一種規(guī)?；苽淙饲傲邢侔﹑c-3細(xì)胞的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用生物反應(yīng)器擴(kuò)增人前列腺癌PC?3細(xì)胞的方法，所述的方法可以高效地培養(yǎng)出大量人前列腺癌PC?3細(xì)胞，所獲得的人前列腺癌PC?3細(xì)胞活力良好。本領(lǐng)域尚沒有成功大規(guī)模擴(kuò)增獲得人前列腺癌PC?3細(xì)胞的先例，本發(fā)明提供的技術(shù)方案填補(bǔ)了人前列腺癌PC?3細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)的技術(shù)空白。本發(fā)明獲得低血清馴化的前列腺癌PC?3細(xì)胞，使用1％(v/v)低血清培養(yǎng)基進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)，大大減少了大規(guī)模培養(yǎng)前列腺癌細(xì)胞的生產(chǎn)成本。本發(fā)明的方法適用于大規(guī)模生產(chǎn)，可以短時間內(nèi)獲得大量的人前列腺癌PC?3細(xì)胞、便于前列腺癌治療性疫苗的制備。
【專利說明】
一種規(guī)模化制備人前列腺癌PC-3細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用生物反應(yīng)器規(guī)?；苽淙饲傲邢侔㏄C-3細(xì)胞的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]前列腺癌的發(fā)病率在不斷升高，已成為危害我國老年男性健康的最常見惡性腫瘤之一。臨床初步確診的前列腺癌患者50?80%已經(jīng)發(fā)生骨或軟組織的轉(zhuǎn)移，采取手術(shù)和放化療的方式都不能達(dá)到根治性治療。
[0003]免疫療法是一種很有潛力的治療CRPC(去勢難治性前列腺癌)的方法，通過識別接種的前列腺疫苗的腫瘤抗原和腫瘤相關(guān)抗原來主動激活自身免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)機(jī)體對腫瘤的特異性免疫反應(yīng)，從而阻止腫瘤的生長、擴(kuò)散和復(fù)發(fā)。利用細(xì)胞膜表面錨定修飾技術(shù)即可制備前列腺癌治療性疫苗，即利用細(xì)胞膜表面蛋白質(zhì)的伯氨易生物素化以及生物素與鏈親和素的高效而超強(qiáng)結(jié)合的這兩個特性，大量制備的前列腺癌細(xì)胞經(jīng)酒精處理后滅活，經(jīng)生物素化試劑將生物素交聯(lián)到欲修飾的腫瘤細(xì)胞表面，然后鏈親和素標(biāo)記的免疫刺激因子雙功能融合蛋白借助鏈親和素與生物素的特異結(jié)合將免疫刺激因子錨定在腫瘤細(xì)胞表面，從而制備出前列腺癌治療性疫苗。
[0004]人前列腺癌PC-3細(xì)胞可用于制備前列腺癌治療性疫苗，該腫瘤疫苗應(yīng)用于臨床和臨床前研究需要大量的前列腺癌PC-3細(xì)胞。然而普通的細(xì)胞傳代所獲得的細(xì)胞數(shù)量有限，不能滿足于前列腺癌疫苗的臨床應(yīng)用。由于人前列腺癌PC-3細(xì)胞需要貼壁生長，實驗室使用培養(yǎng)瓶擴(kuò)增不但耗材消耗量大，而且時間的付出也多。生物反應(yīng)器和微載體培養(yǎng)技術(shù)是目前公認(rèn)的最有發(fā)展前途的動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)，廣泛用于培養(yǎng)各種類型的貼壁細(xì)胞，能夠一次性獲得大量細(xì)胞，既節(jié)省了大量的耗材，又節(jié)省了很多時間。但是本領(lǐng)域尚沒有成功大規(guī)模擴(kuò)增獲得人前列腺癌PC-3細(xì)胞的先例。
