專利名稱：：阻斷官能化表面上的非特異性蛋白結(jié)合的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及阻斷(block)表面上的非特異性蛋白結(jié)合的方法。本發(fā)明還涉及生物傳感器表面，該表面已被單糖、二糖(例如海藻糖)、多糖(例如葡聚糖)或寡糖封閉(block)以防止非特異性蛋白結(jié)合(non-specificproteinbinding)。
背景技術(shù)：
：隨著人類基因組測(cè)序的完成，分子生物學(xué)的下一個(gè)重要的挑戰(zhàn)是了解DNA編碼的多種蛋白靶如何與其他蛋白、小分子藥物候選物以及多種酶和抑制劑相互作用。參見例如，Pandey&Mann，"Proteomicstostudygenesandgenomes,"TVa,歸，405，p.837-846，2000;LeighAnderson爭(zhēng)，"Proteomics:applicationsinbasicandappliedbiology,"Cw/rewfC/^'"/(wj5z'otecAwo/o^y，11,p.408-412，2000;Patterson,"Proteomics:theindustrializationofproteinchemistry,"C"/re,CJp^wVm/"腸敝^</柳，11，p.413-418，2000;MacBeath&Schreiber，"PrintingProteinsasMicroarraysforHigh-ThroughputFunctionDetermination,"5We"ce，289，p.1760-1763，2000;DeWHdt爭(zhēng)，"Antibodyarraysforhigh-throughputscreeningofantibody-antigeninteractions,"■/Vflrft/rei/(to^朋to^，18，p.989-994，2000,為此，能夠高靈敏度地同時(shí)鑒定和/或定量多種不同的生物分子相互作用的工具將用于藥物發(fā)現(xiàn)、蛋白質(zhì)組學(xué)和診斷學(xué)。此外，為使這些工具能夠被廣泛應(yīng)用，它們必須易于使用、購(gòu)買和操作的成本低廉并適用于各種各樣的分析物，所迷分析物包括例如多核苷酸、肽、小蛋白、抗體、甚至完整細(xì)胞。將靶分子固定在支持物表面上已成為生物學(xué)測(cè)定的發(fā)展過程中一個(gè)非常重要的方面.通常，生物學(xué)測(cè)定在微孔滴定板、顯微鏡栽玻片、試管、有機(jī)硅圓片(siliconewafers)或膜的表面上進(jìn)行。利用表面上的官能團(tuán)和靶分子官能團(tuán)之間的偶聯(lián)反應(yīng)將靶分子共價(jià)固定在表面上。在玻璃表面上進(jìn)行表面官能化的一種通用技術(shù)是用功能性珪烷進(jìn)行珪烷化。5Wae，^幼'o)"m,"wrfMetoZ-Ogaw/cy,p.88，GelestInc.出版，TuHytown，PA(2000),當(dāng)前可用的顯微鏡栽玻片形式的生物學(xué)測(cè)定表面例如CorningInc.(Corning,NY)生產(chǎn)的涂覆有GAPSH的栽玻片，TeleChemInternational,Inc(Sunnyvale,CA)提供的ArryitSuperAmine栽玻片，SigmaDiagnostics(StLouis，MO)提供的SILANE-PREF加胺官能化栽玻片，以及其他例子，據(jù)稱，SuperAmine栽玻片每im^提供5x1012個(gè)胺基團(tuán)。再如，尼龍支持物上已衍生脒的酰胺基用于在檢測(cè)特異性多核苷酸序列的雜交試驗(yàn)中固定DNA和RNA探針。參見美國(guó)專利4,806,546。微孔滴定板和試管形式的產(chǎn)品包括NalgeNuncInternational(Rochester,NY)提供的NucleoLink頂和CovaLink,僅存在于高分子支持物表面。CovaLinkTM產(chǎn)品提^H中胺表面，約1012個(gè)基團(tuán)/mm2表面積。在多種共軛反應(yīng)中，仲胺顯示出比伯胺更低的反應(yīng)性。參見，Loudon，G.Marc，OrganicChemistry,第3版，TheBenjamin/CummingsPublishing,RedwoodCity,CA(1995)。有許多已知方法可用于對(duì)材料表面進(jìn)行化學(xué)官能化，所述材料例如硅、玻璃或金，表面官能化引起了人們極大的興趣，因?yàn)橄鄬?duì)于未進(jìn)行化學(xué)官能化的表面，其往往使表面的用途得到擴(kuò)展，從而可能使各種分子與表面的結(jié)合得到增強(qiáng)并對(duì)各種分子進(jìn)行分析。表面上的化學(xué)官能化涂層的類型、數(shù)量和質(zhì)量決定了該表面結(jié)合具體分析物的共價(jià)強(qiáng)度和能力。非常希望該涂層自身在多次使用后不易降解或不易被沖洗掉，已證明，涂覆在表面上的眵-官能團(tuán)和胺-官能團(tuán)為檢測(cè)生物分子提供了多種平臺(tái)，這些基團(tuán)可通過物理吸引例如靜電相互作用或例如化學(xué)結(jié)合而捕獲生物分子。可直接地或間接地(即，通過化學(xué)接頭(liker))實(shí)現(xiàn)這種化學(xué)結(jié)合.本領(lǐng)域已知多種同基雙功能或異基雙功能接頭。用胺涂覆表面的一種簡(jiǎn)單方法是將清潔的表面直接暴露于聚賴氨酸。一個(gè)例子是用于微陣列印刷的栽璃片表面(glassslidesurface).用胺涂覆表面的一種可選方案是將胺-涂覆分子共價(jià)附著在表面上，例如將珪烷附著在玻璃上或?qū)⒘虼几街诮鹕?，這兩種情況均是公知的。各種M)^硅烷試劑已用于涂覆帶有胺基的硅基或玻璃基表面。用于涂覆此類表面的方法包括使用多種硅烷試劑、溶劑和不同的物理處理程序，此外，為檢測(cè)表面上化學(xué)基團(tuán)的存在，已使用的方法包括放射性方法、比色法、熒光、XPS、FTIR、AFM、及其他方法。靈敏度是選擇用于表面試驗(yàn)的合適方法時(shí)一個(gè)重要的問題。一般而言，既沒有用于化學(xué)涂敷生物傳感器的感受器表面的標(biāo)準(zhǔn)工業(yè)程序，也沒有用于檢測(cè)此類生物傳感器上的具體化學(xué)部分的存在或數(shù)量的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試方法。用醛結(jié)合位點(diǎn)涂覆表面的一種方法是用胺基官能化該表面并向該胺官能化表面(amine-functionalizedsurface)添加含有氰基硼氬4乜物(cyanoborohydride)的醛溶液。得到的生物傳感器可用于結(jié)合蛋白及其他含有胺的分子。也可通過商業(yè)途徑(例如CELAssociates和NoAbBioDiscoveries)獲得一些搭改性的栽玻片用于印刷陣列。業(yè)已開發(fā)出了例如用于檢測(cè)包括寡核苷酸的多種生物分子復(fù)合物、抗體抗原相互作用、激素-受體相互作用以及酶-底物相互作用的生物傳感器。一般，生物傳感器由兩個(gè)元件組成高度特異性的識(shí)別元件，和能夠?qū)⒎肿幼R(shí)別事件轉(zhuǎn)換成可定量信號(hào)的轉(zhuǎn)換器。業(yè)已通過多種方法實(shí)現(xiàn)了信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、包括熒光、干涉量度學(xué)(Jenison等，"Interference-baseddetectionofnucleicacidtargetsonopticallycoatedsilicon,"NatureBiotechnology,19，p.62-65;Lin等，"Aporoussilicon-basedopticalinterferometricbiosensors,"Science,278，p.840-843,1997)和重量分析法(A.Cunningham,BioanalyticaJSensors,JohnWiley&Sons(1998)),在所述基于光學(xué)的轉(zhuǎn)導(dǎo)方法中，直接方法不需要用熒光化合物標(biāo)記分析物，它是有價(jià)值的，因?yàn)闇y(cè)定相對(duì)簡(jiǎn)單，并且能夠研究不容易標(biāo)記的小分子和蛋白的相互作用。直接光學(xué)方法包括表面等離子體共振(SPR)(Jordan&Cora,"SurfacePlasmonResonanceImagingMeasurementsofElectrostaticBiopolymerAdsorptionontoChemicallyModifiedGoldSurfaces,"Anal.Chem.，69:1449-1456(1997))，光柵耦合器(Morhard等，"Immobilizationofantibodieshimicropa付ernsforcelldetectionbyopticaldiffraction,"SensorsandActuatorsB,70，p.232-242，(2000)),橢圓偏光'法(Jin等，"Abiosensorconceptbasedonimagingellipsometryforvisualizationofbiomolecularinteractions,"AnalyticalBiochemistry,232,p.69-72,(1995))，損耗波裝置(Huber等，"Directopticalimmunosensing(sensitivityandselectivity)，"SensorsandActuatorsB，6，p.122-126,1992)，和反射測(cè)量術(shù)(Brecht&Gauglite，"Opticalprobesandtransducers,"BiosensorsandBioelectronics，10，p.923-936，1995),理6論上推測(cè)的這些檢測(cè)方法的檢測(cè)極限業(yè)已確定，并且用實(shí)驗(yàn)證實(shí)了可用于診斷上相關(guān)的濃度范圍，搭-官能化表面(aldehydbfunctionalizedsurface)已用于固定或捕獲幾種裝置形式的表面上的靶分子，所述裝置形式包括微陣列、微孔板和孔栽玻片(wellslide)。將靶分子固定在表面上之后，它可通過特異性分子間相互作用而結(jié)合未知樣品中的分析物分子從而分析樣品。然而，未反應(yīng)的醛基仍然具有反應(yīng)性，能夠通過靶分子-分析物相互作用將分析物分子化學(xué)性附著至表面上，從而導(dǎo)致非特異性結(jié)合，即使表面上沒有任何把分子(例如生物學(xué)受體)，用吸附至絕大多M面上，這種吸附同樣引起不希望的非特異性結(jié)合。