專利名稱：抑制免疫應(yīng)答或治療增生性疾病的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本文公開(kāi)了用于治療增生性疾病和用于抑制免疫系統(tǒng)應(yīng)答的方法和藥用組合物，它們涉及對(duì)主體給藥某些4H-1-苯并吡喃-4-酮類(lèi)化合物。
背景技術(shù)：
磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)將磷酯酰肌醇(phosphinositide)的3-羥基磷酸化。這些酶產(chǎn)生第二信使(例如，PIP3)并且起到酪氨酸激酶受體和G蛋白偶聯(lián)受體下游的轉(zhuǎn)導(dǎo)物的作用。PI3K參予許多基本過(guò)程，包括細(xì)胞程序死亡、增殖、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性和粘著。(參見(jiàn)Walker等人，Molec.Cell，6909-919,2000)。因此，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了幾種PI3K抑制劑。
雷帕霉素(mTOR)的哺乳動(dòng)物靶標(biāo)為289kDa的絲氨酸蘇氨酸激酶，其亦稱FKBP-12靶-1(RAFT-1)和FKBP-12雷帕霉素相關(guān)蛋白。有幾個(gè)mTOR的保守結(jié)構(gòu)域，包括絲氨酸-蘇氨酸激酶域。T細(xì)胞模型表明，IL-2和其它因子促進(jìn)mTOR活化并且隨后通過(guò)誘導(dǎo)新的蛋白質(zhì)合成促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)。已知mTOR促進(jìn)P70S6激酶的活化，活化又催化S6的磷酸化，S6為用于活化多核糖體以驅(qū)動(dòng)蛋白質(zhì)合成和mRNA翻譯所需的40S核糖體蛋白。另外，mTOR活化真核起始因子4E。因此，mTOR在調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞周期中起作用。認(rèn)為mTOR通過(guò)感知細(xì)胞狀態(tài)和通過(guò)G1-S期調(diào)節(jié)細(xì)胞進(jìn)程而起到關(guān)卡的作用。mTOR上游和下游的多種已知的效應(yīng)器途徑用于調(diào)節(jié)mTOR活性。因此，通過(guò)結(jié)合于mTOR而使mTOR失活的化合物可用于調(diào)節(jié)細(xì)胞周期功能并從而調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)。隨著mTOR特異性地在淋巴細(xì)胞中起作用，mTOR的抑制還可用于改變T細(xì)胞和B細(xì)胞中的信號(hào)(參見(jiàn)Kirken和Want，Transplantation Proc.，35227S-23OS，2003)。
已知的mTOR抑制劑包括LY294002(2-(4-嗎啉基)-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮)和雷帕霉素(rapamycin)。雷帕霉素用于免疫抑制、化療方案中，和用于血管成形術(shù)后冠脈再狹窄的預(yù)防。LY294002阻斷蛋白激酶B的PI3K-依賴性磷酸化作用。雷帕霉素具有顯著的副作用，包括高膽甾醇血、藥物誘導(dǎo)性肺炎、腎毒性、高血壓、和增加易患病體質(zhì)的機(jī)會(huì)感染。
不希望有的細(xì)胞增殖是許多疾病治療方法的構(gòu)成部分。例如，不希望有的細(xì)胞生長(zhǎng)可以引起良性腫瘤或惡性腫瘤的形成。根據(jù)theAmerican Cancer Society(美國(guó)癌癥學(xué)會(huì))，癌癥為一組以異常細(xì)胞的非受控生長(zhǎng)和散布為特征的疾病。如果散布未受到控制，其可引起死亡。雖然癌癥經(jīng)常被稱為單一的一種病況，其實(shí)際上包括超過(guò)100種不同的疾病。這些疾病的特征在于異常細(xì)胞的非受控生長(zhǎng)和散布。癌癥可以在許多部位產(chǎn)生并且根據(jù)其起源器官的不同而有不同表現(xiàn)。還在繼續(xù)尋找可用于治療不同類(lèi)型的癌癥的藥物。
不希望有的細(xì)胞生長(zhǎng)還是再狹窄、狹窄的再發(fā)生或矯正術(shù)后動(dòng)脈狹窄的構(gòu)成部分。再狹窄在冠脈旁路術(shù)(CAB)、動(dòng)脈內(nèi)膜切除術(shù)、心臟移植之后，特別是在血管成形術(shù)、斑塊切除術(shù)(atherectomy)、激光切除術(shù)或施加支架之后發(fā)生。再狹窄是由管腔開(kāi)口操作過(guò)程中對(duì)血管壁造成損害所致。在一些患者中，這種損害引發(fā)在被血管成形術(shù)損傷區(qū)域中的以稱作“增生”的平滑肌細(xì)胞增殖為特征的修復(fù)反應(yīng)。這種平滑肌細(xì)胞增生在幾周到幾個(gè)月內(nèi)使由血管成形術(shù)打開(kāi)的管腔再狹窄，從而需要重復(fù)血管成形術(shù)或其它操作以緩解再狹窄。
在免疫應(yīng)答中，T細(xì)胞和/或B細(xì)胞響應(yīng)被免疫系統(tǒng)看作是“外源性物質(zhì)”的刺激物而增殖。雖然免疫應(yīng)答通常是有益的，但是存在其中期望減少免疫應(yīng)答的情況。例如，在自身免疫疾病中，免疫系統(tǒng)的細(xì)胞錯(cuò)誤地將自身組成部分識(shí)別為外源性的，并且響應(yīng)自身組成部分進(jìn)行增殖。炎癥應(yīng)答可以是有害的，因?yàn)槠淇梢悦庖邞?yīng)答對(duì)抗移植器官。
顯而易見(jiàn)，需要開(kāi)發(fā)可以減少不希望的細(xì)胞增殖的藥物。這些藥物包括誘導(dǎo)免疫抑制、化療劑，和再狹窄治療劑。

發(fā)明內(nèi)容
本文公開(kāi)了用于抑制主體中的免疫應(yīng)答和用于治療主體中的增生性疾病的方法。這些方法包括對(duì)主體給藥治療有效量的以下結(jié)構(gòu)表示的2-(4-哌嗪基)-取代的4H-1-苯并吡喃-4-酮類(lèi)化合物，或其可藥用鹽， 式A其中R1和R2各自的存在是非必要的并且R1和R2各自獨(dú)立地選自烷基、取代的烷基、雜烷基、環(huán)烷基、取代的環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、取代的雜環(huán)烷基、芳基、取代的芳基、雜芳基、取代的雜芳基、烷氧基、鹵素、羥基、或氨基。
本文另外公開(kāi)了選擇免疫抑制劑或抗增生劑的方法。該方法包括選擇試驗(yàn)劑，與抑制磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-依賴性的底物磷酸化相比，所述試驗(yàn)劑優(yōu)先抑制酪蛋白激酶2和/或P70S6激酶的磷酸化。
本發(fā)明另外公開(kāi)了藥用組合物，其包括2-(4-哌嗪基)-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮或其可藥用鹽、和可藥用載體。


圖1A為L(zhǎng)Y294002和LY303511的化學(xué)結(jié)構(gòu)。LY294002中的嗎啉基中的氧在LY303511中被胺代替。圖1B為數(shù)字圖像，表示其中將A549細(xì)胞在有或沒(méi)有100μm LY303511、200ng/ml的雷帕霉素、或200nM渥曼青霉素的存在下的培養(yǎng)結(jié)果(或如圖1C中表示的數(shù)字圖像和圖1D中所示的柱狀圖和數(shù)字圖像)。
將細(xì)胞與O-100μm的LY303511反應(yīng)1小時(shí)，然后加入L/I，持續(xù)30分鐘并且制備細(xì)胞溶胞產(chǎn)物。通過(guò)SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)樣品(70μg)并且將其轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜上，隨后通過(guò)蛋白質(zhì)印跡進(jìn)行磷酸-p70S6激酶T389(pS6K)、磷酸-Akt S473(pAkt)、總p70 S6激酶(S6K)、總Akt(Akt)、磷酸-mTOR S2481(pmTOR)、或總mTOR(mTOR)的免疫檢測(cè)。蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)(kDa)位于右側(cè)。對(duì)于圖1D中所示的柱狀圖和數(shù)字圖像，還圖解表示了譜帶密度測(cè)量。將pmTOR的積分譜帶密度對(duì)于總mTOR的積分譜帶密度對(duì)歸一化。將用抑制劑處理的細(xì)胞的歸一化譜帶密度表達(dá)為相對(duì)于用DMSO＝1處理的細(xì)胞的歸一化譜帶密度(pmTOR/DMSO)。數(shù)據(jù)為得自五個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均值(±SEM)。*p＜0.05通過(guò)Student t檢驗(yàn)。所有的板條表示得自相同實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)并且表示四個(gè)單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)。
圖2A為表示LY303511阻斷A549細(xì)胞中的細(xì)胞增殖、DNA合成、和細(xì)胞周期進(jìn)展的柱狀圖。A.使A549細(xì)胞(每35-mm皿為80,000個(gè)細(xì)胞)在具有FBS的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)1天，隨后加入0.1％DMSO、100μMLY303511、雷帕霉素200ng/ml、200nM渥曼青霉素、或100μMLY294002，維持24小時(shí)。然后將細(xì)胞與胰蛋白酶培養(yǎng)，收集并計(jì)數(shù)。數(shù)據(jù)為得自三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞/孔×10-4±SEM的平均值。*p＜0.05通過(guò)Student t-檢驗(yàn)。圖2B為使96孔板中的A549細(xì)胞(每孔4,000)在具有FBS的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)24小時(shí)，然后加入10mM BrDU+0-200μmLY303511，有或者沒(méi)有雷帕霉素200ng/ml、或有單獨(dú)的雷帕霉素(0-200ng/ml)時(shí)得到的結(jié)果的線形圖。根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明書(shū)(BrDU檢測(cè)試劑盒，Roche)的原地ELISA測(cè)量BrDU結(jié)合(在490/465的吸光度)。對(duì)于每個(gè)試驗(yàn)，用抑制劑培養(yǎng)的細(xì)胞中的BrDU表示為用0.2％DMSO對(duì)照處理的細(xì)胞中的BrDU的百分?jǐn)?shù)(％對(duì)照)。在各個(gè)實(shí)驗(yàn)中相對(duì)于對(duì)照＝100％的平均吸光度測(cè)量值為0.9±0.3、0.8±0.3、和0.8±0.3。數(shù)據(jù)為得自三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的BrDU含量±SEM的平均值。*p＜0.05通過(guò)Student t-檢驗(yàn)。圖2C為柱狀圖，表示LY303511通過(guò)組合的G1和G2/M抑制而抑制細(xì)胞周期。A549細(xì)胞在具有FBS的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)48小時(shí)，然后加入沒(méi)有或有雷帕霉素200ng/ml的0-100μM的LY303511，維持24小時(shí)。然后收獲細(xì)胞并將其與碘化丙啶培養(yǎng)2小時(shí)，然后使用Becton-Dickson FACSCalibur計(jì)數(shù)。數(shù)據(jù)為處于細(xì)胞周期的G1、S、或G2/M期的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)的平均值±SEM。通過(guò)Student t檢驗(yàn)，相對(duì)于DMSO對(duì)照的*p＜0.05，相對(duì)于10μM LY303511的p＝0.056。
圖3A-3B為柱狀圖和數(shù)字圖像，表示LY303511對(duì)細(xì)胞周期抑制劑和細(xì)胞周期蛋白的水平的作用。使A549細(xì)胞(每100-mm皿～1×106細(xì)胞)生長(zhǎng)48小時(shí)，然后加入0.1％DMSO、100μM LY303511、或雷帕霉素200ng/ml，維持0、12、或24小時(shí)。在所示的時(shí)間，將細(xì)胞勻質(zhì)化并儲(chǔ)存在-80℃。對(duì)于蛋白質(zhì)印跡分析，將通過(guò)SDS-PAGE分離的溶胞產(chǎn)物蛋白質(zhì)樣品(70μg)轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜上并與以下抗體反應(yīng)A.磷酸-S6K T389(pS6K)、p27Kipl、p21Cipl、磷酸-Rb S807/S811、或B.細(xì)胞周期蛋白A、細(xì)胞周期蛋白B、細(xì)胞周期蛋白D、和細(xì)胞周期蛋白E。所有的印跡得自于一個(gè)實(shí)驗(yàn)。下面的數(shù)據(jù)(相對(duì)密度)為，在三個(gè)實(shí)驗(yàn)中，相對(duì)于DMSO對(duì)照＝1.0，得自用抑制劑處理24小時(shí)的一式兩份的皿的密度測(cè)量值的平均值。通過(guò)Student t-檢驗(yàn)，相對(duì)于DMSO對(duì)照的*p＜0.05。
圖4A-4D為柱狀圖和數(shù)字圖像，表示LY303511抑制血清刺激的S6K和Akt的磷酸化(圖4A和4B)，以及PASM細(xì)胞的增殖(圖4C和4D)。在無(wú)血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)24小時(shí)之后，將PASM細(xì)胞與沒(méi)有或有100μM LY303511、雷帕霉素200ng/ml、或200nM渥曼青霉素(圖4A)、或0-100μM LY303511(圖4B)培養(yǎng)1小時(shí)，然后加入10％FBS，維持30分鐘并制備細(xì)胞溶胞產(chǎn)物。通過(guò)SDS-PAGE分離等量的蛋白質(zhì)(20μg/凝膠體)并將其轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜上，然后通過(guò)蛋白質(zhì)印跡免疫檢測(cè)磷酸-p70 S6激酶T389(pS6K)或磷酸-Akt S473(pAkt)。數(shù)據(jù)得自于五個(gè)實(shí)驗(yàn)中有代表性的一個(gè)實(shí)驗(yàn)。