[0005]本領(lǐng)域迫切需要研究腫瘤細(xì)胞的大規(guī)模擴(kuò)增方法，以滿足科學(xué)研究以及臨床應(yīng)用所需，本發(fā)明提供的技術(shù)方案填補(bǔ)了人前列腺癌PC-3細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)的技術(shù)空白。另夕卜，本方案采用1%(ν/ν)低血清培養(yǎng)基進(jìn)行人前列腺癌PC-3細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)，節(jié)約了大規(guī)模培養(yǎng)的生產(chǎn)成本。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是，提供一種利用生物反應(yīng)器微載體低血清規(guī)?；苽淙饲傲邢侔㏄C-3細(xì)胞的方法。為實現(xiàn)以上技術(shù)目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
(I)低血清馴化:將前列腺癌PC-3細(xì)胞進(jìn)行低血清馴化，獲得低血清馴化的前列腺癌PC-3細(xì)胞；
(2 )轉(zhuǎn)瓶細(xì)胞培養(yǎng):將步驟(I)獲得的低血清馴化的人前列腺癌PC-3細(xì)胞，在培養(yǎng)瓶中傳代擴(kuò)增。當(dāng)細(xì)胞擴(kuò)增到一定數(shù)量后，將細(xì)胞接種至轉(zhuǎn)瓶，在轉(zhuǎn)瓶中進(jìn)行PC-3細(xì)胞培養(yǎng)。設(shè)置轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)參數(shù):培養(yǎng)箱溫度為37°C，二氧化碳濃度為5%，轉(zhuǎn)瓶機(jī)轉(zhuǎn)速為4?12 r/h。將轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)得到的細(xì)胞作為接種生物反應(yīng)器的種子細(xì)胞；
(3)生物反應(yīng)器接種PC-3細(xì)胞:生物反應(yīng)器中預(yù)先加入含有l(wèi)%(v/v)FBS的DMEM/F12低血清培養(yǎng)基。將步驟(2)得到的PC-3細(xì)胞用0.25%(w/v)胰酶消化液消化，加入含有1%(ν/ν)FBS的DMEM/F12低血清培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，將細(xì)胞以I X 15?6 X 15 cells/ml的細(xì)胞密度接種到生物反應(yīng)器;加入已經(jīng)高壓滅菌的微載體Cytodex 3，微載體濃度為4g/L;補(bǔ)加含有l(wèi)%FBS(v/v)的DMEM/F12低血清培養(yǎng)基至終體積為5L。
[0007](4)控制各種參數(shù)進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng):將生物反應(yīng)器參數(shù)調(diào)節(jié)為培養(yǎng)溫度在37°C，pH維持在7.0-7.4,溶氧濃度在40%?60%，攪拌速度在35?80 rpm。培養(yǎng)48h后進(jìn)行灌流培養(yǎng)，灌流含有l(wèi)%(v/v)FBS的DMEM/F12低血清培養(yǎng)基。
[0008](5)收獲細(xì)胞:在生物反應(yīng)器培養(yǎng)一段時間，PC-3細(xì)胞鋪滿微載體后，排出上清液，收集微載體細(xì)胞，使用PBS溶液清洗兩遍，使用0.25%(w/v)胰酶消化微載體細(xì)胞5?15min，使用200目的篩網(wǎng)過濾，收獲PC-3細(xì)胞。
[0009]本發(fā)明的低血清馴化方法為:
(a)將細(xì)胞已2X105cells/ml密度接種至10%(v/v)FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48h，收獲接近90%匯合度的細(xì)胞。將細(xì)胞以相同的接種密度連續(xù)傳代培養(yǎng)3代，獲得穩(wěn)定增殖的細(xì)胞株；
