯示各組大鼠心臟切面TTC染色結(jié)果。切面中白色區(qū)域(TTC未染區(qū))為梗 死區(qū)域。A、B、C、D分別代表A組、B組、C組和D組。
具體實施例方式實施例1 重組人紐蘭格林(rhNRG-Ι)對大鼠缺血再灌注心肌的保護(hù)作用試驗所用試劑重組人紐蘭格林(rhNRG-Ι)上海澤生科技開發(fā)有限公司研制，批號200503007 ； 規(guī)格250 μ g/支。賦形劑上海澤生科技開發(fā)有限公司研制，批號200503001F ；規(guī)格250 μ g/支。重組人胸腺素- β 4 北京諾思蘭的生物技術(shù)有限公司，批號20050728。大鼠(雄性Wistar大鼠，200 240g)腹腔注射20%烏拉坦(5ml/kg)麻醉后，給 予不同劑量的NRG、賦性劑或重組人胸腺素-β 4。開始給藥后30分鐘，大鼠左冠狀動脈結(jié) 扎，出現(xiàn)明顯的局部心肌顏色變白。冠脈結(jié)扎45分鐘后，松開結(jié)扎的線，使冠脈缺血再灌注2小時。實驗結(jié)束后，迅速取出心臟，用生理鹽水沖洗，去除血管脂肪等非心肌組織，-300C 凍存1小時。順房室溝從心尖到心基部平行將心臟切成Imm厚的心肌片，于的TTC染液中， 37度溫孵染色20min，染色過程中不時搖動使染液和心肌有充分的接觸機會。染色后立即 用水沖洗去多余的染料，并在4%的甲醛溶液襯染1小時。將心肌片拍成照片，用圖像分析 軟件，分析心肌片總面積及心肌片梗死區(qū)面積(TTC未染區(qū))。心肌梗死面積比用未染梗死 區(qū)面積之和與心肌片總面積和的比來表示。實驗分組及給藥情況詳見表1。結(jié)果顯示A組(賦形劑)大鼠心肌梗死面積比為 0. 178士0. 047，B 組(10ug/kg/h rhNRG-1)大鼠心肌梗死面積比為 0. 130士0. 049，與 A 組相 比，梗死面積相差顯著(P < 0. 05)，明顯減小。C組(30ug/kg/h rhNRG-1)大鼠心肌梗死面 積比為0. 121 士0.047，與A組相比，梗死面積相差顯著(P < 0.05)，明顯減小。D組(重組 人胸腺素-β4)大鼠心肌梗死面積比為0.151 士0.030，與各組相比，無顯著差異。(詳見 表2及圖1)。表1.實驗分組及給藥情況
權(quán)利要求
1.NRG用于制備預(yù)防、治療或延遲哺乳動物心臟缺血再灌注損傷的藥物的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中NRG選自NRG-I，NRG-2,NRG-3或NRG-4。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中所述NRG是NRG-I。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中所述NRG包含SEQID N0:1的氨基酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中所述哺乳動物是人。
6.一種用于預(yù)防、治療或延遲哺乳動物心臟缺血再灌注損傷的藥物制劑，其特征在于 其含有有效劑量的NRG。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用途，其中NRG選自NRG-I，NRG-2,NRG-3或NRG-4。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用途，其中所述NRG是NRG-I。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用途，其中所述NRG包含SEQID NO :1的氨基酸序列。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用途，其中所述哺乳動物是人。
11.一種用于預(yù)防、治療或延遲哺乳動物心臟缺血再灌注損傷的組合物，其特征在于其 含有如權(quán)利要求6所述的藥物制劑以及其它用于治療缺血再灌注損傷的藥物。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的組合物，其中所述其它用于治療缺血再灌注損傷的藥物包 含自由基清除劑和改善缺血組織代謝的藥物。
13.一種用于預(yù)防、治療或延遲哺乳動物心臟缺血再灌注損傷的藥盒，其中含有如權(quán)利 要求6所述的藥物制劑以及如何使用該藥物制劑的說明書。
全文摘要
本發(fā)明涉及神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白在制備用于預(yù)防、治療或延遲哺乳動物特別是人缺血再灌注損傷的藥物中的用途。更為特別地，涉及神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白用于預(yù)防、治療或延遲心臟缺血再灌注損傷的方法和組合物。具體地說，雖然神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白在各種細(xì)胞試驗、動物試驗和臨床試驗中顯示了改善心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)、提高心臟功能的作用，然而目前對神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白對心臟缺血再灌注損傷是否有影響仍然不是很清楚。本發(fā)明通過大鼠動物模型，證明神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白可以在缺血再灌注過程中減小梗死面積，提示神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白可以用于預(yù)防、治療或延遲心臟缺血再灌注損傷。
文檔編號A61P9/10GK102139095SQ20101011297
公開日2011年8月3日 申請日期2010年1月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月29日
發(fā)明者周明東 申請人:上海澤生科技開發(fā)有限公司