非特異性結(jié)合降低了基于特異性生物分子相互作用的生物分子檢測(cè)中的信噪比。生物傳感器(包括BINDtm侍感器)的眵密度已顯著提高。由于醛密度增加，非特異性結(jié)合達(dá)到了顯著性水平，造成難以確定檢測(cè)信號(hào)來自于分析物還是來自虛假讀數(shù)。因此，對(duì)減少這種非特異性結(jié)合非常感興趣，對(duì)減少胺-官能化表面的非特異性結(jié)合同樣非常感興趣。作為例子，可將靶分子(如鏈霧抗生物素蛋白)固定在生物傳感器表面。生物傳感器可通過檢測(cè)其它蛋白或小分子(又稱配體)與靶分子的結(jié)合事件產(chǎn)生的信號(hào)變化而檢測(cè)此類結(jié)合，所述信號(hào)可以是例如光信號(hào)、電信號(hào)或可視信號(hào)，然而，需要封閉含有靶分子的生物傳感器表面以減少蛋白或小分子與該表面的非特異性結(jié)合，僅允許與靶分子的特異性相互作用.此類特異性相互作用的例子是鏈霉抗生物素蛋白和生物素(鏈霉抗生物素蛋白的特異性配體)之間的相互作用，通常利用任何可通過商業(yè)途徑獲得的阻斷劑(例如Superblock逸阻斷緩沖液、SeaBlock阻斷緩沖液、Blockerit、BlockerCasin、Fishskingelatin和BSA(利用1%BSA+TWEEN))來進(jìn)行阻斷。這些阻斷劑是兩親性的，僅可將一種不希望的引力對(duì)換成另外一種.先前試圖封閉鏈霉抗生物素蛋白-涂覆的生物傳感器(例如BINDT,感器板)的嘗試通過利用這種降低通過檢測(cè)到結(jié)合于鏈霉抗生物素蛋白的生物素減少而測(cè)得。這種千擾部分可由商業(yè)阻斷劑中存在的生物材料例如蛋白(或肽)而引起。因此，本領(lǐng)域仍然需要解決這個(gè)問題。發(fā)明概述本發(fā)明一種實(shí)施方式提供減少表面上非特異性結(jié)合的方法，其中所迷表面是醛-官能化的、胺-官能化的或它們的組合。該方法包括用糖分子處理該表面，從而減少表面上的非特異性結(jié)合。糖分子可包括二糖。二糖可以是海藻糖分子或包括海藻糖分子。糖分子也可以是硫酸葡聚糖或包括硫酸葡聚糖。表面可以是生物傳感器表面，例如比色共振反射生物傳感器表面。糖分子可包括單糖、二糖、多糖、三糖、四糖、五糖、或它們的組合.表面可以是胺官能化表面。糖分子可包括乳糖、甘油醛或它們的組合.糖分子包括海藻糖和乳糖。糖分子可包括海藻糖和甘油眵，本發(fā)明另一種實(shí)施方式提供一種生物傳感器，其包含結(jié)合于表面附著的醛基的多種特異性結(jié)合物質(zhì)以及結(jié)合于表面附著的醛基的多種糖分子。糖分子可以是二糖或包括二糖。二糖可以是海藻糖分子?；蛘?，糖分子可以是葡聚糖或包括葡聚糖，特異性結(jié)合物質(zhì)可以是蛋白。蛋白可包括鏈霉抗生物素蛋白，本發(fā)明另一種實(shí)施方式提供一種包裝，其容納生物傳感器和包含糖分子的存貯溶液(storagesolution)，所述生物傳感器含有結(jié)合于表面附著的醛基的特異性結(jié)合物質(zhì)。因此，本發(fā)明提供具有高親水性、非電荷特征的小分子，它們不像兩親性阻斷劑一樣提供不希望的吸引。附圖簡(jiǎn)迷圖1A和1B是用于比色共振反射生物傳感器的光柵結(jié)構(gòu)的各種實(shí)施方式的示意圖。n^代表基片(substrate)材料.n！代^蓋層的折射率。n2代表一維或二維光柵的折射率.nbiu代表一種或多種特異性結(jié)合物質(zhì)的折射率，h代表覆蓋層的厚度。t2代表光柵的厚度，tw。代表一種或多種特異性結(jié)合物質(zhì)的層厚度.圖2表示加入到固定有鏈霉抗生物素蛋白(SA)的孔中或加入到僅含有5%海藻糖溶液的對(duì)照孔中的5%海藻糖溶液產(chǎn)生的偏移(nm)。固定期間SA的濃度是0.05mg/ml或0.2mg/ml,圖3表示在固定有鏈霉抗生物素蛋白(SA)的孔中加入5。/。海藻糖溶液，然后加入10%或100%FBS產(chǎn)生的偏移(nm)。結(jié)果與無海藻糖的孔比較。固定期間SA的濃度是0.05mg/ml或0.2mg/ml.圖4表示用5%海藻糖阻斷后華法林(warfarin)結(jié)合于HSA產(chǎn)生的歸一化(normalized)峰值波長(zhǎng)(PWV).圖5表示用5%海條糖阻斷后CBS結(jié)合于碳酸酐酶產(chǎn)生的歸一化峰值波長(zhǎng)(PWV),發(fā)明詳述官能化的、經(jīng)涂覆的生物傳感器表面用于結(jié)合化學(xué)或生物分子，例如蛋白、肽、多肽、核苷酸、多核苷酸、小分子、小的有機(jī)分子、生物素、細(xì)胞、分級(jí)的(fractionated)細(xì)胞、細(xì)胞提取物、細(xì)胞級(jí)分(fractions)、細(xì)胞部分，以及例如在蛋白質(zhì)組學(xué)、基因組學(xué)、制藥學(xué)、藥物發(fā)現(xiàn)和診斷研究領(lǐng)域中感興趣的其他化學(xué)或生物分子。例如，生物傳感器可以涂覆酪或涂覆胺，以結(jié)合感興趣的化學(xué)或生物分子.如本文所用，"醛"指具有式-CHO的分子，"胺"指具有式-NH2的伯胺以及仲胺。醛和胺可直接附著于表面或通過連接分子附著于表面，例如生物傳感器表面，涂覆胺的表面或胺-官能化表面指提供可進(jìn)行化學(xué)改性的胺基的表面，所述化學(xué)改性例如特異性結(jié)合物質(zhì)(specificbindingsubstances)的直接或間接附著。涂覆搭的表面或醛官能化表面指提供可進(jìn)行化學(xué)改性的搭基的表面，所迷化學(xué)改性例如特異性結(jié)合物質(zhì)的直接或間接附著，間接附著指如本領(lǐng)域公知的通過化學(xué)接頭附著化學(xué)或生物分子。'如本文所用，"表面"指能夠直接或間接結(jié)合特異性結(jié)合物質(zhì)的任何表面，例如，表面可含有直接附著于表面的官能胺基或官能醛基，或者這些官能團(tuán)可通過接頭分子附著于表面，表面可以是或不是官能化的，表面可以是但不局限于塑料、玻璃或金。此類表面包括但不局限于傳感器表面，例如生物傳感器表面。同樣如本文所用，糖分子指單糖、二糖、多糖和寡糖，二糖、多糖或寡糖可以是但不限于海藻糖、乳糖、麥芽糖、麥芽三糖、帕拉金糖(palatinose)、乳果糖、蔗糖、葡聚糖、棉籽糖(raffinose)、水蘇糖、毛蕊花糖(verbascose),海藻糖是由兩個(gè)葡萄糖分子通過oc-l，l鍵鍵合而成的二糖。參見Higashiyama，/W々pACto"74(7):1263-1269(2002),可用具有高折射率的材料(例如氣化鉭或其他合適的材料)涂覆生物傳感器光柵(grating)，然后任選再涂覆二氧化硅。在塑料中大表面積產(chǎn)生高靈敏度生物傳感器的能力4吏得能夠?qū)⑸飩鞲衅髡先氪竺娣e、一次性使用的試驗(yàn)形式(disposableassayformats),例如微量滴定板和微陣列栽玻片。優(yōu)選生物傳感器可整合入無底微量滴定板、微陣列或微流體裝置的底部，生物傳感器板可用于進(jìn)行例如多個(gè)并行的蛋白-蛋白或靶分子-配體結(jié)合試驗(yàn).所述無底的微量滴定板可具有例如6、8、12、24、48、96、384、1536或3456個(gè)孔。發(fā)現(xiàn)塑料基片生物傳感器的檢測(cè)靈敏度優(yōu)于或等于以前報(bào)道的玻璃基片生物傳感器。例如，基于塑料的生物傳感器可大量生產(chǎn)；生物傳感器陣列例如96孔或384孔例如可進(jìn)行,放大(up-scaled)和大量生產(chǎn).基于塑料的生物傳感器或塑料生物傳感器指包含塑料光柵或傳感器表面、光柵的塑料支持物(也稱為基片)和/或其它塑料組分的生物傳感器，用于官能化此類生物傳感器表面的反應(yīng)條件導(dǎo)致此類生物傳感器可能容易降解。優(yōu)選具有光學(xué)質(zhì)量的塑料，該塑料可以是清晰透明的，沒有任何微粒，能夠提供平滑的消光(flatfmishK作為例予，生物傳感器可包含支持丙烯酸類聚合物-光柵層的聚酯基片。作為另一例子，生物傳感器可包含支持環(huán)氧樹脂光柵層的聚碳酸酯基片，塑料的其它非限制性例子包括聚酯和聚氨酯。然而，可使用提供可用于生物傳感器的光學(xué)質(zhì)量的任何塑料。另一個(gè)例子中，光柵表面是塑料的，從而塑料既充當(dāng)基片又充當(dāng)光柵。本領(lǐng)域通常用來官能化此類生物傳感器表面的反應(yīng)條件導(dǎo)致此類生物傳感器容易降解。然而，有些官能化方法不引起基于塑料的生物傳感器的降解，參見，例如2004年11月11日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)No.10/983,511，其全文通過參考納入本文。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)可本發(fā)明方法也能夠和基于玻璃生物傳感器一起使用，作為例子，生物傳感器可以是BINDTM傳感器板。BINDTM系統(tǒng)允許無標(biāo)記檢測(cè)化學(xué)和生物分子的相互作用。BINDtm系統(tǒng)可包括bindtm讀數(shù)儀和96-或384-孔微板生物傳感器。bindtm系統(tǒng)使用光學(xué)效應(yīng)，以提供生物傳感器表面結(jié)合的靈敏度檢測(cè)，生物傳感器可以是非結(jié)構(gòu)性光柵，將其整合入行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)形式的微孔滴定板中，BINDTM系統(tǒng)允許檢測(cè)利用蛋白、肽和細(xì)胞進(jìn)行化學(xué)和生物分子的相互作用，以及其他相互作用。BINDTM系統(tǒng)可用于抗原親合性排序(ranking)、細(xì)胞功能性篩選、肽表位作圖和免疫遺傳學(xué)篩選。醛-官能化表面或胺-官能化表面指具有涂層的表面，通過該涂層可附著特異性結(jié)合物質(zhì)。例如，醛-官能化表面可指但不限于具有高折射率材料涂層的生物傳感器的光柵表面，通過所述涂層可附著特異性結(jié)合物質(zhì)。此類高折射率材料包體例如氮化硅、硫化鋅、二氧化鈦或氧化鉭，10任選地，在表面官能化之前將氧化硅層涂覆在高折射率材料上。高折射率材料或氧化硅可用醛官能團(tuán)或胺官能團(tuán)官能化，用于附著化學(xué)和生物分子。用于對(duì)涂覆有高折射率材料的光柵表面進(jìn)行^官能化或胺官能化的試劑優(yōu)逸與光柵材料和基片材料(不管它們是塑料或環(huán)氧樹脂的)相容.雖然光柵涂覆有高折射率材料，所述材料為光柵提供一定的不受用來醛官能化或胺官能化該表面的試劑影響的保護(hù)，但光柵的反面仍可能在官能化過程中暴露。同樣地，當(dāng)光柵結(jié)合于基片時(shí)，基片的反面可能暴露于官能化試劑。同時(shí)，光柵表面上的高折射率材料涂層的瑕疵(imperfections)可導(dǎo)致光柵表面上部區(qū)域暴露.