專利名稱：包含來自流感病毒和乙型肝炎病毒的抗原的病毒體顆粒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種包含病毒體膜的病毒體(virosome)，所述病毒體膜包含一種包膜病毒的至少一種脂質(zhì)和包膜蛋白，并且所述包膜病毒的核殼體顆粒位于所述病毒體的里面和外面并且附著于所述包膜蛋白。另外，本發(fā)明涉及一種包含本發(fā)明的病毒體的疫苗以及一種生產(chǎn)本發(fā)明的病毒體的方法。進一步地，本發(fā)明提供了本發(fā)明的病毒體在制備例如用于預(yù)防或緩解與HBV感染有關(guān)的疾病的疫苗中的應(yīng)用，以及對對象進行免疫接種的方法。
本說明書引用了一些文獻。本文通過引用將所引用的每一篇文獻公開的內(nèi)容(包括任何生產(chǎn)商的說明書、指導等等)并入本文。
新的并且更加安全的疫苗的開發(fā)通常使用其特征已經(jīng)被研究清楚的抗原，特別是高度純化的重組蛋白質(zhì)或合成的肽。盡管有一些成功，但是這種方法被這些抗原通常在單獨給予時是較差的免疫原這一事實所阻礙。這個事實使得開發(fā)能夠增強給定抗原的免疫原性的合適的佐劑及載體系統(tǒng)成為必要。一種可能的方法是將抗原整合進更高級的結(jié)構(gòu)，例如病毒樣顆粒中。全部疫苗成分在單一顆粒中的物理關(guān)聯(lián)(physical association)保證了它們同時與單一的免疫細胞作用，并因此使協(xié)同作用的潛力最大化。這在免疫刺激或免疫調(diào)節(jié)成分(佐劑)被包含在配制物(formulation)中時是特別有用的。另外，顆粒結(jié)構(gòu)本身可以具有免疫刺激作用，并且可以增加各個成分的穩(wěn)定性和免疫原性。
因此尋找一種將相關(guān)抗原組合在工業(yè)適用的產(chǎn)生有效預(yù)防和/或治療應(yīng)用的配制物中的合適的方法是一個問題。
在病毒在宿主細胞中復(fù)制的過程中，利用細胞基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)(infrastructure)產(chǎn)生該病毒基因組的拷貝，并且在組裝為成熟病毒粒體(virion)之前表達并加工病毒蛋白。通常的基本事實是病毒復(fù)制和子代組裝需要活的宿主細胞的環(huán)境以及導致大分子病毒粒體結(jié)構(gòu)的分離和組裝的一系列有序的病毒核酸、病毒和宿主細胞蛋白、以及脂膜之間的特異性相互作用。所需要的大量不同分子和另外涉及到的細胞結(jié)構(gòu)表明任何病毒粒體組裝的高度復(fù)雜性。在不同病毒類別之間，特別是在包膜病毒和無包膜病毒之間存在重要差異。所有包膜病毒的共同之處是由一層具有整合的病毒蛋白的脂膜組成的病毒外殼(outershell)，以及由此產(chǎn)生的膜關(guān)聯(lián)病毒蛋白和可溶性病毒蛋白或基于蛋白的結(jié)構(gòu)例如核殼體之間的為了組裝成熟包膜病毒所必需的相互作用。無包膜病毒缺乏基于脂質(zhì)的膜，其僅組裝自蛋白質(zhì)和核酸分子。
在文獻中已經(jīng)描述了多種體外和體內(nèi)重建(reconstitute)病毒顆粒的方法，可以分為不同幾類(a)病毒包膜的體外重建衍生自病毒的或重組的包膜蛋白可以純化并與或不與另外的脂質(zhì)配制為脂蛋白體(proteoliposome)。這種完全體外方法產(chǎn)生包膜病毒的外殼，即包膜，但是并不包含病毒核心(core)，即核殼體(nucleocapsid)。有嵌合病毒體結(jié)構(gòu)的實例，其整合來自不同病毒的包膜蛋白。尚未將重建的病毒包膜成功的用于基因轉(zhuǎn)移(DNA或RNA)，但是這些方法不依賴于對功能性的基于蛋白的核殼體進行包裝，而是將核酸直接與重建的包膜相關(guān)聯(lián)。
(b)一或多個病毒蛋白的異源表達分離的重組病毒蛋白可以自組裝為病毒樣結(jié)構(gòu)(virus-like structure，VLP)HPV(酵母，桿狀病毒)，HCV(桿狀病毒)，HBs抗原(酵母，CHO)，HBc(大腸桿菌(E.coli))。所有這些方法的共同之處在于所述自組裝發(fā)生在異源細胞表達系統(tǒng)中，并且所述病毒樣顆粒接下來被純化。因此，所述組裝在體外不能進行，而是要依賴于細胞系統(tǒng)。已經(jīng)將VLP用作疫苗和疫苗載體。(Pumpens，P.；Grens，E.(2001)Intervirology 44(2-3)；98-114；Noad R，Roy P.(2003)TrendsMicrobiol.11(9)438-44)(c)無包膜(二十面體)病毒或病毒樣顆粒的體外重建這種方法基于被分別純化的成分。由于缺少基于脂膜的包膜，無包膜病毒在結(jié)構(gòu)上比較簡單，并且如果所有必要成分以正確化學計量(stoechiometry)存在，其能夠在一定的條件下進行體外自組裝。相似的，包膜病毒的內(nèi)核無脂質(zhì)的核殼體或其亞單位已經(jīng)在體外由純化的重組成分重建，例如流感病毒(Martin-Benito J.et al.(2001)EMBO Rep.2(4)313-7)。
(d)病毒核殼體的純化已經(jīng)由許多不同的病毒類型提取并純化了核殼體，以鑒定其組成。這些制備物也可用于轉(zhuǎn)染易感細胞以拯救病毒。成功的病毒拯救提示分離了功能性的核殼體并將其送遞至宿主細胞的細胞質(zhì)。然而，這不意味著功能性包膜病毒的成功重建，因為依賴于功能性包膜的感染的自然途徑通過使用介導核殼體直接送遞至宿主細胞的細胞質(zhì)的轉(zhuǎn)染子而被繞開。
(e)細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中的包膜病毒和病毒載體的假型包裝(pseudotyping)這種體內(nèi)方法已經(jīng)在實驗室水平上廣泛并且成功地用于產(chǎn)生嵌合病毒或載體(例如反轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒和AAV)。生產(chǎn)假型包裝的病毒的關(guān)鍵因素是共表達整合進病毒粒體的所有蛋白并介導所述病毒粒體組裝的輔助細胞。相反，包膜病毒的體外組裝基于已闡明的、分別生產(chǎn)并純化的成分，并且所述物理關(guān)聯(lián)在體外在受控條件下進行(Sandrin V.et al.(2003)Curr Top Microbiol Immunol.；281137-78)。
作為病毒樣顆粒的特殊形式，病毒體是一種被臨床證實的疫苗載體/佐劑系統(tǒng)，其在人體中具有優(yōu)異的安全性和耐受性特征。病毒載體通過外源和內(nèi)源途徑都可以介導抗原加工的能力使得這個系統(tǒng)成為治療性疫苗的很好的候選者。
病毒體的基本概念包括在體外重建空病毒包膜，或更一般地，重建整合進球形脂雙層的病毒包膜蛋白。病毒體已經(jīng)由多種病毒產(chǎn)生(YKaneda.(2000)Adv.Drug Delivery Rev.43，197-205；Drummond DC.etal.(2000)Prog Lipid Res.39(5)409-60)。已經(jīng)證實了產(chǎn)生包含來自兩種不同病毒的包膜蛋白的嵌合病毒體的可能性(Bagai S，Sarkar DP.(1994)FEBS Lett.353(3)332-6)。
在所有情況中，感興趣的病毒蛋白是跨膜或錨定于膜的結(jié)構(gòu)，這是自發(fā)整合的前提條件。
不與病毒體脂膜直接相互作用的分子的病毒體配制要困難得多。盡管早先已經(jīng)提出了將分子連接至病毒體結(jié)構(gòu)的想法(WO 95/32706，INEX)，但是實現(xiàn)穩(wěn)定及有效的配制的技術(shù)障礙可能是非常多的，這依賴于感興趣的分子的生物化學性質(zhì)。核酸可以通過使用帶正電的脂質(zhì)而與病毒體結(jié)構(gòu)相關(guān)聯(lián)(WO 98/52603，Berna)。對于其功能缺乏二級和三級結(jié)構(gòu)的小分子(肽、藥物)可以被生物化學修飾以進行關(guān)聯(lián)、整合或包囊作用。已經(jīng)描述了用于病毒體配制、特別是小分子(Wlti etal，(2002)Canc.Res)或合成顆粒(Jana et al.(2002)FEBS Lett.；515(1-3184-188)的包囊作用的一些方法。這些方法僅在影響大蛋白質(zhì)或更多的影響多聚蛋白質(zhì)復(fù)合物如病毒核殼體(例如HBc抗原顆粒)的真正構(gòu)象的化學條件下進行。迄今為止描述的用于將缺乏暴露的親脂結(jié)構(gòu)域的一或多個蛋白質(zhì)與病毒體膜相關(guān)聯(lián)的方法需要對所述蛋白質(zhì)進行生物化學修飾，例如共價連接至脂分子(Hunziker IP.et al.(2002)IntImmunol.14(6)615-26)以將所述蛋白質(zhì)錨定在脂膜中。這種方法也已經(jīng)證明對于將病毒體通過交聯(lián)抗體重靶定至特定細胞類型是有效的(Mastrobattista E.et al.(2001)FEBS Lett.509(1)71-6.