專利名稱：一種金黃色葡萄球菌表面蛋白的融合蛋白,其制備方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種融合蛋白，具體地說涉及一種金黃色葡萄球菌表面蛋白的融合蛋白，還涉及該融合蛋白的制備方法及用途。
背景技術(shù)：
金葡菌是醫(yī)院感染中最常見的病原菌，也是社會(huì)上大范圍感染的主要病原菌。金葡菌感染可引起心內(nèi)膜炎、骨髓炎、濃毒性關(guān)節(jié)炎、肺炎和膿腫等疾病。金葡菌也是重要經(jīng)濟(jì)動(dòng)物的主要病原菌。金葡菌對(duì)青霉素這樣的首選藥物產(chǎn)生抗藥性后引起的主要問題是，甲氧西林抗性的金黃色葡萄球菌菌株可抵抗大多數(shù)臨床上應(yīng)用的抗生素，因此約10-60％的S.aureus是從醫(yī)院里分離的；尤其令人憂慮的是，MRSA菌株對(duì)治療葡萄球菌感染最為有效的抗生素——萬古霉素的敏感性日益降低，這些對(duì)萬古霉素不敏感的金黃色葡萄球菌菌株的出現(xiàn)使人們產(chǎn)生了金葡菌不能治愈的恐懼感，因此必須尋找到一種有效的治療方法。
除了真核細(xì)胞外，各種病原性細(xì)菌也是通過細(xì)胞表面的細(xì)胞外結(jié)合基質(zhì)(extracellular-matrix，ECM)結(jié)合分子與宿主的ECM發(fā)生特定的相互作用。病原性細(xì)菌的ECM結(jié)合分子屬一組蛋白，被稱為黏附素或是能夠識(shí)別黏附基質(zhì)的細(xì)胞表面組分(MSCRAMMs)；它們與ECM的相互作用被認(rèn)為是細(xì)菌感染的先決條件(1.Juliano RL，Haskill S.Signal transduction from theextracellular matrix.J Cell Biol.1993，120(3)，577-85.2.Yamada KM.Adhesiverecognition sequences.J Biol Chem.1991，266(20)，12809-12.)，否則細(xì)菌就無法定居和繁殖，也不能產(chǎn)生和釋放胞外酶和外毒素。黏附雖非直接導(dǎo)致組織受損，但對(duì)組織的選擇和疾病的嚴(yán)重程度卻有重要的影響。金葡菌的黏附素除介導(dǎo)細(xì)菌黏附外，還賦予細(xì)菌逃避宿主防御機(jī)制的功能。這主要是通過這些黏附素，將機(jī)體的可溶性ECM(如纖維粘連素、血纖維蛋白)大量結(jié)合在細(xì)菌的表面，使細(xì)菌菌體完全被宿主ECM包被，從而不被宿主的免疫系統(tǒng)所識(shí)別，這對(duì)金葡菌感染的結(jié)果亦有重要影響。這些蛋白的共同特征是均為細(xì)菌表面的蛋白成分，具相似的結(jié)構(gòu)，不形成菌毛等特殊附件；它們所結(jié)合的宿主成分皆為ECM；且金葡菌的細(xì)胞外結(jié)合基質(zhì)蛋白與ECM的作用系為蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)的相互作用，無碳水化合物參與。為了感染宿主，病菌必須緊緊“貼牢”組織以克服外力對(duì)其移動(dòng)。它們除了應(yīng)用非特異性的疏水力及靜電引力與宿主結(jié)合外，其表面蛋白與ECM及血漿蛋白還具有特異的親合力。這些蛋白通常被稱作細(xì)胞外結(jié)合基質(zhì)蛋白(ECMBPs)，雖然它們之中的一些結(jié)合血漿蛋白而不與基質(zhì)結(jié)構(gòu)相聯(lián)系。
金葡菌可表達(dá)數(shù)種細(xì)胞外結(jié)合基質(zhì)蛋白(ECMBPs)，這些蛋白均定位于金葡菌細(xì)胞表面，具革蘭氏陽性菌表面分子的特征。它們均能識(shí)別機(jī)體ECM成員，并發(fā)生特異性結(jié)合，并依此介導(dǎo)金葡菌黏附于宿主組織。盡管ECM在正常情況下一般不暴露，但當(dāng)組織器官被機(jī)械作用或化學(xué)物質(zhì)損傷后，ECM暴露出來，則金葡菌黏附其上，并導(dǎo)致感染。此外，在不同動(dòng)物中，ECM的結(jié)構(gòu)相當(dāng)保守，故金葡菌能黏附于不同動(dòng)物的各種組織，而無明顯的宿主特異性及組織傾向性。
S.aureus的分離物一個(gè)基本的特征是纖連蛋白的結(jié)合特性。許多菌株表達(dá)兩種相關(guān)的纖連蛋白結(jié)合蛋白，F(xiàn)nBPA及FnBPB；二者是由兩個(gè)相近的基因編碼的(Greene C，McDevitt D，F(xiàn)rancois P，Adhesion properties of mutants ofStaphylococcus aureus defective in fibronectin-binding proteins and studies on theexpression of fnb genes.Mol Microbiol.1995，17(6)，1143-52.)。通過同源突變體及重組的蛋白片段表明，這些蛋白介導(dǎo)細(xì)菌黏附到體內(nèi)的纖連蛋白及介導(dǎo)S.aureus的細(xì)胞壁黏附到血漿凝塊及做為體外的生物材料去黏附宿主。因此，對(duì)于感染初期來說它們是重要的因素。膠原蛋白結(jié)合蛋白Cna介導(dǎo)細(xì)菌黏附到膠原蛋白及成膠(collagenous)的組織。Cna的存在對(duì)于S.aureus細(xì)胞在體外黏附于軟骨是足夠的，也是必需的，抗Cna的抗體抑制細(xì)菌與膠原蛋白的結(jié)合及阻止細(xì)菌黏附于軟骨。
最近的葡萄球菌病的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，基于葡萄球菌細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合蛋白的重組蛋白疫苗對(duì)機(jī)體更具保護(hù)作用(1.rennermalm A，Li YH，BohaufsL，et al.Antibodies against a truncated Staphylococcus aureus fibronectin-bindingproteins protect against dissemination of infection in therat.Vaccine，2001，19(25-26)3376.2.Lee JC.Development of anti-Staphylococcalvaccines.Curr.Infect.Dis.2001，3(6)517-524.)。
但是，但目前為止，尚未見到纖連蛋白結(jié)合蛋白FnBP與膠原蛋白結(jié)合蛋白Cna的融合蛋白的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開了一種融合蛋白，該融合蛋白為金黃色葡萄球菌表面蛋白膠原蛋白結(jié)合can與纖連蛋白結(jié)合蛋白fnb的融合蛋白。
本發(fā)明還公開了金黃色葡萄球菌表面蛋白的融合蛋白的制備方法，該方法包括如下步驟首先是制備金黃色葡萄球菌表面蛋白cna和fnb的編碼基因，制備方法可以通過PCR方法，以金黃色葡萄球菌為模板擴(kuò)增獲得；然后以制備的cna和fnb的編碼基因?yàn)槟０澹ㄟ^重疊引物延伸PCR技術(shù)擴(kuò)增，將fnb和cna基因連接起來，獲得金黃色葡萄球菌表面蛋白的融合蛋白的編碼基因，將該基因克隆進(jìn)表達(dá)載體進(jìn)行金黃色葡萄球菌表面蛋白的融合蛋白的表達(dá)。表達(dá)方式可以選用融合表達(dá)或非融合表達(dá)，優(yōu)選融合表達(dá)方式。