因此，生物傳感器的醛-官能化表面或胺-官能化表面指基于塑料的生物傳感器以及非基于塑料的生物傳感器，例如，生物傳感器包括二氧化鈦涂覆的傳感器，或具有高折射率、低吸收率(indexofabsorption)涂層的其他傳感器，或在頂層上和基層材料結(jié)構(gòu)上具有覆蓋層(covering)的傳感器。此外，考慮各種物理形式的二氧化硅或其他具有低吸收率和低折射率的材料。這些生物傳感器是示例性的，并不限制具有^-官能化表面或胺-官能化表面的生物傳感器。亞波長(zhǎng)(subwavelength)結(jié)構(gòu)表面(SWS)生物傳感器在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，亞波長(zhǎng)結(jié)構(gòu)表面(SWS)被用于在特定波長(zhǎng)產(chǎn)生強(qiáng)烈光學(xué)共振反射，可將它用于以高靈敏度跟蹤化學(xué)或生物學(xué)材料的相互作用，如特異性結(jié)合物質(zhì)或結(jié)合伴倡(parters)或這兩者，比色共振反射生物傳感器表面起著特異性結(jié)合物質(zhì)的表面結(jié)合平臺(tái)的作用。亞波長(zhǎng)結(jié)構(gòu)表面是非常規(guī)類型的衍射光學(xué)元件(optic),它能模擬薄膜涂層的作用(Peng&Morris,"Resonantscatteringfromtwo-dimensionalgratings,"J.Opt.Soc.Am.A，Vol.13,No.5,p.993,1996年5月；Magnusson，&Wang,"Newprincipleforopticalfilters,"Appl.Phys.Lett.,61，No.9，p.1022,1992年8月；Peng&Morris,"Experimentaldemonstrationofresonantanomaliesindiffractionfromtwo-dimensionalgratings,"OpticsLetters,Vol.21'No.8,p.549，1996年4月).SWS結(jié)構(gòu)包括表面浮雕的(surface-relief)—維或二維光柵，其中，與入射光的波長(zhǎng)相比，光柵周期較小，以便不允許除了反射和透射零級(jí)以外的衍射級(jí)波長(zhǎng)傳播。參見美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?0/059,060和10/058,626，全文通過參考納入本文，SWS表面窄帶濾光片可以包括在基片層和覆蓋層之間所夾的一維或二維光柵，所迷覆蓋層填充光柵刻線槽(grooves)?？扇芜x地不使用覆蓋層。當(dāng)光柵區(qū)的有效折射率大于所述基片或覆蓋層時(shí)，就會(huì)產(chǎn)生導(dǎo)模(guidedmode)共振效應(yīng)。當(dāng)適當(dāng)設(shè)計(jì)濾光片時(shí)，一維或二維光柵結(jié)構(gòu)選擇性耦合(couple)窄帶波長(zhǎng)的光。光發(fā)生散射并與向前和向后傳播的零級(jí)光耦合。這種導(dǎo)模共振效應(yīng)從任何光子進(jìn)入該結(jié)構(gòu)的位點(diǎn)開始高度局限性地發(fā)生在約3微米的區(qū)域。由于導(dǎo)模在側(cè)向的傳播沒有得到支持，因此沒有產(chǎn)生波導(dǎo)。倡或這兩者添加在覆蓋層的上表面或一維或二維光柵表面上而進(jìn)行調(diào)節(jié)。所添加的分子增加了通過該結(jié)構(gòu)的入射輻射的光程長(zhǎng)度，并因此改變了發(fā)生最大反射或透射的波長(zhǎng)。在一種實(shí)施方式中，在用白光照射生物傳感器時(shí)，將它設(shè)計(jì)成只能反射單一波長(zhǎng)。當(dāng)特異性結(jié)合物質(zhì)或靶分子(例如化學(xué)和生物分子)附著在生物傳感器的表面上時(shí)，反射波長(zhǎng)(顏色)由于耦合入光柵的燈光的光程改變而偏移。通過將特異性結(jié)合物質(zhì)連接在生物傳感器表面上，可以在不使用任何類型的熒光探針或顆粒標(biāo)記的情況下檢測(cè)互補(bǔ)性結(jié)合伴侶分子。所述檢測(cè)技術(shù)能夠分辨，例如，大約O.lnm厚的蛋白結(jié)合變化，并且能夠用浸泡在流體中的或干燥的生物傳感器表面來實(shí)施，檢測(cè)系統(tǒng)由例如光源和分光計(jì)組成，所迷光源以正入射方式通過例如光纖探頭照射生物傳感器的小斑點(diǎn)，所迷分光計(jì)通過，例如，同樣是正入射的第二個(gè)光纖探頭收集反射光，由于在激發(fā)/檢測(cè)系統(tǒng)和生物傳感器表面之間沒有物理接觸，所以不需要特殊的耦合棱鏡，并且所述生物傳感器可以容易地應(yīng)用在任何常用測(cè)定平臺(tái)上，包括，例如微量滴定板和微陣列載玻片，可以在幾毫秒時(shí)間內(nèi)進(jìn)行一次分光計(jì)讀數(shù)，因此，有可能快速測(cè)量在生物傳感器表面上平行發(fā)生的大量的分子相互作用，并且實(shí)時(shí)監(jiān)控反應(yīng)動(dòng)力學(xué)。這種技術(shù)可應(yīng)用于平行測(cè)量大量的生物分子的相互作用，特別是當(dāng)分子標(biāo)記能改變或抑制研究中的分子的功能時(shí).用蛋白靶高通量篩選藥用化合物庫(kù)，以及用于蛋白質(zhì)組學(xué)的蛋白-蛋白相互作用的微陣列篩選是需要由本發(fā)明的組合物和方法提供的靈敏度和通量的應(yīng)用的例子。圖1是SWS結(jié)構(gòu)的一種例子的示意圖。在圖1中，n基a表示基片材料。m表示任選的覆蓋層的折射率。n2表示一維或二維光柵的折射率，表示一種或多種特異性結(jié)合物質(zhì)的折射率，t,表示在一維或二維光柵結(jié)構(gòu)上的覆蓋層的厚度。t2表示光柵的厚度，tW。表示一種或多種特異性結(jié)合物質(zhì)層的厚度。在一種實(shí)施方式中，I!2〉IM(參見圖1)對(duì)層厚度(即覆蓋層，一種或多種特異性結(jié)合物質(zhì)，或光柵)進(jìn)行選擇，以便獲得對(duì)頂面上的其他分子的共振波長(zhǎng)靈敏度。選擇光柵周期，以便獲得理想波長(zhǎng)的共振。所述結(jié)構(gòu)可由玻璃或氮化硅介電材料制成?；蛘?，所述結(jié)構(gòu)可由具有合適的介電覆蓋層的壓紋塑料(embossedplastic)形成。本發(fā)明一種實(shí)施方式提供SWS生物傳感器.SWS生物傳感器包括一維或二維光柵、支持光柵的基片層、以及固定在基片層反面的光柵表面的一種或多種特異性結(jié)合物質(zhì)。一維或二維光柵可由例如以下材料組成硫化鋅、二氧化鈦、氧化鉭和氮化硅。光柵的橫截面輪廓可以包括任何周期性的重復(fù)功能，例如，"方波"。光柵還可以包括選自以下的重復(fù)形式的形狀連續(xù)的平行線、正方形、圓形、橢圓形、三角形、梯形、正弦波、卵形、長(zhǎng)方形和六邊形。正弦形橫截面輪廓優(yōu)選用于需要將光柵形狀壓紋為軟材料例如塑料或?qū)⒐鈻疟砻鎻?fù)制為例如環(huán)氧樹脂材料的制造應(yīng)用。本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，光柵的深度約0.01微米至約1微米，光柵周期約0.01微米至約1微米，SWS生物傳感器還可包括一維線形光柵表面結(jié)構(gòu)，即一系列平行的線或槽。一維線形光柵足夠產(chǎn)生導(dǎo)模共振濾光效應(yīng)。二維光柵在與傳感器表面平面交叉的兩個(gè)側(cè)向均有特征，即兩者均為亞波長(zhǎng)，而一維光柵的橫截面僅在一個(gè)側(cè)向是亞波長(zhǎng)，長(zhǎng)度(longdimension)可大于共振光柵效應(yīng)的波長(zhǎng)。一維光柵生物傳感器可包含高折射率材料，將其以薄膜涂覆在具有一維光柵表面結(jié)構(gòu)的低折射率材料層上?；蛘撸痪S光柵生物傳感器可包含低折射率材料基片，在該基片上將高折射率薄膜材料模制到(patternedinto)—維光柵表面結(jié)構(gòu)中。低折射率材料可以是玻璃、塑料、聚合物或固化環(huán)氧樹脂。高折射率材料的折射率必須大于低折射率材料。高折射率材料可以是例如硫化鋅、氮化硅、氧化鉭、二氧化鈥或氧4匕銦錫(mdiumtinoxide)?？衫缤ㄟ^將光柵表面制造為與標(biāo)準(zhǔn)顯微鏡栽玻片一樣大小，然后將高親和性化學(xué)受體試劑微滴置于光柵表面的x-y柵格位點(diǎn)上，從而將SWS結(jié)構(gòu)用作微陣列平臺(tái)?；蛘?，可將SWS結(jié)構(gòu)制造為和標(biāo)準(zhǔn)微量滴定板一樣大小，并整合入整塊板的底部表面。當(dāng)化學(xué)官能化表面(例如微陣列/微量滴定板)暴露于分子(例如分析物)時(shí)，這些分子將會(huì)被優(yōu)先吸引到具有高親和性的位置.因此，一些表面位置(Iocations)聚集另外的材料，而其他表面位置則不聚集?？赏ㄟ^檢測(cè)各單獨(dú)的表面位置內(nèi)(例如各單獨(dú)的微陣列/微滴定板表面位置內(nèi))共振波長(zhǎng)的偏移來確定所述吸引另外的材料的表面位置。因此，例如，可通過檢測(cè)共振波長(zhǎng)偏移的程度來確定樣品中結(jié)合分子(例如分析物)的數(shù)量以及受體試劑和這些分子之間的化學(xué)親合性。本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，可檢測(cè)第一分子和第二測(cè)試分子間的相互作用。使用如上所述的SWS生物傳感器，因此，生物傳感器包括一維或二維光柵、支持一維或二維光柵的基片層和任選地覆蓋層。如上所述，當(dāng)用光照射生物傳感器時(shí)，在反射輻射光譜上產(chǎn)生共振光柵效應(yīng)，光柵的深度和周期小于共振光柵效應(yīng)的波長(zhǎng).為檢測(cè)笫一分子和第二測(cè)試分子間的相互作用，將第一和第二分子的混合物施加于生物傳感器上的不同位點(diǎn)。不同位點(diǎn)可以是生物傳感器上的一個(gè)斑點(diǎn)或孔或者可以是生物傳感器上的大面積。還將第一分子和第三對(duì)照分子的混合物施加于生物傳感器上的不同位點(diǎn)。生物傳感器可以是如上所述同一個(gè)生物傳感器，或者可以是第二個(gè)生物傳感器。如果所述生物傳感器是同一個(gè)生物傳感器，則第二個(gè)不同位點(diǎn)可用于第一分子和第三對(duì)照分子的混合物?；蛘撸蓪⒌谝缓偷诙肿訌纳飩鞲衅飨吹糁罄孟嗤莫?dú)特(distinct)生物傳感器位置。笫三對(duì)照分子不與第一分子相互作用，約和第一分子同樣大小。檢測(cè)來自(一個(gè)或多個(gè))生物傳感器的獨(dú)特位置(distinctlocations)反射光波長(zhǎng)的偏移。