使PASM細(xì)胞(每孔4,000個(gè))在90-孔板中生長(zhǎng)24小時(shí)，然后在有(圖4C)或沒(méi)有(圖4D)10％FBS的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)。然后將細(xì)胞在沒(méi)有或有雷帕霉素200或400ng/ml的包含10％FBS、10μM BrDU、和0-100μM LY303511的新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)。根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明書(shū)(BrDU檢測(cè)試劑盒，Roche)通過(guò)原地ELISA測(cè)量BrDU結(jié)合。對(duì)于每個(gè)試驗(yàn)，用抑制劑培養(yǎng)的細(xì)胞中的BrDU含量表示為相對(duì)于用0.1％DMSO對(duì)照培養(yǎng)的細(xì)胞中的BrDU含量的百分?jǐn)?shù)(％對(duì)照)。使用得自不同供體的細(xì)胞的每個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均對(duì)照(＝100％)吸光度分別為圖4C和圖4D的0.22±0.06和0.24±0.06(＝100％)。數(shù)據(jù)為得自一式六份試驗(yàn)中3個(gè)實(shí)驗(yàn)的BrDU的平均值±SEM。通過(guò)Student t檢驗(yàn)，相對(duì)于DMSO對(duì)照的*p＜0.05，或相對(duì)于10μM LY303511的p＜0.05。
圖5A-5B為柱狀圖，表示LY303511通過(guò)引起組合的G1和G2/M抑制而抑制細(xì)胞周期，并且LY303511抑制CK2活性。對(duì)于圖5A中所示的數(shù)據(jù)，PASM細(xì)胞在具有FBS的培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時(shí)，然后加入沒(méi)有或有雷帕霉素400ng/ml的O-100μM的LY303511，維持24小時(shí)。然后收獲細(xì)胞并將其與碘化丙啶培養(yǎng)2小時(shí)，然后使用Becton-DicksonFACSCalibur計(jì)數(shù)。數(shù)據(jù)為一式兩份試驗(yàn)的三個(gè)實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞周期的G1、S、或G2/M期中細(xì)胞百分?jǐn)?shù)的平均值(±SEM)。通過(guò)Student t檢驗(yàn)，相對(duì)于DMSO對(duì)照的*p＜0.05，相對(duì)于10μM LY303511的p＜0.05。圖5B為柱狀圖，表示LY303511或LY294002體外抑制CK2。根據(jù)生產(chǎn)商的指導(dǎo)(Upstate Biotechnologies)，將0或100ng的重組CK2與具有1％DMSO或所示抑制劑的CK2底物肽和32P-γ-ATP培養(yǎng)10分鐘。數(shù)據(jù)是具有抑制劑的樣品的值(以相對(duì)于對(duì)照的百分?jǐn)?shù)表示)的平均值，對(duì)照為(平均±SEM)0.2±0.03pmol磷酸酯/100ng蛋白質(zhì)/10分鐘。數(shù)據(jù)得自于一式兩份進(jìn)行的三個(gè)實(shí)驗(yàn)。以DMSO作對(duì)照進(jìn)行Student t檢驗(yàn)時(shí)，*p＜0.05。
圖6A-6B為柱狀圖，表示LY303511抑制裸鼠中前列腺腺癌細(xì)胞(PC-3)的生長(zhǎng)。將LY303511以10mg/kg/d腹膜內(nèi)給藥，以減弱裸鼠中PC-3腫瘤生長(zhǎng)。生長(zhǎng)抑制程度與用LY303511治療的持續(xù)時(shí)間成正比。LY303511(LY3)的20天療程與10天療程在抑制腫瘤生長(zhǎng)方面同樣有效。圖6C表示Kaplan-Mieir存活分析圖。該分析包括當(dāng)腫瘤達(dá)到300mm3時(shí)發(fā)生事件的假定。Y軸描述腫瘤尺寸小于300mm3的概率。應(yīng)該指出的是，第4組具有早期事件，其很可能表示異常值(例如，動(dòng)物沒(méi)有接受完全劑量的藥物)。
圖7A-F為柱狀圖，表示LY303511抑制初生小鼠腹膜巨噬細(xì)胞或A549細(xì)胞中脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的細(xì)胞因子生成或STAT1活性。使用得自Jackson(Jac)和Taconic(Tac)的野生型小鼠。在用巰基乙醇酸酯注射三天之后收獲腹膜巨噬細(xì)胞。將細(xì)胞在2％FCS RPMI中培養(yǎng)三天。在用有或者沒(méi)有LY 303511(1～100μm)的LPS 1μg/ml或DMSO刺激24小時(shí)之后收集上清液。測(cè)量細(xì)胞上清液中的細(xì)胞因子(白細(xì)胞介素(IL)-12p70、腫瘤壞死因子(TNF)-α、干擾素(IFN)-γ、MCP-1、IL-10、IL-6)。結(jié)果顯示，LY303511引起所有六種細(xì)胞因子的劑量依賴性降低(參見(jiàn)圖7A-F)。加入100μM的LY303511引起類(lèi)似于背景水平的細(xì)胞因子分泌。因此，顯而易見(jiàn)，LY303511可以減少細(xì)胞因子表達(dá)，并且具有抗炎作用。
圖8A-B為一組柱狀圖，其表示LY303511對(duì)由LPS/IFN-γ誘導(dǎo)的STAT1舌性的抑制。將A549細(xì)胞用表達(dá)由STAT1(GAS-luc，Clontech)驅(qū)動(dòng)的熒光蟲(chóng)熒光素酶的報(bào)道基因載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，并且在沒(méi)有或有100μM的LY303511、雷帕霉素200ng/ml、或兩者的情況下培養(yǎng)1小時(shí)，然后加入LPS/IFN-γ，維持6小時(shí)。在細(xì)胞溶胞產(chǎn)物(RLU)中測(cè)量STAT1活性(熒光素酶活性)。給出的數(shù)據(jù)為一式三份樣品±SEM，并且代表兩個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。如圖4A和4B所示，LY303511通過(guò)兩種炎癥遞質(zhì)LPS/IFN-γ抑制STAT1活化。
幾個(gè)實(shí)施例的詳細(xì)說(shuō)明為了便于理解，以下更具體地描述用于本文中的以下術(shù)語(yǔ)化學(xué)術(shù)語(yǔ)“烷基”是指只包含碳和氫的環(huán)狀的、支鏈的、或直鏈的烷基，并且除非另作說(shuō)明，其通常包含一到十二個(gè)碳原子。這個(gè)術(shù)語(yǔ)另外由以下基團(tuán)舉例說(shuō)明甲基、乙基、正丙基、異丁基、叔丁基、戊基、新戊酰、庚基、金剛烷基、和環(huán)戊基。烷基可為未取代的或被一種或多種如下所述的取代基取代。
“取代的烷基”是指其中上述烷基中的一個(gè)或多個(gè)氫或碳原子被另一個(gè)基團(tuán)如鹵素、芳基、取代的芳基、環(huán)烷基、取代的環(huán)烷基、及其組合代替的烷基。示例性的取代的烷基包括芐基、三氯甲基等。
“雜烷基”是指其中上述烷基中的一個(gè)或多個(gè)氫或碳原子被雜原子如N、O、P、B或S代替的烷基。被雜環(huán)烷基、取代的雜環(huán)烷基、雜芳基、取代的雜芳基、烷氧基、芳氧基或氨基取代的烷基也被包括在“雜烷基”內(nèi)。示例性的雜烷基包括氰基、苯甲?；?-吡啶基、2-呋喃基等。
“環(huán)烷基”是指具有單環(huán)或多稠環(huán)的飽和或不飽和的非芳香環(huán)狀烴基。示例性的環(huán)烷基包括環(huán)戊基、環(huán)己基、雙環(huán)辛基等。
“取代的環(huán)烷基”是指其中上述環(huán)烷基中的一個(gè)或多個(gè)氫或碳原子被另一個(gè)基團(tuán)如鹵素、芳基、取代的芳基、烷氧基、芳氧基、氨基、及其組合代替的環(huán)烷基。
“雜環(huán)烷基”是指其中上述環(huán)狀基團(tuán)中的一個(gè)或多個(gè)碳原子被雜原子如N、O、P、B或S代替的環(huán)烷基。示例性的雜環(huán)烷基包括例如哌嗪基、嗎啉基、四氫吡喃基、四氫呋喃基、哌啶基、吡咯烷基、唑啉基等。
“取代的雜環(huán)烷基”是指其中上述雜環(huán)烷基中的一個(gè)或多個(gè)氫或碳原子被另一個(gè)基團(tuán)如鹵素、芳基、取代的芳基、烷氧基、芳氧基、氨基、及其組合代替的雜環(huán)烷基。
“芳基”是指芳香族取代基，其可為單一芳香環(huán)或稠和在一起、共價(jià)連接的或連接于共用基團(tuán)如亞甲基或乙烯部分的多芳香環(huán)。共用連接基團(tuán)也可為羰基，如在二苯酮中；或?yàn)檠酰缭诙矫阎?；或?yàn)榈缭诙桨分?。芳香環(huán)可包括苯基、萘基、聯(lián)苯基、二苯醚、二苯胺和二苯酮，以及其它。在具體的例子中，芳基具有1到20個(gè)碳原子。
“取代的芳基”是指其中上述芳基中的一個(gè)或多個(gè)氫或碳原子被一個(gè)或多個(gè)官能團(tuán)如烷基、取代的烷基、環(huán)烷基、取代的環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、取代的雜環(huán)烷基、鹵素、烷基鹵代、羥基、氨基、烷氧基、和硫基代替的芳基。示例性的取代的芳基包括氯代苯基、3，5-二甲基苯基、2，6-二異丙基苯基等。
“雜芳基”是指其中芳香環(huán)中的一個(gè)或多個(gè)碳原子被雜原子如N、O、P、B或S代替的芳香環(huán)。雜芳基是指可為單一芳香環(huán)、多芳香環(huán)、或結(jié)合于一個(gè)或多個(gè)非芳香環(huán)的一個(gè)或多個(gè)芳香環(huán)。示例性的雜芳基包括例如噻吩、吡啶、異唑、phthalidimide、吡唑、吲哚、呋喃等。
“取代的雜芳基”是指其中上述雜芳基中的一個(gè)或多個(gè)氫或碳原子被一個(gè)或多個(gè)官能團(tuán)如烷基、取代的烷基、環(huán)烷基、取代的環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、取代的雜環(huán)烷基、鹵素、烷基鹵代、羥基、氨基、烷氧基、和硫基代替的雜芳基。
“烷氧基”是指-OZ基團(tuán)，其中Z選自烷基、取代的烷基、環(huán)烷基、取代的環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、取代的雜環(huán)烷基、及其組合。示例性的烷氧基包括甲氧基、乙氧基、芐氧基、和叔丁氧基。相關(guān)的術(shù)語(yǔ)為其中Z選自芳基、取代的芳基、雜芳基、取代的雜芳基、及其組合的“芳氧基”。示例性的烷氧基包括苯氧基、取代的苯氧基、2-吡啶氧基、8-喹啉氧基等。
“氨基”是指基團(tuán)-NZ1Z2，其中Z1和Z2各自獨(dú)立地選自氫、烷基、取代的烷基、環(huán)烷基、取代的環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、取代的雜環(huán)烷基、芳基、取代的芳基、雜芳基、取代的雜芳基、烷氧基、芳氧基、及其組合。
“硫基”是指基團(tuán)-SZ1Z2，其中Z1和Z2各自獨(dú)立地選自氫、烷基、取代的烷基、環(huán)烷基、取代的環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、取代的雜環(huán)烷基、芳基、取代的芳基、雜芳基、取代的雜芳基、烷氧基、芳氧基、及其組合。
“鹵素”是指氟、溴、氯、或碘取代基。
本發(fā)明公開(kāi)的化合物的“可藥用鹽”包括從陽(yáng)離子如鈉、鉀、鋁、鈣、鋰、鎂、鋅形成的那些鹽；和從堿如氨、乙二胺、N-甲基-谷氨酰胺、賴氨酸、精氨酸、鳥(niǎo)氨酸、膽堿、N，N′-二芐基乙二胺、氯普魯卡因、二乙醇胺、普魯卡因、N-芐基苯乙胺、二乙胺、哌嗪、三(羥甲基)甲胺、和氫氧化四甲銨形成的那些鹽。這些鹽可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法制備，例如通過(guò)將游離酸與適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)堿或無(wú)機(jī)堿反應(yīng)。本說(shuō)明書(shū)中敘述的任何化合物都可以作為其可藥用鹽給藥?！翱伤幱名}”還包括游離酸、堿、兩性離子的形式。對(duì)于適當(dāng)?shù)目伤幱名}的說(shuō)明可以在Handbook ofPharmaceutical Salts，Properties，Selection and Use，Wiley VCH(2002)中找到。
“藥劑”或“藥物”是指能夠在適當(dāng)?shù)貙?duì)主體給藥時(shí)誘導(dǎo)所需的治療或預(yù)防效果的化合物或組合物。
其它術(shù)語(yǔ)“AKT”是指已經(jīng)表現(xiàn)出響應(yīng)生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、和致癌Ras調(diào)節(jié)細(xì)胞存活信號(hào)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。AKT經(jīng)由磷酸肌醇-3-OH激酶(PI3K)途徑被活化并且通過(guò)其它上游激酶活化。AKT通過(guò)直接使細(xì)胞程序死亡中涉及的蛋白質(zhì)(包括Bad、procaspase 9、和叉頭(forkhead)轉(zhuǎn)錄因子家族的成員)磷酸化和失活而抑制細(xì)胞死亡途徑。AKT又稱蛋白激酶B(PKB，GenBank登錄號(hào)Nu 005154)。
“動(dòng)物”為有生命的多細(xì)胞脊椎動(dòng)物生物體，其包括例如哺乳動(dòng)物和鳥(niǎo)類(lèi)?！安溉閯?dòng)物”包括人類(lèi)和非人類(lèi)哺乳動(dòng)物?！爸黧w”包括人類(lèi)和動(dòng)物主體。
“抗增生劑”是指減少增殖、或引起細(xì)胞死亡的藥物?？乖錾鷦┌ɑ焺?。
“動(dòng)脈粥樣硬化”是指血管隨時(shí)間而發(fā)生的進(jìn)行性狹窄和硬化。動(dòng)脈粥樣硬化是在大動(dòng)脈和中等尺寸動(dòng)脈的內(nèi)膜和內(nèi)部介質(zhì)中形成的包含膽固醇、類(lèi)脂物質(zhì)、和噬脂細(xì)胞的微黃色斑塊(粉瘤)的動(dòng)脈硬化的常見(jiàn)形式。
“自身免疫性疾病”為其中免疫系統(tǒng)產(chǎn)生對(duì)抗作為正常寄主的一部分的抗原(即，自身抗原)的免疫應(yīng)答(如，B細(xì)胞或T細(xì)胞應(yīng)答)并隨后損害組織的疾病。自身抗原可來(lái)自于寄主細(xì)胞，或者可來(lái)自于通常位于粘膜表面上的共生生物體如微生物(已知為共生生物體)。