所用的表達(dá)載體可以是原核表達(dá)載體或真核表達(dá)載體，優(yōu)選pET-32a(+)表達(dá)載體，將金黃色葡萄球菌表面蛋白fnb和can編碼基因通過重疊引物PCR法連接起來，置于與載體pET-32a(+)表達(dá)的硫氧還蛋白(Thioredoxin protein，Trx)之后，以融合蛋白的形式獲得可溶性高水平表達(dá)。
表達(dá)后的融合蛋白進(jìn)行純化，純化方法可以采用親和層析，優(yōu)選采用金屬螯和介質(zhì)親和層析。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示獲得了金黃色葡萄球菌表面蛋白can-fnb基因在大腸桿菌中的融合表達(dá)蛋白。
本發(fā)明還公開了金黃色葡萄球菌表面蛋白的融合蛋白在制備金黃色葡萄球菌疫苗中的應(yīng)用。
將純化后的融合蛋白進(jìn)行蛋白免疫效應(yīng)試驗(yàn)研究。首先制備金葡菌表面蛋白的融合蛋白疫苗，免疫動(dòng)物，然后進(jìn)行動(dòng)物的體液免疫功能的測(cè)定、脾淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、抗體介導(dǎo)的調(diào)理吞噬作用和免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明的融合蛋白較好地保持了其天然結(jié)構(gòu)，具有較高的免疫原性。
本發(fā)明的融合蛋白可以增強(qiáng)金黃色葡萄球菌表面蛋白fnb和cna編碼基因的表達(dá)功能，提高免疫原性，提高疫苗保護(hù)范圍，在新型疫苗的研究中具有重要的價(jià)值。到目前為止，本發(fā)明的融合蛋白在國內(nèi)外尚未見到相關(guān)報(bào)道。


圖1為fnb、cna基因PCR擴(kuò)增圖譜。其中1fnb基因(345bp)PCR擴(kuò)增條帶；2cna基因(1509bp)PCR擴(kuò)增條帶；M為DNA marker DL2000，大小從上到下依次為2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp.
圖2為fnb-T、cna-T重組質(zhì)粒酶切圖譜，其中1pET-32a(+)；2pET-32a(+)(BamH I和Xhol I雙酶切)；MDNA marker DL2000；3cna-T質(zhì)粒(BamH I和Xhol I雙酶切)；4fnb-T質(zhì)粒(BamH I和Hind III雙酶切)。
圖3為表達(dá)質(zhì)粒trx-fnb-pET-32a(+)雙酶切鑒定圖譜，其中MDNA marker DL2000，1pET-32a(+)；2質(zhì)粒trx-fnb-pET-32a(+)(BamH I/Hind III)；3質(zhì)粒trx-fnb-pET-32a(+)(Nde I/Hind III)圖4為表達(dá)質(zhì)粒trx-cna-pET-32a(+)雙酶切鑒定圖譜，其中MDNA marker DL2000，1cna基因，2trx-cna-pET-32a(+)雙酶切鑒定，3質(zhì)粒trx-cna-pET-32a(+)圖5為trx-fnb-pET-32a(+)重組菌IPTG誘導(dǎo)表達(dá)SDS-PAGE圖譜，其中1pET-32a(+)誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果；2trx-fnb-pET-32a(+)重組菌IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的全菌SDS-PAGE；3trx-fnb-pET-32a(+)重組菌誘導(dǎo)表達(dá)的全菌超聲破碎后上清；4trx-fnb-pET-32a(+)重組菌誘導(dǎo)表達(dá)的全菌超聲破碎后沉淀；M標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白，大小依次為97000Da，66000Da，45000Da，30000Da，20100Da，14000Da。
圖6為trx-fnb-pET-32a(+)重組菌IPTG誘導(dǎo)表達(dá)SDS-PAGE薄層掃描分析，圖中峰10為目的蛋白峰。
圖7為trx-cna-pET-32a(+)重組菌IPTG誘導(dǎo)表達(dá)SDS-PAGE分析，其中1trx-cna-pET-32a(+)重組菌誘導(dǎo)表達(dá)的全菌超聲破碎后沉淀；2trx-cna-pET-32a(+)重組菌誘導(dǎo)表達(dá)的全菌超聲破碎后上清；3trx-fnb-pET-32a(+)重組菌IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的全菌SDS-PAGE；4；pET-32a(+)誘導(dǎo)表達(dá)的全菌超聲破碎后上清；5pET-32a(+)誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果；M標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白，大小依次為97000Da，66000Da，45000Da，30000Da，20100Da，14000Da。
圖8為trx-cna-pET-32a(+)重組菌IPTG誘導(dǎo)表達(dá)SDS-PAGE薄層掃描分析，圖中峰3為目的蛋白峰。
圖9為Trx-FnBP蛋白純化的SDS-PAGE圖10為Trx-cna蛋白純化的SDS-PAGE圖11為Cna蛋白純化的SDS-PAGE圖12為Cna蛋白純化的FPLC色譜13為PCR擴(kuò)增結(jié)果，其中1Cna+fnb基因；2fnb基因；3cna基因；M為DNA marker DL2000，大小從上到下依次為2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp。
圖14為Cna+fnb-T質(zhì)粒的酶切鑒定圖譜，其中MDNA marker DL2000；1pET-32a(+)質(zhì)粒；2pET-32a(+)質(zhì)粒BamHI和Xhol I雙酶切；3Cna+fnb-T質(zhì)粒BamH I和Xhol I雙酶切；4Cna+fnb-T質(zhì)粒。
圖15為Cna+fnb-pET-32a(+)質(zhì)粒的酶切鑒定圖譜，其中1Cna+fnb-pET-32a(+)質(zhì)粒(BamH I和Xhol I雙酶切)；M為DNA markerDL2000；2pET-32a(+)質(zhì)粒；3Cna+fnb-pET-32a(+)質(zhì)粒。
圖16為Cna-fnBP蛋白的表達(dá)SDS-PAGE分析，其中M標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白，大小依次為97000Da，66000Da，45000Da，30000Da，20100Da，14000Da；1重組菌誘導(dǎo)表達(dá)的全菌超聲破碎后沉淀；2重組菌誘導(dǎo)表達(dá)的全菌超聲破碎后上清；3重組菌IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的全菌；4pET-32a(+)誘導(dǎo)表達(dá)的全菌超聲破碎后上清；5pET-32a(+)誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果。
圖17為Cna+fnb-pET-32a(+)重組菌IPTG誘導(dǎo)表達(dá)SDS-PAGE薄層掃描分析，圖中峰3為目的蛋白峰。