如果具有第一分子和第二測(cè)試分子的獨(dú)特位置的反射光波長(zhǎng)偏移大于具有第一分子和第三對(duì)照分子的獨(dú)特位置的反射光波長(zhǎng)偏移，則第一分子和笫二測(cè)試分子相互作用。相互作用可以是例如核酸分子的雜交、抗體或抗體片段與抗原的特異性結(jié)合、以及多肽的結(jié)合。第一分子、第二測(cè)試分子或笫三對(duì)照分子可以是例如核酸、多肽、抗原、多克隆抗體、單克隆抗體、單鏈抗體(scFv)、F(ab)片段、F(ab，)2片段、Fv片段、小的有機(jī)分子、細(xì)胞、病毒和細(xì)菌.胺官能化的生物傳感器將高折射率材料層(例如氮化硅層)涂覆到表面(例如塑料表面)后，將胺官能團(tuán)附著在高折射率材料表面上從而準(zhǔn)備將該裝置用作傳感器?；谒芰系纳飩鞲衅骺稍谙蚱浔砻嫣峁┌饭倌軋F(tuán)的化學(xué)改性期間發(fā)生降解(即，傳感器上的結(jié)構(gòu)或組成改變)，為了避免此類降解，生物傳感器胺表面官能化的方法中可使用與生物傳感器的塑料相容的試劑，已將高折射率材料沉積在塑料生物傳感器的光柵表面上之后，可存儲(chǔ)傳感器或?qū)⑵渲苯佑糜诠倌芑?。在胺官能化程序之前可使用濕?例如用液體(如溶劑)清潔)或干法(例如紫外線、臭氧或等離子)使傳感器經(jīng)歷清潔步驟。一種實(shí)施方式中，胺官能化程序包括(a)將塑料比色共振生物傳感器暴露于硅烷醇溶液(alcoholicsi〗anesolution),然后(b)用醇清洗暴露的塑料比色共振生物傳感器。當(dāng)生物傳感器干燥后，光柵表面含有胺官能團(tuán)，即-NH2基團(tuán)，一種實(shí)施方式中，硅烷溶液含有3-氨丙基三乙H^硅烷和醇(例如乙醇)或其他合適的低分子量醇.同樣地，任何合適的低分子量醇可用于清洗生物傳感器。用胺涂覆塑料生物傳感器的一個(gè)例子是首先將傳感器暴露于含有3-氨丙基三乙M硅烷和乙醇的溶液，然后在乙醇中短暫地(briefly)清洗傳感器，最后干燥傳感器。可調(diào)節(jié)3-氨丙基硅烷在乙醇中的濃度，以使3-氨丙基硅烷在乙醇中的濃度為約1%-約15%。此外，乙醇可以是約卯％-100%(體積/體積，用水調(diào)節(jié)).例如，可在烘箱中于約70"C進(jìn)行干燥步驟10分鐘。干燥可在較高的溫度下進(jìn)行，條件是選擇溫度，以使傳感器不發(fā)生降解，可使用很多合適的溶劑、濃度、反應(yīng)時(shí)間和固化/保溫時(shí)間。變化包括表面類型、硅烷試劑(其他硅烷，例如3-氨丙基三甲氧基硅烷等)、硅烷濃度、涂覆溶劑或溶劑組合(例如乙醇和水)、涂覆反應(yīng)時(shí)間、清洗溶劑或溶劑組合(例如乙醇和水)、固化時(shí)間和固化溫度。表面處理本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，可用化學(xué)處理來改性傳感器表面.例如，可通過將表面浸在溶液中來用溶液處理表面，或者，也可用氣相處理(包括化學(xué)蒸汽或霧化(atomization)沉積)來涂覆表面。氣相處理可用于確保幾何學(xué)上非平坦表面的保形涂覆(conformalcoating)。這種涂覆可用于表面硅烷化步驟中，或用于向表面上加入其他有機(jī)材料.本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉可用于處理表面的其他方法。在氣相涂覆處理之前，通?？墒褂玫入x子處理，等離子處理可除去表面上的大多數(shù)污染并活化一些表面以改善后續(xù)氣相涂敷處理中的粘合.氣相涂覆處理可用于在高分子膜表面上添加化學(xué)官能性(chemicalfunctionality)并使吸附的水分、有機(jī)污染物和低分子量材料最小化。氣相涂覆的優(yōu)點(diǎn)包括但不限于對(duì)表面的處理均勻，處理高分子膜時(shí)無背面(backside)處理，處理多孔材料時(shí)無針孔，用于本發(fā)明的此類涂敷服務(wù)包括但不限于由以下廠商提供的服務(wù)SigmaTechnologies(Tucson,AZ)、4他State(Belmont,CA)、YieldEngineering(SanJose,CA)、ErieScientific(Portsmouth,NH)以及ASTProducts(高級(jí)表面技術(shù)(advancedsurfacetechnologies))(Billerica，MA)。聲學(xué)(acoustic)生物傳感器本發(fā)明的另一種實(shí)施方式中，使用聲學(xué)生物傳感器。聲學(xué)生物傳感器通過檢測(cè)由分子和/或分析物的結(jié)合引起的沉積質(zhì)量變化導(dǎo)致的生物傳感器表面上共振振蕩頻率的變化，來檢測(cè)分子(例如分析物)與共價(jià)附著于表面的化學(xué)或生物分子或把分子的結(jié)合。例如可利用壓阻裝置、機(jī)械振動(dòng)器(例如微機(jī)械懸臂(micromachinedcantilevers)、膜或音叉)或聲表面波振蕩器來檢測(cè)共振振蕩頻率，電子生物傳感器本發(fā)明的另一種實(shí)施方式中，使用電子生物傳感器。電子生物傳感器通過檢測(cè)由分子和/或分析物的結(jié)合所引起的沉積質(zhì)量變化導(dǎo)致的生物傳感器表面上的電阻(例如直流電(DC)或交流電(AC)、低頻或高頻、電容或電感)的變化來檢測(cè)分子(例如分析物)與共價(jià)附著于表面的化學(xué)或生物分子或靶分子的結(jié)合，特異性結(jié)合物質(zhì)和結(jié)合伴侶可通過例如物理吸附或化學(xué)結(jié)合將一種或多種特異性結(jié)合物質(zhì)或靶分子固定在表面(例如傳感器表面)上，特異性結(jié)合物質(zhì)能夠例如特異性地結(jié)合于添加在傳感器表面上的結(jié)合伴侶.特異性結(jié)合物質(zhì)特異性地結(jié)合于它的結(jié)合伴侶，但基本上不結(jié)合添加在生物傳感器表面上的其他結(jié)合伴倡，例如，當(dāng)所述特異性結(jié)合物質(zhì)是抗體，并且它的結(jié)合伴侶是特殊抗原時(shí)，所述抗體能特異性地結(jié)合所述特殊抗原，但基本上不結(jié)合其他抗原。特異性結(jié)合物質(zhì)可以是例如核酸、肽、多肽、蛋白、抗原、多克隆抗體、單克隆抗體、單鏈抗體(scFv)、F(ab)片段、F(ab，)2片段、Fv片段、小分子、小的有機(jī)分子、生物素、細(xì)胞、細(xì)胞提取物、細(xì)胞部分、病毒、細(xì)菌、聚合物、肽溶液、單鏈或雙鏈DNA溶液、RNA溶液、含有來自組合化學(xué)庫(kù)的化合物的溶液、或生物樣品。生物樣品可以是例如血液、血漿、血清、胃腸分泌物、組織或腫瘤的勻漿物、滑液、糞便、唾液、痰、嚢液、羊水、腦脊液、腹腔液、肺灌洗液、精液、淋巴液、眼淚和前列腺液。16優(yōu)選一種或多種特異性結(jié)合物質(zhì)排列在生物傳感器上獨(dú)特位置的微陣列中。特異性結(jié)合物質(zhì)的微陣列包含位于本發(fā)明生物傳感器表面上的一種或多種特異性結(jié)合物質(zhì)，從而表面含有多個(gè)獨(dú)特位置，每一個(gè)位點(diǎn)具有不同的特異性結(jié)合物質(zhì)或具有不同數(shù)量的特異性結(jié)合物質(zhì)。例如，陣列可包含l、10、100、l，OOO、IO，OOO或100,000個(gè)獨(dú)特位置。由于一種或多種特異性結(jié)合物質(zhì)通常以x-y坐標(biāo)中規(guī)則的柵格模式排列，這種生物傳感器表面稱為微陣列。然而，本發(fā)明的微陣列可包括以任何類型的規(guī)則或不規(guī)則模式排列的一種或多種特異性結(jié)合物質(zhì)。例如，獨(dú)特位置可限定一種或多種特異性結(jié)合物質(zhì)的斑點(diǎn)微陣列(microarrayofspots)。微陣列斑點(diǎn)的直徑可以是約50-約500微米。微陣列斑點(diǎn)的直徑還可以是約150-約200微米。一種或多種特異性結(jié)合物質(zhì)可結(jié)合于它們的特異性結(jié)合伴侶?？赏ㄟ^將一種或多種特異性結(jié)合物質(zhì)的微滴置于例如一維或二維光柵或覆蓋層表面的x-y柵格位點(diǎn)上來制造本發(fā)明生物傳感器上的微陣列。當(dāng)生物傳感器暴露于含有一種或多種結(jié)合伴侶的測(cè)試樣品時(shí)，結(jié)合伴侶將優(yōu)先被吸引到含有對(duì)該結(jié)合伴侶有高親和性的特異性結(jié)合物質(zhì)的微陣列上的獨(dú)特位置。一些獨(dú)特位置在其表面上聚集結(jié)合伴侶，而其它位置不聚集。本發(fā)明的微陣列的一種例子是核酸陣列，其中，所述陣列中的每一個(gè)獨(dú)特位置包含不同的核酸分子。在本實(shí)施方式中，在所述核酸微陣列中的斑點(diǎn)檢測(cè)與測(cè)試樣品中核酸的相反鏈的互補(bǔ)性化學(xué)結(jié)合，盡管微量滴定板是用于生物化學(xué)測(cè)定的最常見的形式，但微陣列越來越被認(rèn)為是使可以同時(shí)測(cè)量的生物化學(xué)相互作用的數(shù)目最大化，同時(shí)使珍貴試劑的體積最小化的方法.通過用微陣列點(diǎn)樣器(spotter)將特異性結(jié)合物質(zhì)施加在本發(fā)明的生物傳感器上，可以獲得的特異性結(jié)合物質(zhì)的密度為10,000特異性結(jié)合物質(zhì)/英寸2。通過聚焦照射光束來檢查單個(gè)微陣列位置，可以將生物傳感器用作無標(biāo)記微陣列讀出系統(tǒng)，固定一種或多種特異性結(jié)合物質(zhì)將一種或多種結(jié)合物質(zhì)固定在生物傳感器上，以便特異性結(jié)合物質(zhì)不會(huì)被清洗程序洗掉，并且它與測(cè)試樣品中結(jié)合伴侶的結(jié)合不受生物傳感器表面的妨礙。業(yè)已實(shí)施了若千種不同類型的表面化學(xué)策略，以便將特異性結(jié)合物質(zhì)共價(jià)附著在例如，玻璃上，以便用于各種類型的微陣列和生物傳感器。這些相同的方法可容易地適用于本發(fā)明的生物傳感器。對(duì)生物傳感器進(jìn)行表面制備以使表面含有用于結(jié)合一種或多種特異性結(jié)合物質(zhì)的正確官能團(tuán)，這是生物傳感器生產(chǎn)工藝的必需部分。如本文所用，術(shù)語"靶分子"或"化學(xué)或生物分子"或"特異性結(jié)合物質(zhì)"指可附著于官能化表面的任何特異性結(jié)合物質(zhì)?；瘜W(xué)或生物分子可選自例如蛋白、肽、多肽、核苷酸、多核苷酸、小分子、生物素、細(xì)胞、分級(jí)細(xì)胞、細(xì)胞提取物、細(xì)胞級(jí)分和細(xì)胞部分。