，Wlti et al，Canc.Res.2002)。然而，生物化學修飾需要很可能解離非共價連接的多聚結(jié)構(gòu)(例如病毒核殼體)的條件(例如用于活化反應(yīng)性側(cè)鏈基團的氧化性條件)。另外，這些條件也可能改變研究中的蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象，并由此導致影響其免疫原性，并最終影響疫苗的效力。進一步地，交聯(lián)過程增加了配制所需的步驟數(shù)目并損失抗原。只有一個實例是多聚蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)成功地與病毒體關(guān)聯(lián)而沒有進行生物化學修飾，即甲型肝炎疫苗Epaxal(Glück R.，1995，J.of Liposome Research 1995，5(3)，467-479)。然而，由于病毒體膜與病毒粒體之間的靜電作用，在這個疫苗中在配制流感病毒病毒體后抗原僅與外表面關(guān)聯(lián)。因此，在病毒體液相內(nèi)部沒有抗原，而這里是治療性疫苗所需的進行有效的細胞質(zhì)送遞并誘導基于CD8的細胞應(yīng)答的優(yōu)選的位置。(Bungener L.et al.(2002)J Liposome Res.12(1-2)155-63；Bungener L.et al.(2002)Vaccine.20(17-18)2287-95.)本文下面以HBV為例討論了預(yù)防和治療感染性疾病的方法的潛力和限制。HBV感染是世界范圍內(nèi)的重大健康問題，特別是因為其威脅生命的晚期復(fù)雜化。世界衛(wèi)生組織(WTO)估計目前有大約4億人是慢性HBV攜帶者?；加新訦BV感染的患者顯示各種程度的癥狀，從臨床不明顯到嚴重慢性肝病，而對所有慢性HBV攜帶者來說肝病的長期威脅(慢性肝炎、硬化和肝癌)急劇增加(感染后20至30年內(nèi)發(fā)生率為25％)。所有慢性患者的共同之處還在于對導致疾病的因素HBV，特別是HBV核心蛋白(HBc)的弱免疫應(yīng)答，盡管在整個慢性感染期間有大量抗原循環(huán)。相反，急性乙型肝炎的解決方案和慢性乙型肝炎的自發(fā)的或治療誘導的解決方案與針對HBV抗原的廣泛而有力的免疫應(yīng)答的發(fā)生是嚴格相關(guān)的。傳統(tǒng)治療方法如使用干擾素或抗病毒藥物控制慢性肝炎的治療方案僅僅獲得部分成功，而其是非常昂貴的，并且具有顯著的副作用。因此患有HBV相關(guān)慢性肝炎的患者將會從可以控制這種持久性病毒感染的治療性疫苗中受益。
根據(jù)對HBV發(fā)病機理和免疫學的現(xiàn)有了解，成功的治療性疫苗的關(guān)鍵是克服慢性攜帶者的HBV特異性免疫不應(yīng)答。為此目的，相關(guān)抗原(HBc和HBs)必須以將存在的低效率Th2型(體液)免疫改變?yōu)橛辛Φ牟⑶页掷m(xù)性的Th1型(細胞)應(yīng)答的方式呈遞至患者的免疫系統(tǒng)，并且同時增強Th2型應(yīng)答。
針對相關(guān)抗原的免疫應(yīng)答應(yīng)當是廣泛的并同時針對許多不同表位以預(yù)防該病毒的逃避免疫的突變體。已經(jīng)示出這些突變體在針對單一表位的選擇壓力下進化。另外，使用全長蛋白質(zhì)作為疫苗的抗原要考慮患者對于抗原加工和MHC基因型依賴性表位選擇的遺傳多樣性。
在過去已經(jīng)付出了巨大的努力以開發(fā)治療性HBV疫苗，參見M.Hilleman(Vaccine 21(2003)4626-4649)的綜述。在一些臨床實驗中，已經(jīng)在慢性HBV患者中使用了傳統(tǒng)的基于HBs的預(yù)防性疫苗，但是仍未觀察到持續(xù)的陽性效果?；陔牡囊呙缦Ｍ麑⒅攸c集中在對幾個相關(guān)表位的免疫應(yīng)答上(參見Engler et al.，Mol Immunol.2001Dec；38(6)457-65的綜述)。這種方法在臨床前的研究中獲得了有希望的結(jié)果，但是在人體中沒有。最近，在將兩種相關(guān)HBV抗原組合在一種疫苗中的嘗試中，產(chǎn)生了在表面上攜帶HBs的單一表位的重組HBc顆粒(Chen et al，Vaccine.2004 Jan 2；22(3-4)439-46)。
這些方法的主要方向是免疫系統(tǒng)的體液應(yīng)答。更先進的方法來自于針對HBV的細胞應(yīng)答(Th1型)是成功的治療性免疫的關(guān)鍵因素這一概念。
誘導針對HBV抗原，特別是針對HBc的Th1型免疫應(yīng)答是治療性HBV疫苗的最終目標。盡管HBs獨自即可在一定程度上誘導Th1應(yīng)答，但是單獨的HBc不可以。因此，獨自使用這些抗原不能誘導治療效果所需的足夠的免疫應(yīng)答。只能通過將HBV抗原與支持Th1的佐劑或載體系統(tǒng)組合起來才能夠?qū)崿F(xiàn)。相反，在目前人類疫苗中最廣泛應(yīng)用的佐劑鋁鹽已知徹底破壞Th1應(yīng)答，而有利于Th2應(yīng)答。鋁鹽的這一性質(zhì)使得其對于主要目的在于誘導高滴度的保護性抗體的預(yù)防性疫苗是一種非常有吸引力的佐劑。在治療性方案中，持續(xù)性的Th1應(yīng)答具有關(guān)鍵作用，因為Th1效應(yīng)細胞介導病毒復(fù)制的控制和病毒感染的細胞的清除。
已經(jīng)嘗試使用已知主要促進細胞應(yīng)答的DNA疫苗(編碼HBV核心或S基因的質(zhì)粒DNA)。盡管DNA疫苗在小鼠模型中效果良好，但是大量臨床嘗試都未能提供證據(jù)表明其在人體中的規(guī)律，而這不僅是在HBV領(lǐng)域如此。類似地，主要目的在于增強細胞應(yīng)答的對表達HBV抗原的病毒載體(例如痘苗病毒)的使用也未能在人體中誘導顯著的和持續(xù)性的應(yīng)答。
盡管對于治療性HBV疫苗已經(jīng)測試了各種方法，但是沒有一種方法可以產(chǎn)生充分的治療性疫苗。
兩種主要的HBV結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)HBs和HBc可以在幾種異源系統(tǒng)中獨立表達，所述異源系統(tǒng)如大腸桿菌、酵母、以及哺乳動物細胞系。兩種抗原都形成典型的明顯不同于感染性的、有包膜的、并且包含核殼體的HBV病毒粒體的病毒樣顆粒結(jié)構(gòu)(分別為HBs顆粒和HBc顆粒)。
可以在基于細菌或酵母的表達系統(tǒng)中產(chǎn)生重組乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)，因為這種蛋白是非糖基化的。HBV核心單體自組裝為病毒樣顆粒，其直徑為大約30nm，并且可以從生產(chǎn)細胞中以此形式純化。與真正的HBV核殼體非常相似，HBc顆粒由180或240個自組裝進顆粒結(jié)構(gòu)的單體核心分子組成。HBc顆粒不含有脂質(zhì)。HBV核心單體由183至185氨基酸(aa)殘基組成(長度依賴于分離株)。C末端的30aa形成一個核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域，這導致在HBc顆粒的純化的制備物中存在大量的核酸(主要是在不存在HBV基因組的情況下衍生自表達細胞的RNA)，這是不需要的雜質(zhì)?？梢栽贑末端截短HBc至144aa長，這減少了99％的核酸含量，但是保留顆粒結(jié)構(gòu)。短于144aa的構(gòu)建體不能形成顆粒。
在許多變體中已經(jīng)描述了重組HBc顆粒的產(chǎn)生。已經(jīng)將HBc的工程化變體用作異源抗原的載體系統(tǒng)(Pumpens，P.；Grens，E.(2001)Intervirology 44(2-3)；98-114)。在這個方法中，外源aa序列插入到在多聚體顆粒中暴露于外表面的蛋白質(zhì)鏈的區(qū)域aa70-90中。然而，由于單體必須保持其自組裝為顆粒的能力，所以通過遺傳學手段插入的外源抗原序列的大小是非常有限的。當用作動物模型中的疫苗時，HBc顆粒單獨即可誘導顯著的體液應(yīng)答，但是缺乏誘導被認為對于治療作用是必需的的HBc特異性CD8型細胞應(yīng)答的能力。
WO 00/32625(Biogen)描述了包含乙型肝炎病毒核心顆粒的免疫原，表位潛在地來自多價乙型肝炎病毒核心顆粒。
一種已經(jīng)進入臨床試驗的方法是構(gòu)建含有惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)的多個表位的修飾的乙型肝炎病毒核心顆粒用于預(yù)防瘧疾(Birkett A.，et al，Infection and Immunity 2002，p686-6870)。
真正的HBV包膜蛋白(HBs)以三種形式存在L(大)、M(中等)、S(小)，它們從三個交錯排列的翻譯起始位點表達。所有三種HBs以多聚體形式存在于HBV病毒粒體的包膜中。C末端前S1(L)和前S2(M)結(jié)構(gòu)域在感染過程中參與HBV與細胞的結(jié)合，并且針對前S1結(jié)構(gòu)域的抗體能夠中和HBV。當在酵母或哺乳動物細胞中作為重組蛋白質(zhì)表達時，HBs以微團(micelle)顆粒結(jié)構(gòu)的形式分泌，直徑為35-45nm，其還包含大量(60％w/w)細胞膜脂(Satoh O.et al.(2000)JBiochem；127(4)543-50)。根據(jù)表達構(gòu)建，所述重組顆粒包含單獨的S或包括C末端前S1和/或前S2結(jié)構(gòu)域。