圖18為Cna-fnBP蛋白純化的FPLC色譜19為Cna-fnBP蛋白純化的SDS-PAGE圖20為小鼠免疫后第2周效價(jià)測(cè)定結(jié)果(n＝8，包被Trx-FnBP蛋白)圖21為小鼠免疫后第2周效價(jià)測(cè)定結(jié)果(n＝8，包被Trx-Cna蛋白)圖22為小鼠免疫后第4周效價(jià)測(cè)定結(jié)果(n＝8，包被Trx-FnBP蛋白)圖23為小鼠免疫后第4周效價(jià)測(cè)定結(jié)果(n＝8，包被Trx-Cna蛋白)圖24為FN組小鼠免疫后第6周效價(jià)測(cè)定結(jié)果(包被Trx-FnBP蛋白)圖25為CN組小鼠免疫后第6周效價(jià)測(cè)定結(jié)果(包被Trx-Cna蛋白)圖26.1為CN-FN group小鼠免疫后第6周效價(jià)測(cè)定結(jié)果(包被Trx-FnBP蛋白)圖26.2為CN-FN group小鼠免疫后第6周效價(jià)測(cè)定結(jié)果(包被Trx-Cna蛋白)圖27為各免疫組小鼠各次免疫后抗體滴度變化圖28為Fn組小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖變化圖29為CN組小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖變化圖30為CN-FN組小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖圖31為各組小鼠NBT test結(jié)果圖32Western Blot結(jié)果，其中左為Trx-Cna蛋白；右為Cna-fnBP蛋白圖33Western Blot結(jié)果，其中左為Cna蛋白；右為FnBP蛋白具體實(shí)施方式
實(shí)施例一金黃色葡萄球菌表面蛋白cna，fnb基因在大腸桿菌中的克隆表達(dá)、純化一、材料1、菌株金黃色葡萄球菌(S.aureus)FRI1169為國際標(biāo)準(zhǔn)株，市購。
2、載體與宿主菌克隆載體PMD 18-T Vector為Takara公司產(chǎn)品、表達(dá)載體pET-32a(+)Vecter為Novagen產(chǎn)品，大腸桿菌DH5α，大腸桿菌BL21(DE3)為Stratagene產(chǎn)品。
3、培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基，按常規(guī)方法配制。
4、工具酶內(nèi)切酶BamH I，Nde I，Hind III，Xho I；連接酶Ligation SolusionI均為Takara公司產(chǎn)品。
5、主要試劑及試劑盒PCR試劑購自上海Sangon，X-gal，IPTG，DNAMarker DL2000為Takara公司產(chǎn)品，瞇唑?yàn)镼IAGEN產(chǎn)品，十二烷基硫酸鈉(SDS)為SIGMA產(chǎn)品，丙烯酰胺，N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺，低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白為Amersham Biosciences產(chǎn)品，Wizard Plus SV Minipreps DNAPurification System為Promega公司產(chǎn)品，DNA片段玻璃奶回收試劑盒為北京博大科技產(chǎn)品。其他試劑均為分析純，市購。
6、常用緩沖液TE，TAE，5*Tris-甘氨酸緩沖液，PBS，6×DNA加樣緩沖液，SDS-PAGE凝膠染液，SDS-PAGE凝膠脫色液，Lysis Buffer，WashBuffer，Elution Buffer，蛋白轉(zhuǎn)移緩沖液，Wester blotting溶液等均按照文獻(xiàn)(J.薩姆布魯克，D.W.拉塞爾著.黃培堂等譯.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[M].北京科學(xué)出版社.)配制。
7、儀器(1)PCR儀GeneAmp PCR System 2400，PERKIN ELMER(2)高速低溫離心機(jī)AllegraTM 21R Centrifμge，BECKMANCOMLTER(3)聚丙烯酰胺凝膠電泳儀為BIORAD產(chǎn)品(4)酶聯(lián)免疫吸附儀SPECTRA MAX PLUS，軟件為MR4 PLUSELISA-FLEXTM(5)蛋白純化分析儀AKTA FPLC，Amersham Pharmacia Biotech(6)低溫凍干機(jī)FREEZE DRY SYSTEM，LABCONCOR(7)ST-1型半干式轉(zhuǎn)移電泳槽，大連競(jìng)邁生物科技公司二、方法1、引物的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)NCBI已發(fā)表的S.aureus的編碼基因序列，使用DNAClub軟件輔助分別設(shè)計(jì)了fnb，cna gene引物，由上海博亞生物技術(shù)公司合成。引物序列為fnb up5’-GCGGATCCCATATGGGCCAAAATAGCGGTAAC-3’fnb down5’-GCAAGCTTTAAGCTTACTTTTGGAAGTGT-3’cna up5’-GCGGATCCCATATGGCACGAGATATTTCATCA-3’cna down5’-GCCTCGAGTTAGATTGGTTTTTCAGTATTAG-3’其中GGATCC為BanH I酶切位點(diǎn)，CATATG為Nde I酶切位點(diǎn)，AAGCTT為Hind III酶切位點(diǎn)，CTCGAG為Xhol I酶切位點(diǎn)。
2、PCR模板DNA的獲取用接種環(huán)刮取S.aureus菌落于100μl生理鹽水中，沸水中煮10min，再冰浴5min，如此反復(fù)幾次，該液可作為PCR模板使用。
3、PCR擴(kuò)增目的基因擴(kuò)增條件為98℃預(yù)變性10min。94℃變性30s，45℃退火30s，72℃延伸45s，30個(gè)循環(huán)。72℃延伸10min。1％瓊脂糖凝膠電泳檢查擴(kuò)增產(chǎn)物。
4、cna/fnb重組克隆質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定(1)cna/fnb PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(180v，6min)。
(2)使用北京博大公司DNA片段玻璃奶回收試劑盒回收目的DNA片段。
(3)回收的cna/fnb PCR產(chǎn)物連接克隆載體PMD 18-T Vector，連接條件為16℃，1-2hr。
(4)感受態(tài)細(xì)胞的制備采用CaCl2法。
(5)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞。
(6)重組子的篩選(α-互補(bǔ))和鑒定挑取平板上生長(zhǎng)的白色菌落進(jìn)行PCR鑒定，PCR條件為98℃預(yù)變性10min。94℃變性30s，45℃退火30s，72℃延伸45s，25個(gè)循環(huán)。72℃延伸10min。1％瓊脂糖凝膠電泳檢查擴(kuò)增產(chǎn)物。
接種經(jīng)PCR鑒定為陽性的菌落于含氨芐青霉素(100μg/ml)的LB培養(yǎng)基中，37℃水浴搖床培養(yǎng)過夜，按WizardPlus SV Minipreps DNA PurificationSystem試劑盒方法提取質(zhì)粒。重組質(zhì)粒命名為fnb-T，cna-T。