如本文所用，術(shù)語蛋白、肽和多肽指氨基酸^聚合物。這些術(shù)語同樣適用于如下氛基酸聚合物，即其中一種或多種氨基酸是相應(yīng)的天然存在氨基酸的化學(xué)類似物，包括經(jīng)翻譯后程序(例如，糖基化作用和砩酸化作用)修飾的氨基酸。如本文所用，術(shù)語"蛋白"指任何蛋白，包括但不限于肽、酶、糖蛋白、激素、受體、抗原、抗體、生長(zhǎng)因子等等.術(shù)語"多肽"指氨基酸聚合物，不考慮聚合物長(zhǎng)度；因此，肽、寡肽和蛋白均包括在多肽定義中.該術(shù)語既指天然存在的多肽也指合成多肽。該術(shù)語可包括多肽的化學(xué)或表達(dá)后修飾。因此，術(shù)語"多肽"明確地涵蓋例如，對(duì)多肽的修飾，包括共價(jià)附著糖基、乙?；?、磷酸基、脂質(zhì)基團(tuán)等?；瘜W(xué)修飾的多肽包括摻入了鑒定或捕獲標(biāo)記的多肽。天然的或其它化學(xué)修飾(例如上文列舉的那些)可發(fā)生在多肽中的任何位置，包括肽主鏈、氨基酸側(cè)鏈以及氨基或^末端?？衫斫猓瑯宇愋偷男揎椏梢韵嗤虿煌潭却嬖谟诮o定多肽的幾個(gè)位點(diǎn)，另外，給定多肽可含有多種類型的修飾.多肽可以是分支的，例如由泛素化(ubiquitination)引起的分支；它們也可以是有或者沒有分支的環(huán)狀，修飾包括乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、共價(jià)附著黃素、共價(jià)附著血紅素部分、共價(jià)附著核苷酸或核苷酸衍生物、共價(jià)附著脂質(zhì)或脂質(zhì)衍生物、共價(jià)附著磷脂酰肌醇、交聯(lián)、環(huán)化、形成二硫鍵、脫甲基作用、形成共價(jià)交聯(lián)、形成半胱氨酸、形成焦谷氨酸醋(pyroglutamate)、甲欲化、y-羧基化、糖基化、形成GPI錨、羥基化、氫化、碘化、甲基化、肉豆蔻酰化、氧化、聚乙二醇化、蛋白酶解加工、磷酸化、異戊二烯化(prenylation)、外消旋化、硒化、硫酸化、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA介導(dǎo)的向蛋白中加入氨基酸(例如精氨?；头核鼗?，(參見，例如，Proteins-StructureandMolecularProperties,第2版，T.E.Creighton,W.H.FreemanandCompany,NewYork(1993);PosttranslationalCovalentModificationofProteins,B.C.Johnson,Ed.，AcademicPress,NewYork^第1-12頁(yè)(1983);Seifter等，MethEnzymol182:626-646(1990);Rattan夢(mèng)，AnnNYAcadSci663:48-62(1992)),還包括在"多肽"定義中的是含有一個(gè)或多個(gè)氨基酸類似物(包括例如非天然存在的氛基酸、天然情況下僅存在于不相關(guān)生物系統(tǒng)中的氛基酸、哺乳動(dòng)物系統(tǒng)的,氨基酸等)的多肽，具有天然存在和非天然存在的替代的鍵(substitutedlinkages)以及本領(lǐng)域已知的其它修飾的多肽.這些多肽可以是天然存在或合成的.如本文所用，"小分子"指小于約2,500道爾頓的分子。這些分子包括例如小的有機(jī)分子，如生物素；還包括小肽，例如M擬物(peptidomimetics)以及核苷酸，如通常在抗病毒篩選庫(kù)中發(fā)現(xiàn)的那些核苷酸。小分子既可指合成分子，也可指趨向于具有較大分子量的天然化合物，所述合成分子可以是多種取向的(diversityoriented)并且分子較小。小分子還包括口服起效藥物，其上限分子量范圍為約500道爾頓，參見Lipinski，C.A."Drug-likePropertiesandtheCausesofPoorSolubilityandPoorPermeability,"J.Pharm,AndTox.Methods.44:235(2000)，236("Lipinski")?？梢酝ㄟ^物理吸附(即，不使用化學(xué)接頭)或通過化學(xué)結(jié)合(即，使用化學(xué)接頭)將一種或多種特異性結(jié)合物質(zhì)附著在生物傳感器表面上?；瘜W(xué)結(jié)合能在生物傳感器表面上產(chǎn)生較強(qiáng)的特異性結(jié)合物質(zhì)的附著，并且提供表面結(jié)合分子的規(guī)定的取向和構(gòu)象，化學(xué)結(jié)合類型的例子包括例如胺官能化、酪官能化、氣基官能化；以及生物素、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)和鎳活化.這些表面可用于將特異性結(jié)合物質(zhì)直接附著于生物傳感器表面，或通過利用如表1所示的幾種不同類型的化學(xué)接頭將特異性結(jié)合物質(zhì)附著于生物傳感器表面。還參見，Hermanson，BioconjugateTechniques,AcademicPress,NY，1996,表l<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>可以用胺官能化表面附著幾種類型的接頭分子，而眵表面可用于直接結(jié)合蛋白，而不需要額外的接頭。例如，表面上的醛官能化涂層厚度小于約50埃。此外，表面可以是平坦的或不平坦的。"不平坦的"表面可以是例如包含如本文所述的光柵的表面，"平坦的"表面可以是例如包含具覆蓋層的光柵的表面，所述覆蓋層例如為氧化珪或旋涂坡璃(spin-on-glass)(SOG)，如2001年8月15日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)09/930,352和2002年1月29日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)10/059,060(通過參考納入本文)。4^面可用于結(jié)合具有摻入的組氨酸("his")標(biāo)記的分子，利用鎳-活化的表面進(jìn)行的"組氨酸標(biāo)記的"分子的檢測(cè)為本領(lǐng)域所熟知(Whitesides,Anal.Chem.68，490，(1996))。例如可基本按照針對(duì)固定至玻璃所述，將特異性結(jié)合物質(zhì)固定于塑料傳感器的表面(可以是氧化物).但是，應(yīng)消除會(huì)損害固定特異性結(jié)合物質(zhì)的材料的洗滌和涂覆處理步驟.為了檢測(cè)濃度低于大約0.1ng/m的結(jié)合伴侶，優(yōu)選擴(kuò)增結(jié)合在生物傳感器上的結(jié)合伴侶并將其轉(zhuǎn)換成生物傳感器表面上的額外的層。由于光程長(zhǎng)度增加，可以容易地檢測(cè)沉積在生物傳感器上的增加了的質(zhì)量。通過將更大的質(zhì)量整合到生物傳感器表面上，也增加了所述表面上結(jié)合伴侶的光密度，因此能夠比未添加質(zhì)量時(shí)產(chǎn)生更大的共振波長(zhǎng)偏移。添加質(zhì)量可以通過例如，酶促方法，通過"夾心"測(cè)定，或者通過將物質(zhì)以具有各種大小和組成的適當(dāng)偶合的珠或聚合物形式直接應(yīng)用在生物傳感器表面上而實(shí)現(xiàn)。這種原則業(yè)已應(yīng)用在其他類型的光學(xué)生物傳感器上，以用于證實(shí)靈敏度相對(duì)于沒有質(zhì)量放大的靈敏度極限而言提高了超過1500x,參見，例如，Jenison等，"Interference-baseddetectionofnucleicacidtargetsonopticallycoatedsilicon"，NatureBiotechnology,19:62-65，2001。作為例子，胺官能化生物傳感器表面可能具有特異性結(jié)合物質(zhì)，包括固定在該表面上的單鏈DNA捕獲探針，所述捕獲探針選擇性地與它的互補(bǔ)性結(jié)合伴侶相互作用，反過來，可以將所述結(jié)合伴侶設(shè)計(jì)成包括能夠結(jié)合"檢測(cè)(detector)"分子的序列或標(biāo)記，檢測(cè)分子可以包括，例如，連接在辣根過氧化物酶(HRP)上的接頭，當(dāng)所述接頭暴露于正確的酶時(shí)，會(huì)選擇性地將額外的材料僅沉積在生物傳感器上存在檢測(cè)分子的部位.所述方法能夠在幾分鐘內(nèi)將，例如，300A的可檢測(cè)生物材料添加在生物傳感器上。還可用"夾心"方法增強(qiáng)檢測(cè)靈敏度。在該方法中，可以用大分子量分子放大低分子量分子的存在。例如，分子量為，例如，大約0.1kDa-大約20kDa的結(jié)合伴倡可以進(jìn)行標(biāo)記，例如，用琥珀酰亞胺基-6-!a-甲基-a-(2-吡^-二疏代)甲苯甲酰胺己酸醋(SMPT)或庚二亞胺酸二甲酯(diinethylpimelimidate)(DMP)、組氨酸或生物素分子進(jìn)行標(biāo)記。當(dāng)所迷標(biāo)記是生物素時(shí)，生物素分子能強(qiáng)有力地與鏈霉抗生物素蛋白結(jié)合，它的分子量為60kDa。由于生物素/鏈霉抗生物素蛋白相互作用是高度特異性的，所以所述鏈霉抗生物素蛋白能夠?qū)⒅荒苡尚〉慕Y(jié)合伴侶產(chǎn)生的信號(hào)放大60倍，通過使用化學(xué)衍生化的小顆粒能夠?qū)z測(cè)靈敏度進(jìn)一步提高。用膠態(tài)金、各種塑料，或直徑大約為3-300咖的玻璃制備的"納米顆粒(nanopartide)"可以用能夠使它們選擇性地與結(jié)合伴侶共價(jià)結(jié)合的分子種類涂覆。例如，可用鏈霉抗生物素蛋白共價(jià)涂覆的納米顆粒來增強(qiáng)生物素-標(biāo)記的結(jié)合伴侶在生物傳感器表面上的可見度，盡管鏈霉抗生物素蛋白分子本身的分子量為60kDa，但衍生化的珠的分子量可以為任何大小，包括，例如，60KDa。大型珠的結(jié)合，會(huì)導(dǎo)致生物傳感器表面上光密度的大的改變，并且產(chǎn)生容易檢測(cè)到的信號(hào)。該方法可使靈M分辨率增加大約1000x。使用傳感器的方法本發(fā)明的傳感器可用于平行研究一種或多種特異性結(jié)合物質(zhì)/結(jié)合伴侶相互作用。通過將一種或多種結(jié)合伴侶施加于表面上固有一種或多種特異性結(jié)合物質(zhì)的生物傳感器上，無需使用標(biāo)記，即可檢測(cè)一種或多種特異性結(jié)合物質(zhì)與它們各自的結(jié)合伴侶的結(jié)合。例如，用光照射SWS生物傳感器，檢測(cè)來自生物傳感器的最大反射光波長(zhǎng)或最小透射光波長(zhǎng)。如果一種或多種特異性結(jié)合物質(zhì)已結(jié)合于它們各自的結(jié)合伴侶，那么相比于一種或多種特異性結(jié)合物質(zhì)未結(jié)合于它們各自的結(jié)合伴侶的情況，反射光波長(zhǎng)發(fā)生了偏移.