現(xiàn)有的針對HBV的所有預(yù)防性疫苗均基于與鋁鹽一起配制的重組HBV包膜(HBs)蛋白。多數(shù)產(chǎn)物基于酵母表達。稱為第3代HBV疫苗的最近的產(chǎn)物衍生自哺乳動物細胞。這些疫苗包含前S結(jié)構(gòu)域以及另外的真正哺乳動物糖基化模式和哺乳動物脂質(zhì)組成，這二者都被認為有利于免疫應(yīng)答。
WO 99/39736(Yissum)要求保護HBs顆粒作為疫苗載體的應(yīng)用，但是該系統(tǒng)僅限于單體抗原，從而排除了具有HBc顆?；蚱渌藲んw型結(jié)構(gòu)的共配制物。另外，所述系統(tǒng)沒有預(yù)見到所述載體顆粒的體外解體和重組裝過程。
一篇最近的公開文獻(Ponsel and Bruss，(2003)JV 77416-422)描述了包含HBs和HBc的HBV顆粒從用兩種抗原的表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的哺乳動物細胞中的形成和分泌。然而，沒有關(guān)于包含HBs和HBc抗原的包膜顆粒的體外重建的報道。
US 6,020,167(Medeva)要求保護通過給予包含來自前S1或HBV核心的一或多個T細胞活化表位和能夠呈遞所述多肽的載體的組合物而治療乙型肝炎的方法。根據(jù)該發(fā)明的載體可以是HBsAg顆粒。
作為病毒樣顆粒的特殊形式，病毒體是一種被臨床證實的疫苗載體/佐劑系統(tǒng)，其在人體中具有優(yōu)異的安全性和耐受性特征。病毒載體通過外源和內(nèi)源途徑都可以介導抗原加工的能力使得這個系統(tǒng)成為治療性疫苗的很好的候選者。
病毒體的基本概念包括在體外重建空病毒包膜，或更一般地，重建整合進球形脂雙層的病毒包膜蛋白。病毒體已經(jīng)由多種病毒產(chǎn)生(YKaneda.(2000)Adv.Drug Delivery Rev.43，197-205；Drummond DC.etal.(2000)Prog Lipid Res.39(5)409-60)。已經(jīng)證實了產(chǎn)生包含來自兩種不同病毒的包膜蛋白的嵌合病毒體的可能性(Bagai S，Sarkar DP.(1994)FEBS Lett.353(3)332-6)。
在所有情況中，感興趣的病毒蛋白是跨膜或錨定于膜的結(jié)構(gòu)，這是自發(fā)整合的前提條件。
不與病毒體脂膜直接相互作用的分子的病毒體配制要困難得多。盡管早先已經(jīng)提出了將分子連接至病毒體結(jié)構(gòu)的想法(WO 95/32706，INEX)，但是實現(xiàn)穩(wěn)定及有效的配制的技術(shù)障礙可能是非常多的，這依賴于感興趣的分子的生物化學性質(zhì)。核酸可以通過使用帶正電的脂質(zhì)而與病毒體結(jié)構(gòu)相關(guān)聯(lián)(WO 98/52603，Berna)。對于其功能缺乏二級和三級結(jié)構(gòu)的小分子(肽、藥物)可以被生物化學修飾以進行關(guān)聯(lián)、整合或包囊作用。已經(jīng)描述了用于病毒體配制、特別是小分子(Wlti etal，(2002)Canc.Res)或合成顆粒(Jana et al.(2002)FEBS Lett.；515(1-3184-188)的包囊作用的一些方法。這些方法僅在影響大蛋白質(zhì)或更多的影響多聚蛋白質(zhì)復(fù)合物如病毒核殼體(例如HBc抗原顆粒)的真正構(gòu)象的化學條件下進行。迄今為止描述的用于將缺乏暴露的親脂結(jié)構(gòu)域的一或多個蛋白質(zhì)與病毒體膜相關(guān)聯(lián)的方法需要對所述蛋白質(zhì)進行生物化學修飾，例如共價連接至脂分子(Hunziker IP.et al.(2002)IntImmunol.14(6)615-26)以將所述蛋白質(zhì)錨定在脂膜中。這種方法也已經(jīng)證明對于將病毒體通過交聯(lián)抗體重靶定至特定細胞類型是有效的(Mastrobattista E.et al.(2001)FEBS Lett.509(1)71-6.，Wlti et al，Canc.Res.2002)。然而，生物化學修飾需要很可能解離非共價連接的多聚結(jié)構(gòu)(例如病毒核殼體)的條件(例如用于活化反應(yīng)性側(cè)鏈基團的氧化性條件)。另外，這些條件也可能改變研究中的蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象，并由此導致影響其免疫原性，并最終影響疫苗的效力。進一步地，交聯(lián)過程增加了配制所需的步驟數(shù)目并損失抗原。只有一個實例是多聚蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)成功地與病毒體關(guān)聯(lián)而沒有進行生物化學修飾，即甲型肝炎疫苗Epaxal(Glück R.，1995，J.of Liposome Research 1995，5(3)，467-479)。然而，由于病毒體膜與病毒粒體之間的靜電作用，在這個疫苗中在配制流感病毒病毒體后抗原僅與外表面關(guān)聯(lián)。因此，在病毒體液相內(nèi)部沒有抗原，而這里是治療性疫苗所需的進行有效的細胞質(zhì)送遞并誘導基于CD8的細胞應(yīng)答的優(yōu)選的位置。(Bungener L.et al.(2002)J Liposome Res.12(1-2)155-63；Bungener L.et al.(2002)Vaccine.20(17-18)2287-95.)已經(jīng)有一些關(guān)于流感病毒病毒體(WO 92/19267 WO 98/52603，Berna)和衍生自其他包膜病毒(例如仙臺病毒)的病毒體樣結(jié)構(gòu)的專利提出申請/得到授權(quán)。這些方法包括病毒包膜的溶解、包含病毒基因組的核殼體的清除、以及之后“空”病毒包膜的重建。進一步地，其他抗原被附著于已經(jīng)制備的病毒體(Epaxal)或交聯(lián)至脂分子，以將其錨定在病毒體膜中。
基于上述針對病毒感染的免疫接種的限制，本發(fā)明針對的技術(shù)問題是提供用于對對象進行預(yù)防、緩解或治療病毒感染的免疫接種的改良的方式和方法。
解決所述技術(shù)問題的技術(shù)方案通過提供權(quán)利要求中限定的實施方案而實現(xiàn)。
因此，本發(fā)明提供一種病毒體，其包含(a)包含一種包膜病毒的至少一種脂質(zhì)和包膜蛋白的病毒體膜；和(b)位于所述病毒體的里面和外面并且附著于所述包膜蛋白的所述包膜病毒的核殼體顆粒。
術(shù)語“病毒體”是指一種特殊形式的病毒樣顆粒(VLP)。病毒體是衍生自病毒顆粒的半合成復(fù)合物，并且通過體外方法產(chǎn)生。它們是基本上重建的病毒外被(coat)，而病毒核殼體被選擇的化合物置換。病毒體保留其融合活性，因此將摻入的化合物(抗原、藥物、基因)送遞至靶細胞內(nèi)部。它們可用作疫苗、藥物送遞或基因轉(zhuǎn)移。
VLP是在大小和形狀上都類似于其親代病毒，甚至與其親代病毒彼此難以分辨的顆粒結(jié)構(gòu)，但是其缺乏感染和在宿主細胞中復(fù)制的能力。VLP是由病毒蛋白(真正的或其修飾的變體)組成的多聚體結(jié)構(gòu)。另外，VLP可以或不可以包含核酸、脂質(zhì)，并包含或不包含脂膜結(jié)構(gòu)。衍生自單一病毒(HBV)的VLP的兩個典型的但是非常不同的實例是HBs和HBc顆粒。
術(shù)語“病毒體膜”在本發(fā)明的內(nèi)容中是指一種在體外重建的由具有整合的病毒包膜蛋白的脂雙層組成的球形膜結(jié)構(gòu)。
術(shù)語“包膜蛋白”在本發(fā)明的內(nèi)容中是指由包膜病毒編碼的蛋白質(zhì)，其天然形式與病毒脂膜直接作用。
根據(jù)本發(fā)明，多種脂質(zhì)可以包含在所述病毒體膜中。這組脂質(zhì)包括中性和帶電荷的磷脂、衍生自類固醇的脂質(zhì)、中性和帶電荷的合成脂質(zhì)。除了加入到配制物中的純化的脂質(zhì)外，病毒成分中包含的脂質(zhì)也包括在最終配制物中，例如在配制物(例如HBs顆粒)中包含的衍生自流感病毒或其他任何包膜病毒的脂質(zhì)或衍生自含有脂質(zhì)的VLP的脂質(zhì)。這些衍生自病毒的脂質(zhì)是異源的，并且反映了所述病毒的生產(chǎn)細胞或重組表達細胞的脂質(zhì)組成。優(yōu)選的配制物僅基于磷脂，以使配制物的復(fù)雜度最小化。在所附的實施例中描述的用于HB病毒體的磷脂通常是GMP級的，并且優(yōu)選地與用于已注冊的疫苗Inflexal和Epaxal的材料相同。
術(shù)語“包膜病毒”在本發(fā)明的內(nèi)容中是指在成熟病毒粒體結(jié)構(gòu)中包含衍生自宿主細胞的脂膜的病毒。包膜病毒的種類列于表1。