影響哺乳動(dòng)物的示例性的自身免疫疾病包括類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、幼年寡關(guān)節(jié)炎(juvenile oligoarthritis)、膠原誘發(fā)性關(guān)節(jié)炎、佐劑誘發(fā)性關(guān)節(jié)炎、合格倫綜合征、多發(fā)性硬化、實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓膜炎(experimental autoimmune encephalomyelitis)、炎癥性腸病(如，克隆病、潰瘍性結(jié)腸炎)、自身免疫性胃萎縮、尋常天皰瘡、銀屑病、白癜風(fēng)、I型糖尿病、非肥胖性糖尿病、重癥肌無(wú)力、格雷夫斯病、橋本氏甲狀腺炎、硬化性膽管炎、硬化性涎腺炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、自身免疫性血小板減少性紫癜、古德帕斯丘綜合征、艾迪生病、系統(tǒng)性硬化、多肌炎、皮肌炎、自身免疫性溶血性貧血、惡性貧血等。
“化學(xué)治療”是指給藥稱為“化療劑”的一種化合物或多種化合物的組合，以殺死或減慢迅速繁殖細(xì)胞的繁殖?；焺┌ū绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的那些，包括但不限于5-氟尿嘧啶(5-FU)、硫唑嘌呤、環(huán)磷酰胺、抗代謝物(如氟達(dá)拉濱)、抗腫瘤藥(如依托泊苷、多柔比星、甲氨蝶呤、和長(zhǎng)春新堿)、卡鉑、順鉑和紫杉烷如紫杉醇。雷帕霉素也被用作化療劑。
“移植物抗宿主病”是指其中供體骨髓移植物中的T細(xì)胞攻擊和進(jìn)攻宿主組織的骨髓移植物的并發(fā)癥。移植物抗宿主病(GVHD)在其中血液骨髓供體與患者無(wú)關(guān)或當(dāng)供體與患者相關(guān)但不完全匹配的情況中最常見(jiàn)。有兩種GVHD形式早期形式被稱為急性GVHD，其在移植不久以后在白細(xì)胞升高時(shí)出現(xiàn)；和晚期形式，被稱為慢性GVHD。
急性GVHD通常在移植后的前三個(gè)月內(nèi)出現(xiàn)并且可以影響到皮膚、肝、胃、和/或腸。早期征候通常為手、腳和臉上的看似曬傷一樣散布的皮疹。急性GVHD伴有的嚴(yán)重問(wèn)題可包括皮膚上的水皰、伴有腹部絞痛的水性或便血性腹瀉、和反映肝臟受到牽連的黃疸(皮膚和眼睛變黃)。
慢性GVHD通常在移植后的2-3個(gè)月出現(xiàn)并且引起類(lèi)似于自身免疫疾病如狼瘡和硬皮病的癥狀?；颊甙l(fā)展出現(xiàn)干燥發(fā)癢的皮疹并且看似鱷魚(yú)皮一樣。還可發(fā)生毛發(fā)喪失、皮膚出汗減少、和毛發(fā)過(guò)早灰白。口干為常見(jiàn)癥狀。其可發(fā)展為食物性過(guò)敏，并且辛辣和酸性食物可引起刺痛。眼睛也可受到牽連而變得干燥和感覺(jué)受刺激并變紅。幾乎任何器官都可以受到慢性GVHD的影響。
“免疫應(yīng)答”是指免疫系統(tǒng)的細(xì)胞如B細(xì)胞、T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞或多形核細(xì)胞對(duì)刺激的響應(yīng)。免疫應(yīng)答可以包括宿主防御反應(yīng)中所牽涉的身體的任何細(xì)胞，如分泌細(xì)胞因子的上皮細(xì)胞。細(xì)胞因子包括但不限于白細(xì)胞介素(如IL-12(參見(jiàn)Quesniaux，Research Immunology，143385-400，1992)、腫瘤壞死因子(TNF)-α(參見(jiàn)Aggarwal和Vilcek(eds)，“Tumor necrosis factorstructure，function，and mechanism of action”，Marcel Dekker Inc.1992)，干擾素(IFN)-y(參見(jiàn)Farrar和Schreiber，Ann.Rev.of Immunol.，11571-611，1993)、單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP)-1(參見(jiàn)Yoshimura和Leonard，Cytokines，4131-52，1992)、IL-10(參見(jiàn)Zlotnik和Moore，Cytokines，3366-71，1991)、和IL-6(參見(jiàn)Van Snick，Ann.Rev.Immunol.，8253-78，1990)。需要指出的是，對(duì)細(xì)胞因子的描述包括它們的蛋白質(zhì)序列、核酸序列和對(duì)它們功能性描述可在國(guó)際互聯(lián)網(wǎng)上得到例如在COPECytokines Online Pathfinder Encyclopaedia網(wǎng)址上。免疫應(yīng)答(例如先天性的、獲得性的)包括但不限于對(duì)病毒感染或細(xì)菌感染的應(yīng)答、先天性免疫應(yīng)答、對(duì)自體抗原或炎癥的應(yīng)答。
“免疫抑制”是指細(xì)胞和/或體液免疫的非特異性的無(wú)反應(yīng)性。免疫抑制是指當(dāng)T和/或B細(xì)胞數(shù)目耗竭或其反應(yīng)性、脹大或分化受到抑制時(shí)出現(xiàn)的免疫應(yīng)答的阻止或減少。免疫抑制可起因于特異性或非特異性T細(xì)胞如Treg細(xì)胞的由響應(yīng)輻射的細(xì)胞因子信號(hào)所活化、或由對(duì)T和B細(xì)胞具有通用免疫抑制作用的藥物所活化。
“免疫抑制劑”是指可以減少免疫應(yīng)答如炎性反應(yīng)的分子如化合物、小分子、類(lèi)固醇、核酸分子、或其它生物劑。免疫抑制劑包括但不限于關(guān)節(jié)炎治療劑(抗關(guān)節(jié)炎劑)。免疫抑制劑的具體的非限制性例子為非甾體抗炎藥、環(huán)孢素A、FK506和抗-CD4。在另外的例子中，免疫抑制劑為生物應(yīng)答改變劑，如Kineret(阿那白滯素)、Enbrel(依那西普)、或Remicade(英利昔單抗)；緩解疾病的抗風(fēng)濕性藥物(DMARD)如Arava(來(lái)氟米特)；非甾體抗炎藥(NSAID)；具體地為環(huán)氧化酶-2(COX-2)抑制劑，如Celebrex(塞來(lái)昔布)和Vioxx(羅非昔布)；或其它制品如Hyalgan(玻尿糖苷)和Synvisc(hylan G-F20)。雷帕霉素為免疫抑制劑的另一個(gè)例子。
“炎癥”或“炎癥過(guò)程”是指一系列的復(fù)雜事件，包括小動(dòng)脈、毛細(xì)血管和小靜脈擴(kuò)張，伴隨有滲透性和血流量增加、流體滲出，包括血漿蛋白質(zhì)和白細(xì)胞移動(dòng)到炎性病灶中。炎癥可通過(guò)本領(lǐng)域中公知的多種方法測(cè)量，如白細(xì)胞數(shù)、多形核白細(xì)胞嗜中性粒細(xì)胞(PMN)數(shù)、PMN活化程度如腔內(nèi)(luminal)增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光的測(cè)量、或細(xì)胞因子存在量的測(cè)量。
“抑制”或“治療”疾病是指抑制例如處于某種疾病(如自身免疫性疾病、移植物抗宿主病、或移植組織或器官排斥)危險(xiǎn)下的主體中疾病或狀況的全面發(fā)展?！爸委煛笔侵父纳萍膊〉恼骱蚧虬Y狀或開(kāi)始發(fā)展之后的病理學(xué)狀況的治療性干預(yù)。如本文中使用的，關(guān)關(guān)疾病或病理學(xué)狀況的術(shù)語(yǔ)“改善”是指治療的任何可觀察到的有益效果。有益效果可以通過(guò)例如以下方面得以證實(shí)易感主體中疾病的臨床癥狀的延遲發(fā)病、疾病的一些或所有臨床癥狀的嚴(yán)重程度減輕、疾病的進(jìn)展減慢、疾病的復(fù)發(fā)次數(shù)減少、主體的總體健康或良好狀態(tài)的改善、或通過(guò)本領(lǐng)域中公知的針對(duì)具體疾病具有特異性的其它參數(shù)。
“激酶”是指催化磷酸基從一個(gè)分子轉(zhuǎn)移到另一個(gè)分子的酶?！敖z氨酸蘇氨酸激酶”將磷酸基轉(zhuǎn)移到多肽中的絲氨酸和/或蘇氨酸的羥基?！癙70 S6激酶”為將核糖體的40S亞單位(小亞基)的S6蛋白磷酸化的激酶。GenBank登錄號(hào)JE0377表示人P70S6激酶的示例性氨基酸序列?！傲字＜〈?-激酶”是指將肌醇脂質(zhì)在肌醇環(huán)的D-3位磷酸化以產(chǎn)生3-磷酸肌醇、磷脂酰肌醇3-磷酸[PtdIns(3)P]、磷脂酰肌醇3，4-二磷酸[PtdIns(3，4)P2]和磷脂酰肌醇3，4，5-三[PtdIns(3，4，5)P3]的酶。GenBank登錄號(hào)AAB53966表示人磷脂酰肌醇3-激酶的催化性亞單位的示例性氨基酸序列?！袄业鞍准っ?”(genbank登錄號(hào)NP 001887)是指優(yōu)先磷酸化酸性蛋白質(zhì)如酪蛋白的酶。GenBank登錄號(hào)NP001887表示酪蛋白激酶2的示例性氨基酸序列。酪蛋白激酶2底物的例子包括p53(GenBank登錄號(hào)CAA25652)、BH3相互作用結(jié)構(gòu)域死亡激動(dòng)劑(Bid；選擇性轉(zhuǎn)錄本的登錄號(hào)為NP_001187.1、NP_932070.1、NP_932071.1)、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶II(NP 001058)。激酶的“優(yōu)先”抑制是指與抑制第二種激酶如PI3K的活性相比，更大程度地降低一種激酶如P70S6激酶的活性。
“白細(xì)胞”是指血液中的細(xì)胞，也稱為“白血球”，其參予防護(hù)身體免受感染性生物體和外來(lái)物質(zhì)的威脅。白細(xì)胞在骨髓中產(chǎn)生。有五種主要類(lèi)型的白細(xì)胞，其再分成兩個(gè)主要的組多形核白細(xì)胞(嗜中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞)和單核白細(xì)胞(單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞)。
“巨噬細(xì)胞”是指負(fù)責(zé)多種內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定過(guò)程、免疫過(guò)程和炎癥過(guò)程的無(wú)處不在的單核吞噬細(xì)胞群。它們的廣泛的組織分布使得這些細(xì)胞非常適合于在白細(xì)胞侵入之前提供對(duì)抗外來(lái)物質(zhì)的立即性防御。炎性巨噬細(xì)胞存在于多種滲出物中，并且可通過(guò)多種特異性的標(biāo)識(shí)物表征，如過(guò)氧化物酶活性和細(xì)胞因子表達(dá)，并且得自共享類(lèi)似性質(zhì)的單核細(xì)胞?！盎罨木奘杉?xì)胞”是指具有特異性地增加的功能活性的巨噬細(xì)胞。分化過(guò)程與巨嗜細(xì)胞“活化”不同，其為分化的巨噬細(xì)胞獲得增加的執(zhí)行特異性功能的能力的過(guò)程。通常，未活化的巨噬細(xì)胞為相對(duì)免疫靜止的，具有低的耗氧量、低的主要組織相容性復(fù)合體(MHC)II類(lèi)基因表達(dá)水平，并且有很少的或幾乎沒(méi)有細(xì)胞因子分泌。一旦被活化，巨噬細(xì)胞不能增殖并且具有高的耗氧量。另外，活化的巨噬細(xì)胞能夠殺死寄生物質(zhì)和/或細(xì)胞溶解腫瘤細(xì)胞，并且分泌細(xì)胞因子如TNF-α、IL-1和IL-6。
“雷帕霉素哺乳動(dòng)物靶標(biāo)標(biāo)(mTOR)”是指與啤酒糖酵母(S.cerevisae)ToR1和ToR2蛋白質(zhì)共有約45％同一性的約289kDa的多肽。人、大鼠、和小鼠的mTOR蛋白共有約95％的氨基酸同一性。mTOR蛋白質(zhì)為絲氨酸-蘇氨酸蛋白質(zhì)激酶(參見(jiàn)Hunter等人，Cell，831-4，1995；Hoekstra，Curr.Opina.Genet.Dev.，7170-175，1997)。mTOR(參見(jiàn)GenBank登錄號(hào)L30475)在蘇氨酸389處磷酸化P70S6激酶并且使真核翻譯起始因子的結(jié)合蛋白磷酸化和活化。
“瘤形成”是指細(xì)胞異常和非受控生長(zhǎng)的過(guò)程。瘤形成的產(chǎn)物為瘤(腫瘤)，其為由過(guò)度細(xì)胞分裂導(dǎo)致的組織的異常生長(zhǎng)。不發(fā)生轉(zhuǎn)移的瘤稱為“良性腫瘤”。侵犯周?chē)M織和/或可以轉(zhuǎn)移的瘤稱為“惡性腫瘤”。腫瘤形成為增生性疾病的一個(gè)例子。
血液瘤的例子包括白血病，包括急性白血病(如急性淋巴細(xì)胞性白血病、急性髓細(xì)胞性白血病、急性髓性白血病、和成髓細(xì)胞性白血病、早幼粒細(xì)胞性白血病、成髓單細(xì)胞性白血病、單核細(xì)胞性白血病和紅白血病)、慢性白血病(如慢性髓細(xì)胞性(粒細(xì)胞性)白血病、慢性髓性白血病、和慢性淋巴細(xì)胞性自血病)、真性紅細(xì)胞增多癥、淋巴瘤、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤(無(wú)痛形式和高級(jí)形式)、多發(fā)性骨髓瘤、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血癥、重鏈病、脊髓發(fā)育異常綜合征、和脊髓發(fā)育不良。
實(shí)體瘤如肉瘤和癌的例子包括纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、骨原性肉瘤、和其它肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤因瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結(jié)腸癌、惡性淋巴瘤、胰腺癌、乳癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝細(xì)胞癌、鱗狀細(xì)胞癌、皮膚基底細(xì)胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、髓樣癌、支氣管肺癌、腎細(xì)胞癌、肝細(xì)胞瘤、膽管癌、絨膜癌、維耳姆斯瘤、宮頸癌、睪丸瘤、膀胱癌、和CNS癌(如神經(jīng)膠質(zhì)瘤、星形細(xì)胞瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、成血管細(xì)胞瘤、聽(tīng)神經(jīng)瘤、少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤、髓膜瘤(menangioma)、黑素瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤)。