當(dāng)用一系列含有一種或多種特異性結(jié)合物質(zhì)的獨(dú)特位置涂敷SWS生物傳感器時(shí)，檢測(cè)來自生物傳感器的各獨(dú)特位置的最大反射光波長(zhǎng)或最小透射光波長(zhǎng).可將多種特異性結(jié)合物質(zhì)(例如抗體)以陣列形式固定在生物傳感器上。然后，使生物傳感器與含有結(jié)合伴侶(例如蛋白)的感興趣測(cè)試樣品接觸。只有與固定在生物傳感器上的抗體特異性結(jié)合的蛋白才能保持結(jié)合于生物傳感器上。該方法基本上是酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定的大恥漠形式；然而，不需要使用酶或熒光標(biāo)記?？赏ㄟ^將一種或多種酶施加于已固定了一種或多種特異性結(jié)合物質(zhì)的生物傳感器上來檢測(cè)酶的活性，例如，洗滌生物傳感器并用光照射，來自檢測(cè)生物傳感器反射光波長(zhǎng)。當(dāng)一種或多種酶通過酶促活性改變了生物傳感器上的一種或多種特異性結(jié)合物質(zhì)時(shí)，反射光波長(zhǎng)發(fā)生偏移，另外，可將測(cè)試樣品(例如含有結(jié)合伴侶的細(xì)胞裂解物)施加于生物傳感器，然后洗滌以除去未結(jié)合的材料?？蓮纳飩鞲衅魃舷疵摻Y(jié)合于生物傳感器的結(jié)合伴侶，用例如質(zhì)謙法鑒定。任選地，可將噬菌體DNA展示庫(kù)施加于本發(fā)明的生物傳感器，然后洗滌以除去未結(jié)合的材料?？煞蛛x結(jié)合于生物傳感器的單獨(dú)的噬菌體顆粒，并對(duì)這些噬菌體顆粒中的插入物測(cè)序以確定結(jié)合伴侶的身份(identity)。對(duì)上述應(yīng)用而言，尤其是對(duì)于蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用而言，將諸如來自測(cè)試樣品的結(jié)合伴侶等材料選擇性地結(jié)合到本發(fā)明生物傳感器的能力，和其后從生物傳感器的獨(dú)特位置選擇性地除去結(jié)合材料以用于進(jìn)一步分析的能力是非常有利的。本發(fā)明生物傳感器還能夠通過測(cè)定光的反射波長(zhǎng)的偏移來檢測(cè)并定量樣品中結(jié)合到生物傳感器陣列獨(dú)特位置的結(jié)合伴侶的數(shù)量，例如，可將一個(gè)特定生物傳感器位點(diǎn)的波長(zhǎng)偏移與其他特定生物傳感器位點(diǎn)的陽(yáng)性和陰性對(duì)照進(jìn)行比較，以確定結(jié)合于生物傳感器陣列獨(dú)特位置的結(jié)合伴侶的數(shù)量。阻斷生物傳感器表面上的非特異性結(jié)合糖(例如海藻糖和葡聚糖)可用于減少固定在生物傳感器表面上的特異性結(jié)合物質(zhì)與溶液中其他小分子和蛋白之間的非特異性相互作用?？捎糜诒景l(fā)明的糖包括例如單糖、二糖、三糖、四糖、五糖及其他多糖和寡糖例如葡聚糖。糖是非蛋白性物質(zhì)，可用于阻斷或減少分子與蛋白涂覆的生物傳感器表面(例如傳感器板)等物質(zhì)的非特異性結(jié)合。糖不干涉特異性蛋白-配體相互作用(例如鏈霉抗生物素蛋白-生物素相互作用)。如本文所用，"寡糖"指具有約3-10個(gè)單糖單元的糖，"多糖"指具有多于約10個(gè)單糖單元但可具有多于3000個(gè)單糖單元的糖。葡聚糖是復(fù)雜的、分支多糖的例子，其由多個(gè)葡萄糖分子結(jié)合成不同長(zhǎng)度的鏈而構(gòu)成，糖可用于封閉例如胺-官能化表面、^-官能化表面和氯基官能化表面。可通過例如實(shí)施例3和實(shí)施例4描述的方法檢測(cè)非特異性結(jié)合的減少。這些糖阻斷劑(例如二糖阻斷劑)還可用作運(yùn)輸?shù)鞍淄扛舶鍟r(shí)的存儲(chǔ)溶液。例如，將所需蛋白固定在菘官能化生物傳感器表面上后，例如將鏈霉抗生物素蛋白固定在傳感器板上之后，在包裝前將海藻糖溶液加到板上。海藻糖結(jié)合于^表面并阻斷任何剩余的醛基.當(dāng)接收者接收生物傳感器時(shí)，預(yù)先用二糖分子阻斷表面，糖提供了一種惰性方式，保持板濕潤(rùn)或穩(wěn)定而不允許發(fā)生可能會(huì)損壞板的功能的化學(xué)反應(yīng)。這種實(shí)施方式中，糖作為暫時(shí)的保護(hù)基。認(rèn)為糖與醛形成了半縮醛，產(chǎn)生短暫的"共價(jià)"鍵，這種鍵可通過簡(jiǎn)單的氧化還原化學(xué)而容易地除去/逆轉(zhuǎn)，如果在加糖之前將蛋白加到表面上，則糖通過在非常鄰近固定化蛋白質(zhì)處保持重要的、維持水分子的結(jié)構(gòu)層而起到穩(wěn)定蛋白的作用.由于它們的分子大小和均一的高度疏水性，糖不干涉特異性蛋白-配體相互作用(例如鏈霉抗生物素蛋白-生物素相互作用).糖還具有維持蛋白不變性的作用。添加糖使固定有蛋白的表面能夠以更穩(wěn)定的狀態(tài)運(yùn)輸并可能以半千狀態(tài)運(yùn)輸。用于本發(fā)明的糖包^E原糖和非還原糖。還原糖含有醛基，其成員包括例如果糖、葡萄糖、甘油眵、乳糖和麥芽糖。由于還原糖可與胺反應(yīng)，可用還原糖(例如甘油^)封閉胺官能化表面。單糖也可附著于胺-官能化表面。可用含有醛基還含有羥基的糖封閉搭官能化表面。還原糖和非還原糖均含有羥基，可與傳感器的醛官能化表面上的醛基反應(yīng)，從而封閉表面，海藻糖和蔗糖屬于非還原糖類，因?yàn)樗鼈儾缓写罨?。醛官能化表面可用于附著蛋白。糖可與醛反應(yīng)并阻斷它們，從而防止蛋白與表面上的未結(jié)合于特異性結(jié)合物質(zhì)的醛基反應(yīng).本發(fā)明的表面也可含有一些胺基。例如，高密度胺表面(其轉(zhuǎn)化為含有^的表面)上可能不是所有胺基均轉(zhuǎn)變，因此表面上仍保留了一些胺基。因此，還原糖和非還原糖均可用于阻斷表面上的胺和醛基，從而在檢測(cè)期間作為分析物加入的蛋白僅結(jié)合于固定的蛋白，而不結(jié)合于表面上含有胺和搭基的其他部分。據(jù)信，海藻糖及其他二糖分子可能是經(jīng)由半縮搭附著于將靶蛋白固定在表面上之后仍未反應(yīng)的醛官能團(tuán)。這種鍵可通過簡(jiǎn)單的氧化還原化學(xué)逆轉(zhuǎn)，并可使其在通常試驗(yàn)的僅約幾小時(shí)的時(shí)間范圍中保持穩(wěn)定，因此，海藻糖似乎以穩(wěn)定的方式結(jié)合于搭表面。本發(fā)明的一種實(shí)施方式提供一種生物傳感器，其包含結(jié)合于表面附著的醛基的多種特異性結(jié)合物質(zhì)和結(jié)合于表面附著的醛基的多種糖分子。也就是說，生物傳感器被醛-官能化，將糖和特異性結(jié)合物質(zhì)加到生物傳感器上，從而特異性結(jié)合物質(zhì)和糖結(jié)合于生物傳感器表面附著的膝基。本發(fā)明另一種實(shí)施方式提供一種包裝，其容納生物傳感器和含有糖分子的存貯溶液，所述生物傳感器具有結(jié)合于表面附著的醛基的特異性結(jié)合物質(zhì)。表面附著的醛基是加到表面上4吏其成為搭官能化表面的胺基。本文說明性地描述的本發(fā)明可合適地在缺乏本文未明確公開的任何一種或多種要素、一種或多種限制的情況下付諸實(shí)施，因此，例如，在本文每種情況下，任一術(shù)語"包括"、"基本由……組成》和"由……組成"可由另兩個(gè)術(shù)語中的任一個(gè)替換而保留了其普通含義.已采用的術(shù)語和表達(dá)方式是用作描述性術(shù)語，而非限制性的，并且沒有任何意圖在使用這些術(shù)語和表達(dá)方式時(shí)排除任何已顯示的和已描述的等同特征或者其一部分，但應(yīng)當(dāng)意識(shí)到在所宣稱的本發(fā)明的范圍內(nèi)可作出各種修改。因此，應(yīng)當(dāng)理解雖然已經(jīng)通過實(shí)施方式和可選的特征詳細(xì)公開了本發(fā)明，但本文所公開的概念的修改和變化也應(yīng)被視為在說明書和所附權(quán)利要求界定的本發(fā)明范圍內(nèi)。此外，當(dāng)本發(fā)明的特征和方面以可選方案的馬庫(kù)什組或其他可選擇要素組進(jìn)行描述時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到本發(fā)明也因此根據(jù)所迷馬庫(kù)什組或其他組的任何獨(dú)立成員或成員亞組(subgroup)進(jìn)行了描述。提供以下實(shí)施例只是用于說明目的，而不希望限定上面以廣義形式描述的本發(fā)明的范圍.在4^>開內(nèi)容中引用的所有參考文獻(xiàn)都通過參考納入本文。實(shí)施例1SWS生物傳感器的制造SWS生物傳感器的詳細(xì)制造工藝以前已有描述。參見例如，Qmningham等，^附w朋^Mc似atorsB6779，1-6(2002)，通過參考納A^文。具體而言，使用光學(xué)級(jí)聚合物薄膜作為SWS傳感器的支持物。將可用紫外線固化的丙烯酸基聚合物涂層涂覆在薄膜上，用具有96個(gè)圏(circle)(與96孑L微滴定板的標(biāo)準(zhǔn)格式對(duì)應(yīng)，所述圍形成SWS結(jié)構(gòu))的磋掩膜(smconmask)復(fù)制。復(fù)制(replication)后，用XenonCorporation(Wobum，MA)提供的紫外燈RC600固化涂層，然后，將二氧化鈥層和二氧化硅(siliconedioxide)層沉積在表面頂端。固定一種或多種特異性結(jié)合物質(zhì)對(duì)比色共振反射生物傳感器使用下述規(guī)程，以便用胺官能團(tuán)使所述表面官能化。胺基可用作用于后續(xù)幾種類型的接頭分子的共價(jià)結(jié)合的通用表面。通過將玻璃基片生物傳感器浸在Piranha蝕刻劑(etch)(M酸/過氧化氫)中12小時(shí)來使其清潔。用水徹底地洗滌該生物傳感器。將生物傳感器浸在溶于無水丙酮的3%3-氨丙基-三乙|^^睡烷溶液中l(wèi)分鐘，然后用無水丙酮漂洗并風(fēng)千。然后用水洗滌生物傳感器.用半定量法驗(yàn)證生物傳感器表面上氨基的存在.用5mL的50mM碳酸氫鈉(pH8.5)短暫洗涂來自每一批氨基官能化生物傳感器的一個(gè)生物傳感器。然后將生物傳感器浸在含有0.1raM硫代-琥珀銑亞胺基的5mL50mM碳酸氫鈉(pH8.5)中，劇烈振蕩30分鐘，將3.0mg的s-SDTB溶解在lmLDMF中，并用50mM碳酸氦鈉(pH8.5)稀釋至50mL來制備s-SDTB溶液。30分鐘溫育后，用20mLddH20洗滌生物傳感器三次，然后用5mL30%高氯酸處理。出現(xiàn)橙色溶液，表明生物傳感器已成功地被胺官能化；未經(jīng)處理的玻璃生物傳感器^見察到顏色變化，在上述程序之后，通過高氯酸處理后的該溶液在495nm的吸光度可用作表面上胺基的數(shù)量的指示。