術(shù)語“核殼體顆?！痹诒景l(fā)明的內(nèi)容中是指由病毒衣殼蛋白組成的顆粒結(jié)構(gòu)。這種顆粒結(jié)構(gòu)可以是VLP(由一或多個重組病毒衣殼蛋白組成)，或者是由親代病毒純化的核殼體復(fù)合物。所述核殼體顆粒是否含有核酸與該顆粒的形成沒有關(guān)系。
本發(fā)明的病毒體(嵌合病毒樣顆粒)包含在一個單一顆粒中物理關(guān)聯(lián)的上述鑒定的分子。本發(fā)明的病毒體中的包膜蛋白質(zhì)可以以天然方向整合進病毒體的表面中，與相應(yīng)核殼體顆粒的反應(yīng)面朝向病毒體里面，也可以以人工方向整合進病毒體的表面中，與相應(yīng)核殼體顆粒的反應(yīng)面朝向病毒體外面。
圖1示出了這種病毒體的一個實例。這類新的病毒體的結(jié)構(gòu)與上面描述的各個成分的微粒結(jié)構(gòu)或與原始病毒不同。這類顆粒在自然界中不存在，并且在現(xiàn)有體外產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)中既沒有被描述過也沒有被提示過。因此，所述顆粒結(jié)構(gòu)是第一種從分離的成分完全體外重組裝的包膜病毒樣顆粒。
本領(lǐng)域已知的和上面所描述的病毒體在基于細胞的系統(tǒng)中產(chǎn)生。在這種基于細胞的系統(tǒng)中，全部成分都必須在同一細胞中同時產(chǎn)生，這嚴重限制了表達系統(tǒng)的選擇，并損害了產(chǎn)量和可測量性。不易控制的生物表達系統(tǒng)和代謝過程限定了所產(chǎn)生的病毒樣顆粒的組成，例如限定了成分之間的比例。進一步地，在細胞系統(tǒng)中產(chǎn)生的病毒樣顆粒之后必須被提取和純化而不影響顆粒結(jié)構(gòu)或組成，以獲得有用的制備物。
與之相反并如下文所述，本發(fā)明的病毒體的體外配制物的組成可以通過加入的材料和所選擇的生物化學參數(shù)控制。該方法的簡單性保證了其是強有力的方法。得到的配制物不需要進一步純化。各個成分可以預(yù)先在獨立的基于細胞的系統(tǒng)(例如大腸桿菌、哺乳動物細胞、以及酵母)中產(chǎn)生，并且對于每一種成分，可以針對產(chǎn)量、可測量性和純度選擇最適系統(tǒng)。
本發(fā)明的病毒體的配制方法利用了很容易整合進病毒體型結(jié)構(gòu)中的病毒蛋白質(zhì)(膜關(guān)聯(lián)蛋白、包膜蛋白)和自身不與膜關(guān)聯(lián)的蛋白質(zhì)之間的作用。盡管這種作用在大多數(shù)包膜病毒在宿主細胞內(nèi)的天然復(fù)制過程中的組裝都是必需和有效的，但是這一性質(zhì)在藥物產(chǎn)品的體外配制方法中的應(yīng)用是新的。令人驚訝地，所述細胞內(nèi)病毒組裝過程確實可以在體外模擬，盡管是在完全不同的條件下。
優(yōu)選地，所述病毒體是一種病毒體，其中所述至少一種脂質(zhì)包括至少一種磷脂。更優(yōu)選地，所述磷脂包括磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰絲氨酸。
在一個進一步優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明還設(shè)想了這種病毒體，其中所述包膜蛋白是第一種和第二種包膜病毒的包膜蛋白，并且所述核殼體顆粒是所述第二種包膜病毒的核殼體顆粒。
所述第一種包膜病毒可以選自任何包膜病毒。本發(fā)明特別優(yōu)選流感病毒。
在本發(fā)明一個更優(yōu)選的實施方案中，所述第一種包膜病毒的包膜蛋白是血凝素(HA)和/或神經(jīng)氨酸酶(NA)。
本發(fā)明的病毒體的流感病毒成分血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)可以純化自滅活的流感病毒(例如A/Singapore病毒株)，類似于已確立及授予專利權(quán)的流感病毒體的配制物(EpaxalWO 92/19267，WO92/19268，Glück R.，1995，Journal of Liposome Research 5(3)，467-479)。衍生自流感病毒的蛋白質(zhì)/所述第一種包膜病毒的蛋白質(zhì)可基于功能性而非結(jié)構(gòu)性/機械性原因而被包括，因為本發(fā)明的病毒體還可在缺乏流感病毒蛋白質(zhì)/所述第一種包膜病毒的蛋白質(zhì)的情況下配制?？砂鞲胁《境煞忠詮娀景l(fā)明的病毒體的病毒體樣載體的免疫學性質(zhì)。
同樣根據(jù)本發(fā)明，所述第二種包膜病毒優(yōu)選地選自由乙型肝炎病毒(HBV)(優(yōu)選的病毒)、丙型肝炎病毒(HCV)或任何其他黃病毒、和人類免疫缺陷病毒(HIV)組成的一組包膜病毒。
在本發(fā)明進一步優(yōu)選的實施方案中，所述核殼體顆粒包含HBc蛋白。
HBc顆?？梢栽诖竽c桿菌中產(chǎn)生，包括全長氨基酸序列或截短的形式。全長和截短的144氨基酸構(gòu)建體都成功地配制進HB病毒體中?；蛘撸舶▽⑤^短的(非特殊的)HBV核心摻入HB病毒體中。本領(lǐng)域已知相應(yīng)的技術(shù)，并且描述于所附的實施例中。
也優(yōu)選所述第二種包膜病毒的包膜蛋白是HBs蛋白。
HBs顆?？梢詢H包含S或前S和S的組合。本領(lǐng)域已知產(chǎn)生所述顆粒的方法。所述顆粒可以例如在酵母或哺乳動物細胞中產(chǎn)生。在包含本發(fā)明的病毒體的疫苗中存在前S結(jié)構(gòu)域可能有助于更廣泛及更有效的免疫應(yīng)答，但是對于配制過程沒有影響。HB病毒體可以從任何來源的HBs產(chǎn)生。甚至來自不同來源或不同血清型的不同HBs類型的組合配制進單一HB病毒體也已經(jīng)使用本文描述的方法得到證實。本發(fā)明將上述優(yōu)選的實施方案歸入流感病毒體一類。然而，摻入接下來用于將相同病毒的核殼體蛋白(HBc)連接至病毒體結(jié)構(gòu)的完全無關(guān)的病毒(HBV)的包膜蛋白(HBsAg)是全新的。
本發(fā)明另一個實施方案涉及包含本發(fā)明的病毒體的疫苗。
術(shù)語“疫苗”在本發(fā)明的內(nèi)容中是指預(yù)防性組合物，其在預(yù)防一種病毒疾病時被給予對象?？商娲鼗蚋郊拥?，該術(shù)語也指藥物組合物，其在緩解或治療病毒疾病時被給予對象。
根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“預(yù)防性組合物”和“藥物組合物”是指用于給予患者，優(yōu)選人類患者的組合物。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述組合物包括用于非胃腸道給予、經(jīng)皮給予、腔內(nèi)給予(intraluminal)、動脈內(nèi)給予、鞘內(nèi)給予或通過直接注射進組織而給予的組合物。特別設(shè)想所述組合物通過灌注或注射被給予患者。給予適當?shù)慕M合物可以通過不同途徑實現(xiàn)，例如通過靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、局部或皮內(nèi)給予。本發(fā)明的疫苗/組合物可以進一步包括藥物學可接受的賦形劑。根據(jù)本發(fā)明使用的賦形劑包括載體、添加劑和稀釋劑例如膠囊、載體(vehicle)、保存劑(conservant)、著色劑、崩解劑、粘合劑、乳化劑、增溶劑、潤濕劑、溶劑、緩沖劑、膠凝劑、增稠劑、成膜劑、潤滑劑、助流劑、分型劑(form-separating agen)、調(diào)流劑(flow-regulatingagent)、吸附劑和添加劑例如抗氧化劑、矯味劑(taste-correcting agent)及矯嗅劑(smell-correcting agent)。合適的藥物學載體為本領(lǐng)域所熟知，包括磷酸緩沖鹽水溶液、水、乳劑例如油/水乳劑、各種類型的潤濕劑、無菌溶液等等。包含這些組合物的載體可以通過熟知的常規(guī)方法配制。這些組合物可以以適當?shù)膭┝拷o予患者。給藥方案由主治醫(yī)生和臨床因素確定。如醫(yī)藥領(lǐng)域所熟知的，用于任何一名患者的劑量依賴于許多因素，包括患者的體重、體表面積、年齡、給予的特定化合物、性別、給予時間和途徑、一般健康狀況和其他共給予的藥物。用于給予的一個優(yōu)選劑量可能在每次1ng-1mg范圍內(nèi)變化。
本發(fā)明的疫苗/組合物可以局部或全身給予。優(yōu)選地非胃腸道給予，例如通過推注送遞至內(nèi)部或外部靶位點。用于非胃腸道給予的制備物包括無菌水或非水溶液、懸浮液、以及乳劑。水相載體包括水、乳劑或懸浮液，包括鹽水和緩沖介質(zhì)。非胃腸道的載體包括氯化鈉溶液、Ringer’s葡萄糖、葡萄糖和氯化鈉、或乳酸化的Ringer’s。靜脈內(nèi)載體包括體液和養(yǎng)料補充物、電解質(zhì)補充物(例如基于Ringer’s葡萄糖的那些)等等。防腐劑和其他添加劑也可以存在，例如抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑、惰性氣體等等。也設(shè)想本發(fā)明的疫苗/組合物可以除了本發(fā)明的病毒體之外基于所述組合物的用途進一步包含生物活性劑。這些物質(zhì)可以是佐劑。佐劑是一種添加到疫苗配制物中以增強或調(diào)節(jié)針對所述疫苗中包含的抗原的免疫應(yīng)答的物質(zhì)。各種不同的佐劑為本領(lǐng)域所熟知，包括脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、碳水化合物、去污劑、鹽、或它們的組合。