“非腸道”給藥是指在腸外如不通過(guò)消化道的給藥。通常，非腸道制劑為通過(guò)除攝取之外的任何可能的方式給藥的那些。這個(gè)術(shù)語(yǔ)具體地是指注射，無(wú)論是以靜脈內(nèi)、鞘內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、或皮下給藥；和各種表面施用形式，包括例如鼻內(nèi)、皮內(nèi)、和局部施用。
“磷酸化”是指生成有機(jī)分子(如蛋白質(zhì)或脂質(zhì))的磷酸酯衍生物。在細(xì)胞中，這可以通過(guò)從三磷酸腺苷(ATP)轉(zhuǎn)移磷酸基而實(shí)現(xiàn)。
“增生性疾病”包括腫瘤和再狹窄。
“再狹窄”是指心臟瓣膜矯正術(shù)后狹窄的再發(fā)生、或除去或減少先前狹窄后的血管結(jié)構(gòu)(如冠狀動(dòng)脈)的狹窄再發(fā)生。在多種例子中，再狹窄出現(xiàn)在放置支架之后或血管成形術(shù)之后。
“序列同一性”是指氨基酸序列之間的相似性，并且以序列之間的相似性表示，也稱為序列同一性。序列同一性通常以百分同一性(或相似性或同源性)測(cè)量得到；百分?jǐn)?shù)越高，則兩個(gè)序列越相似。在使用標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)比時(shí)，多肽的同系物或變體具有較高程度的序列同一性。
用于比較的序列對(duì)比方法為本領(lǐng)域中公知的。多種程序和對(duì)比算法在Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.，2482，1981；Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.，48443，1970；Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，852444，1988；Higgins和Sharp，Gene，73237，1988；Higgins和Sharp，CABIOS，5151，1989；Corpet等人，Nucleic AcidsResearch 1610881，1988；和Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，852444，1988中描述。Altschul等人，Nature Genet.，6119，1994提供了序列對(duì)比方法和同源性計(jì)算的詳細(xì)討論。
NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)(Altschul等人，J.Mol.Biol.，215403，1990)可得自多種來(lái)源，包括the National Centerfor Biotechnology Information(NCBI，Bethesda，MD)、和國(guó)際互聯(lián)網(wǎng)上，用于連接序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx。關(guān)于如何使用這個(gè)程序測(cè)定序列同一性的描述可在國(guó)際互聯(lián)網(wǎng)上的NCBI網(wǎng)址上得到。
多肽的“同系物”和“變體”是指使用NCBI Blast 2.0、gapped blastp設(shè)置為缺省參數(shù)，與多肽的氨基酸序列進(jìn)行全長(zhǎng)對(duì)比時(shí)計(jì)算的以具有至少75％，例如至少80％、或至少90％序列同一性為特征的多肽。對(duì)于大于約30個(gè)氨基酸的氨基酸序列的比較，采用Blast 2序列函數(shù)，使用設(shè)置為缺省參數(shù)的default BLOSUM62 matrix(gap existence cost為11，和per residue gap cost為1)。在對(duì)比短的肽(少于約30個(gè)氨基酸)時(shí)，使用Blast 2序列函數(shù)進(jìn)行對(duì)比，采用設(shè)置為缺省參數(shù)的PAM30matrix(open gap為9，extension gap為1 penalties)。在通過(guò)這種方法評(píng)價(jià)時(shí)，具有與參考序列更大相似性的蛋白質(zhì)表現(xiàn)出增加的百分同一性，如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、或至少99％的序列同一性。當(dāng)比較不足整個(gè)序列的序列同一性時(shí)，同系物和變體通常在10-20個(gè)氨基酸的短窗中具有至少80％序列同一性，并且可具有至少85％或至少90％或95％的序列同一性，根據(jù)它們與參考序列的相似性而定。在這種短窗中測(cè)定序列同一性的方法可在國(guó)際互聯(lián)網(wǎng)上的NCBI網(wǎng)址得到。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，提供的這些序列同一性范圍只是指導(dǎo)性的；完全有可能得到提供超出所述范圍的非常顯著的同系物。
“移植”是指組織、細(xì)胞、或器官、或其一部分從一名主體到另一名主體、從一名主體到相同主體的另一個(gè)部分、或從一名主體到相同主體的相同部分的轉(zhuǎn)移。供體和接受者可為相同的或不是為相同的基因型。“同種異體移植”或“異種移植”是指從一個(gè)個(gè)體到另一個(gè)個(gè)體的移植，其中個(gè)體在兩個(gè)個(gè)體的序列中的一個(gè)或多個(gè)基因座上具有不同的基因。同種異體移植可以在遺傳學(xué)不同的相同種類(lèi)的兩個(gè)個(gè)體之間發(fā)生、或在兩個(gè)不同種類(lèi)的個(gè)體之間發(fā)生。“自體移植”是指組織、細(xì)胞、或其一部分從相同個(gè)體的一個(gè)位置到另一個(gè)位置的移植，或組織或其一部分從一個(gè)個(gè)體到另一個(gè)個(gè)體的移植，其中兩個(gè)個(gè)體為遺傳學(xué)相同的。
提供以上術(shù)語(yǔ)描述只是用于幫助讀者，不應(yīng)將其解釋為是小于本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的范圍，或因此將其看作是對(duì)權(quán)利要求范圍的限制。
單數(shù)術(shù)語(yǔ)“a”、“an”和“the”包括復(fù)數(shù)，除非上下文關(guān)系清楚地表明不是這樣。類(lèi)似地，單詞“或”是指包括“和”，除非上下文清楚地指明不是這樣。單詞“包括”表示“包含”。另外，應(yīng)該理解，對(duì)于化合物的所有的分子量或分子質(zhì)量值為近似值，提供目的在于說(shuō)明。雖然與本文中所述方法和材料相似或等價(jià)的那些可用于本公開(kāi)的實(shí)踐或試驗(yàn)，適當(dāng)?shù)姆椒ê筒牧厦枋鋈缦?。另外，材料、方法、和?shí)施例只是示例性的而不是限制性的。所有的化合物都包括(+)和(-)立體異構(gòu)體(以及(+)或(-)立體異構(gòu)體)、及其任何互變異構(gòu)體?？s寫(xiě)“mc”表示“微”，因此，“mcM”表示微摩爾，“mcL”表示微升。
使用的化合物可用于本文公開(kāi)的方法和組合物中的一類(lèi)4H-1-苯并吡喃-4-酮類(lèi)化合物的一個(gè)例子為2-(4-哌嗪基)-取代的4H-1-苯并吡喃-4-酮類(lèi)化合物，其具有下式表示的代表性結(jié)構(gòu)
式A其中R1和R2各自的存在為非必要的，并且R1和R2各個(gè)獨(dú)立地選自烷基、取代的烷基、雜烷基、環(huán)烷基、取代的環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、取代的雜環(huán)烷基、芳基、取代的芳基、雜芳基、取代的雜芳基、烷氧基、鹵素、羥基、氨基、或硫基。如果R1和/或R2存在，則在每個(gè)各自的環(huán)狀結(jié)構(gòu)上可能有一個(gè)或多個(gè)R1和/或R2取代基。
可用于本文公開(kāi)的方法和組合物中的一類(lèi)4H-1-苯并吡喃-4-酮類(lèi)化合物的另一個(gè)例子為2-(4-哌嗪基)-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮類(lèi)化合物，其具有下式表示的代表性結(jié)構(gòu) 式B其中R1和R2各自的存在為非必要的，并且R1和R2各自獨(dú)立地選自烷基、芳基、烷氧基、鹵素、羥基或氨基。如果R1和/或R2存在，則在每個(gè)各自的環(huán)狀結(jié)構(gòu)上可能有一個(gè)或多個(gè)R1和/或R2取代基。
具體的4H-1-苯并吡喃-4-酮類(lèi)化合物的示例性例子為2-(4-哌嗪基)-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮，其具有下式表示的結(jié)構(gòu)
式C2-(4-哌嗪基)-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮二鹽酸鹽可購(gòu)自Sigma-Aldrich Corporationis，名稱為“LY 303511”。本文中所述的2-(4-哌嗪基)-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮化合物可根據(jù)Vlahos等人，J.Biol.Chem.，2695241-5248，1994中所述的方法合成。2-(4-哌嗪基)-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮的其它鹽的形式可容易地根據(jù)已知技術(shù)合成，如在Handbook of Phazmaceutical Salts，Properties，Selection and Use，WileyVCH(2002)中描述的那些。
本發(fā)明公開(kāi)的方法包括對(duì)主體給藥在藥學(xué)相容性載體中的一種或多種本發(fā)明所述的一種或多種化合物、或一種或多種化合物與一種或多種其它藥物的組合。給藥以有效抑制增生性疾病如腫瘤或再狹窄形成、或有效提供免疫抑制的量進(jìn)行。雖然可以在處于顯著的這種疾病的危險(xiǎn)下人口統(tǒng)計(jì)群體中的任何患者中進(jìn)行預(yù)防性治療，也可以使用更具體的標(biāo)準(zhǔn)選擇主體，如病況的明確診斷。
在其中藥物進(jìn)行遞送的介質(zhì)可以包括藥物的可藥用組合物，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法?？蓪⑷魏纹胀ǖ妮d體如無(wú)菌鹽水或葡萄糖溶液與本文公開(kāi)的藥物一起使用。給藥途徑包括但不限于口服和非腸道途徑，如靜脈內(nèi)(iv)、腹膜內(nèi)(ip)、直腸、局部、眼、鼻、和透皮。
藥物可以現(xiàn)在已知的或以后開(kāi)發(fā)的適當(dāng)方式在任何常規(guī)的介質(zhì)(參見(jiàn)以下)中給藥，如口服或靜脈內(nèi)。例如，靜脈內(nèi)注射可通過(guò)鹽水介質(zhì)進(jìn)行。介質(zhì)也可包含常規(guī)的藥用輔劑，諸如例如，可藥用鹽用于調(diào)節(jié)滲透壓力，脂質(zhì)載體如環(huán)糊精、蛋白質(zhì)如血清白蛋白、親水性試劑如甲基纖維素、洗滌劑、緩沖液、防腐劑、表面活性劑、抗氧化劑(如，抗壞血酸棕櫚酸酯、丁基羥基茴香醚(BHA)、丁基羥基甲苯(BHT)和維生素E)、螯合劑、粘度調(diào)節(jié)劑、口味劑(tonicifiers)、香料、著色劑、調(diào)味劑等。對(duì)于非腸道藥用載體的更完全說(shuō)明可以在RemingtonTheScience and Practice of Pharmacy(第19版，1995)的第95章中找到。
其它藥用組合物的例子可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)的可藥用載體、助劑和平衡離子制備。優(yōu)選組合物為固體、半固體和液體劑型的單位劑量的形式，如片劑、丸劑、粉末劑、液體溶液或懸浮液。半固體制劑可為任何半固體制劑，包括例如凝膠劑、糊劑、霜?jiǎng)?、和膏劑。液體劑型可包括溶液、懸浮液、脂質(zhì)體制劑、或在有機(jī)或含水介質(zhì)中的乳劑。
抑制免疫應(yīng)答或治療增生性疾病的方法本文提供了抑制主體中的免疫應(yīng)答的方法，其包括對(duì)主體給藥治療有效量的本文公開(kāi)的2-(4-哌嗪基)-取代的4H-1-苯并吡喃-4-酮類(lèi)化合物或其可藥用鹽。在一個(gè)具體的非限制性例子中，免疫應(yīng)答可包括細(xì)胞因子的分泌，所述細(xì)胞因子例如但不限于白細(xì)胞介素(IL)-12、腫瘤壞死因子(TNF)-α、干擾素(IFN)-γ、單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP)-1、IL-10、IL-6。在另一個(gè)具體的非限制性例子中，免疫應(yīng)答包括巨噬細(xì)胞活化。
可以將治療有效量的本文公開(kāi)的2-(4-哌嗪基)-取代的4H-1-苯并吡喃-4-酮類(lèi)化合物或其可藥用鹽與另外的免疫抑制劑聯(lián)合給藥。這種給藥可以任何順序同時(shí)或連續(xù)進(jìn)行。免疫抑制劑包括但不限于環(huán)孢素A、FK506、或其類(lèi)似物；或抗體如特異性地結(jié)合CD3(如OKT3)、CD4、或CD8的單克隆抗體。
在一個(gè)例子中，2-(4-哌嗪基)-取代的4H-1-苯并吡喃-4-酮類(lèi)化合物和免疫抑制劑可以在溶液中或在促進(jìn)這些藥物的遞送和吸收的遞送介質(zhì)如脂質(zhì)體中共同給藥。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本文公開(kāi)的方法可用于治療移植排斥。移植涉及組織或器官或其一部分從一個(gè)身體或身體的一部分到另一個(gè)身體或身體的一部分的轉(zhuǎn)移?！巴N異體移植”或“異種移植”為從供體到接受者主體的移植，其中供體和接受者具有在兩個(gè)個(gè)體的序列中的一個(gè)或多個(gè)基因座上的不同基因。接受者可能產(chǎn)生對(duì)抗供體抗原(包括供體MHC)的免疫應(yīng)答；因此免疫抑制療法經(jīng)常用于治療移植接受者(如心、肺、或腎移植接受者)。本文公開(kāi)了用于治療移植排斥的新方法，該方法包括給藥治療有效量的本文公開(kāi)的2-(4-哌嗪基)-取代的4H-1-苯并吡喃-4-酮類(lèi)化合物或其可藥用鹽。在一個(gè)實(shí)施方案中，治療延長(zhǎng)了供體組織的存活或改善了其功能。本文公開(kāi)的方法還可以用于治療移植物抗宿主病。
本文提供治療增生性疾病的方法，該方法包括對(duì)主體給藥治療有效量的本文公開(kāi)的2-(4-哌嗪基)-取代的4H-1-苯并吡喃-4-酮類(lèi)化合物。本文證明了2-(4-哌嗪基)-取代的4H-1-苯并吡喃-4-酮化合物可用于抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。因此，可對(duì)主體給藥治療有效量的2-(4-哌嗪基)-取代的4H-1-苯并吡喃-4-酮類(lèi)化合物以治療瘤。腫瘤包括良性腫瘤和惡性腫瘤。腫瘤另外包括血液瘤和實(shí)體瘤。示例性的腫瘤為皮膚、神經(jīng)系統(tǒng)、肺、乳房、生殖器官、胰腺、淋巴樣細(xì)胞(包括白血病和淋巴瘤)、血液或淋巴管、和結(jié)腸的腫瘤。腫瘤包括癌、肉瘤、乳頭狀瘤、腺瘤、血癌、淋巴瘤、黑素瘤、和腺癌，以及其它。