(7)重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定對(duì)fnb-T質(zhì)粒用Nde I和Hind III以及BamHI和Hind III進(jìn)行雙酶切鑒定。對(duì)cna-T質(zhì)粒用Nde I和Xhol I以及BamH I和Xhol I進(jìn)行雙酶切鑒定。酶切條件37℃ 3-4hr。1％瓊脂糖凝膠電泳檢查酶切產(chǎn)物。
(8)測(cè)序挑選PCR、酶切鑒定結(jié)果為陽性的重組菌，提取并純化質(zhì)粒測(cè)序。測(cè)序引物為M13 primers，由上海博亞生物技術(shù)公司測(cè)序。
5、重組表達(dá)質(zhì)粒fnb-pET-32a(+)，cna-pET-32a(+)的構(gòu)建(1)上述酶切的重組質(zhì)粒進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分離后，使用北京博大公司DNA片段玻璃奶回收試劑盒進(jìn)行回收。同時(shí)對(duì)表達(dá)載體pET-32a(+)進(jìn)行相應(yīng)位點(diǎn)的雙酶切。各酶切體系在37℃恒溫水浴鍋內(nèi)反應(yīng)3-4hr。1％瓊脂糖凝膠電泳檢查酶切產(chǎn)物。使用北京博大公司DNA片段玻璃奶回收試劑盒進(jìn)行回收。
(2)連接將酶切好的fnb-T質(zhì)粒和cna-T質(zhì)粒與酶切好的相應(yīng)的表達(dá)載體pET-32a(+)連接，16℃ 1-2hr。
(3)轉(zhuǎn)化取5μl連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入200u E.coli BL21(DE3)感受態(tài)。取200μl涂布含氨芐青霉素(100μg/ml)的LB平板。
(4)重組子的篩選和鑒定逐一挑取平板上生長(zhǎng)的菌落作為模板進(jìn)行PCR鑒定。接種PCR鑒定為陽性的菌落于LB培養(yǎng)基(含氨芐青霉素100μg/ml)中，37℃搖床培養(yǎng)過夜，按WizardPlus SV Minipreps DNA Purification System試劑盒方法提取質(zhì)粒。分別進(jìn)行相應(yīng)的雙酶切鑒定。
6、重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)將重組菌落接種于5ml LB培養(yǎng)基(含氨芐青霉素100μg/ml)中，37℃搖床培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)前期(OD值約為0.6)，加入1mol/l IPTG誘導(dǎo)3-4hr。取適量菌液離心集菌后進(jìn)行SDS-PAGE分析表達(dá)情況。fnb基因表達(dá)的蛋白命名為纖維粘連蛋白FnBP(fibronectin-binding protein)，cna基因表達(dá)的蛋白命名為膠原結(jié)合蛋白Cna(collagen-binding protein)。
表達(dá)的蛋白均在破碎上清中，這就使蛋白純化較為簡(jiǎn)便，進(jìn)行大量培養(yǎng)，準(zhǔn)備純化。
7、SDS-PAGE蛋白電泳取培養(yǎng)好的菌液1.5mL，以8000rpm室溫離心5分鐘集菌，棄上清，200μl純水懸起沉淀，取25μl懸浮液加入25μl 2×SDS凝膠加樣緩沖液，煮沸10分鐘，取20μl進(jìn)行SDS-PAGE分析。電壓180V，約1-2hr。
進(jìn)行染色、脫色。對(duì)凝膠染色30分鐘后，脫色1小時(shí)后進(jìn)行分析。
8、表達(dá)蛋白的純化-Ni-NTA親和層析。
(1)新Ni柱的預(yù)處理①用至少1倍柱體積的去離子水洗柱；②用2倍體積的100mM NiSO4洗柱；③用2倍柱體積的去離子水洗柱；(2)純化過程①用5倍柱體積的Lysis buffer平衡柱子，流速2mL/min；②將所集菌用Lysis buffer懸起，超聲破碎(超聲破碎30次，聲20s，間隔10s)后，4℃，8000，離心15，收集上清；將上清用Lysis buffer進(jìn)一步稀釋后，分3-5次上樣，并收集穿透液；③使用5-10倍柱體積的Lysis buffer洗柱，收集洗液；④使用5-10倍柱體積的Wash buffer洗柱，收集洗液；⑤使用5-10倍柱體積的Elution buffer洗脫蛋白，每2mL收集1管，做好標(biāo)記；⑥將所收集樣品使用SDS-PAGE檢測(cè)。
(3)純化完后，依次用15L 0.2M乙酸，15mL 30％甘油，15mL純水，15mL30％乙醇處理。最后用乙醇3保存于備用。
9、蛋白定量(1)BCA法蛋白定量使用PIERCE公司的BCATMProtein Assay Kit操作。
(2)雙波長(zhǎng)法樣品稀釋后，測(cè)280nm和260nm的OD值。代入公式(1.55×OD280-0.75×OD260)*稀釋倍數(shù)10、純化后的蛋白使用低溫凍干機(jī)FREEZE DRY SYSTEM，LABCONCOR凍干制成成品，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)備用。
三、結(jié)果1、金葡球菌表面蛋白cna，fnb基因在大腸桿菌中的克隆表達(dá)、純化結(jié)果(1)目的基因的擴(kuò)增提取S.aureus的染色體DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物行1％瓊脂糖凝膠電泳。fnb基因360bp處有一致密斑；cna基因在1500bp左右有一致密斑。二者與預(yù)期結(jié)果一致(圖1)。
(2)fnb-T質(zhì)粒，cna-T質(zhì)粒的構(gòu)建瓊脂糖凝膠電泳回收(玻璃奶回收)fnb、cna基因片段，與克隆載體PMD18-T Vector連接。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布含X-gal和IPTG的LB平板(含氨卞)。37℃培養(yǎng)過夜后，挑取白色菌落作為模板進(jìn)行PCR鑒定。為陽性的菌落提取fnb-T質(zhì)粒后用BamH I和Hind III進(jìn)行雙酶切；cna-T質(zhì)粒用BamH I和Xhol I進(jìn)行雙酶切。行1％瓊脂糖凝膠電泳(圖2)。
3、序列測(cè)定挑選cna-T其中一個(gè)經(jīng)鑒定為陽性的重組菌落，提取質(zhì)粒，純化后以通用引物M13primers進(jìn)行DNA測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果合并，得出cna基因的序列。cna基因全長(zhǎng)1509bp，編碼503個(gè)氨基酸。將測(cè)序結(jié)果提交NCBI(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)進(jìn)行同源性檢索(advanced BLAST)分析，斷定獲得了cna基因。
挑選fnb-T其中一個(gè)經(jīng)鑒定為陽性的重組菌落，提取質(zhì)粒，純化后以通用引物M13 primers進(jìn)行DNA測(cè)序。fnb基因全長(zhǎng)345bp，編碼115個(gè)氨基酸。將測(cè)序結(jié)果提交NCBI進(jìn)行同源性檢索(advanced BLAST)分析，斷定獲得了fnbB基因。