(b)將(a)中收獲的細(xì)胞再以2X105cells/ml密度接種至含5%(v/v)FBS的DMEM/F12低血清培養(yǎng)基中，當(dāng)細(xì)胞生長至接近90%匯合度時，使用0.25%(w/v)胰酶進(jìn)行消化并收集細(xì)胞懸液，以相同的接種密度接種至含5% (v/v)FBS的DMEM/F12低血清培養(yǎng)基中連續(xù)傳代培養(yǎng)3代，獲得穩(wěn)定增殖的細(xì)胞株；
(c)將(b)中收獲的穩(wěn)定增殖細(xì)胞株重復(fù)(b)的流程依次接著至3%(v/v)FBS和1%(ν/ν)FBS血清的DMEM/F12低血清培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。本方案中使用的DMEM/F12低血清培養(yǎng)基是，以DMEM/F12作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，補(bǔ)加胰島素(10mg/l)、亞希酸鈉(2.5mg/l)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(7.5mg/I)、檸檬酸鐵(75mg/l)、EGF(20ng/ml)、bFGF(20ug/ml)、氫化可的松(2ng/l)，最終加入相應(yīng)濃度的FBS配制而成。
[0010]本發(fā)明的方法適用于大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)，可以短時間內(nèi)獲得大量的前列腺癌PC-3細(xì)胞，用于臨床前研究、臨床試驗等應(yīng)用。本發(fā)明提供的技術(shù)方案填補(bǔ)了人前列腺癌PC-3細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)的技術(shù)空白，所選培養(yǎng)條件適于人前列腺癌PC-3細(xì)胞生長，實現(xiàn)了前列腺癌PC-3細(xì)胞高密度培養(yǎng)，減少了后續(xù)的勞動強(qiáng)度。本發(fā)明在大規(guī)模培養(yǎng)過程中使用1%(ν/V)低血清培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，保證了細(xì)胞增殖所需的營養(yǎng)物質(zhì)，又大大減少了大規(guī)模培養(yǎng)前列腺癌細(xì)胞的生產(chǎn)成本。
【附圖說明】
[0011 ]圖1、人前列腺癌PC-3細(xì)胞規(guī)模化制備工藝的流程圖。
[0012]圖2、人前列腺癌PC-3細(xì)胞在生物反應(yīng)器中擴(kuò)增不同時間的細(xì)胞密度。
【具體實施方式】
[0013]通過以下實施例進(jìn)一步舉例描述本發(fā)明，并不以任何方式限制本發(fā)明。凡在本發(fā)明的申請范圍內(nèi)所做的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0014]下述實施例和實驗所用的材料及設(shè)備如下:
7.5L生物反應(yīng)器:美國NBS公司，型號為CelliGen 310，溫度、PH、攪拌、溶氧PID全自動控制，四氣混合控制供氣系統(tǒng)。微載體:Cytodex 3，美國GE公司。細(xì)胞系:人前列腺癌PC_3細(xì)胞，購自中科院上海細(xì)胞所。
[0015]實施例1:人前列腺癌PC-3細(xì)胞低血清馴化
從液氮罐中取凍存狀態(tài)的PC-3細(xì)胞，將凍存管投入37 °C溫水，不時搖動令其盡快融化，解凍I分鐘；將凍存管用酒精消毒后打開管蓋，吸出細(xì)胞懸液，加入到離心管并滴加適量DMEM/F12培養(yǎng)液，混合后低速離心，除去上清液，將細(xì)胞以2X105cells/ml密度接種至10%(v/v)FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基中。然后更換為DMEM/F12低血清培養(yǎng)基進(jìn)行傳代培養(yǎng)，并逐步將血清降低至1%，以此來低血清馴化細(xì)胞。本方案中使用的DMEM/F12低血清培養(yǎng)基是，以DMEM/F12作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，補(bǔ)加胰島素(10mg/l)、亞希酸鈉(2.5mg/l)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(7.5mg/I)、檸檬酸鐵(75mg/l)、EGF(20ng/ml)、bFGF(20ug/ml)、氫化可的松(2ng/l)，最終加入相應(yīng)濃度的FBS配制而成。具體的實驗流程是:
(1)將細(xì)胞以2X105cells/ml密度接種至10%(v/v)FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48h，收獲接近90%匯合度的細(xì)胞；
(2)將(I)中收獲的細(xì)胞再以2X105cells/ml密度接種至含5%(v/v)FBS的DMEM/F12低血清培養(yǎng)基中，當(dāng)細(xì)胞生長至接近90%匯合度時，胰酶消化收集細(xì)胞，并以相同的接種密度接種至含5% (v/v)FBS的培養(yǎng)基中連續(xù)傳代培養(yǎng)3代，獲得穩(wěn)定增殖的細(xì)胞株；
(3)將(2)中收獲的穩(wěn)定增殖細(xì)胞株重復(fù)(2)的流程依次接著至3%(v/v)FBS和1%(ν/ν)FBS的DMEM/F12低血清培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。
[0016]當(dāng)培養(yǎng)基中的血清濃度降至I%時，細(xì)胞仍能保持良好的生長活力。將I %(v/v)FBS DMEM/F12低血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞收獲凍存，作為種子細(xì)胞。
[0017]實施例2:生物反應(yīng)器擴(kuò)增人前列腺癌PC-3細(xì)胞
收集前述的低血清馴化的前列腺癌PC-3細(xì)胞，接種至培養(yǎng)瓶中，加入適量的含有1%(ν/v)FBS的DMEM/F12低血清培養(yǎng)基，置于37 °C、5% 二氧化碳條件下培養(yǎng)，觀察細(xì)胞生長狀態(tài)。進(jìn)行常規(guī)細(xì)胞傳代培養(yǎng)，待PC-3細(xì)胞擴(kuò)增至一定數(shù)量后，將培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)的PC-3細(xì)胞經(jīng)0.25%(w/v)胰酶消化后，將細(xì)胞懸液以1.5 X 15 cells/ml的細(xì)胞密度接種至850cm2轉(zhuǎn)瓶，培養(yǎng)體積為150ml;轉(zhuǎn)速為5 r/h，置于37°C、5% 二氧化碳條件下擴(kuò)大培養(yǎng)。
[0018]生物反應(yīng)器接種前的準(zhǔn)備:將干的微載體與無Ca2+、Mg2+的PBS溶液混合進(jìn)行水化，并在I3BS溶液中加入吐溫80，2?3滴每100ml PBS。微載體水化4小時或過夜后，將上清液倒出，加入新鮮的無Ca2+、Mg2+的PBS溶液，得到水化微載體，進(jìn)行高壓滅菌后貯存?zhèn)溆?。在生物反?yīng)器中加入PBS溶液，連接生物反應(yīng)器的各個管路，121°C高壓滅菌30min。
[0019]按照規(guī)程完成生物反應(yīng)器的安裝、校準(zhǔn)和滅菌消毒，連接攪拌電極、pH電極導(dǎo)線、溶氧電極導(dǎo)線、溫度探頭、收液瓶、取樣管等，檢查無誤后，開機(jī)；
無菌排出生物反應(yīng)器內(nèi)的I3BS溶液，并灌流含l%(v/v)FBS的DMEM/F12低血清培養(yǎng)基2L進(jìn)入7.5L生物反應(yīng)器(工作體積為5L)內(nèi)；待細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶擴(kuò)增至一定數(shù)量時，將轉(zhuǎn)瓶中培養(yǎng)的PC-3細(xì)胞經(jīng)0.25%(w/v)胰酶消化后，用DMEM/F12培養(yǎng)基分散，將細(xì)胞懸液以3 X 15 cells/ml的細(xì)胞密度接種到5L生物反應(yīng)器中；加入已經(jīng)高壓滅菌的微載體Cytodex 3，微載體濃度為4g/L;補(bǔ)加含有l(wèi)%(v/v)FBS的DMEM/F12低血清培養(yǎng)基至終體積為5L。設(shè)置起始培養(yǎng)條件:溫度37°C、pH 7.2、溶氧控制50%、攪拌速度35 rpm;攪拌速度前12h為35rpm，12h后調(diào)整為40rpm，48h 后調(diào)整為 45rpm。