可以將治療有效量的本文公開(kāi)的2-(4-哌嗪基)-取代的4H-1-苯并吡喃-4-酮類(lèi)化合物或其可藥用鹽與另外的化療劑聯(lián)合給藥。這種給藥可以任何順序同時(shí)或連續(xù)進(jìn)行。化療劑包括但不限于化藥、抗代謝物和抗體。示例性的化療劑為多柔比星、紫杉醇、雷帕霉素和甲氨蝶呤。
本文另外證明了2-(4-哌嗪基)-取代的4H-1-苯并吡喃-4-酮類(lèi)化合物可用于抑制平滑肌細(xì)胞的增殖。因此，可對(duì)主體給藥治療有效量的2-(4-哌嗪基)-取代的4H--1-苯并吡喃-4-酮化合物以治療血管再狹窄。
本文公開(kāi)的治療用化合物可用于治療再狹窄，通過(guò)在冠脈或外周動(dòng)脈血管成形術(shù)或斑塊切除術(shù)、冠脈架橋術(shù)移植體或支架手術(shù)、或外周血管手術(shù)(如，頸動(dòng)脈或其它外周血管動(dòng)脈內(nèi)膜切除術(shù)、血管搭橋、支架或假體移植操作)之前、過(guò)程中和/或之后將本發(fā)明的化合物對(duì)患者給藥。除了本說(shuō)明書(shū)中在別處描述的給藥技術(shù)之外，苯并吡喃-4-酮可通過(guò)腔內(nèi)裝置如血管支架或移植體遞送。例如，可對(duì)支架或移植體涂布或結(jié)合苯并吡喃-4-酮化合物，用于在感興趣的血管位置控制釋放苯并吡喃-4-酮化合物。這種控制釋放可包括在所需時(shí)段內(nèi)持續(xù)地遞送化合物。
對(duì)于在本文公開(kāi)的治療方法中的應(yīng)用，2-(4-哌嗪基)-取代的4H-1-苯并吡喃-4-酮化合物(和任選的另外的藥物)的給藥可為系統(tǒng)或局部給藥。2-(4-哌嗪基)-取代的4H-1-苯并吡喃-4-酮類(lèi)化合物的局部給藥通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法進(jìn)行。例如，對(duì)個(gè)體如患有關(guān)節(jié)炎的個(gè)體的膝、臀部、和/或肩給藥的一個(gè)方法為通過(guò)關(guān)節(jié)內(nèi)注射給藥。為了對(duì)膝給藥，例如，將要注射的關(guān)節(jié)用聚維酮碘溶液或其它防腐劑洗滌。將約1％鹽酸利多卡因溶液注射到皮膚和皮下組織中。使用3通旋塞閥/針頭組件，通過(guò)18-30號(hào)針頭給藥化合物。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的標(biāo)準(zhǔn)旁側(cè)方法(lateral approach)將2-(4-哌嗪基)-取代的4H-1-苯并吡喃-4-酮類(lèi)化合物局部注射到關(guān)節(jié)間隙中。隨著將針頭抽出，通過(guò)3通旋塞閥組件用1％鹽酸利多卡因清洗凈化針頭和針管道。然后使膝移動(dòng)通過(guò)彎曲-伸展弧，然后以完全伸展方式被固定。然后患者臥床約24小時(shí)，使移動(dòng)最小化和活性劑從關(guān)節(jié)的滲漏最小化。
在其它實(shí)施方案中，2-(4-哌嗪基)-取代的4H-1-苯并吡喃-4-酮化合物的給藥為系統(tǒng)給藥?？紤]了口服、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、和甚至直腸的給藥。
使用的藥理學(xué)組合物可以常規(guī)方式使用一種或多種藥理學(xué)(如，生理學(xué)或藥學(xué))可接受的載體進(jìn)行配制，包括可藥用的賦形劑以及促進(jìn)將活性化合物加工為制劑的非必要助劑。適當(dāng)?shù)闹苿└鶕?jù)選擇的給藥途徑而定。另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地選擇適當(dāng)?shù)慕o藥途徑，包括但不限于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)粘膜、皮下、透皮、經(jīng)鼻、吸入、和口服給藥。
因此，對(duì)于注射劑，可將活性組分配制為水溶液，優(yōu)選在生理學(xué)相容性緩沖液中。對(duì)于經(jīng)粘膜給藥，在制劑中使用適合于滲透屏障的滲透劑。這種滲透劑通常為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。對(duì)于口服給藥，可將活性組分與適合包括在片劑、丸劑、糖衣丸、膠囊、液體、凝膠劑、糖漿劑、淤漿劑、懸浮液等中的載體組合。2-(4-哌嗪基)-取代的4H-1-苯并吡喃-4-酮類(lèi)化合物也可被配制為用于吸入療法，例如治療患有肺炎癥的主體。對(duì)于通過(guò)吸入給藥，使用適當(dāng)?shù)耐七M(jìn)劑，可將存在于加壓包裝或霧化器中的活性組分方便地以氣霧劑噴射的形式遞送。
2-(4-哌嗪基)-取代的4H-1-苯并吡喃-4-酮類(lèi)化合物可被配制為用于通過(guò)注射進(jìn)行非腸道給藥，如通過(guò)彈丸注射或連續(xù)輸注。類(lèi)似地，2-(4-哌嗪基)-取代的4H-1-苯并吡喃-4-酮類(lèi)化合物可被配制為用于氣管內(nèi)給藥或用于吸入。這種組合物可為如懸浮液、溶液、或在油性或水性介質(zhì)中的乳劑形式，并且可以包含制劑用助劑如助懸劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑。其它藥理學(xué)賦形劑為本領(lǐng)域中所公知。
本發(fā)明所述化合物的治療有效劑量可由本領(lǐng)域技術(shù)人員測(cè)定，目的是實(shí)現(xiàn)抗再狹窄、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗腫瘤或抗免疫抑制所需的水平?；衔锏南鄬?duì)毒性使得其可能以多種劑量范圍進(jìn)行給藥。在一個(gè)例子中，化合物以單獨(dú)的或分開(kāi)的劑量進(jìn)行口服給藥。
對(duì)于任何特定主體的特定劑量水平和劑量頻率可能不同，并且根據(jù)多種因素而定，所述的多種因素包括特定化合物的活性、所患疾病的活性程度、年齡、體重、一般健康狀態(tài)、性別、膳食、給藥方式和時(shí)間、排泄速率、藥物組合、和經(jīng)歷治療的主體的病況的嚴(yán)重程度。
篩選本文提供用于選擇免疫抑制劑或抗增生劑的方法。該方法包括選擇試驗(yàn)劑，與抑制磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)依賴性的底物磷酸化相比，該試驗(yàn)劑優(yōu)先抑制MTOR-依賴性的P70S6激酶磷酸化，從而鑒定藥學(xué)有用的免疫抑制劑或抗增生劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，藥物還抑制一種或多種另外的激酶。例如，藥物可以抑制酪蛋白激酶2，酪蛋白激酶2為細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)劑。因此，該方法包括選擇試驗(yàn)劑，與抑制磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)依賴性的底物磷酸化相比，該試驗(yàn)劑優(yōu)先抑制mTOR-依賴性的P70S6激酶、酪蛋白激酶2、或兩者的磷酸化，從而鑒定藥學(xué)有用的免疫抑制劑或抗增生劑。該試驗(yàn)可以在細(xì)胞或細(xì)胞提取物中進(jìn)行。
試驗(yàn)化合物可為感興趣的任何化合物，包括化合物、小分子、多肽、或其它生物制劑(例如抗體或細(xì)胞因子)。在幾個(gè)例子中，篩選一組可能的化療劑、或一組可能的免疫抑制劑。在其它實(shí)施方案中，篩選一組多肽變體。
在使用細(xì)胞的試驗(yàn)中，使細(xì)胞接觸試驗(yàn)化合物。在一些實(shí)施方案中，將細(xì)胞與試驗(yàn)化合物培養(yǎng)足夠的時(shí)間，從而通過(guò)PI3K實(shí)現(xiàn)底物磷酸化和抑制細(xì)胞中P70S6激酶磷酸化。將細(xì)胞胞溶并測(cè)量磷酸化P70S6激酶的量和被PI3K磷酸化的底物的量。將存在于細(xì)胞中的磷酸化P70S6激酶的量和磷酸化底物的量與沒(méi)有暴露于試驗(yàn)化合物下的相同細(xì)胞進(jìn)行比較。
在一些實(shí)施方案中，將蛋白質(zhì)印跡技術(shù)用于通過(guò)電泳分離的細(xì)胞蛋白質(zhì)并且使用結(jié)合于P70S6激酶、磷酸化p70S6激酶的抗體，和/或特異性地結(jié)合底物(如磷酸化S6)的抗體。或者，可將細(xì)胞在包含放射性同位素標(biāo)記的磷的正磷酸鹽的存在下培養(yǎng)，并檢測(cè)磷酸化或未磷酸化的底物(如P70S6激酶)。
在一些實(shí)施方案中，在體外在37℃下在5％CO2的濕潤(rùn)氣氛中將細(xì)胞用試驗(yàn)化合物處理。在用試驗(yàn)化合物處理之后，細(xì)胞用不含Ca2+和Mg2+的PBS洗，并且如(Haldar等人，Cell Death Diff.，1109-115，1994；Haldar等人，Nature，342195-198，1989；Haldar等人，Cancer Res.，542095-2097，1994)中所述提取總蛋白質(zhì)。在另外的實(shí)施方案中，使用一系列稀釋的試驗(yàn)化合物。
在一些實(shí)施方案中，使用蛋白質(zhì)印跡法和免疫檢測(cè)分析磷酸化作用，所述蛋白質(zhì)印跡法和免疫檢測(cè)使用Amersham ECL進(jìn)行，AmershamECL是增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)和公知方法。在一個(gè)例子中，在試驗(yàn)化合物的存在下使用1mCi/ml的[p32]正磷酸(NEN)在無(wú)磷酸鹽的培養(yǎng)基(GIBCO)中進(jìn)行淋巴樣細(xì)胞磷酸化6小時(shí)。p32標(biāo)記的細(xì)胞提取物的免疫沉淀反應(yīng)可以如例如Haldar等人，Nature，342195-198，1998中所述進(jìn)行。該免疫沉淀反應(yīng)采用結(jié)合感興趣的底物如P70S6激酶、酪蛋白激酶2底物(如p53、Bid、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶II)、或PI3K底物(如磷脂酰肌醇、磷脂酰肌醇4-磷酸、磷脂酰肌醇4，5-磷酸)的抗體。將免疫復(fù)合物在0.75mm厚的10％SDS-PAGE上運(yùn)行。隨后，將凝膠干燥并暴露以進(jìn)行自動(dòng)射線照相。
如本領(lǐng)域中已知的方式進(jìn)行磷酸-氨基酸分析。例如，分析可以基本上以Hunter薄層電泳系統(tǒng)，HTLE700，(CBS Scientific Company Inc.，USA)操作手冊(cè)中所述方式進(jìn)行。簡(jiǎn)而言之，將p32標(biāo)記的免疫沉淀物在10％SDS-PAGE凝膠上運(yùn)行。從凝膠中切取所感興趣的免疫活性譜帶并用50μM的碳酸氫銨洗脫。在洗脫之后，在15％-20％TCA+載體蛋白的存在下使蛋白質(zhì)沉淀，并用乙醇洗。然后在過(guò)甲酸中將沉淀的蛋白質(zhì)氧化，并凍干。將干燥的小球再次懸浮在恒沸的HCl中，在110℃加熱，并凍干。將殘余物再次懸浮在包含磷酸-氨基酸標(biāo)準(zhǔn)的pH為1.9的緩沖液(50mcl的甲酸、156mcl的乙酸、1794mcl的H2O)中，并點(diǎn)樣在PEI纖維素板上。進(jìn)行二維薄層色譜法，使用pH為1.9的緩沖液進(jìn)行第一維色譜法，使用pH為3.5的緩沖液(100ml的乙酸、10ml的吡啶、1890ml的H2O)用于第二維色譜法。將板在65℃烘烤10分鐘，并通過(guò)對(duì)冷卻的板噴射0.25％茚三酮并將板送回到65℃烘箱中15分鐘使標(biāo)準(zhǔn)顯像。然后使板暴露于膠片下兩到四周，使用Kodak X-omat AR膠片。
在一些實(shí)施方案中，使用細(xì)胞提取物作為起始原料分析磷酸化的調(diào)節(jié)。將試驗(yàn)化合物與細(xì)胞提取物合并，并檢查化合物對(duì)P70S6激酶磷酸化和對(duì)磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-依賴性磷酸化的作用。在一個(gè)例子中，將細(xì)胞提取物接觸試驗(yàn)化合物，以鑒定在32P-γ-ATP的存在下試驗(yàn)化合物對(duì)P70 S6激酶磷酸化的作用，或鑒定試驗(yàn)化合物對(duì)bcl-2磷酸化的作用。
在示例性的方案中，使用100μg的總細(xì)胞提取物與特定濃度的試驗(yàn)化合物在體外在37℃下處理細(xì)胞提取物。對(duì)于磷酸酶反應(yīng)，將50μl的細(xì)胞溶胞產(chǎn)物接觸試驗(yàn)化合物并將反應(yīng)混合物在37℃培養(yǎng)30-60分鐘。
對(duì)于細(xì)胞提取物的磷酸化，將100μg的細(xì)胞提取物如上所述進(jìn)行處理，只是向各個(gè)反應(yīng)中中加入40μci的[32P]ATP(3000Ci/mmol)。通過(guò)將試管浸漬在冰中使反應(yīng)終止。通過(guò)使用交聯(lián)劑二甲基庚二酸亞胺酯(dimethylpimelimidate)二鹽酸化物(50mM)將純抗體共價(jià)結(jié)合于蛋白質(zhì)-A瓊脂糖凝膠上，而將[32P]ATP標(biāo)記的反應(yīng)混合物吸收在由對(duì)抗P70S6激酶或PI3K底物的單克隆抗體制成的免疫親和柱上。用包含0.5％去氧膽酸鈉的0.05M二乙胺(pH 11.5)洗脫特異性結(jié)合的[32P]-標(biāo)記蛋白質(zhì)。
在示例性的方法中，使用Amersham ECL檢測(cè)系統(tǒng)和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡法的免疫檢測(cè)。可以如例如Haldar等人，Nature，342195-198，1989中所述進(jìn)行p32標(biāo)記的細(xì)胞提取物的免疫沉淀反應(yīng)。將免疫復(fù)合物在0.75mm厚的10％SDS-PAGE上運(yùn)行。隨后，將凝膠干燥并暴露以進(jìn)行自動(dòng)射線照相，使用膠片如Kodak XAR膠片的膠片。