一套試驗(yàn)中，Sigma栽玻片、Cel-Associate栽玻片和內(nèi)部(in-house)生物傳感器載玻片的吸光度分別是0.627、0.647和0.728。這表明生物傳感器表面的NH2官能化水平與通過商業(yè)途徑獲得的官能化微陣列玻璃栽片相當(dāng)。遵循上述用胺使生物傳感器官能化的目之后，可將接頭分子附著于生物傳感器。選擇交聯(lián)劑時(shí)，應(yīng)考慮例如活性基團(tuán)的選擇性、間隔臂長(zhǎng)度、溶解度、可裂解性(ceavability)等問題。反過來，接頭分子結(jié)合用于特異性識(shí)別結(jié)^M呂的特異性結(jié)合物質(zhì)。作為例子，用下文所述規(guī)程將生物素接頭分子結(jié)合至胺官能化生物傳感器.用生物素使胺涂覆的生物傳感器官能化的M^用PBS(pH8.0)洗滌胺涂覆的生物傳感器三次。在PBS緩沖液(pH8)中制備濃度為0.5mg/ml的硫代琥珀酰亞胺基-6-(生物素酰氨基)已酸酯(硫代-NHS-LC-生物素，Pierce,Rockford，IlUnois)溶液。向各胺涂覆的生物傳感器上添加2ml硫代-NHS-LC生物素溶液，室溫下溫育30分鐘。用PBS(pH8.0)洗滌生物傳感器三次，所述疏代-NHS-LC生物素接頭的分子量為556.58，長(zhǎng)度為22.4。得到的生物傳感器可用于捕獲抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白分子.用醛胺使涂覆的生物傳感器官能化的規(guī)程在O.lM磷酸鈉和O.P/oll^鄰氫化鈉(pH7.0)中制備2.5%的戊二眵溶液。向各胺涂覆的生物傳感器添加2ral戊二醛溶液，室溫下溫育30分鐘。用PBS(pH7.0)洗滌生物傳感器三次，戊二i^頭的分子量為100.11,得到的生物傳感器可用于結(jié)合蛋白及其他含有胺的分子。該反應(yīng)通過形成希夫堿來進(jìn)行，隨后的還原性胺化產(chǎn)生穩(wěn)定的仲胺鍵，一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，將涂覆醛的栽玻片與可通過商業(yè)途徑獲得的搭栽玻片(Cel-Associate)比較，觀察到用上述方法制各的栽玻片上鏈霉抗生物素蛋白和抗-兔lgG的結(jié)合高出10倍.用NHS使胺涂覆的生物傳感器官能化的規(guī)程26在碳酸鈉緩沖液(pH8.S)中制備25mM的二琥珀酰亞胺基碳酸酯(DSC，SigmaChemicalCompany,St.Louis,Missouri)溶液，向各胺涂覆的生物傳感器上添加2mlDSC溶液，室溫下溫育2小時(shí)，用PBS(pH8.5)洗滌生物傳感器三次。DSC接頭的分子量為256.17,得到的生物傳感器用于結(jié)^^有羥基或胺的分子，該接頭是可獲得的最小的同基雙功能NHS酯交聯(lián)劑之一。除上述規(guī)程之外，已報(bào)道了很多另外的表面官能化和分子接頭技術(shù)，這些技術(shù)針對(duì)不同類型的生物分子優(yōu)化了檢測(cè)性能。這些技術(shù)中最常見的是胺表面、醛表面和鎳表面。然后，如表2所示，這些官能化表面可用于將幾種不同類型的化學(xué)接頭附著于生物傳感器表面，胺表面用來附著幾種類型的接頭分子，但搭表面用來直接結(jié)合蛋白而無需另外的接頭，鎳表面專門用于結(jié)合具有摻入的組氨酸("his")標(biāo)記的分子.用鎳活化的表面檢測(cè)"組氨酸標(biāo)記的"分子是本領(lǐng)域z〉知的(Sigal等(1996)Anal.Chem.，vol.68，p.490)。表1說明了用于制造和使用生物傳感器的步驟的順序以及可用于表面官能化化學(xué)、化學(xué)接頭分子、特異性結(jié)合物質(zhì)和結(jié)合伴侶分子的各種選擇的實(shí)例。還存在通過用較大的分子(例如HRP或鏈霉抗生物素蛋白)來進(jìn)行放大，和使用聚合物材料(例如葡聚糖或TSPS)來增加可用于分子結(jié)合的表面積，從而增強(qiáng)所檢測(cè)到的信號(hào)的可能性，表1<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>實(shí)施例2醛表面官能化和測(cè)試以下實(shí)施例在比色共振生物傳感器表面上提供化學(xué)官能團(tuán)以結(jié)合蛋白、肽、核酸、細(xì)胞、小分子、小的有機(jī)分子、其它化學(xué)和/或生物分子等等。蛋白質(zhì)組學(xué)、基因組學(xué)、醫(yī)藥、藥物發(fā)現(xiàn)、診斷學(xué)、環(huán)境、化學(xué)和類似的研究領(lǐng)域和/或工業(yè)界對(duì)這些化學(xué)官能團(tuán)非常感興趣.該實(shí)施例致力于開發(fā)一種涂覆方法，該方法利用不改變或降解生物傳感器結(jié)構(gòu)的化學(xué)試劑提供了高密度官能性醛結(jié)合位點(diǎn)。該實(shí)施例解決的另一個(gè)問題是開展一種測(cè)試方法來驗(yàn)證比色共振生物傳感器的官能化表面上的搭結(jié)合位點(diǎn)的存在。傳感器表面已預(yù)先涂覆有表面胺基。用胺涂覆傳感器表面的一種簡(jiǎn)單方法是將清潔的表面直接暴露于聚賴氨酸，一個(gè)例子是用于微陣列印刷的玻璃載玻片表面。用胺涂覆表面的一種可選方案是將胺-涂覆分子共價(jià)附著在表面上，例如將硅烷附著在玻璃上或?qū)⒘虼几街诮鹕?，這兩種情況均是公知的。也可通過商業(yè)途徑(例如CELAssociates和NoAbBioDiscoveries，見下文)獲得一些酪改性的栽玻片用于印刷陣列。該實(shí)施例描述了一種方法，該方法在比色共振生物傳感器表面上提供了高密度官能性^結(jié)合位點(diǎn)，而沒有改變或降解生物傳感器的結(jié)構(gòu)。為了驗(yàn)證搭基的存在，當(dāng)前的比色和熒光方法通常使用溶液中的樣品，這種樣品的檢測(cè)可比千;^面上的檢測(cè)更靈敏，已證明，在干燥和不平的(即不是完全平坦的)表面上進(jìn)行厚度小于約50埃的化學(xué)基團(tuán)的表面鑒定非常困難。比色共振生物傳感器表面可用胺基官能化，其中該表面可以是如本文所述包含塑料、玻璃、環(huán)氧樹脂、或聚合物基片的生物傳感器?？捎门己暇彌_液清洗胺-官能化表面。可在pH約7.4的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中配制偶合緩沖液?？蓪⒑蟹栈饸浠}的醛溶液添加到生物傳感器表面。搭溶液可包含含有約100mM氰基硼氫化鹽的約10°/。的戊二餒?？稍试S表面在約室溫下靜置例如約4小時(shí)?？捎美缗己暇彌_液洗滌生物傳感器表面，為了測(cè)試生物傳感器表面上醛基的存在，可使用多種方法，包括但不限于放射性方法、比色、熒光、X射線光電子光諳(XPS)、傅里葉變換紅外光語(FTIR)、原子力顯微術(shù)(AFM)，等等，用于搭表面官能化的熒光測(cè)試可包括例如，將經(jīng)搭處理的和未經(jīng)處理的生物傳感器切割成2x2ci^的片?？蓪⑷┩扛驳谋砻姹┞队跓晒馊玖希摕晒馊玖夏軌虮豢梢姽饧ぐl(fā)。例如，使用配制在PBS(pH7.4)溶液中的熒光肼衍生物如ALEXA647-肼(MolecularProbes,Portland,OR)，該染料的終濃度可以為約100pg/mL,可將約lOOpL染料溶液分配在一片蓋玻片上，將生物傳感器片面朝下(facedown)置于染料溶液上?？捎谑覝販赜玖虾蜕飩鞲衅骷sl小時(shí)，可丟棄蓋玻片和染料溶液，可清洗生物傳感器表面，例如在去離子蒸熘水中清洗3次，可將生物傳感器片置于培一(含例如約20mL去離子蒸餾水)中，在搖動(dòng)平臺(tái)上洗滌約1小時(shí)，用N2干燥生物傳感器片?？捎盟螌⑸飩鞲衅髌瑝涸诓Ａг圆Ｆ希美鏏ffymetrix⑧428TM掃描儀掃描。讀取各生物傳感器片的熒光從而確定醛結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)量.比色共振生物傳感器包含例如如本文所迷的沉積在含有低折射率材料的光柵上的高折射率材料.高折射率材料可以是例如疏化鋅、二氧化鈦、氧化銦錫、氧化鉭或氮化硅，而低折射率材料可以是例如玻璃、塑料、聚合物或環(huán)氧樹脂。一種實(shí)施方式中，任選用Si02涂覆生物傳感器的高折射率材料，所用的比色生物傳感器表面上的眵涂層可以是任何厚度，包括小于約50埃。另外，生物傳感器表面可以是不平的(即，不平坦)。在檢測(cè)搭表面活化之前，生物傳感器表面可以是千燥的，使用上迷^官能化規(guī)程和熒光測(cè)試方法，相對(duì)于未用醛表面官能化的生物傳感器，搭涂覆的帶染料的生物傳感器通常顯示至少10倍的熒光過量.表2表示對(duì)未進(jìn)行醛官能化(空白)的塑料生物傳感器和醛-官能化生物傳感器的比較，所述所有生物傳感器均處于熒光測(cè)試程序中。該規(guī)程和方法顯示，涂覆的醛的表面密度高于商業(yè)供應(yīng)商(例如CELAssociates,TX和NoAbBioDiscoveries，(Mississauga，ON，加拿大))所使用的方法獲得的密度。表3顯示了沒有醛官能化的玻璃栽片(空白，所示為4個(gè)樣品的平均值)和醛-官能化栽玻片的比較，這些玻璃栽片或栽玻片由商業(yè)供應(yīng)商(Cel-Associate和NoAb)的方法或本發(fā)明方法獲得，均進(jìn)行了熒光測(cè)試程序。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>也可用蛋白結(jié)合試驗(yàn)測(cè)試醛表面官能化。例如，可在PBS中制備A蛋白的約100ig/mL溶液，pH約7.4,將其添加到餒涂覆的和未經(jīng)處理的生物傳感器片上，于約室溫溫育約l小時(shí)。可用含1%(w/v)BSA的PBS溶液洗滌生物傳感器約3次。可在約室溫將生物傳感器片置于洗滌溶液中洗滌約15分鐘?？稍诩s室溫下，用約pH7.4的PBS緩沖液洗滌生物傳感器片，將合適抗體的標(biāo)記溶液添加到生物傳感器表面并溫育，例如，可使用20Mg/mL的兔抗-羊IgG-ALEXA647(MolecularProbes)溶液，黑暗中溫育生物傳感器大約30分鐘?？捎煤s0.05%TweenTM20的PBS緩沖液(約pH7.4)(PBST溶液)洗滌生物傳感器約3次.可用去離子水洗滌生物傳感器并用N2干燥。檢測(cè)可包括例如用Affymetrix428TM掃描儀掃描生物傳感器以獲得熒光讀數(shù)。使用醛涂覆工藝和蛋白結(jié)合試驗(yàn)方法，已證明眵涂覆的生物傳感器對(duì)A蛋白/IgG的結(jié)合比未涂敷、并經(jīng)過同樣的A蛋白/IgG處理的生物傳感器高約5倍(參見表4)。