如所附實施例中所描述的，已知病毒體配制物確實改善了針對抗原的細胞應(yīng)答。這特別由在用HB病毒體免疫小鼠后檢測到針對HBc的細胞應(yīng)答這一事實證明。持續(xù)誘導針對病毒核心抗原例如HBc的細胞應(yīng)答特別是CD8/Th1型應(yīng)答是有益的，并且是用本發(fā)明的疫苗對對象進行免疫的特別優(yōu)選的結(jié)果。
任選地，本發(fā)明的疫苗可以進一步包括藥物學可接受的載體或稀釋劑和/或佐劑。
藥物學可接受的載體或稀釋劑在下文描述。稱為佐劑的免疫刺激物質(zhì)可以加入到本發(fā)明的疫苗的配制物中以進一步增強或調(diào)節(jié)針對所述疫苗中包含的抗原的免疫應(yīng)答。本領(lǐng)域已知大量具有佐劑性質(zhì)的化合物。這些化合物包括蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、碳水化合物、核酸及其組合。所述化合物可以是合成的或生物學產(chǎn)生的。佐劑可以加入至預(yù)先配制的病毒體中，或共配制并整合進病毒體結(jié)構(gòu)中。后者是可能的，如果該佐劑的生物化學性質(zhì)允許與任何一種病毒體成分相互作用的話。特別優(yōu)選地，所述佐劑是RC529(Corixa)。
如本文前面所述，本發(fā)明優(yōu)選的HB病毒體是穩(wěn)定的同源病毒體共配制物，其中流感病毒和HBV抗原在單一顆粒中物理關(guān)聯(lián)?？乖c病毒體載體的關(guān)聯(lián)是已經(jīng)清楚記載的對于全面探查病毒體抗原載體/佐劑系統(tǒng)的免疫刺激作用的前提要求(參見綜述Moser C et al.(2003)Expert Rev Vaccines，2(2)189-96)。
·抗原的HA介導的MHC-I呈遞和針對抗原的Th1免疫應(yīng)答·以重復(fù)性的病毒樣結(jié)構(gòu)進行的抗原呈遞·抗原呈遞細胞的靶向·防止細胞外降解對于治療性HBV疫苗來說，病毒體(HA)介導的MHC-I呈遞和樹突狀細胞的靶向是病毒體疫苗載體的最重要的相關(guān)特性。因此，優(yōu)選地HBc抗原的至少一部分應(yīng)當被包囊進病毒體中，以送遞至抗原呈遞細胞的細胞質(zhì)中，實現(xiàn)抗原特異性CD8T細胞的誘導(Bungener Let al.(2002)J Liposome Res.12(1-2)155-63)。更新的研究已經(jīng)證實了病毒體通過CD4T細胞的激活增強I類MHC限制的CTL(Schumacheret.al，Vaccine 22(2004)714-723)。未修飾的HBs和HBc抗原分別的物理整合和摻入代表了在實驗原型配制物水平，甚至在工業(yè)cGMP水平上的主要技術(shù)障礙。所述障礙通過本發(fā)明得以克服。配制物中使用的HBV和流感病毒抗原在不同的重組表達系統(tǒng)(哺乳動物細胞、酵母或大腸桿菌)中分別產(chǎn)生和純化，并且這些純化的抗原通過其自身形成有其特點的顆粒。
在另一實施方案中，本發(fā)明提供一種產(chǎn)生病毒體的方法，包括下列步驟(a)在存在脂質(zhì)的情況下，在去污劑溶液中溶解包膜病毒的包膜蛋白；(b)降低去污劑在溶液中的濃度；(c)將所述包膜病毒的核殼體顆粒加入至步驟(b)中所獲得的溶液中；以及(d)除去去污劑或卵磷脂從而產(chǎn)生病毒體。
術(shù)語“降低濃度”在本發(fā)明的內(nèi)容中包括加入不含有所述去污劑的溶液或加入與在步驟(a)中獲得的溶液相比含有較低濃度的所述去污劑的溶液。
術(shù)語“除去去污劑”在本發(fā)明的內(nèi)容中包括例如透析、滲濾、或?qū)游龅确椒?。當去污劑通過吸附至一種基質(zhì)(例如珠、樹脂)而除去時，優(yōu)選后者，即層析。
本發(fā)明的病毒體的配制方法可調(diào)整為用于GMP生產(chǎn)的方法而沒有進一步困擾。如針對HB病毒體的實例所描述的，對于生物化學和化學計量條件的修飾是必需的，以獲得包含HBc蛋白的新的多成分顆粒結(jié)構(gòu)的同源和有效的配制物(圖2)并且可以基于本說明書的教導而無需不必要的負擔即可實現(xiàn)。
本發(fā)明的方法的基本概念是通過利用病毒包膜蛋白與相應(yīng)的核殼體或核殼體樣顆粒之間的特異性相互作用而進行病毒體的完全體外組裝，其在病毒復(fù)制過程中的細胞內(nèi)病毒組裝期間發(fā)生。在實施例中，HBs和HBc分別代表了典型的和優(yōu)選的包膜蛋白和核殼體復(fù)合物，但是應(yīng)理解本發(fā)明并非限于此，而是可以應(yīng)用于任何包膜病毒。作為一般性的原則，在體外配制期間，所選擇的生物化學條件應(yīng)當允許包膜蛋白(env)與核殼體(nc)成分之間的相互作用。配制中的關(guān)鍵生化參數(shù)包括去污劑濃度、pH值、摩爾滲透壓濃度(osmolarity)、以及存在的螯合劑、特異的鹽、緩沖分子。
必須存在一種去污劑以溶解起始材料(病毒粒體或VLP的包膜)和脂質(zhì)成分。去污劑類型和濃度的變化在下文描述。
pH和摩爾滲透壓濃度優(yōu)選地在技術(shù)上可能的情況下盡可能地保持與生理條件(pH 7.4，150mEq)接近，以降低與其他成分的較弱相互作用或非特異性相互作用的風險。對于其他包膜病毒，優(yōu)選pH范圍在5-10，摩爾滲透壓濃度在10-400mEq。
鹽、螯合劑和緩沖液也影響蛋白質(zhì)之間的相互作用，并因此影響env/nc配制物的效力。在所附的實施例中描述的一種方案中，使用包含NaCl和生理緩沖系統(tǒng)磷酸鹽的模擬生理條件鹽組成的磷酸緩沖鹽水溶液(PBS)。然而，對于配制其他包膜病毒，可能需要修飾的緩沖系統(tǒng)(例如基于Tris的緩沖液或基于碳酸鹽的緩沖液)與NaCl、MgCl、KCl和CaCl鹽組合使用。在本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案中，可以設(shè)想包括螯合劑(例如EDTA、EGTA)以使不需要的酶活性失活。
最成功的配制物是病毒樣顆粒的單一的、同源的群體，其大小、成分、或生物化學性質(zhì)與各種起始材料(純化的病毒或VLP)都不同。大小的差異可以通過光子相關(guān)光譜(photon correlation spectroscopy，PCS)分析很容易地檢測，如在圖4中示出的HB病毒體的分析。該分析方法描述于實施例4(第31頁)。
對于本方法的原理來說，核殼體是否由單一重組蛋白亞基組成(這是HBc的情況)或是包含與核酸相關(guān)聯(lián)的幾種不同的病毒蛋白是沒有關(guān)系的。病毒包膜蛋白成分例如HBs起到在重建的病毒體膜和核殼體顆粒(例如HBc)之間的接頭的作用，而其自身不能與膜結(jié)構(gòu)有效地作用或關(guān)聯(lián)。盡管基本上不同，但是體外配制過程必須在一定程度上模擬HBV感染的細胞內(nèi)部的條件，以使得HBs和HBc之間進行有效的相互作用。在本發(fā)明的體外方法中，在不存在任何大分子細胞結(jié)構(gòu)的情況下，在除去去污劑的過程中發(fā)生組裝。相反，在HBV復(fù)制過程中，HBs分子被錨定在細胞膜中與HBV核殼體反應(yīng)。盡管存在令人驚訝的基本上不同的條件，病毒組裝——將核殼體顆粒包裝進病毒包膜中——在我們的配制過程中以高效發(fā)生。需要兩個過程同時發(fā)生以將兩種抗原與病毒體結(jié)構(gòu)連接起來(i)跨膜蛋白、流感病毒包膜(HA和NA)和HBs(HBV包膜)需要整合進病毒體膜中，以及(ii)HBc顆粒需要與錨定在膜中的HBs有效地關(guān)聯(lián)。
因此，有效的HB病毒體組裝僅可以在最優(yōu)化的生物化學條件和各種成分的正確化學計量下發(fā)生。對于包含來自流感病毒和HBV之外的其他病毒的蛋白質(zhì)的病毒體組裝也是如此。復(fù)合物核殼體結(jié)構(gòu)的完整性被認為是其與膜錨定的包膜蛋白進行相互作用的前提要求。
在本發(fā)明的實施例中，來自獨立來源的三種獨特的生物學顆粒結(jié)構(gòu)被體外轉(zhuǎn)變?yōu)橐环N新型合成病毒樣顆粒，其明顯有別于任何起始結(jié)構(gòu)，并且其是天然不存在的。
優(yōu)選地，本發(fā)明的方法的上述實施方案中的脂質(zhì)至少包含一種磷脂。更優(yōu)選地，所述磷脂包括磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰絲氨酸。
本發(fā)明的方法中還優(yōu)選所述包膜蛋白是第一種和第二種包膜病毒的包膜蛋白，并且所述核殼體顆粒是所述第二種包膜病毒的核殼體顆粒。
在本發(fā)明的方法的進一步優(yōu)選的實施方案中，所述第一種包膜病毒是流感病毒。更優(yōu)選地，所述包膜蛋白是血凝素(HA)和/或神經(jīng)氨酸酶(NA)。