例如，磷酸-氨基酸分析可以基本上如Hunter薄層電泳系統(tǒng)，HTLE700，(CBS Scientific Company Inc.，USA)操作手冊(cè)中所述方式進(jìn)行。在示例性的方法中，將p32標(biāo)記的免疫沉淀物在10％SDS-PAGE凝膠上運(yùn)行。從凝膠上切取P70S6激酶免疫活性譜帶并用50μM的碳酸氫銨洗脫。在洗脫之后，在15％-20％TCA+載體蛋白的存在下使蛋白質(zhì)沉淀，并用乙醇洗。然后在過(guò)甲酸中將沉淀的蛋白質(zhì)氧化，并凍干。將干燥的小球再次懸浮在恒沸的HCl中，在110℃加熱并凍干。將殘余物再次懸浮在包含磷酸-氨基酸標(biāo)準(zhǔn)的pH為1.9的緩沖液(50mcl的甲酸、156mcl的乙酸、1794mcl的H2O)中，并點(diǎn)樣在PEI纖維素板上。進(jìn)行二維薄層色譜法，使用pH為1.9的緩沖液進(jìn)行第一維色譜法，使用pH為3.5的緩沖液(100ml的乙酸、10ml的吡啶、1890ml的H2O)用于第二維色譜法。將板在65℃烘烤10分鐘，通過(guò)對(duì)冷卻的板噴射0.25％茚三酮并將板送回到65℃的烘箱中15分鐘而使標(biāo)準(zhǔn)顯像。然后將板暴露于膠片下。
酪蛋白激酶2活性的一個(gè)特異性試驗(yàn)是購(gòu)自UpstateBiotechnology(New York)的試劑盒。該試驗(yàn)基于在30℃培養(yǎng)10分鐘的過(guò)程中由酪蛋白激酶2轉(zhuǎn)移32P-ATP的γ-磷酸的特異性底物(CK-2底物肽)的磷酸化。然后使用P81磷酸纖維素紙將磷酸化的底物與殘留的32P-ATP分離，并通過(guò)閃爍計(jì)數(shù)定量。
實(shí)施例雷帕霉素通過(guò)阻斷P70S6激酶的mTOR-依賴性調(diào)節(jié)而抑制癌癥和平滑肌細(xì)胞增殖。雷帕霉素由FDA批準(zhǔn)用于治療移植排斥(免疫抑制作用和抗炎)、癌癥、和冠脈血管成形術(shù)后的血管再狹窄。然而，雷帕霉素的應(yīng)用具有幾個(gè)缺點(diǎn)和副作用，并且期望鑒定mTOR依賴性信號(hào)的其它藥理學(xué)抑制劑。
與LY294002一樣，LY303511抑制mTOR和酪蛋白激酶2。與LY294002不同，LY303511不能顯著地抑制PI3K，PI3K為控制細(xì)胞死亡、胞質(zhì)分裂、和葡萄糖/脂類(lèi)代謝中重要的信號(hào)酶。渥曼青霉素對(duì)PI3K有選擇性。本文公開(kāi)的實(shí)施例使用LY303511作為示例性的4H-1-苯并吡喃-4-酮化合物。結(jié)果證明，LY303511可用于抑制免疫應(yīng)答和用于抑制細(xì)胞(包括平滑肌細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞)的增殖。LY303511有可能在不同于雷帕霉素結(jié)合中所牽涉的位置上選擇性地抑制mTOR，而對(duì)PI3K的作用較小。LY303511可單獨(dú)使用、或與雷帕霉素或其它藥物組合，用于控制細(xì)胞增殖和免疫應(yīng)答。
實(shí)施例1LY303511抑制細(xì)胞增殖這個(gè)實(shí)施例證明，LY303511阻斷P70S6激酶磷酸化和人肺上皮腺癌(A549)細(xì)胞的細(xì)胞增殖。LY303511與LY294002的不同之處在于用胺代替嗎啉基中的氧(圖1A)。
將A549細(xì)胞在沒(méi)有或有100mcM LY303511、200ng/ml雷帕霉素、或50nM渥曼青霉素的無(wú)血清培養(yǎng)基中處理1小時(shí)，然后加入大腸桿菌脂多糖(LPS)(1000mcg/ml)和干擾素(IFN)-γ(100U/ml)(LPS/IFN-y或“L/I”)。將細(xì)胞勻質(zhì)化并通過(guò)蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)所示的蛋白質(zhì)(參見(jiàn)表1)。蛋白質(zhì)印跡得自相同的實(shí)驗(yàn)，為三個(gè)實(shí)驗(yàn)的代表。
表1抗體的描述

結(jié)果證明，LY303511阻斷P70S6激酶磷酸化(圖1B)。渥曼青霉素和雷帕霉素也阻斷磷酸化。結(jié)果證明，LY303511和雷帕霉素增加AKT的磷酸化(圖1B)。渥曼青霉素阻斷PI3K并且抑制pAKT磷酸化。因此，LY303511抑制S6的mTOR敏感性磷酸化，而不是AKT的(圖1C)。這些結(jié)果表明，LY303511為mTOR抑制劑。結(jié)果還證明，LY303511以濃度依賴性方式抑制mTOR的自磷酸化(圖1D)。與雷帕霉素不同，LY303511對(duì)S6K或mTOR的基礎(chǔ)磷酸化有極小的作用(圖1B、1D)。因此，LY303511在低至1μM的濃度下以獨(dú)立于PI3K的方式抑制LPS/IFN-γ刺激的mTOR活化和S6K的mTOR-依賴性磷酸化。
在另一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，將A549細(xì)胞以每孔4,000個(gè)細(xì)胞鋪板在96孔板上并用沒(méi)有或有所示藥理學(xué)抑制劑的溴脫氧尿苷處理24小時(shí)。通過(guò)原地ELISA(BrdU檢測(cè)試劑盒，Roche)測(cè)量溴脫氧尿苷(BrdU)吸收，作為DNA合成和細(xì)胞增殖的指示劑。
另外，使A549細(xì)胞(每孔80,000個(gè)細(xì)胞)生長(zhǎng)24小時(shí)，然后加入抑制劑(圖2A)。在24小時(shí)之后，使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)用錐蟲(chóng)藍(lán)染色的細(xì)胞。在所有條件下細(xì)胞存活率＞99％(數(shù)據(jù)未表示)。在暴露于單獨(dú)介質(zhì)下的細(xì)胞中，在24小時(shí)內(nèi)，細(xì)胞數(shù)增加～50％。雷帕霉素輕微地減弱細(xì)胞增殖，而LY303511具有顯著的抑制作用，幾乎等于LY294002的抑制作用。與LY303511和LY294002的獨(dú)立于PI3K的作用一致，渥曼青霉素未顯著減少A549細(xì)胞增殖。通過(guò)碘化丙啶染色細(xì)胞的流式細(xì)胞計(jì)分析測(cè)定，LY303511沒(méi)有誘導(dǎo)細(xì)胞程序死亡或壞死。
根據(jù)溴脫氧尿苷(BrDu)吸收所確定的，LY303511以及LY303511與雷帕霉素的組合抑制A549細(xì)胞的增殖(圖2B)。盡管雷帕霉素對(duì)DNA合成具有弱的但是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的作用，LY303511的給藥引起濃度依賴性的減少(圖2B)。當(dāng)LY303511與雷帕霉素組合時(shí)，沒(méi)有另外的作用。單獨(dú)的DMSO對(duì)于A549細(xì)胞增殖沒(méi)有作用。
在另一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，使A549細(xì)胞在含血清的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)到亞匯合和并與培養(yǎng)基、100mcM的LY303511、或雷帕霉素200ng/ml培養(yǎng)0、12、或24小時(shí)。將細(xì)胞胞溶并通過(guò)SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)，然后轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜上。將膜與對(duì)抗p27Kipl、p21 Cipl、或磷酸-P70S6激酶T389培養(yǎng)。
在處理之后的12和24小時(shí)，LY303511和雷帕霉素在T389阻斷P70 S6激酶磷酸化，與mTOR激酶活性的抑制一致(圖3A)。LY303511而不是雷帕霉素引起細(xì)胞周期停滯標(biāo)識(shí)物p27Kipl、和p21 Cipl的積聚。p27 Kipl(p27)水平的LY303511依賴性增加表明類(lèi)似于雷帕霉素的G1/S過(guò)渡抑制劑的作用(圖3A)。然而，與雷帕霉素相比，LY303511引起S期晚期進(jìn)展的抑制劑p21 Cipl(p21)的顯著增加。LY303511而不是雷帕霉素降低細(xì)胞周期蛋白A和B的水平，它們也是S和G2/M期進(jìn)展的調(diào)節(jié)劑(圖3B)。LY303511還降低Rb磷酸化，這表明細(xì)胞周期抑制的機(jī)理部分是由于E2F-依賴性基因的抑制所致。這些結(jié)果支持了LY303511-敏感性激酶在除了在G1/S過(guò)渡中之外，還在S晚期和G2/M進(jìn)展中的作用。
為了證實(shí)LY303511引起G1抑制，將A549細(xì)胞用0、10、或100mcM的LY303511處理24小時(shí)，固定，并與對(duì)抗KI-67的抗體培養(yǎng)。將載波片裝在包含DAPI以染色細(xì)胞核的溶液中。使用相等的激光強(qiáng)度抓拍照片并放大。用LY303511而不是雷帕霉素的處理在全部細(xì)胞中引起KI-67水平的顯著降低，其也與在細(xì)胞增殖中的阻斷一致。
結(jié)果證明，LY303511在作為mTOR依賴性P70S6激酶活化的標(biāo)識(shí)物的蘇氨酸(T)389(T389)處抑制P70S6激酶的基礎(chǔ)磷酸化和刺激磷酸化。另外，LY303511沒(méi)有在473位絲氨酸(S)(S473)抑制AKT的PI3K依賴性磷酸化。與雷帕霉素相似，LY303511增加AKT磷酸化。另外，LY303511在作為mTOR激酶活性標(biāo)識(shí)物的2481位絲氨酸(S2481)抑制mTOR的基礎(chǔ)磷酸化和刺激磷酸化。LY303511還抑制A549細(xì)胞的增殖。該作用在使用雷帕霉素與10到100mcM劑量的LY303511時(shí)是相加的。因此，LY303511、或LY303511與雷帕霉素的組合可用于抑制腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。結(jié)果進(jìn)一步證明誘導(dǎo)了細(xì)胞周期停滯。
實(shí)施例2LY303511抑制炎癥過(guò)程的活化這個(gè)實(shí)施例證明，LY303511抑制A549細(xì)胞中的P70S6激酶磷酸化和STAT1響應(yīng)LPS和IFN-γ的活化。
將A549細(xì)胞用表達(dá)由STAT1(GAS-1uc，Clontech)驅(qū)動(dòng)的熒光蟲(chóng)熒光素酶的報(bào)道基因載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染并在沒(méi)有或有100mcM的LY303511、雷帕霉素200ng/ml、或兩者的情況下培養(yǎng)1小時(shí)，然后加入LPS/IFN-γ，維持6小時(shí)。在細(xì)胞溶胞產(chǎn)物(RLU)中測(cè)量STAT1舌性(熒光素酶活性)。圖8中的數(shù)據(jù)為一式三份樣品±SEM，并且為兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表。LY303511通過(guò)兩種炎癥遞質(zhì)LPS/IFN-γ抑制STAT1舌化。
與轉(zhuǎn)錄因子STAT1的抑制一致，LY303511通過(guò)用LPS刺激的巨噬細(xì)胞降低由LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞因子產(chǎn)生(參見(jiàn)實(shí)施例8)。
實(shí)施例3LY303511抑制平滑肌細(xì)胞中P70S6激酶磷酸化這個(gè)實(shí)施例證明，LY303511抑制初級(jí)人肺動(dòng)脈平滑肌(HPASM)細(xì)胞中P70S6激酶磷酸化。
HPASM細(xì)胞購(gòu)自Clonetics并且根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明書(shū)傳代。將細(xì)胞在100mm皿中鋪板，并使其生長(zhǎng)到接近匯合，然后血清饑餓24小時(shí)。向介質(zhì)中加入抑制劑，在1小時(shí)之后加入10％FBS，維持30分鐘。將細(xì)胞勻質(zhì)化并通過(guò)蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)所示的蛋白質(zhì)。
LY303511抑制人肺動(dòng)脈平滑肌(PASM)細(xì)胞中P70S6激酶的基礎(chǔ)磷酸化和血清刺激的磷酸化(圖4A和4B)。LY303511還抑制AKT的磷酸化，雖然比p70S6激酶的磷酸化程度更低(圖4B)。LY303511還抑制在作為mTOR激酶活性的標(biāo)識(shí)物的S2481處的血清刺激的mTOR磷酸化。
在與血清培養(yǎng)并且之后加入抑制劑的PASM細(xì)胞中，雷帕霉素對(duì)增殖有很小的作用，而LY303511以濃度依賴性方式抑制(圖4C)。在沒(méi)有或有LY303511的情況下，雷帕霉素對(duì)增殖(BrDu結(jié)合)的作用當(dāng)將PASM細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)24小時(shí)然后加入FBS時(shí)得到增強(qiáng)(圖4D)。在沒(méi)有血清存在下，LY303511對(duì)PASM細(xì)胞增殖的作用得到增強(qiáng)，如同雷帕霉素一樣。10μM LY303511和雷帕霉素200ng/ml對(duì)增殖的作用相對(duì)于單獨(dú)的10μM LY303511是相加的(p＜0.05，圖4C、D)。雖然Akt磷酸化作用被LY303511抑制(圖4B)，渥曼青霉素沒(méi)有抑制細(xì)胞增殖，表明LY303511的這種作用與PI3K無(wú)關(guān)。
雷帕霉素和LY303511在PASM中對(duì)細(xì)胞周期的作用不如在A549細(xì)胞中的顯著(圖5A)。與雷帕霉素或無(wú)血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)引起G1抑制。相比之下，LY303511通過(guò)增加G1和G2/M期的分?jǐn)?shù)而降低處于S期的細(xì)胞比例。雷帕霉素+LY303511對(duì)S期細(xì)胞減少的作用是相加的。然而，響應(yīng)LY303511的G1平滑肌細(xì)胞的增加是微不足道的，表明LY303511在癌細(xì)胞中比在初級(jí)細(xì)胞中作用更大。
因此，LY303511、或LY303511與雷帕霉素的組合可用于抑制初級(jí)平滑肌細(xì)胞的生長(zhǎng)。結(jié)果進(jìn)一步表明LY303511可用于誘導(dǎo)這些細(xì)胞的細(xì)胞周期停滯。