[0020]培養(yǎng)48h后進(jìn)行灌流培養(yǎng)，每24h更換40%體積的培養(yǎng)基(培養(yǎng)基仍為含有1%(ν/ν)FBS的DMEM/F12低血清培養(yǎng)基)。在整個培養(yǎng)過程中生物反應(yīng)器能夠通過對四種氣體(CO2、N2、02與空氣)的自動調(diào)控，從而控制pH為7.2，溶氧為50%左右。通過生物反應(yīng)器5天的培養(yǎng)后，細(xì)胞密度達(dá)到1.2 X 16 cells/ml ο
[0021 ]生物反應(yīng)器停止攪拌，待微載體完全沉降后，排出上清液，收集微載體細(xì)胞，使用PBS溶液清洗微載體兩遍，使用0.25%(w/v)胰酶消化微載體細(xì)胞5?15min，使用200目的篩網(wǎng)過濾，收獲細(xì)胞懸液。
[0022]以上對本發(fā)明的實施例進(jìn)行了詳細(xì)說明，但所述實施例并不用以限制本發(fā)明。凡在本發(fā)明的申請范圍內(nèi)所做的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1.一種利用生物反應(yīng)器規(guī)?；苽淙饲傲邢侔㏄C-3細(xì)胞的方法，其特征在于包含以下方法: (1)將前列腺癌PC-3細(xì)胞低血清馴化，獲得低血清馴化的前列腺癌PC-3細(xì)胞； (2)將步驟(I)所獲得的低血清馴化的前列腺癌PC-3細(xì)胞進(jìn)一步擴(kuò)增培養(yǎng)，然后接種至生物反應(yīng)器進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，最終收獲前列腺癌PC-3細(xì)胞。2.根據(jù)權(quán)利要求1的所述的方法，其步驟(I)所述的前列腺癌PC-3細(xì)胞低血清馴化方法為:將前列腺癌PC-3細(xì)胞依次加入到血清含量依次遞減的培養(yǎng)基中，使得前列腺癌PC-3細(xì)胞適應(yīng)低血清環(huán)境。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的低血清馴化方法為: (a)將細(xì)胞已2X105cells/ml密度接種至10%(v/v)FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48h，收獲接近90%匯合度的細(xì)胞;將細(xì)胞以相同的接種密度連續(xù)傳代培養(yǎng)3代，獲得穩(wěn)定增殖的細(xì)胞株； (b)將(a)中收獲的細(xì)胞再以2X105cells/ml密度接種至含5%(v/v)FBS的DMEM/F12低血清培養(yǎng)基中，當(dāng)細(xì)胞生長至接近90%匯合度時，使用0.25%(w/v)胰酶進(jìn)行消化并收集細(xì)胞懸液，以相同的接種密度接種至含5% (v/v)FBS的DMEM/F12低血清培養(yǎng)基中連續(xù)傳代培養(yǎng)3代，獲得穩(wěn)定增殖的細(xì)胞株； (c)將(b)中收獲的穩(wěn)定增殖細(xì)胞株重復(fù)(b)的流程依次接著至3%(v/v)FBS和1%(ν/ν)FBS血清的DMEM/F12低血清培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用生物反應(yīng)器微載體規(guī)?；苽淙饲傲邢侔㏄C-3細(xì)胞的方法，其特征在于所述的生物反應(yīng)器的細(xì)胞接種密度為I X 105-6X105cells/mlo
【文檔編號】C12R1/91GK106011066SQ201610530379
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年7月7日
【發(fā)明人】高基民, 辜金鑫, 舒華維
【申請人】溫州生物材料與工程研究所