本發(fā)明的方法中進一步優(yōu)選所述第二種包膜病毒是乙型肝炎病毒(HBV)。更優(yōu)選地，所述核殼體顆粒包含HBc蛋白。同樣優(yōu)選地，所述包膜蛋白是HBs蛋白。
根據(jù)本發(fā)明的方法，優(yōu)選地在步驟(a)中的溶解步驟之前對包膜蛋白的稀釋液進行離心，并將所獲得的沉淀在存在脂質(zhì)的情況下在去污劑或卵磷脂溶液中溶解。
可以在本發(fā)明的方法中應(yīng)用的脂質(zhì)已經(jīng)在前面更詳細地限定。
進一步優(yōu)選地，步驟(a)進一步包括在離心之前對稀釋液進行超聲處理。
更優(yōu)選地，所述離心在100,000g和4℃至少進行2小時，和/或所述超聲處理在37℃水浴中進行至少2分鐘。
在本發(fā)明的方法的一個可替代的方案中，所述方法可進一步包括在步驟(b)之后進行的步驟(b’)(b’)對步驟(b)中獲得的稀釋液進行無菌過濾。
對溶液進行無菌過濾的方式和方法是本領(lǐng)域所熟知的。所述無菌過濾例如可包括將步驟(b)中獲得的稀釋液通過0.22μm濾器進行過濾，如所附實施例中所描述的。
本發(fā)明上述方法的步驟(d)中的除去去污劑可通過下述步驟實現(xiàn)(i)加入Bio-Beads SM-2并將稀釋液在旋轉(zhuǎn)的情況下進行溫育；和(ii)從稀釋液中除去Bio-Beads SM-2。
優(yōu)選地所述步驟(i)和(ii)使用新鮮Bio-Beads SM-2重復(fù)進行至少一次，優(yōu)選地重復(fù)至少兩次。
同樣優(yōu)選地，所述步驟(i)和(ii)在室溫進行。
進一步地，同樣也是優(yōu)選地，步驟(i)中的溫育至少持續(xù)30分鐘。
還設(shè)想了本發(fā)明的方法可包括步驟(e)(e)對步驟(d)中獲得的稀釋液進行無菌過濾。
優(yōu)選地，上面描述的去污劑是非離子去污劑。根據(jù)本發(fā)明的非離子去污劑的實例包括去污劑例如八聚乙二醇單(N-正十二烷基)醚(octaethylene glycol mono(N-dodecyl)ether，OEG)、Triton X-100、TritonX-114、NP 40、Tween 20/80和卵磷脂。去污劑可以優(yōu)選地在濃度范圍0.1-15％(v/v)使用。由于去污劑的性質(zhì)，優(yōu)選的濃度通常以(v/v)形式給出。然而，OEG以粉末形式獲得，因此其濃度優(yōu)選地以mM單位給出。例如濃度為100mM OEG相應(yīng)于大約5.5％(v/v)OEG。
特別優(yōu)選的是所述非離子去污劑是八聚乙二醇單(N-正十二烷基)醚(OEG)。
本發(fā)明的方法還優(yōu)選OEG在步驟(b)中調(diào)整到濃度為20mM-100mM。最優(yōu)選地所述濃度是50mM(相應(yīng)于大約2.75％OEG(v/v))。
在本發(fā)明的方法的優(yōu)選的實施方案中，調(diào)整的脂質(zhì)∶蛋白質(zhì)比例在1∶10和20∶1之間。更優(yōu)選地，所述脂質(zhì)∶蛋白質(zhì)比例是大約5∶1。
本發(fā)明的方法優(yōu)選磷脂酰膽堿部分在病毒體內(nèi)是22％。
在本發(fā)明的方法中還優(yōu)選HA∶病毒包膜蛋白∶病毒衣殼蛋白比例是1∶1∶1。
另外，優(yōu)選地本發(fā)明的方法包括在步驟(d)中產(chǎn)生病毒體之前加入佐劑。
本發(fā)明的進一步可替代的實施方案涉及本發(fā)明的病毒體或通過本發(fā)明的方法生產(chǎn)的病毒體在制備疫苗中的應(yīng)用。
本發(fā)明的進一步可替代的實施方案涉及本發(fā)明的病毒體或通過本發(fā)明的方法生產(chǎn)的病毒體在制備用于預(yù)防、緩解、或治療HBV感染的疫苗中的應(yīng)用。
本發(fā)明還涉及一種對對象進行免疫接種的方法，包括步驟將本發(fā)明的病毒體或通過本發(fā)明的方法生產(chǎn)的病毒體給予需要其的患者。所述病毒體可以如前面所描述的一般用于藥物組合物的方法給予。
本發(fā)明的另一個實施方案涉及用于對對象進行免疫接種以預(yù)防、緩解或治療HBV感染的方法，包括步驟將本發(fā)明的病毒體或通過本發(fā)明的方法生產(chǎn)的病毒體給予需要其的患者。任選地所述病毒體可以與藥物學可接受的載體或稀釋劑和/或佐劑組合給予。
特別優(yōu)選地，上述對象是人。
表1包膜病毒列表(來源http://www.virology.net/Big_Virology/BVHostList.html)
附圖顯示了圖1圖1示出了各個成分的結(jié)構(gòu)和得到的HB病毒體的示意圖。分析數(shù)據(jù)與這個設(shè)想的結(jié)構(gòu)相符。
圖2圖2示出了配制過程的流程圖。HB病毒體的詳細配制方案在所附的實施例中提供。
圖3圖3示出了HB病毒體的SDS-PAGE分析結(jié)果。HB病毒體和起始材料(流感病毒、HBs和HBc)的蛋白質(zhì)組成在圖3中示于SDS-PAGE分析。
HB病毒體的預(yù)期的物理結(jié)構(gòu)被接下來的分析結(jié)果所證實(圖4-7)。
圖4圖4示出了HB病毒體與其各個成分的大小相比較的大小分析的結(jié)果。HB病毒體由一個與各個成分截然不同的單一類型的顆粒組成，在分子相關(guān)光譜中的顆粒大小分布中顯示為一個單一窄峰。
圖5圖5示出了HB病毒體的梯度分級分離分析的結(jié)果。HB病毒體在蔗糖梯度上超速離心后所有抗原在同一梯度級分中發(fā)現(xiàn)，提示了它們的物理關(guān)聯(lián)。
圖6圖6示出了HB病毒體的SDS-PAGE/Western印跡分析的結(jié)果。使用抗HA或抗HBs抗體進行的HB病毒體的免疫沉淀在兩種情況下都產(chǎn)生了所有抗原(HBs、HBc和HA)的共沉淀。如果在免疫沉淀之前通過加入去污劑破壞HB病毒體結(jié)構(gòu)，則只有被抗體直接識別的抗原被沉淀(分別是HA或HBs)。這個發(fā)現(xiàn)證實了所有抗原在一個單一結(jié)構(gòu)中相關(guān)聯(lián)。
圖7圖7示出了HB病毒體的SDS-PAGE/Western印跡分析的結(jié)果。當對HB病毒體進行胰蛋白酶消化時，HBV的兩種抗原都被部分保護(50％，根據(jù)Western印跡)。如果在胰蛋白酶溫育前通過加入去污劑而破壞病毒體結(jié)構(gòu)，則HBV抗原在短時間內(nèi)被完全降解。
圖8圖8示出了在免疫小鼠后對HB病毒體的抗體免疫應(yīng)答的測試結(jié)果。對于HB病毒體的免疫原性目前只有初步數(shù)據(jù)。在小鼠中使用HB病毒體而沒有另外的佐劑進行實驗。小鼠通過肌內(nèi)注射不同量的HB病毒體進行免疫，檢測到針對所有三種抗原的高抗體滴度。
圖9圖9示出了在免疫小鼠后對HB病毒體的細胞免疫應(yīng)答的測試結(jié)果。在第三次加強后，從被免疫的動物中純化脾細胞，并且在用相應(yīng)抗原體外再刺激后，通過針對γ干擾素進行的ELISPOT確定細胞應(yīng)答。應(yīng)當注意這種方法不能區(qū)分CD4和CD8型應(yīng)答。
圖10總結(jié)表顯示了在用HB病毒體免疫后迄今為止獲得的免疫數(shù)據(jù)。在被免疫的動物中檢測到針對HBs和HBc的體液和細胞應(yīng)答。
本發(fā)明現(xiàn)在通過參考下面的實施例進行描述，這些實施例僅僅是示例性的，而不應(yīng)將其解釋為對本發(fā)明的范圍的限制。
實施例1HBsAg在酵母中的表達和純化Schaefer S.et al.，in Hansenula polymorphaBiology andApplications，WILEY-VCH Verlag，Weinheim，2002，Recombinanthepatitis B vaccines-disease characterization and vaccine production(p187-p193)該方法包括下述步驟構(gòu)建表達盒和載體；轉(zhuǎn)化酵母多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha)、選擇并研究菌株特征、發(fā)酵、收獲細胞、破壞細胞、澄清、吸附、離子交換色譜、超濾、超速離心、凝膠過濾色譜、最終液體的無菌過濾。
最終物質(zhì)的質(zhì)量(quality)由各種生物化學測試確定，如Lowry、SDS/PAGE、Western印跡分析、或AUSZYME。
實施例2HBc在大腸桿菌中的表達Zheng et al，Journal of Biological Chemistry 1992，139422-9429The structure of Hepadnaviral core antigensPreikschat et al.，Journal of General Virology 1999，801777-1788Expression，assembly competence and antigenic properties of hepatitis Bvirus core gene deletion variants from infected liver cells.