4、表達(dá)質(zhì)粒trx-fnb-pET-32a(+)，trx-cna-pET-32a(+)的構(gòu)建分別用Nde I，Hind III及BamH I，Hind III雙酶切pET-32a(+)和fnb-T質(zhì)粒后。酶切產(chǎn)物連接后，轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)感受態(tài)。過夜培養(yǎng)后，挑取平板上生長(zhǎng)的菌落，進(jìn)行PCR鑒定。分別挑取陽性結(jié)果提取質(zhì)粒(trx-fnb-pET-32a(+)質(zhì)粒)，進(jìn)行相應(yīng)位點(diǎn)的雙酶切鑒定(圖3)。
分別用Nde I，Xhol I及BamH I，Xhol I雙酶切pET-32a(+)和cna-T質(zhì)粒后。酶切產(chǎn)物連接后，轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)感受態(tài)。過夜培養(yǎng)后，挑取平板上生長(zhǎng)的菌落，進(jìn)行PCR鑒定。分別挑取陽性結(jié)果提取質(zhì)粒(trx-cna-pET-32a(+)質(zhì)粒)，進(jìn)行相應(yīng)位點(diǎn)的雙酶切鑒定(圖4)。
5、重組trx-fnb-pET-32a(+)，trx-cna-pET-32a(+)的表達(dá)接種含trx-fnb-pET-32a(+)，trx-cna-pET-32a(+)的工程菌于LB培養(yǎng)基(含氨芐青霉素100μg/ml)中，37℃搖床培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后加入1mol/lIPTG誘導(dǎo)3-4hr。取1ml培養(yǎng)液行SDS-PAGE蛋白電泳，結(jié)果顯示用BamH I，Hind III雙酶切的trx-fnb-pET-32a(+)重組菌出現(xiàn)一條新增的蛋白帶，而誘導(dǎo)后的pET-32a(+)載體菌則無此蛋白帶產(chǎn)生(圖5)。經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)的全菌超聲破碎后離心，分離上清、沉淀后SDS-PAGE蛋白電泳顯示，目的蛋白主要以可溶形式分泌表達(dá)。
trx-fnb-pET-32a(+)重組菌IPTG誘導(dǎo)表達(dá)SDS-PAGE分析結(jié)果顯示，重組菌獲得高的蛋白表達(dá)量，經(jīng)薄層掃描分析可知目的蛋白的表達(dá)量占全菌蛋白總量的52.8％(圖6)。
用BamH I、Xho I雙酶切的trx-cna-pET-32a(+)重組菌在分子量約處出現(xiàn)一條新增的蛋白帶，而誘導(dǎo)后的pET-32a(+)載體菌則無此蛋白帶產(chǎn)生(圖7)。
trx-cna-pET-32a(+)重組菌IPTG誘導(dǎo)表達(dá)SDS-PAGE分析結(jié)果顯示，重組菌獲得高的蛋白表達(dá)量，經(jīng)薄層掃描分析可知目的蛋白的表達(dá)量占全菌蛋白總量的58.8％(圖8)。
6、蛋白純化結(jié)果
Trx-FnBP蛋白和Trx-cna蛋白使用蛋白純化分析儀KTA FPLC。進(jìn)行Ni-NTA親和層析(HiTrap Chelating HP)。使用Lysis Buffer(50mMNaH2PO4.2H2O，300mM NaCL，20mM咪唑用NaOH調(diào)pH至8.0)平衡柱子后；用Wash Buffer(50mM NaH2PO4，300mM NaCL，20mM咪唑，用NaOH調(diào)pH至8.0)和Elution Buffer(50mM NaH2PO4.2H2O，300mM NaCL，250mM咪唑，用NaOH調(diào)pH至8.0)做線形洗脫，收集蛋白峰，進(jìn)行SDS-PAGE分析純化效果(圖9，10)。
cna蛋白使用蛋白純化分析儀KTA FPLC，進(jìn)行離子交換層析(QSepharose HP)。緩沖液為，A5mM Tris-Hcl，pH8.4；B5mMTris-Hcl，5M的Nacl.以5ml/s的流速做線形洗脫，收集蛋白峰，進(jìn)行SDS-PAGE分析純化效果(圖11，12)。
7、純化蛋白的定量經(jīng)純化的蛋白BCA法蛋白定量(使用PIERCE公司的BCATMProtein AssayKit)結(jié)果為Trx-FnBP蛋白可達(dá)1.25mg/ml和Trx-cna蛋白可達(dá)2mg/ml。
實(shí)施例二 金黃色葡萄球菌表面蛋白cna-fnb基因在大腸桿菌中的融合表達(dá)一、材料1、目的基因含cna，fnb基因的fnb-T質(zhì)粒，cna-T質(zhì)粒。
2、載體與宿主菌克隆載體PMD 18-TVector(為Takara公司產(chǎn)品)、表達(dá)載體pET-32a(+)Vecter(為Novagen產(chǎn)品)，大腸桿菌DH5α為本室保存，大腸桿菌BL21(DE3)(為Stratagene產(chǎn)品)。
3、引物cna up5’-GCGGATCCCATATGGCACGAGATATTTCATCA-3’4、工具酶內(nèi)切酶BamH I，Nde I，Xhol I；連接酶Ligation Solusion I均為Takara公司產(chǎn)品。
5、緩沖液及PCR試劑同實(shí)施例一。
二、方法1、引物的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)NCBI已發(fā)表的S.aureus的cna，fnb編碼基因序列，使用DNAClub軟件輔助分別設(shè)計(jì)了三條引物，由上海博亞生物技術(shù)公司合成。引物序列為cna up5’-GCGGATCCCATATGGCACGAGATATTTCATCA-3zh15’-GATTGGTTTTTCAGTATTAG-3’zh25’-CTAATACTGAAAAACCAATCGGCCAAAATAGCGGTAAC-3’zh35’-GCCTCGAGTTAGCTTACTTTTGGAAGTGT-3’其中GGATCC為BamH I酶切位點(diǎn)，CATATG為Nde I酶切位點(diǎn)。zh1和zh2中的黑體部分為反向互補(bǔ)序列，用于將cna，fnb基因連接起來。
2、重疊引物延伸PCR(1)以S.aureus J72為模板，以cna up和zh1為引物PCR法獲得cna基因片段。PCR反應(yīng)條件為98℃預(yù)變性10min。94℃變性60s，45℃退火60s，72℃延伸60s，30個(gè)循環(huán)。72℃延伸10min。1％瓊脂糖凝膠電泳檢查擴(kuò)增產(chǎn)物。使用北京博大公司DNA片段玻璃奶回收試劑盒回收DNA目的片段。
(2)以S.aureus J72為模板，以zh2和zh3為引物PCR法獲得fnb基因片段。PCR反應(yīng)條件為98℃預(yù)變性10min。94℃變性60s，45℃退火60s，72℃延伸60s，30個(gè)循環(huán)。72℃延伸10min。1％瓊脂糖凝膠電泳檢查擴(kuò)增產(chǎn)物。使用北京博大公司DNA片段玻璃奶回收試劑盒回收DNA目的片段。
(3)以上述兩輪PCR的回收產(chǎn)物為模板，以cna up和zh3為引物擴(kuò)增cna+fnb長(zhǎng)基因片段。PCR反應(yīng)條件為98℃預(yù)變性5min。94℃變性45s，45℃退火45s，72℃延伸45s，30個(gè)循環(huán)。72℃延伸10min。1％瓊脂糖凝膠電泳檢查擴(kuò)增產(chǎn)物。使用北京博大公司DNA片段玻璃奶回收試劑盒回收DNA目的片段。至此所的產(chǎn)物為cna+fnb長(zhǎng)基因片段。