實(shí)施例4LY303511通過(guò)引起組合的G1和G2抑制而抑制細(xì)胞周期為了研究LY303511對(duì)細(xì)胞周期的作用，使A549細(xì)胞或肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞在含血清的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)到亞匯合，并在沒(méi)有或有雷帕霉素(200ng/ml)的情況下與介質(zhì)、10、或100mcM LY303511培養(yǎng)24小時(shí)。然后收獲細(xì)胞并用碘化丙啶染色，然后通過(guò)流式細(xì)胞計(jì)分析細(xì)胞周期。測(cè)定在每種試驗(yàn)條件下處于細(xì)胞周期的G1、S、或G2/M期的細(xì)胞比例。通過(guò)碘化丙啶染色的強(qiáng)度門(mén)控細(xì)胞，以測(cè)定處于細(xì)胞周期的G1、S、或G2/M期中的細(xì)胞比例。與對(duì)DNA合成的作用一致，100μM的LY303511顯著地降低S期的細(xì)胞分?jǐn)?shù)(圖2C)。處于G2/M期中的細(xì)胞的比例保持不變，表明細(xì)胞在G1和G2/M都受到抑制。相比之下，雷帕霉素通過(guò)降低處于S和G2/M期中的細(xì)胞比例而增加G1群。10μMLY303511和雷帕霉素對(duì)減少S期細(xì)胞的作用相對(duì)于單獨(dú)的10μMLY303511是相加的(P＝0.056，圖2C)。通過(guò)向雷帕霉素中加入LY303511產(chǎn)生的S期細(xì)胞的更大減少而G2/M沒(méi)有進(jìn)一步的減少表明LY303511通過(guò)另外的不同于雷帕霉素的機(jī)制阻斷細(xì)胞周期。
結(jié)果證明，LY303511在轉(zhuǎn)化細(xì)胞和肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中都引起細(xì)胞周期停滯。因?yàn)?，與雷帕霉素不同，LY303511引起G2/M期中的細(xì)胞增加，該結(jié)果還暗示出，將有用于LY303511的另外的mTOR非依賴性細(xì)胞靶(如，酪蛋白激酶2)。
實(shí)施例5LY303511抑制酪蛋白激酶2(CK2)活性已經(jīng)進(jìn)行了微陣列基因表達(dá)分析，其中將A549細(xì)胞在沒(méi)有或有LY294002、或渥曼青霉素的情況下培養(yǎng)1小時(shí)，然后加入L/I，維持6小時(shí)。通過(guò)細(xì)胞反饋機(jī)制，在該藥物的存在下，被藥理學(xué)藥物直接抑制的mRNA編碼蛋白質(zhì)的水平可能增加。為了鑒定用于LY294002的另外的PI3K非依賴性激酶靶，通過(guò)過(guò)濾和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，從數(shù)據(jù)集鑒定被LY294002而不是被渥曼青霉素增加的mRNA。不出所料，在LY294002的存在下，mTOR mRNA的水平增加(1.7倍)，，而不是被渥曼青霉素增加。被LY294002增加的其它激酶的mRNAs包括編碼CK2α′的那些(1.8倍；GenBank登錄號(hào)55268)。因?yàn)镃K2可以調(diào)節(jié)G1和G2/M細(xì)胞周期過(guò)渡，評(píng)價(jià)了LY294002和LY303511對(duì)CK2活性的作用。
使用酪蛋白激酶2活性試劑盒(Upstate Biotechnology，產(chǎn)品編號(hào)17-132)測(cè)量酪蛋白激酶2(CK2)活性(每分鐘計(jì)數(shù))，通過(guò)將在50mcl試驗(yàn)緩沖液中的重組100ng CK2、鎂/ATP雞尾酒(10mcCi32P-γ-ATP、0.675微摩爾的MgCl2、4.5nmoles的ATP)和10微摩爾的肽底物(氨基酸序列RRRDDDSDDD(SEQ ID NO1)在沒(méi)有或有所示濃度的DMSO(1％)、LY294002、LY303511、或雷帕霉素存在下在30℃培養(yǎng)10分鐘。用20mcl的40％三氯乙酸終止試驗(yàn)，并將25mcl點(diǎn)樣在P81磷酸纖維素方格紙上，然后用0.75％磷酸洗滌3次，并且用丙酮洗滌一次。通過(guò)使用Packard 100Tri-Carb液體閃爍計(jì)數(shù)器在5ml閃爍流體中計(jì)數(shù)磷酸纖維素方格而檢測(cè)底物肽上的32P結(jié)合。
重組CK2與LY303511或LY294002的培養(yǎng)引起濃度依賴性抑制CK2活性(圖5B)。LY294002的近似IC50(10μM)為L(zhǎng)Y303511的十分之一。渥曼青霉素和雷帕霉素都不影響CK2活性。因?yàn)橐阎狢K2調(diào)節(jié)完整細(xì)胞中的G1和G2進(jìn)展，CK2代表了用于LY303511的另外的激酶靶。因此，LY303511以10到100mcM的IC50抑制酪蛋白激酶2。與抑制PI3K相比，LY303511優(yōu)先抑制P70S6激酶和酪蛋白激酶2。
LY303511和LY294002在體內(nèi)抑制CK2的能力提出了第二種mTOR非依賴性和PI3K非依賴性機(jī)制，這些抑制劑可通過(guò)這種機(jī)制阻斷細(xì)胞增殖。這些結(jié)果確立了可用于治療腫瘤疾病的新的一族化合物。
LY303511和LY294002阻斷CK2活性的發(fā)現(xiàn)提出了用于這類(lèi)藥物的新的替代靶，并且與用于抑制細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的mTOR非依賴性機(jī)制一致。CK2為普遍存在的并且是細(xì)胞生存需要的高度保守性絲氨酸-蘇氨酸激酶。通常，腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出高水平的CK2活性，CK2過(guò)量產(chǎn)生能夠在缺乏p53的小鼠中誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生。CK2通過(guò)直接磷酸化蛋白質(zhì)如p53、只含BH3的促凋亡蛋白(BID)、β-連環(huán)蛋白、或Fas相關(guān)因子(FAF1)而保護(hù)細(xì)胞免于細(xì)胞程序死亡。另外，CK2通過(guò)G0/G1、G1/S、和G2/M關(guān)卡調(diào)節(jié)進(jìn)展。LY303511誘導(dǎo)的細(xì)胞周期蛋白A和B水平降低、以及p21和p27水平增加(圖3)與CK2依賴性的細(xì)胞周期阻斷一致。LY303511對(duì)增殖和細(xì)胞周期的相加作用表明，除了抑制S6K的mTOR磷酸化之外，LY303511可以通過(guò)抑制不同于S6K的途徑如CK2而克服對(duì)雷帕霉素的耐受性。
mTOR和PI3K屬于蛋白質(zhì)的磷脂酰肌醇3-和4-激酶家族(interpro家族PI3 PI4激酶，編號(hào)IPR000403，參見(jiàn)可得自國(guó)際互聯(lián)網(wǎng)的InterPro數(shù)據(jù)庫(kù))。這個(gè)家族包括具有用于PI3K結(jié)構(gòu)域的特異性特征序列的247個(gè)蛋白質(zhì)。LY294002抑制PI3K和mTOR，而其它類(lèi)似物(如LY303511)可以優(yōu)先抑制這個(gè)家族中的亞型激酶。已知mTOR中PI3K催化域與PI3K之間的結(jié)構(gòu)同源性，LY303511還可以抑制具有PI3K樣結(jié)構(gòu)域的其它激酶，這些包括以下

實(shí)施例6磷酸化抑制的IC50的測(cè)定在A549細(xì)胞中，通過(guò)pS6K熒光印記(phosphoblots)的光密度分析，LY303511介導(dǎo)的在受刺激細(xì)胞中S6K磷酸化抑制的IC50為約10mcM。當(dāng)A549細(xì)胞接觸藥物時(shí)，LY303511不抑制Akt的磷酸化，即使在100mcM下。在肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中，通過(guò)光密度測(cè)定法，LY303511介導(dǎo)的S6K磷酸化抑制的IC50為約1mcM。通過(guò)光密度測(cè)定法，LY303511介導(dǎo)的Akt磷酸化抑制的IC50為10到100mcM(參見(jiàn)圖8A-D)。
實(shí)施例7LY303511單獨(dú)、或LY303511與多柔比星的組合在體內(nèi)模型系統(tǒng)中對(duì)前列腺癌的作用對(duì)雄性成年裸鼠喂養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)飲食并圈養(yǎng)在普通籠子中。每個(gè)試驗(yàn)組包括五只小鼠，總共100只小鼠。為每只小鼠皮下接種在包含20％matrigel的PBS中的1×106細(xì)胞PC-3(前列腺癌)細(xì)胞。在腫瘤達(dá)到～200mm3大小之后，每天給藥介質(zhì)(0.2％DMSO或鹽水)或藥物一次，持續(xù)5天，并且每2天測(cè)量腫瘤體積，持續(xù)33天，然后處死或通過(guò)二氧化碳吸入無(wú)痛處死小鼠。
如下為每個(gè)試驗(yàn)組分配五只小鼠

多柔比星或介質(zhì)只在第一天給藥。雷帕霉素或LY303511每天給藥，如前所述在第1-5天腹膜內(nèi)給藥(參見(jiàn)Grunwald等人，Cancer Res 626141，2002)。給藥方案在藥物治療開(kāi)始之后的33天結(jié)束。在無(wú)痛處死或處死小鼠之后，切除腫瘤用于組織學(xué)分析、免疫組織化學(xué)、和蛋白質(zhì)印跡法。

體內(nèi)評(píng)價(jià)LY303511對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的作用。將人前列腺腺癌細(xì)胞(PC-3細(xì)胞，ATCC No.CTL-1435)體外培養(yǎng)，然后收獲并植入。對(duì)于每只小鼠，通過(guò)皮下注射到側(cè)腹中植入在MatrigelTM(基質(zhì))中的1×106細(xì)胞。將小鼠再分成六個(gè)組，每組十只。在腫瘤達(dá)到約150mm3時(shí)開(kāi)始治療方案(第1天)，在所示時(shí)間點(diǎn)測(cè)量腫瘤體積(＝卡尺長(zhǎng)度×寬度2/2)，維持三十天。對(duì)于每個(gè)試驗(yàn)組和時(shí)間點(diǎn)，數(shù)據(jù)表示為平均腫瘤體積+/-SEM。數(shù)據(jù)表示在圖6A和6B中。(在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行組間比較，通過(guò)單向ANOVA，*p＜0.05)。圖6C為Kaplan-meier分析，表示在任何給定時(shí)間點(diǎn)腫瘤體積小于300mm3的概率(組間比較，通過(guò)對(duì)數(shù)-秩檢驗(yàn)，p＜0.001)。
為每個(gè)組指派以下處理

LY303511抑制裸鼠中前列腺腺癌細(xì)胞(PC-3)細(xì)胞的生長(zhǎng)。腹膜內(nèi)給藥10mg/kg的LY303511用于減弱裸鼠中PC-3腫瘤生長(zhǎng)。生長(zhǎng)抑制程度與治療持續(xù)時(shí)間成正比。LY303511(LY3)的20天療程與十天療程同樣有效抑制腫瘤生長(zhǎng)(參見(jiàn)圖6C)。在21天之后，超過(guò)15％的小鼠因?yàn)檫^(guò)度腫瘤生長(zhǎng)需要無(wú)痛處死，并且平均腫瘤體積測(cè)量變得太易變。
結(jié)果證明，LY303511、或LY303511與多柔比星的組合降低腫瘤負(fù)荷(圖6A和6B)。因此，LY303511和/或與另外的化療劑組合的LY303511可用于治療增生性疾病，如癌癥。LY303511也可以與雷帕霉素組合用于腫瘤治療。
實(shí)施例8LY303511用于抑制免疫應(yīng)答的應(yīng)用包括多發(fā)性硬化(MS)、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病、自身免疫葡萄膜炎、移植排斥、慢性鈹塵病和移植物抗宿主病的多種人類(lèi)疾病的發(fā)病機(jī)理看起來(lái)是由T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。本文公開(kāi)的化合物可用于治療這些疾病。
表2人類(lèi)自身免疫疾病的例子

有幾個(gè)基于動(dòng)物的自身免疫模型可用于試驗(yàn)本文公開(kāi)的化合物用于治療自身免疫疾病的應(yīng)用。表2列舉了可使用肽/MHC絡(luò)合物治療的幾種示例性的免疫介導(dǎo)疾病。例如，非肥胖型糖尿病(NOD)小鼠模型為其中動(dòng)物隨年齡增加而發(fā)生糖尿病的動(dòng)物模型系統(tǒng)。為了試驗(yàn)具體化合物的效力，將糖尿病前期的動(dòng)物組(最大為4周)用例如LY303511、或LY303511與另外的免疫抑制劑的組合處理。然后分析發(fā)生糖尿病的動(dòng)物數(shù)、和動(dòng)物發(fā)生糖尿病的速率。類(lèi)似地，在Hashimoto小鼠模型系統(tǒng)中，為了試驗(yàn)疫苗的效力，將發(fā)生癥狀之前的動(dòng)物組用例如LY303511、或LY303511與另外的免疫抑制劑的組合處理。然后分析發(fā)生該疾病的動(dòng)物數(shù)、和動(dòng)物發(fā)生該疾病的速率。
在NOD模型或在Hashimoto模型、或在任何其它模型系統(tǒng)中，與未經(jīng)處理的動(dòng)物相比，LY303511、或LY303511與另外的免疫抑制劑的組合延遲疾病的進(jìn)展，或提供免于發(fā)生該疾病的保護(hù)。
為了證明LY303511對(duì)免疫應(yīng)答的作用，使用得自Jackson(Jac)和Taconic(Tac)的野生型小鼠。在巰基乙醇酸酯注射三天之后收獲腹膜巨噬細(xì)胞。將細(xì)胞在2％FCS RPMI中培養(yǎng)三天。在用有或者沒(méi)有LY303511(1～100μM)或DMSO的LPS 1μg/ml刺激24小時(shí)之后收集上清液。測(cè)量細(xì)胞上清液中的細(xì)胞因子(白細(xì)胞介素(IL)-12p70、腫瘤壞死因子(TNF)-α、干擾素(IFN)γ、單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP)-1、IL-10、IL-6)。結(jié)果證明，LY303511在所有六種細(xì)胞因子中引起劑量依賴性降低(參見(jiàn)圖7A-F)。加入100μM的LY303511引起與背景水平相似的細(xì)胞因子分泌。因此，顯而易見(jiàn)，LY303511可以減少細(xì)胞因子表達(dá)，并且具有抗炎作用。
實(shí)施例9材料和方法以下提供用于上述實(shí)施例的材料和方法的概要；提供這個(gè)部分用于與單個(gè)章節(jié)中的信息合并。
細(xì)胞培養(yǎng)物A549細(xì)胞(CCL 185，American Type CultureCollection(ATCC)；Manassas，VA)，為人類(lèi)肺泡II型上皮細(xì)胞樣肺腺癌細(xì)胞系，在37℃下在5％CO2下在補(bǔ)充有10％胎牛血清(FBS)、2mM谷氨酰胺、青霉素(100單位/ml)、和鏈霉素(100μg/ml)的Ham′s F-12K培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，上述都得自Biofluids(Rockville，MD)。根據(jù)生產(chǎn)商的指導(dǎo)說(shuō)明使人肺動(dòng)脈平滑肌(PASM)細(xì)胞(Cambrex；Rockland，ME)在37℃下在5％CO2下在補(bǔ)充有5％FBS、胰島素、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、和慶大霉素/兩性霉素B的SMG2培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。