該方法包括下述步驟構(gòu)建表達盒和載體；轉(zhuǎn)化細菌大腸桿菌(Escherichia coli)、選擇并研究菌株特征、發(fā)酵、收獲細胞、破壞細胞、澄清、吸附、色譜、凝膠過濾、最終液體的無菌過濾。
最終物質(zhì)的質(zhì)量(quality)由各種生物化學測試確定，如Lowry、SDS/PAGE、Western印跡分析。
實施例3流感病毒病毒體的重建
Glück R，1995，Journal of Liposome Research 1995，5(3)，467-479Liposomal Hepatitis A Vaccine and Liposomal multiantigen combinationvaccines流感病毒病毒體由磷脂和生長在雞胚中或細胞培養(yǎng)物中的流感病毒產(chǎn)生。通過一或多個離心步驟收獲、純化并濃縮病毒，接下來通過用β-丙內(nèi)酯(BPL)處理滅活。
滅活病毒通過超速離心沉淀，并在去污劑(含有100mM OEG的PBS)中重懸以溶解病毒的外殼，即病毒包膜，而病毒的內(nèi)側(cè)部分即核殼體保留蛋白質(zhì)復(fù)合物和殘余核酸。同樣地，脂質(zhì)(卵磷脂及其他)在相同的去污劑(含有100mM OEG的PBS)中溶解。接下來混合脂質(zhì)和溶解的流感病毒，并且任選地，用超聲脈沖處理以完成解離。接下來，進行第二次超速離心以沉淀并除去混和物中所有不能溶解的物質(zhì)。這種不能溶解的物質(zhì)主要包括病毒核殼體復(fù)合物。超速離心后的上清含有未來的病毒體的處于溶液中的全部成分病毒包膜蛋白和脂質(zhì)，以及分別加入的磷脂。在最后一步中，從上清中通過使用SM-2Bio-Beads的批處理色譜除去去污劑。順序除去去污劑導致自發(fā)形成病毒體囊泡(vesicle)的同源群體，其平均直徑為100至200nm，取決于精確組成和脂∶蛋白質(zhì)比例。
實施例4HB病毒體的配制和分析為了實現(xiàn)HBs和HBc成分定量整合進HB病毒體，已確立的用于流感病毒病毒體的配制方法被較大程度修飾并針對一些變量進行優(yōu)化。使用標準流感病毒病毒體的方案，已經(jīng)證明HBV抗原的摻入率和該方法的重現(xiàn)性不能令人滿意。
4.1圖3-11示出了用于HB病毒體的詳細的基本配制方案。
混和包含2mg HA和2mg純化的重組HBs抗原(二者均處于磷酸緩沖鹽水(PBS)中)的滅活的流感病毒(A/Singapore病毒株)，并在100000g，4℃離心2小時。將得到的沉淀在含有100mM PBS-OEG的1ml PBS中溶解。
將粉末形式的衍生自雞卵的磷脂(16.5-mg磷脂酰膽堿和4.5mg磷脂酰乙醇胺)溶解在1ml 100mM PBS-OEG中。
接下來將磷脂和HA-HBs抗原溶液進行混和并在37℃水浴中超聲處理2分鐘以完全溶解。不能溶解的物質(zhì)通過在100000g，4℃離心2小時而除去。收集得到的上清(2ml)并用PBS稀釋至終體積3.5ml。
將HBc抗原在PBS中稀釋至4mg/ml，并且將0.5ml該稀釋液加入至含有處于PBS-OEG中的HA、HBs抗原和磷脂的溶液中，得到OEG終濃度為50mM。
配制物混和物通過0.22微米濾器(Millipore)進行過濾并且進入去污劑清除程序。所述混和物加入到1.2g(干重)Bio-Beads SM-2(BioRad)中并且在室溫下轉(zhuǎn)動溫育30分鐘。接下來，將懸浮液轉(zhuǎn)移至0.8g新鮮Bio-Beads并在相同條件下溫育30分鐘，之后在相同條件下與0.8g新鮮Bio-Beads進行第三次溫育。得到的HB病毒體接下來進行無菌過濾(0.22微米)并在4℃玻璃安瓿中貯存直至使用。
4.2HB病毒體的組成的可能的修飾以相似的方式制備包含來自不同來源(CHO衍生的HBs、酵母衍生的HBs)、亞型(ayw和adw HBV核心顆粒)或變體(全長和截短的HBV核心)的HBV抗原的HB病毒體。上述重建的HB病毒體的制備得自為了鑒別顆粒大小和抗原摻入率的關(guān)鍵參數(shù)而進行的，并且在與最終無菌過濾相容的均一大小的顆粒中允許好的抗原摻入的一系列配制。具有不同磷脂組成(磷脂酰乙醇胺和磷脂酰膽堿比例不同)的配制物顯示了顆粒大小和磷脂酰乙醇胺含量之間的反比關(guān)系。脂質(zhì)與蛋白質(zhì)比例(2.5，5，6，7.5)對于大小和抗原摻入的影響已經(jīng)在一系列配制中進行研究。已經(jīng)顯示不同抗原的相對量影響摻入，在配制中增加HA的濃度(不含有HBc抗原)引起HBs抗原摻入的增加，對于1∶1比例達到80％。測試了下列參數(shù)并系統(tǒng)地使其優(yōu)化脂質(zhì)∶蛋白質(zhì)比例我們手中最佳脂質(zhì)∶蛋白質(zhì)比例是5∶1，但是如果使用磷脂，則對于最大抗原摻入，20∶1至1∶10之間的范圍也是可能的。如果使用其他脂質(zhì)(合成的脂質(zhì)、類固醇型脂質(zhì))或不同脂質(zhì)的組合，則脂質(zhì)∶蛋白質(zhì)比例可以變化更大。
磷脂組成(PC、PE、其他脂質(zhì))可以產(chǎn)生僅具有PC的HB病毒體，在我們手中，對于大小和同一性而言22％PE是最適的。同樣，如果使用其他脂質(zhì)，這些比例可以有很大變化。
抗原之間的比例(HA∶HBs∶HBc)在我們手中1∶1∶1的比例被證明是最適的。然而，當使用修飾的脂質(zhì)組成和脂質(zhì)∶蛋白質(zhì)比例時，對于最大抗原摻入的最適量很可能變化。另外，不含有任何HA的配制也得到了希望的顆粒結(jié)構(gòu)。
去污劑選擇的去污劑是濃度為50mM的OEG。然而，當修飾組成和比例時，20-100mM之間的范圍也可應(yīng)用。也可以使用其他具有非離子、離子、或兩性離子性質(zhì)的去污劑代替OEG用于配制過程。
其他非離子去污劑候選者去污劑 濃度范圍Triton X-100 0.1-15％(v/v)Triton X-114 0.1-15％(v/v)NP 400.1-15％(v/v)Tween 20/80 0.1-15％(v/v)
4.3病毒體配制物分析HB病毒體的徹底的物理-化學分析對于配制過程的最適化和將來的產(chǎn)品的質(zhì)量控制是一個極其重要的因素。因此，對于開發(fā)研究HB病毒體的成分和結(jié)構(gòu)的測試投入了巨大努力。由于佐劑效果(MCH-1呈遞)直接依賴于HB病毒體的物理結(jié)構(gòu)，因此特別關(guān)注了將疫苗的HBV成分與病毒體載體物理關(guān)聯(lián)在一起的單一顆粒類型的闡明。
成分的定量蛋白質(zhì)(SDS-PAGE)HBs(ELISA，Western印跡)HBc(ELISA，Western印跡)HA(SRD)磷脂(酶學分析)病毒體結(jié)構(gòu)光子相關(guān)光譜免疫共沉淀密度梯度超速離心胰蛋白酶消化電子顯微鏡術(shù)(計劃中的)確定總蛋白質(zhì)濃度通過在260、280和320nM波長的UV光吸收測定蛋白質(zhì)濃度，根據(jù)下述公式計算1.55×(A280-A320)-0.76×(A260-A320)。結(jié)果用每毫升毫克數(shù)表示。
HBs和HBc抗原定量通過定量Elisa分析確定摻入HB病毒體的HBs和HBc抗原的量。為了最大程度地接觸抗原，將抗原標準和HB病毒體樣品在第一次稀釋期間溶解于PBS-OEG中，而后續(xù)稀釋在PBS中進行。使用可商購的HBs Elisa檢測試劑盒(DADE Behring)進行HBs分析，在同一分析中測試的純化的HBs抗原的系列稀釋使得可以定量確定HB病毒體樣品中的抗原。對于定量HBc ELISA，用針對HBc的單克隆抗體(mAb)(克隆7E6，Biogenesis，稀釋度1∶1000)在Na2CO3，50mM，pH 9.6覆蓋微量滴定平板。接下來用PBS中的BSA 1％、sucrose 5％、0.05％NaN3在室溫下封閉所述平板至少1小時，并用含有0.05％(v/v)Tween20的PBS(漂洗緩沖液)漂洗。對樣品(0.1ml)進行上樣并在室溫溫育1小時。針對HBc的第二種生物素?；膍AB(克隆4H5，Biogenesis)在含有0.05％Tween 20和BSA 0.1％的PBS(稀釋緩沖液)中以1∶1000稀釋，在室溫加入(0.1ml/孔)并溫育1小時。在漂洗4次后，將平板在存在鏈霉抗生物素蛋白(1∶5000，稀釋緩沖液中)的情況下在室溫溫育1小時。在另外漂洗四次后，溫育TMB(0.075ml/孔)30分鐘并用1M H2SO4(75μl/孔)終止顯色反應(yīng)，在450nm測定光強度。
HA定量使用標準徑向擴散(radial diffusion，SRD)分析確定HB病毒體的HA含量。這個測試是分析病毒體疫苗的有效分析，由Berna BiotechLtd.QC部門依照Epaxal相關(guān)SOP進行。
凝膠電泳，Western印跡，銀染為了闡明HB病毒體中存在HA、HBs或HBc抗原，將來自配制物、梯度級分、蛋白酶消化、或免疫共沉淀的樣品在NuPage Bis-TrisSDS-Page預(yù)制凝膠(Invitrogen)上用MES緩沖液分離，然后根據(jù)生產(chǎn)商的說明轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。膜用PBST(PBS中的1％Tween20)中的5％牛乳封閉，并與1∶1000稀釋的抗原特異性抗體在室溫溫育1小時。漂洗膜后與1∶10,000稀釋的過氧化物酶綴合的抗兔或抗綿羊免疫球蛋白溫育1小時。蛋白質(zhì)用ECL Plus底物試劑(AmershamPharmacia，Piscataway，N.J.)顯色。
凝膠的銀染根據(jù)供貨商(Invitrogen)的說明進行。
確定顆粒大小光子相關(guān)光譜通過光子相關(guān)光譜或動態(tài)光散射(dynamic light scattering)確定起始物質(zhì)和配制的HB病毒體的水力直徑(hydrodynamic diameter)、多分散性指數(shù)(polydispersity index)、和統(tǒng)計學顆粒大小分布。這種方法基于布朗運動的大小依賴性速度，其作為相對于時間的光散射變量測定。Malvern Zetasizer 1000HS(Malvern Ltd，Malvern，UK)被用于此目的，包括用于從原始數(shù)據(jù)光強度變化計算參數(shù)的軟件。樣品在PBS中充分稀釋，并在25℃標準條件下分析1ml稀釋液。
蔗糖梯度應(yīng)用通過非連續(xù)蔗糖梯度進行的超速離心作為基于各個成分的不同密度評估HB病毒體結(jié)構(gòu)中的抗原摻入的分析方法。PBS中的HB病毒體配制物的小份被置于PBS中的20-60％(w/v)非連續(xù)蔗糖梯度的頂部并在100,000g 4℃離心24小時。接下來分析收集到的級分的密度、蛋白質(zhì)的量和通過western印跡分析不同抗原的存在。