3、回收的cna+fnb PCR產(chǎn)物連接克隆載體PMD 18-T Vector，連接條件16℃ 1-2hr。
4、轉(zhuǎn)化與篩選、鑒定連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞。重組菌經(jīng)α-互補(bǔ)篩選和PCR鑒定為陽性的提取質(zhì)粒、酶切鑒定后交上海博亞生物技術(shù)公司測(cè)序。
5、酶切經(jīng)測(cè)序?yàn)檎_的序列的重組質(zhì)粒和表達(dá)載體pET-32a(+)Vecter分別用BamH I，Xhol I和Nde I，Xhol I兩次雙酶切。體系同實(shí)施例一。
6、連接酶切的基因片段和相應(yīng)位點(diǎn)酶切的pET-32a(+)Vecter在16℃，LigationSolusion I(Takara公司)作用下連接2-3hr。體系同第一部分。
7、轉(zhuǎn)化與篩選、鑒定連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)感受態(tài)。重組菌經(jīng)PCR、酶切鑒定為陽性的提取質(zhì)粒、15％甘油保菌。
8、誘導(dǎo)表達(dá)將重組菌落接種于5ml LB培養(yǎng)基(含氨芐青霉素100μg/ml)中，37℃搖床培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)前期(OD值約為0.6)，加入1mol/l IPTG誘導(dǎo)3-4hr。取適量菌液離心集菌后進(jìn)行SDS-PAGE分析表達(dá)情況。Cna和fnb基因融合表達(dá)的蛋白命名為Cna-fnBP(Cna-fnb binding protein)。
9、蛋白純化大量誘導(dǎo)重組菌后，以4℃、6000rpm離心15分鐘集菌。用PBS懸起沉淀，超聲破碎儀(300W，30s，30次)破碎菌體，4℃、6000rpm、15分鐘離心分離上清和沉淀，SDS-PAGE蛋白電泳分析可見，目的蛋白主要以可溶形式分泌表達(dá)在上清中。
取分離的上清注射器上樣后(Chelatine Sepharose High performance金屬螯和介質(zhì)親和預(yù)裝柱；HiTrap Chelating，Amersham)，使用蛋白純化分析儀KTAFPLC(Amersham Pharmacia Biotech)。
使用Lysis Buffer(50mM NaH2PO4.2H2O，300mM NaCL，20mM咪唑用NaOH調(diào)pH至8.0)平衡柱子后；用Wash Buffer(50mM NaH2PO4，300mM NaCL，20mM咪唑，用NaOH調(diào)pH至8.0)和Elution Buffer(50mM NaH2PO4.2H2O，300mM NaCL，250mM咪唑，用NaOH調(diào)pH至8.0)做線形洗脫，收集蛋白峰，進(jìn)行SDS-PAGE分析純化效果。
10、純化后的蛋白BCA法蛋白定量(同前)。
11、純化后的蛋白使用低溫凍干機(jī)FREEZE DRY SYSTEM，LABCONCOR凍干制成成品，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)備用。
三、結(jié)果1、目的基因的擴(kuò)增提取S.aureusJ72染色體DNA作為模板，以cna up和zh1為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得cna基因，以zh2和zh3為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得fnb基因。擴(kuò)增產(chǎn)物行1％瓊脂糖凝膠電泳，分別在360bp和1500bp處有一致密斑，二者與預(yù)期結(jié)果一致(圖13)。以cna up和zh3為引物，上述PCR產(chǎn)物經(jīng)回收后作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得Cna+fnb基因。
2、Cna+fnb-T質(zhì)粒的構(gòu)建瓊脂糖凝膠電泳回收(玻璃奶回收)Cna+fnb基因片段，與克隆載體PMD18-T Vector連接。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布含X-gal和IPTG的LB平板(含氨卞)。37℃培養(yǎng)過夜后，挑取白色菌落作為模板進(jìn)行PCR鑒定。為陽性的菌落提取質(zhì)粒(Cna+fnb-T質(zhì)粒)后用BamH I和Xhol I進(jìn)行雙酶切(圖14)。結(jié)果表明，我們通過重疊引物延伸法成功地把cna基因和fnb基因連在一起，并連接到克隆載體PMD 18-T Vector。
3、序列測(cè)定及分析挑選Cna+fnb-T其中一個(gè)經(jīng)鑒定為陽性的重組菌落，提取質(zhì)粒，純化后以通用引物M13 primers進(jìn)行DNA測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果合并，得出Cna+fnb基因的序列。Cna+fnb基因全長(zhǎng)1854bp，編碼618個(gè)氨基酸。將測(cè)序結(jié)果提交NCBI(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)進(jìn)行同源性檢索(advancedBLAST)分析，確定為Can和fnb序列.
4、Cna+fnb-pET-32a(+)質(zhì)粒的構(gòu)建分別用Nde I，Hind III及BamH I，Hind III雙酶切pET-32a(+)和Cna+fnb-T質(zhì)粒后。酶切產(chǎn)物連接后，轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)感受態(tài)。過夜培養(yǎng)后，挑取平板上生長(zhǎng)的菌落，進(jìn)行PCR鑒定。分別挑取陽性結(jié)果提取質(zhì)粒(Cna+fnb-pET-32a(+)質(zhì)粒)，進(jìn)行相應(yīng)位點(diǎn)的雙酶切鑒定(圖15)。
5、Cna-fnBP蛋白的表達(dá)結(jié)果接種含Cna+fnb-pET-32a(+)質(zhì)粒的工程菌于LB培養(yǎng)基(含氨芐青霉素100μg/ml)中，37℃搖床培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后加入1Mol/l IPTG誘導(dǎo)3-4hr。取1ml培養(yǎng)液行SDS-PAGE蛋白電泳，結(jié)果顯示重組菌在分子量約97 000Da處出現(xiàn)一條新增的蛋白帶，而誘導(dǎo)后的pET-32a(+)載體菌則無此蛋白帶產(chǎn)生(圖16)。經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)的全菌超聲破碎后離心，分離上清、沉淀后SDS-PAGE蛋白電泳顯示，目的蛋白主要以可溶形式分泌表達(dá)。
Cna+fnb-pET-32a(+)質(zhì)粒的工程重組菌IPTG誘導(dǎo)表達(dá)SDS-PAGE分析結(jié)果顯示，重組菌獲得較高的蛋白表達(dá)量，經(jīng)薄層掃描分析可知目的蛋白的表達(dá)量占全菌蛋白總量的26.5％(圖17，峰3)。