藥理學(xué)抑制劑和抗體LY303511、雷帕霉素、LY294002、和渥曼青霉素購(gòu)自Biomol(Plymouth，PA)或Calbiochem(San Diego，CA)并溶解于DMSO中。對(duì)抗磷酸-S6K T389、磷酸-Akt S473、磷酸-mTOR S2481、磷酸-Rb S807/S811、S6K、和Akt的抗體購(gòu)自Cell SignalingTechnologies(Beverly，MA)。對(duì)抗mTOR(RAFT1)、細(xì)胞周期蛋白A、細(xì)胞周期蛋白B、細(xì)胞周期蛋白D、細(xì)胞周期蛋白E、p27 Kip1、和p21Cip1的單克隆抗體購(gòu)自BD Transduction Laboratories(San Diego，CA)。
蛋白質(zhì)磷酸化的測(cè)量將A549細(xì)胞在沒(méi)有或有抑制劑的無(wú)血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)1小時(shí)，如所示的，然后與LPS，100μg/ml(Sigma；St.Louis，MO)和IFN-γ，100U/ml(Roche；Nutley，NJ)的混合物培養(yǎng)30分鐘。將PASM細(xì)胞在沒(méi)有或有抑制劑的無(wú)血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)24小時(shí)，如所示的，然后與10％FBS培養(yǎng)30分鐘。將A549或PASM細(xì)胞用冷的PBS洗滌一次并在溶胞緩沖液(20mM的Tris，pH 8.0、1％的Nonidet P-40、1mM的EDTA、5mM的芐脒、抑肽酶10μg/ml、亮肽素10μg/ml、胰蛋白酶大豆抑制劑、1mM的PMSF、50mM的氟化鈉、100μM的原釩酸鈉、和1∶100的Sigma磷酸酶抑制劑組合I，包含斑蝥素、微囊藻素LR和bromotetramizole)中在冰上培養(yǎng)15分鐘。在凍融之后，將溶胞產(chǎn)物在16,000xg離心30分鐘，然后測(cè)量蛋白質(zhì)并儲(chǔ)存在-80℃。通過(guò)SDS-PAGE分離總蛋白質(zhì)的等份并將其轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜上，然后如所示進(jìn)行初級(jí)抗體的免疫印跡法。將膜用連接于辣根過(guò)氧化酶的抗兔IgG或抗小鼠IgG抗體(Promega；Madison，WI)處理，使用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒(SuperSignal West Pico，Pierce；Rockford，IL)展開(kāi)，并暴露于X線膠片下，膠片使用Epson Expression 636掃描器掃描。使用Scion Imageβ 3b軟件定量積分譜帶密度。
細(xì)胞增殖的測(cè)量使用原地5-溴-2-脫氧尿嘧啶核苷(BrDU)檢測(cè)試劑盒，根據(jù)生產(chǎn)商的指導(dǎo)說(shuō)明(Roche Diagnostics；Nutley，NJ)評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖或DNA合成。簡(jiǎn)而言之，將A549或PASM細(xì)胞(4,000/孔)接種在96孔板中并在血清的存在下生長(zhǎng)24小時(shí)。在沒(méi)有或有所示抑制劑的存在下加入10mM BrDU，維持24小時(shí)。在一些實(shí)驗(yàn)中，將PASM細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)另外的24小時(shí)，然后加入BrDU和抑制劑。將細(xì)胞固定并使用過(guò)氧化物酶結(jié)合的抗BrDU抗體檢測(cè)BrDU。將在用抑制劑處理的細(xì)胞中測(cè)量的吸光度數(shù)據(jù)相對(duì)于用DMSO對(duì)照處理的那些數(shù)據(jù)歸一化(％對(duì)照)。
細(xì)胞周期的測(cè)量將A549或PASM細(xì)胞生長(zhǎng)到80％匯合，然后加入所示的抑制劑，維持24小時(shí)。通過(guò)溫和的胰蛋白酶處理收獲細(xì)胞并用PBS洗滌三次，然后加入0.5ml的Vindalov′s碘化丙啶(10mM的Trizma堿、10mM的NaCl、0.05mg/ml的碘化丙啶、0.7U/ml的核糖核酸酶、0.1％的Nonidet P40)，維持至少2小時(shí)。在FACSCalibur流式細(xì)胞儀(BD Biosciences；San Diego，CA)上進(jìn)行細(xì)胞周期分析。得自氬氣激光器的488-nm線用于碘化丙啶的激發(fā)，并且使用585-nm譜帶通濾波器(FL2)收集發(fā)射的熒光。使用Cell Quest Software在線性刻度上收集Listmode數(shù)據(jù)。通過(guò)流式細(xì)胞計(jì)計(jì)數(shù)碘化丙啶染色的細(xì)胞，并測(cè)定處于G1、S、或G2/M期中的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。
酪蛋白激酶2(CK2)活性的測(cè)量使用CK2活性試劑盒(Upstate，Charlottesville，VA)測(cè)量CK2活性(每分鐘計(jì)數(shù))，通過(guò)將沒(méi)有或有所示濃度的在1％DMSO中的LY294002、LY303511、渥曼青霉素或雷帕霉素的存在下的50μl試驗(yàn)緩沖液(20mM的MOPS，pH 7.2、5mM的EGTA、25mM的β-磷酸甘油、1mM的原釩酸鈉、1mM的二硫蘇糖醇)中的100ng的重組CK2、鎂/ATP雞尾酒(10μCi32P-γ-ATP、0.675μmol的MgCl2、4.5nmol的ATP)、和10摩爾肽底物(氨基酸序列RRRDDDSDDD)在30℃下培養(yǎng)10分鐘。使用20μl的40％三氯乙酸終止試驗(yàn)，并將上清液的樣品(25μl)應(yīng)用于P81磷酸纖維素紙方格上，然后將其用0.75％磷酸洗滌三次，用丙酮洗滌一次。使用Packard 100Tri-Carb液體閃爍計(jì)數(shù)器在5ml的閃爍流體中定量磷酸纖維素方格上的底物肽中的32P?；钚员硎緸槊?0分鐘結(jié)合的pmol磷酸酯。在抑制劑的存在下測(cè)量的CK2活性除以在DMSO對(duì)照存在下測(cè)量的CK2活性(＝100％對(duì)照)。
已經(jīng)說(shuō)明和描述了公開(kāi)的組合物和方法的原則，顯而易見(jiàn)，這些組合物和方法可在構(gòu)建和細(xì)節(jié)上進(jìn)行改進(jìn)而不脫離這種原則。
權(quán)利要求
1.抑制主體中的免疫應(yīng)答的方法，包括對(duì)主體給藥治療有效量的具有式A所示結(jié)構(gòu)的2-(4-哌嗪基)-取代的4H-1-苯并吡喃-4-酮類(lèi)化合物或其可藥用鹽， 式A其中R1和R2各自的存在是非必要的并且R1和R2各自獨(dú)立地選自烷基、取代的烷基、雜烷基、環(huán)烷基、取代的環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、取代的雜環(huán)烷基、芳基、取代的芳基、雜芳基、取代的雜芳基、烷氧基、鹵素、羥基、或氨基。
2.權(quán)利要求1的方法，其中2-(4-哌嗪基)-取代的4H-1-苯并吡喃-4-酮類(lèi)化合物包括具有式B所示結(jié)構(gòu)的2-(4-哌嗪基)-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮化合物， 式B其中R1和R2各自的存在是非必要的并且R1和R2各自獨(dú)立地選自烷基、芳基、烷氧基、鹵素、羥基或氨基。
3.權(quán)利要求1的方法，其中2-(4-哌嗪基)-取代的4H-1-苯并吡喃-4-酮類(lèi)化合物包括2-(4-哌嗪基)-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮。
4.權(quán)利要求1的方法，其中2-(4-哌嗪基)-取代的4H-1-苯并吡喃-4-酮類(lèi)化合物抑制雷帕霉素或酪蛋白激酶2的哺乳動(dòng)物靶標(biāo)，但是不顯著抑制磷脂酰肌醇3-激酶。
5.權(quán)利要求1的方法，其中主體患有自身免疫疾病。
6.權(quán)利要求1的方法，其中主體具有炎癥應(yīng)答。
7.權(quán)利要求1的方法，其中主體患有移植物抗宿主疾病。
8.權(quán)利要求1的方法，其中主體是移植接受者，并且其中免疫應(yīng)答是移植體的排斥。
9.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括對(duì)主體給藥治療有效量的另一種免疫抑制劑。
10.抑制細(xì)胞增殖的方法，包括使細(xì)胞接觸有效量的具有式A所示結(jié)構(gòu)的2-(4-哌嗪基)-取代的4H-1-苯并吡喃-4-酮類(lèi)化合物或其可藥用鹽， 式A其中R1和R2各自的存在是非必要的并且R1和R2各自獨(dú)立地選自烷基、取代的烷基、雜烷基、環(huán)烷基、取代的環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、取代的雜環(huán)烷基、芳基、取代的芳基、雜芳基、取代的雜芳基、烷氧基、鹵素、羥基、或氨基。
11.權(quán)利要求10的方法，其中2-(4-哌嗪基)-取代的4H-1-苯并吡喃-4-酮化合物包括具有式B所示結(jié)構(gòu)的2-(4-哌嗪基)-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮化合物， 式B其中R1和R2各自的存在是非必要的并且R1和R2各自獨(dú)立地選自烷基、芳基、烷氧基、鹵素、羥基或氨基。
12.權(quán)利要求10的方法，其中2-(4-哌嗪基)-取代的4H-1-苯并吡喃-4-酮化合物包括2-(4-哌嗪基)-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮。
13.權(quán)利要求10的方法，其中2-(4-哌嗪基)-取代的4H-1-苯并吡喃-4-酮類(lèi)化合物抑制雷帕霉素或酪蛋白激酶2的哺乳動(dòng)物靶標(biāo)，但是不顯著抑制磷脂酰肌醇3-激酶。
14.權(quán)利要求10的方法，進(jìn)一步包括使細(xì)胞接觸有效量的化療劑。
15.權(quán)利要求10的方法，其中細(xì)胞在體內(nèi)。
16.權(quán)利要求10的方法，其中細(xì)胞在體外。
17.抑制主體中的增生性疾病的方法，包括對(duì)主體給藥治療有效量的具有式A結(jié)構(gòu)所示的2-(4-哌嗪基)-取代的4H-1-苯并吡喃-4-酮類(lèi)化合物或其可藥用鹽， 式A其中R1和R2各自的存在是非必要的并且R1和R2各自獨(dú)立地選自烷基、取代的烷基、雜烷基、環(huán)烷基、取代的環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、取代的雜環(huán)烷基、芳基、取代的芳基、雜芳基、取代的雜芳基、烷氧基、鹵素、羥基、或氨基。
18.權(quán)利要求17的方法，其中2-(4-哌嗪基)-取代的4H-1-苯并吡喃-4-酮類(lèi)化合物包括具有式B所示結(jié)構(gòu)的2-(4-哌嗪基)-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮化合物 式B其中R1和R2各自的存在是非必要的并且R1和R2各自獨(dú)立地選自烷基、芳基、烷氧基、鹵素、羥基或氨基。
19.權(quán)利要求17的方法，其中2-(4-哌嗪基)-取代的4H-1-苯并吡喃-4-酮類(lèi)化合物包括2-(4-哌嗪基)-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮。
20.權(quán)利要求17的方法，其中2-(4-哌嗪基)-取代的4H-1-苯并吡喃-4-酮類(lèi)化合物抑制P70 S6激酶的磷酸化，但是不顯著抑制磷脂酰肌醇3-激酶。
21.權(quán)利要求17的方法，其中增生性疾病包括再狹窄。
22.權(quán)利要求17的方法，其中增生性疾病是腫瘤。
23.權(quán)利要求22的方法，其中腫瘤是肺癌或前列腺癌。
24.選擇免疫抑制劑或抗增生劑的方法，包括選擇試驗(yàn)劑，與抑制磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)依賴性的底物磷酸化相比，該試驗(yàn)劑優(yōu)先抑制酪蛋白激酶2和P70 S6激酶的磷酸化，從而鑒定藥學(xué)有用的免疫抑制劑或抗增生劑。
25.權(quán)利要求24的方法，其中底物為蛋白激酶B(PKB)。
26.權(quán)利要求24的方法，其中試驗(yàn)劑在389位絲氨酸抑制P70 S6激酶的磷酸化。
27.權(quán)利要求24的方法，其中選擇免疫抑制劑。
28.權(quán)利要求23的方法，其中選擇抗增生劑。
29.藥用組合物，包括2-(4-哌嗪基)-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮或其可藥用鹽、和可藥用載體。
30.權(quán)利要求1的方法，其中免疫應(yīng)答包括巨噬細(xì)胞活化。
31.權(quán)利要求1的方法，其中免疫應(yīng)答包括一種或多種細(xì)胞因子的分泌。
32.權(quán)利要求31的方法，其中細(xì)胞因子為白細(xì)胞介素(IL)-12、腫瘤壞死因子(TNF)-α、干擾素(IFN)-γ、單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP)-1、IL-10、IL-6。
33.權(quán)利要求22的方法，進(jìn)一步包括對(duì)主體給藥另外的化療劑。
34.權(quán)利要求33的方法，其中化療劑為5-氟尿嘧啶(5-FU)、硫唑嘌呤、環(huán)磷酰胺、氟達(dá)拉濱、依托泊苷、多柔比星、甲氨蝶呤、長(zhǎng)春新堿、卡鉑、順鉑、紫杉醇、雷帕霉素、或其組合。
全文摘要
本文公開(kāi)了用于抑制主體中的免疫應(yīng)答、治療主體中的腫瘤、或治療主體中纖維增生性血管病的方法，包括對(duì)主體給藥治療有效量的具有式(A)所示結(jié)構(gòu)的2－(4－哌嗪基)－取代的4H－1－苯并吡喃－4－酮類(lèi)化合物或其可藥用鹽，其中R
文檔編號(hào)A61P37/06GK1889958SQ200480036665
公開(kāi)日2007年1月3日 申請(qǐng)日期2004年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月9日
發(fā)明者約埃爾·莫斯, 阿諾爾德·克里斯托夫 申請(qǐng)人:美國(guó)政府健康及人類(lèi)服務(wù)部