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>表5顯示當(dāng)搭官能化的基于塑料的比色共振生物傳感器陣列順序地暴露于PBS、BSA和抗-BSA時(shí)如何反應(yīng)。同時(shí)監(jiān)測(cè)六個(gè)生物傳感器。步驟1中，將所有的生物傳感器暴露于PBS(pH7.4)溶液以獲得關(guān)于生物傳感器的基線。然后，步驟2中，將傳感器3-6暴露于0.5mg/mL的BSA(在PBS中配制)，而生物傳感器1和2(用作參比)仗暴露于PBS。在BSA結(jié)合的生物傳感器上觀察到約0.38nm的平均信號(hào)，而參比生物傳感器保持在基線水平。最后，步驟3中，傳感器3和4暴露于0.5mg/mL的抗-BSA，而生物傳感器1和2再次僅暴露于PBS。發(fā)現(xiàn)抗-BSA對(duì)BSA的結(jié)合(生物傳感器3和4)產(chǎn)生高于基線的另外約1.4nm的信號(hào)。作為對(duì)照，該步驟中，生物傳感器5和6分別暴露于PBS和0.5mg/mL的BSA，此時(shí)它們的反應(yīng)仍保持步驟2的水平，表5暴露于溶液步驟1信號(hào)波步稞2信號(hào)波步驟3信號(hào)波長(zhǎng)偏移Oim)長(zhǎng)偏移(nm)長(zhǎng)偏移(nm)傳感器l步驟1PBS+-參比步驟2PBS+0.000-0.009-0.020步驟3PBS傳感器2步驟1PBS+-參比步驟2PBS+0扁0.0090.020步驟3PBS傳感器3步驟1PBS+一樣品步驟2BSA+步騍3抗BSA-0.0020.3841.473傳感器4步驟1PBS+-樣品步驟2BSA+步驟3抗BSA-0.0020.3S01.425傳感器5步驟1PBS+—對(duì)照步驟2BSA+步驟3PBS0.0000.3890.398傳感器6步騍1PBS+-對(duì)照步棵2BSA+步驟3BSA-O駕0.3800.390由于可使用眵涂覆的表面進(jìn)行寬范圍的檢測(cè)應(yīng)用，本文所述的程序、方法和結(jié)果可得到廣泛應(yīng)用，包括但不限于蛋白，肽、核酸、細(xì)胞、小分子、小的有機(jī)分子、其他的化學(xué)和/或生物分子等的結(jié)合.包括蛋白質(zhì)組學(xué)、基因組學(xué)、醫(yī)藥、藥物發(fā)現(xiàn)、診斷學(xué)、環(huán)境、化學(xué)等很多領(lǐng)域?qū)Υ祟悜?yīng)用非常感興趣。實(shí)施例3用5V。海藻糖封閉鏈霉抗生物素蛋白(SA)表面將40h15%的海藻糖溶液加到固定有SA的孔(0.05mg/mlSA和0.2mg/mlSA)和對(duì)照孔(僅有海藻糖)中，使其結(jié)合2小時(shí)，洗涂板，測(cè)定峰值波長(zhǎng)(PWV)偏移(見表6和圖2)。SA偏移是SA結(jié)合到醛表面的PWV,而阻斷劑偏移是允許阻斷劑結(jié)合到固定有SA的醛表面上的未>^應(yīng)搭官能團(tuán)后獲得的PWV偏移小阻斷劑比較大的SA分子更容易接近未反應(yīng)的醛.較高的SA濃度使阻斷劑的偏移較低，可能是由于這些孔中可結(jié)合阻斷劑的醛較少。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>實(shí)施例4海藻糖減少非特異性結(jié)合的效力為了測(cè)試海藻糖減少非特異性結(jié)合的效力，測(cè)定海藻糖減少胎牛血清(FBS)結(jié)合SA表面的能力，使市售10。/。和100。/。FBS與SA表面反應(yīng)，所述SA表面的PWV偏移為2nm或5.8nm，測(cè)定產(chǎn)生的偏移(參見表7和困3)。通過將表面被封閉之后產(chǎn)生的信號(hào)認(rèn)為是0或基線將偏移歸一化為海藻糖偏移，表7<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>這些結(jié)果表明，F(xiàn)BS結(jié)合于表面上未反應(yīng)的搭。另外，這些結(jié)果證明，即使在SA低固定密度下(表面上仍有較多可用的未反應(yīng)醛基)，用海藻糖封閉仍減少了非特異性結(jié)合。海藻糖減少了來自FBS的蛋白與SA表面的非特異性結(jié)合。5.8rnnSA表面觀察到最高的偏移減少，表明阻斷劑的最優(yōu)選擇依賴于固定的靶蛋白的表面密度。換句話說，對(duì)于低表面密度而言(表面覆蓋稀疏)，可使用小分子阻斷劑或大分子阻斷劑(例如惰性蛋白)。然而，對(duì)于高表面密度而言(表面的蛋白覆蓋率高)，阻斷劑應(yīng)小到足夠穿透蛋白層并結(jié)合于未反應(yīng)的醛。選擇阻斷劑的另一個(gè)考慮是表面的預(yù)期用途.用于例如蛋白-蛋白相互作用(如抗體篩選)應(yīng)用的表面一般具有低密度靶蛋白，而高固定密度表面用于例如小分子結(jié)合的檢測(cè)，例如藥物篩選，實(shí)施例5海藻糖對(duì)特異性蛋白-蛋白相互作用的影響為了測(cè)試海藻糖對(duì)特異性蛋白-蛋白相互作用的影響，測(cè)定海藻糖干涉生物素與SA表面結(jié)合的能力。使10%或100%FBS中的生物素與SA表面反應(yīng)，所迷SA表面的PWV偏移為5.8nm,檢測(cè)產(chǎn)生的偏移(參見表8)。生物素結(jié)合產(chǎn)生的理論偏移(顯示在括號(hào)中)由以下公式計(jì)算(生物素分子量/SA分子量)xSA上生物素結(jié)合位點(diǎn)數(shù)目xSA偏移，或(244/55000)x4(結(jié)合位點(diǎn))x5.8nm(SA偏移)。所有情況下均觀察到清晰的生物素結(jié)合信號(hào)。因此，海藻糖似乎不像其它阻斷劑一樣影響生物素結(jié)合。表8<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>實(shí)施例6海藻糖對(duì)HSA-華法林蛋白-小分子系統(tǒng)的影響海藻糖可用于減少其它蛋白-小分子系統(tǒng)的非特異性結(jié)合。例如，海藻糖可阻斷與人血清白蛋白(HSA)和華法林的相互作用相關(guān)的非特異性結(jié)合。試驗(yàn)在T/oDMSO中進(jìn)行，用5。/。海藻糖阻斷HSA,結(jié)果示于表8和閨4。海藻糖對(duì)華法林與表面的非特異性相互作用的阻斷使得能夠檢測(cè)小于lnM的與HSA的特異性結(jié)合。如果不添加海藻糖，難以檢測(cè)到如此低濃度的結(jié)合。<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>實(shí)施例7海藻糖對(duì)碳酸酐酶(CA)-羧基磺跣胺(Carboxysulfonamide)(CBS)蛋白-小分子系統(tǒng)的影響海藻糖可用于減少其它蛋白-小分子系統(tǒng)的非特異性結(jié)合。例如，海藻糖可阻斷與CBS和碳酸酐酶的相互作用相關(guān)的非特異性結(jié)合。用5。/。海藻糖封閉CA表面.結(jié)果示于表9和圖5。海藻糖對(duì)CBS與表面的非特異性相互作用的阻斷使得能夠檢測(cè)小于1nM的與CA的特異性結(jié)合。如果不添加海藻糖，難以檢測(cè)到如此低濃度的結(jié)合，<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>權(quán)利要求1.減少表面上的非特異性結(jié)合的方法，其中，所述表面是醛官能化的、胺官能化的或它們的組合，所述方法包括用糖分子處理表面，從而減少該表面上的非特異性結(jié)合。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，糖分子包括二糖。3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述二糖是海藻糖分子或包含海藻糖分子。4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述糖分子是硫酸葡聚糖或包含硫酸葡聚糖。5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所il^面是生物傳感器表面。6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述生物傳感器是比色共振反射生物傳感器。7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所迷糖分子包括單糖、二糖、多糖、三糖、四糖、五糖、或它們的組合。8.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所ii^面是胺官能化表面。9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述糖分子包括乳糖、甘油醛或它們的組合。10.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述糖分子包括海藻糖和乳糖。11.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所迷糖分子包括海藻糖和甘油眵。12.生物傳感器，其包含結(jié)合于表面附著的搭基的多種特異性結(jié)合物質(zhì)以及結(jié)合于表面附著的搭基的多種糖分子。13.如權(quán)利要求12所述的生物傳感器，其中，所述糖分子包括二糖。14.如權(quán)利要求13所迷的生物傳感器，其中，所述二糖是海藻糖分子。15.如權(quán)利要求15所述的生物傳感器，其中，所迷糖分子是二糖。16.如權(quán)利要求13所述的生物傳感器，其中，所述二糖是海藻糖分子。17.如權(quán)利要求12所述的生物傳感器，其中，所述糖分子包括葡聚糖。18.如權(quán)利要求12所述的生物傳感器，其中，所述糖分子是葡聚糖，19.如權(quán)利要求12所述的生物傳感器，其中，所述特異性結(jié)合物質(zhì)是蛋白。20.如權(quán)利要求19所述的生物傳感器，其中，所述蛋白包括鏈霉抗生物素蛋白。21.包裝，其含有生物傳感器和包含糖分子的存貯溶液，所述生物傳感器含有結(jié)合于表面附著的醛基的特異性結(jié)合物質(zhì)。22.如權(quán)利要求21所述的包裝，其中，所述糖分子包括二糖。23.如權(quán)利要求22所述的包裝，其中，所述二糖包括海藻糖，24.如權(quán)利要求21所述的包裝，其中，所述糖分子包括葡聚糖。25.如權(quán)利要求21所述的包裝，其中，所述糖分子是葡聚糖。全文摘要本發(fā)明提供一種阻斷表面例如蛋白涂覆的生物傳感器表面上的非特異性蛋白結(jié)合的方法。文檔編號(hào)G01N33/543GK101646943SQ200780048736公開日2010年2月10日申請(qǐng)日期2007年10月26日優(yōu)先權(quán)日2006年10月31日發(fā)明者G·喬吉卡爾馬斯申請(qǐng)人:Sru生物系統(tǒng)公司