6、Cna-fnBP蛋白的純化使用蛋白純化分析儀KTA FPLC。進(jìn)行Ni-NTA親和層析(HiTrapChelating HP)。使用Lysis Buffer(50mM NaH2PO4.2H2O，300mM NaCL，20mM咪唑用NaOH調(diào)pH至8.0)平衡柱子后；用Wash Buffer(50mM NaH2PO4，300mMNaCL，20mM咪唑，用NaOH調(diào)pH至8.0)和Elution Buffer(50mMNaH2PO4.2H2O，300mM NaCL，250mM咪唑，用NaOH調(diào)pH至8.0)做線形洗脫，收集蛋白峰，進(jìn)行SDS-PAGE分析純化效果(圖18，19)。
7、Cna-fnBP蛋白的定量結(jié)果為2.8mg/ml。
實(shí)施例三 Trx-FnBP、Cna、Trx-Cna、TrxCn-fnBP蛋白免疫效應(yīng)研究一、材料1、重組蛋白Trx-FnBP，Cna，Trx-Cna，Cna-FnBP蛋白為所純化蛋白透析后的低溫凍干制品。
2、免疫佐劑FREUND’S ADJUVANT Complete和FREUND’SADJUVANT Incomplete為SIGMA公司產(chǎn)品。
3、其它試劑MUCIN(Type IICrude；From Porcine Stomach)為SIGMA產(chǎn)品；Ficoll-paque為Pharmacia產(chǎn)品；CellTiter 96RAqueous Non-RadioactiveCell Proliferation Assay為Promega公司試劑盒；Thioglycolate Broth withResazurine為Fluka產(chǎn)品；羊抗小鼠IgG-HRP北京中山生物技術(shù)公司產(chǎn)品；ELISA試劑均為分析純。
4、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物5-6周昆明系二級(jí)雌性小鼠和Balb/c雌性小鼠均購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。
二、實(shí)驗(yàn)方法1、制備金葡菌蛋白疫苗凍干保存的Trx-FnBP，Cna，Trx-Cna，Cna-FnBP蛋白溶于PBS(0.03mol/l，pH7.2)，濃度為100μg/100μl。各蛋白100μl分別與100μl的FREUND’SADJUVANT Complete和FREUND’S ADJUVANT Incomplete佐劑充分混合乳化后用于動(dòng)物免疫。
2、小鼠免疫程序及劑量5-6周昆明系雌性小鼠或Balb/c雌性小鼠隨機(jī)分組。各組免疫三次(0、2、3周)劑量為100μg。第一次采用腹部皮下多位點(diǎn)注射(100μg蛋白/每只。弗氏完全佐劑乳化)；第二次采用腹腔注射(100μg蛋白/每只。弗氏不完全佐劑乳化)；第三次腹腔注射(100μg蛋白溶于PBS)。末次免疫后一周(第四周)采取實(shí)驗(yàn)樣品。
3、免疫小鼠體液免疫功能的測(cè)定各次免疫后(2、3、4周)斷尾采取血樣，間接ELISA法測(cè)定抗體效價(jià)(參見朱立平，陳學(xué)清主編.免疫學(xué)常用實(shí)驗(yàn)方法[M].北京人民軍醫(yī)出版社.)。
將1μg的Trx-FnBP，Cna，Trx-Cna，Cna-FnBP蛋白以100μl/孔包被ELISA板，4℃過夜→棄包被液，PBST 120μl/孔洗三次，3min/次→加入封閉液(PBST稀釋的3％BSA)，37℃封閉40min→棄封閉液，PBST 120μl/孔洗三次，3min/次→分別加入免疫血清(各組小鼠血清自1∶10進(jìn)行10倍梯度稀釋)，按100μl/孔加樣，37℃作用1hr→PBST 120μl/孔洗三次，3min/次→加入酶標(biāo)羊抗小鼠IgG(1∶1000稀釋)，37℃作用40min→PBST 120μl/孔洗四次，3min/次→加入A、B液顯色4min，加入2N H2SO4終止液→OD450nm測(cè)值。
4、免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)(1)脾細(xì)胞的制備末次免疫的Balb/c雌性小鼠一周后處死，無菌分離脾臟。脾臟經(jīng)篩網(wǎng)研磨后，擠出脾細(xì)胞，用RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液洗細(xì)胞兩次，再調(diào)整細(xì)胞數(shù)為5*106cell/ml。
(2)淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)(MTS法)(參見朱立平，陳學(xué)清主編.免疫學(xué)常用實(shí)驗(yàn)方法[M].北京人民軍醫(yī)出版社.)96孔細(xì)胞板每孔加入100μl細(xì)胞液→取各純化蛋白分別加入各孔中，使終濃度分別為40μg/ml、20μg/ml、10μg/ml、5μg/ml、2.5μg/ml、1.25μg/ml、0.65μg/ml(倍比稀釋)，每孔100μl，總體積為200μl/孔。置37℃、5％CO2孵箱72hr，并設(shè)細(xì)胞對(duì)照孔→各孔加入20μl顯色液(Promega公司CellTiter 96RAqueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay試劑盒)，孵育2.5hr→以RPMI-1640+20μl顯色液調(diào)零，590nm處測(cè)OD值。
5、抗體介導(dǎo)的調(diào)理吞噬作用中性粒細(xì)胞的調(diào)理吞噬作用(NBT test)(參見朱立平，陳學(xué)清主編.免疫學(xué)常用實(shí)驗(yàn)方法[M].北京人民軍醫(yī)出版社.)三名健康成人血清，加入5％的肝素防凝血。用3％的含葡聚糖鹽溶液，37℃作用30min以沉淀紅細(xì)胞。用Ficoll-paque(Pharmacia)密度梯度離心分離中性粒細(xì)胞，RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液洗細(xì)胞兩次，再調(diào)整細(xì)胞數(shù)為5*106cell/ml。經(jīng)抗體調(diào)理的細(xì)菌，可以刺激中性粒細(xì)胞。產(chǎn)生的超氧化物可以使無色的四作唑氮藍(lán)(NBT)降解成藍(lán)色甲(月贊)產(chǎn)物。
實(shí)驗(yàn)步驟為①20μl S.aureus strain S-6(1*109CFU)與30μl免疫血清(倍比稀釋1∶2至1∶32)混合，加入96孔細(xì)胞板，37℃孵育60min；②100μl新制的中性粒細(xì)胞(5*106cell/ml)和50μl 0.1％過濾除菌的NBT液共加入細(xì)胞孔，37℃孵育60min；③用50μl的0.5M HCl終止反應(yīng)；⑤甲(月贊)產(chǎn)物用1200rpm離心10min，小心吸棄細(xì)胞孔中液體200μl；再用DMSO 200μl/孔重懸；⑥540nm處測(cè)OD值。
6、免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)5-6周昆明系雌性小鼠，末次免疫后一周進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)。S.aureus strain S-6(5*107CFU，5％的MUCIN)(參見文獻(xiàn)Ali I.Fattom，Jawad Sarwar，Alberto Ortiz，et al.A Staphylococcus aureus capsular)，1ml/只，腹腔注射后，觀察保護(hù)率。各組存活小鼠四天后，活殺后取內(nèi)臟組織(心、肝、脾、肺和腎)做病理切片，行HE染色觀察病理變化。