胰蛋白酶消化通過有限胰蛋白酶消化研究HB病毒體顆粒中抗原摻入和最終的包囊作用。接下來通過western印跡分析被加工的樣品的蛋白酶解抗性片段或被保護的蛋白全長。HB病毒體在PBS緩沖液(完整顆粒＝天然條件)中稀釋，或在PBS中的0.5％Na-去氧膽酸和1％Triton X100(被破壞的病毒體結(jié)構(gòu)＝變性條件)中稀釋。用胰蛋白酶5％(w/w蛋白質(zhì))在室溫進行0、2、5和10小時蛋白酶消化。作為各個成分有效接觸胰蛋白酶消化的對照，將不同抗原的混和物在相同濃度相同條件下也進行消化。通過加入4x SDS-PAGE樣品緩沖液終止反應(yīng)。在95℃變性10分鐘后，對消化產(chǎn)物進行SDS-PAGE電泳并對HBs和HBc進行免疫印跡分析。
免疫共沉淀HA、HBs和HBc抗原在HB病毒體結(jié)構(gòu)中的物理關(guān)聯(lián)通過每一種抗原在天然和變性條件下(如對胰蛋白酶消化所描述的)的分離的(獨自的)免疫沉淀、以及接下來通過western印跡分析進行的免疫共沉淀的抗原的鑒別而闡明。在存在針對HA、HBc或HBs的特異性抗體的情況下，在平行分析中進行HB病毒體配制物的免疫沉淀。免疫復(fù)合物接下來與G蛋白-瓊脂糖凝膠包被的珠(Promega)溫育4小時并離心。得到的沉淀用PBS漂洗五次。通過在樣品緩沖液中煮沸10分鐘重懸免疫沉淀的蛋白質(zhì)，并用SDS-PAGE和Western印跡分析。通過與相應(yīng)的特異性抗體一起溫育研究每一種抗原的存在。
病毒體配制在小鼠模型中的免疫原性對于HB病毒體的免疫原性目前只有初步數(shù)據(jù)。在小鼠中使用有或沒有一種額外佐劑RC529(Corixa)的HB病毒體進行實驗。小鼠通過肌內(nèi)注射不同量的HB病毒體進行免疫，檢測到針對所有三種抗原的高抗體滴度(圖8)。在第三次加強后，從被免疫的動物中純化脾細胞，并且在用相應(yīng)抗原體外再刺激后，通過針對γ干擾素進行的ELISPOT確定細胞應(yīng)答(圖9)。應(yīng)當注意這種方法不能區(qū)分CD4和CD8型應(yīng)答。另外，通過FACS分析來自被免疫的動物的脾細胞(圖10)。新鮮的脾細胞直接用與抗CD8抗體組合的HBc特異性五聚體染色?；蛘哂肅D8特異性肽或全蛋白刺激脾細胞，并接下來對與抗CD4或抗CD8抗體組合的細胞內(nèi)γ干擾素染色。
實施例5配制原則對其他病毒系統(tǒng)的應(yīng)用不同病毒蛋白質(zhì)之間的相互作用對于病毒粒體組裝是至關(guān)重要的，并且已發(fā)現(xiàn)這對于所有病毒來說是一個一般規(guī)律。包膜病毒粒體的組裝依賴于細胞膜結(jié)構(gòu)。核殼體(一種核酸和蛋白質(zhì)的復(fù)合物)與膜結(jié)合的病毒蛋白相關(guān)聯(lián)以形成成熟病毒結(jié)構(gòu)。我們已經(jīng)示出了對于乙型肝炎病毒這一過程可以在體外模擬，并且在缺乏細胞膜結(jié)構(gòu)并使用來自不同重組來源的病毒蛋白的情況下進行。盡管對于數(shù)量和純度來說病毒抗原的重組來源是優(yōu)選的，但是病毒蛋白質(zhì)也可以衍生自起始病毒，如本文中涉及的流感病毒HA所應(yīng)用的。體外配制物的可變性使得可以包括來自不同來源的多個抗原?；谶@一原則，包含來自幾種病毒的蛋白質(zhì)的多價配制物(如示出的關(guān)于HBV和流感病毒的情況)可以改良物理穩(wěn)定性、免疫學性質(zhì)、或者疫苗保護譜。
如果條件適合相應(yīng)病原體并且必需的成分可以得到并且有充分的量，那么同樣的原則應(yīng)用于任何其他包膜病毒也是可能的。下面列出了一些候選者，對于它們可以應(yīng)用體外配制原則，并且它們還代表了引人注目的和急迫的疫苗靶。然而，這些理論上的病毒樣顆粒誘導的免疫應(yīng)答是否將會具有預(yù)防性甚至治療性效果還無法預(yù)測。
5.1丙型肝炎病毒HCV作為丙型肝炎的病原物代表了一個全球健康問題。據(jù)估計全世界％的人口被這種病毒感染。目前沒有針對HCV的疫苗，無論是用于預(yù)防還是用于治療。已經(jīng)闡明了病毒樣顆粒在細胞系統(tǒng)中的組裝(Baumert et al，Journal of Virology 1998，753827-3838；Hepatitis C virus structural proteins assemble into viruslike particlesin insect cells)。至于在HBV中，核心蛋白單體與與膜錨定的包膜蛋白(E1，E2)相互作用的二十面體核殼體相關(guān)聯(lián)。
5.2其他黃病毒除了HCV外，黃病毒科中還包括一些相關(guān)人類病原體(西尼羅河病毒、庫寧病毒(Kunjin virus)、流行性乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus)、登革病毒、黃熱病毒、和森林腦炎病毒)。與HCV(和HBV)在結(jié)構(gòu)水平上的相似性是很高的，因此體外重組裝病毒樣顆?？瓷先ナ强赡艿?。
5.3HIVHIV是逆轉(zhuǎn)錄病毒科最重要的成員。同樣，盡管有非常急切的醫(yī)療需要，但是還沒有有效的疫苗。盡管這些病毒形成更復(fù)雜的核殼體，但是基于與HB病毒體相同的原則，體外配制多抗原疫苗看上去是可行的。
權(quán)利要求
1.一種病毒體，其包含(a)包含流感病毒和乙型肝炎病毒(HBV)的至少一種脂質(zhì)和包膜蛋白的病毒體膜；和(b)包含位于所述病毒體的里面和外面并且附著于所述包膜蛋白的所述HBV的HBc蛋白的核殼體顆粒。
2.權(quán)利要求1的病毒體，其中所述至少一種脂質(zhì)包括至少一種磷脂。
3.權(quán)利要求2的病毒體，其中所述磷脂包括磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺。
4.權(quán)利要求1-3任一項的病毒體，其中所述流感病毒的包膜蛋白是血凝素(HA)和/或神經(jīng)氨酸酶(NA)。
5.權(quán)利要求1-4任一項的病毒體，其中所述HBV的包膜蛋白是HBs蛋白。
6.一種疫苗，其包含權(quán)利要求1-5任一項的病毒體及任選地一種藥物學可接受的載體或稀釋劑和/或佐劑。
7.權(quán)利要求6的疫苗，其中所述佐劑是RC529(Corixa)。
8.一種產(chǎn)生病毒體的方法，包括下列步驟(a)在存在脂質(zhì)的情況下，在去污劑溶液中溶解包膜病毒流感病毒和HBV的包膜蛋白；(b)降低去污劑在溶液中的濃度；(c)將包含HBc蛋白的HBV的核殼體顆粒加入至步驟(b)中所獲得的溶液中；以及(d)除去去污劑從而產(chǎn)生病毒體。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述脂質(zhì)包括至少一種磷脂。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述磷脂包括磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺。
11.權(quán)利要求8-10任一項的方法，其中所述流感病毒的包膜蛋白是血凝素(HA)和/或神經(jīng)氨酸酶(NA)。
12.權(quán)利要求8-11任一項的方法，其中所述HBV的包膜蛋白是HBs蛋白。
13.權(quán)利要求8-12任一項的方法，進一步包括在步驟(b)之后進行的步驟(b’)(b’)對步驟(b)中獲得的稀釋液進行無菌過濾。
14.權(quán)利要求8-13任一項的方法，進一步包括步驟(e)(e)對步驟(d)中獲得的稀釋液進行無菌過濾。
15.權(quán)利要求8-14任一項的方法，其中所述去污劑是非離子去污劑。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述非離子去污劑是八聚乙二醇單(N-正十二烷基)醚(OEG)。
17.權(quán)利要求15或16的方法，其中所述非離子去污劑在步驟(b)中調(diào)整到濃度為20mM-100mM。
18.權(quán)利要求8-17任一項的方法，其中脂質(zhì)∶蛋白質(zhì)比例在1∶1和10∶1之間。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述脂質(zhì)∶蛋白質(zhì)比例是大約5∶1。
20.權(quán)利要求10-19任一項的方法，其中磷脂酰膽堿部分在病毒體內(nèi)是22％。
21.權(quán)利要求11-20任一項的方法，其中HA∶病毒包膜蛋白∶病毒衣殼蛋白比例是1∶1∶1。
22.權(quán)利要求8-20任一項的方法，進一步包括在步驟(d)中產(chǎn)生病毒體之前加入佐劑。
23.權(quán)利要求1-5任一項的病毒體或通過權(quán)利要求8-22任一項的方法獲得的病毒體在制備疫苗中的應(yīng)用。
24.權(quán)利要求1-5任一項的病毒體或通過權(quán)利要求8-22任一項的方法獲得的病毒體在制備用于預(yù)防、緩解、或治療HBV感染的疫苗中的應(yīng)用。
25.一種對對象進行免疫接種的方法，包括步驟給予權(quán)利要求1-5任一項的病毒體或通過權(quán)利要求8-22任一項的方法獲得的病毒體。
26.一種對對象進行免疫接種以預(yù)防、緩解或治療HBV感染的方法，包括步驟給予權(quán)利要求1-5任一項的病毒體或通過權(quán)利要求8-22任一項的方法獲得的病毒體，任選地與藥物學可接受的載體或稀釋劑和/或佐劑組合給予。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種包含病毒體膜的病毒體，所述病毒體膜包含一種包膜病毒的至少一種脂質(zhì)和包膜蛋白，并且所述包膜病毒的核殼體顆粒位于所述病毒體的里面和外面并且附著于所述包膜蛋白。另外，本發(fā)明提供了一種包含本發(fā)明的病毒體的疫苗以及一種生產(chǎn)本發(fā)明的病毒體的方法。進一步地，本發(fā)明提供了本發(fā)明的病毒體在制備例如用于預(yù)防或緩解與HBV感染有關(guān)的疾病的疫苗中的應(yīng)用，以及對對象進行免疫接種的方法。
文檔編號A61K9/127GK101048498SQ200580037140
公開日2007年10月3日 申請日期2005年10月20日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月27日
發(fā)明者克里斯蒂安·莫澤, 喬萬納·阿瑟羅, 埃皮法尼奧·菲凱拉, 達里奧·文圖拉, 勞倫斯·朗珀勒, 迪亞娜·費爾納羅瓦 申請人:瑞士博爾納生物技術(shù)有限公司