7、Western Blot檢測(cè)目的蛋白(1)當(dāng)SDS-PAGE電泳即將結(jié)束時(shí)，用蒸餾水清洗石墨板；(2)帶上手套，切6張濾紙和1張硝酸纖維素膜。濾紙和膜的大小完全相等或小于凝膠，否則兩張濾紙的邊緣接觸會(huì)造成電流短路，達(dá)到大大降低轉(zhuǎn)移的效率；(3)把硝酸纖維膜漂浮于一盤去離子水面上，借毛細(xì)作用使膜從下往上濕潤后，將膜完沒于水中，浸泡5分鐘以除去濾膜上殘留的氣泡；(4)在一淺托盤中加入少量轉(zhuǎn)移緩沖液，把6張濾紙浸沒于其中；(5)安裝轉(zhuǎn)移電泳槽平放石墨電極的底座，此石墨板為陽極；在石墨板上放置3張經(jīng)轉(zhuǎn)移液浸泡過的濾紙，對(duì)齊后用一玻璃移液管在濾紙上面滾動(dòng)，以排除殘留氣泡；把硝酸纖維素濾膜放在濾紙堆上，要保證精確對(duì)齊，避免在濾紙與硝酸纖維素濾膜之間有氣泡；從電泳槽中取出SDS-PAGE凝膠，把凝膠轉(zhuǎn)移到一盤去離子水中略為漂洗一下，然后準(zhǔn)確平放于硝酸纖維素濾膜上，把凝膠左下腳至于硝酸纖維素濾膜的標(biāo)記角上，帶手套排除所有氣泡；把另一組的3張濾紙放在凝膠上方，同樣須確保各層精確堆齊并避免氣泡；將轉(zhuǎn)移電泳槽上蓋扣到石墨電極-轉(zhuǎn)移膜膠復(fù)合體上，連接電源，注意正負(fù)極，根據(jù)凝膠面積0.65-1.0mA/cm2接通電流，電轉(zhuǎn)移0.5-2h；斷開電源并拔出槽上插頭，逐一卸轉(zhuǎn)移裝置，取出凝膠進(jìn)行抗體標(biāo)記；將轉(zhuǎn)移完的硝酸纖維素膜以3％BSA/B液封閉過夜；棄封閉液，液洗滌3次，間隔5min/次；加入一抗anti-TSST-1(1∶500稀釋)，與硝酸纖維素膜室溫作用1小時(shí)；棄一抗，用洗滌5次，間隔5min/次；加入羊抗兔抗體(1∶1000稀釋)，室溫作用30分鐘；棄二抗，用洗滌5次，間隔5min/次；將3mg DAB加于5mLA+10μl H2O2，然后與硝酸纖維素膜充分反應(yīng)；以蒸餾水終止反應(yīng)，顯色觀察。
三、結(jié)果1、免疫Balb/c雌性小鼠血清抗體滴度變化5-6周Balb/c雌性小鼠，隨機(jī)分為四組(FN組、trx-CN組、CN+FN組和對(duì)照組)，每組8只。給藥情況FN組，Trx-FnBP蛋白；trx-CN組，Trx-Cna蛋白；CN+FN組，Trx-FnBP蛋白和Trx-Can蛋白各100μg/次；對(duì)照組，100μl PBS/次。各次免疫后(第2、3、4周)斷尾取血(各只小鼠血清混合)進(jìn)行ELISA測(cè)抗體效價(jià)。
(1)免疫小鼠第一次免疫后(第2周)血清抗體滴度測(cè)定(2003-4-14)見圖20，21(2)免疫小鼠第二次加強(qiáng)免疫后(第4周)血清抗體滴度測(cè)定(2003-4-28)見圖22，23(3)免疫小鼠第三次免疫后(第6周)血清抗體滴度測(cè)定(2003-5-15)見圖24-27。
2、免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)表1 Fn組小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖情況

成對(duì)t檢驗(yàn)P＝0.000249，表明用抗原FnBP分別刺激Fn組、Control組的脾淋巴細(xì)胞，二者增殖具有顯著性差異(P＜0.001)圖28表2 CN組小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖情況

圖29表3 CN-FN組小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖情況

圖303、中性粒細(xì)胞的調(diào)理吞噬作用健康三名成人血清，加入5％的肝素防凝血。用3％的含葡聚糖鹽溶液，37℃作用30min以沉淀紅細(xì)胞。用Ficoll-paque(Pharmacia)密度梯度離心分離中性粒細(xì)胞，RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液洗細(xì)胞兩次，再調(diào)整細(xì)胞數(shù)為5*106cell/ml。經(jīng)抗體(抗血清)調(diào)理的細(xì)菌，可以刺激中性粒細(xì)胞。產(chǎn)生的超氧化物可以使無色的四作唑氮藍(lán)(NBT)降解成藍(lán)色甲(月贊)產(chǎn)物。
圖314、免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)表4 免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)的有關(guān)參數(shù)

各組小鼠攻毒后，其存活率明顯高于對(duì)照組，初步表明我們所獲蛋白具有較好的保護(hù)效果。不過，由于樣本數(shù)少，還需增加樣本數(shù)目進(jìn)一步證實(shí)其效果。
5、Western Blot分析Trx-Cna、Trx-FnBP、Cna和融合Trx的Cna-fnBP蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離后，進(jìn)行膜轉(zhuǎn)印，進(jìn)行抗原抗體結(jié)合反應(yīng)。一抗為各組小鼠免疫抗血清。
圖32，3權(quán)利要求
1.一種金黃色葡萄球菌表面蛋白的融合蛋白，其特征在于是由金黃色葡萄球菌表面蛋白cna和fnb融合而成。
2.權(quán)利要求1所述的融合蛋白的制備方法，其特征在于包括如下步驟(1)金黃色葡萄球菌表面蛋白cna，fnb編碼基因的制備；(2)金黃色葡萄球菌表面蛋白的融合蛋白編碼基因的制備；(3)金黃色葡萄球菌表面蛋白的融合蛋白的表達(dá)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于采用重疊引物延伸PCR技術(shù)，將fnb和cna基因連接起來，制備金黃色葡萄球菌表面蛋白的融合蛋白編碼基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于表達(dá)融合蛋白所用載體為pET-32a(+)。
5.權(quán)利要求1所述的融合蛋白在制備金黃色葡萄球菌疫苗中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種金黃色葡萄球菌表面蛋白的融合蛋白，還公開了其制備方法及用途。本發(fā)明融合蛋白是由金黃色葡萄球菌表面蛋白cna，fnb融合而成，其制備方法包括金黃色葡萄球菌表面蛋白cna，fnb編碼基因的制備，融合蛋白編碼基因的制備，融合基因的表達(dá)等步驟。本發(fā)明的融合蛋白是可溶性蛋白，保持了天然蛋白的免疫原性。經(jīng)檢測(cè)該融合蛋白具有良好的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答的效果，擴(kuò)大了蛋白疫苗的保護(hù)范圍，可以防治絕大部分金黃色葡萄球菌引起的感染。
文檔編號(hào)A61K39/085GK1884299SQ20051007773
公開日2006年12月27日 申請(qǐng)日期2005年6月24日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月24日
發(fā)明者姜永強(qiáng), 鄭玉玲, 周宏 , 寧保安, 馬茹, 江華, 荊紅波 申請(qǐng)人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所