一種長(zhǎng)期儲(chǔ)存及復(fù)蘇培養(yǎng)成人外周血單個(gè)核細(xì)胞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種長(zhǎng)期儲(chǔ)存及復(fù)蘇培養(yǎng)成人外周血單個(gè)核細(xì)胞的方法，尤其涉及一 種細(xì)胞凍存復(fù)蘇后高效擴(kuò)增的方法，該方法可以進(jìn)行成人免疫細(xì)胞的儲(chǔ)存及后期復(fù)蘇培養(yǎng) 應(yīng)用臨床治療項(xiàng)目。
【背景技術(shù)】
[0002] 免疫細(xì)胞（immune cell)是白細(xì)胞的俗稱，包括淋巴細(xì)胞和各種吞噬細(xì)胞等，也特 指能識(shí)別抗原、產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答的淋巴細(xì)胞等。淋巴細(xì)胞是免疫系統(tǒng)的基本成分，在體 內(nèi)分布很廣泛，主要是T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞受抗原刺激而被活化（activation)，分裂增 殖、發(fā)生特異性免疫應(yīng)答。T淋巴細(xì)胞是一個(gè)多功能的細(xì)胞群。除T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì) 胞外，還有一種淋巴細(xì)胞為自然殺傷細(xì)胞（natural killer cells，NK)。除淋巴細(xì)胞外，參 與免疫應(yīng)答的細(xì)胞還有漿細(xì)胞、粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、抗原呈遞細(xì)胞及單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)的細(xì) 胞。
[0003] 外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，即外周血中具 有單個(gè)核的細(xì)胞，包括淋巴細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞和其它少量細(xì)胞（造血干細(xì)胞等）。PBMC是將 白細(xì)胞進(jìn)一步提取的、具有分化為更強(qiáng)大效應(yīng)細(xì)胞的一部分。通過(guò)特定因子的誘導(dǎo)，PBMC 在體外可以分化為多種免疫細(xì)胞，如現(xiàn)在廣泛應(yīng)用于生物治療的細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞 (cytokine induced killer，CIK)，樹(shù)突狀細(xì)胞（dendritic cells，DCs)和自然殺傷細(xì)胞 (NK)等細(xì)胞。
[0004] 最新版的《世界癌癥報(bào)告》由世衛(wèi)組織下屬的官方癌癥機(jī)構(gòu)國(guó)際癌癥研究中心 (IARC)負(fù)責(zé)，來(lái)自40多個(gè)國(guó)家的250多位科學(xué)家參與編撰，對(duì)全球180多個(gè)國(guó)家的28種癌 癥的總體情況和流行趨勢(shì)進(jìn)行了全面的描述和分析，這也是6年來(lái)首篇概述全球癌癥情況 的報(bào)告。
[0005] 報(bào)告預(yù)測(cè)全球癌癥病例將呈現(xiàn)迅猛增長(zhǎng)態(tài)勢(shì)，由2012年的1400萬(wàn)人，逐年遞增至 2025年的1900萬(wàn)人，到2035年將達(dá)到2400萬(wàn)人。
[0006] 報(bào)告還顯示，非洲、亞洲和中南美洲的發(fā)展中國(guó)家癌癥發(fā)病形勢(shì)最為嚴(yán)峻。2012年 全世界共新增1400萬(wàn)癌癥病例并有820萬(wàn)人死亡。其中，中國(guó)新增307萬(wàn)癌癥患者并造成 約220萬(wàn)人死亡，分別占全球總量的21. 9%和26. 8%。世衛(wèi)的數(shù)據(jù)略低于中國(guó)自己的統(tǒng)計(jì)。 全國(guó)腫瘤登記中心發(fā)布的2012年數(shù)據(jù)顯示，中國(guó)每年新增癌癥病例約350萬(wàn)，約有250萬(wàn) 人因此死亡。
[0007] 細(xì)胞免疫治療有可能成為癌癥治療的主要手段。目前臨床試驗(yàn)效果顯示，細(xì)胞免 疫治療在一些較難治療的癌癥病例中，取得較為突出的臨床效果和生存數(shù)據(jù)，是繼手術(shù) 和放療、化療后的一項(xiàng)突出有效的治療方式。目前該治療方式在國(guó)際上取得極大關(guān)注，如 2011年《Nature》雜志發(fā)表文章認(rèn)為"癌癥細(xì)胞免疫治療即將迎來(lái)新一輪的研究高潮，未 來(lái)有可能在癌癥治療中占據(jù)相當(dāng)重要的地位"；2012年底，《Science》雜志將癌癥免疫治 療列為2013年最值得關(guān)注的六大科學(xué)領(lǐng)域之一。科學(xué)界的關(guān)注，表明該治療方式的巨大 潛力，但也說(shuō)明該方法目前還處于比較早期，在臨床試驗(yàn)中研究較多，產(chǎn)業(yè)化需要逐步推 進(jìn)。
[0008] 據(jù)了解，人的免疫力在20歲的時(shí)候達(dá)到巔峰，40歲時(shí)免疫力只有巔峰時(shí)的1/2,到 了 70歲更是只剩下巔峰時(shí)期的1/10,免疫力下降意味著免疫細(xì)胞對(duì)抗病毒、細(xì)菌以及癌變 的能力逐年降低，患病風(fēng)險(xiǎn)也相對(duì)提高。而在年輕、健康的情況下儲(chǔ)存優(yōu)質(zhì)免疫細(xì)胞，則是 給人體生命的一份保障，也是為人體健康儲(chǔ)存了一份希望。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明為了解決現(xiàn)有PBMC提取率較低、細(xì)胞凍存液含有動(dòng)物血清、凍存細(xì)胞活率 低下及復(fù)蘇后細(xì)胞擴(kuò)增能力不足等技術(shù)中存在的問(wèn)題而提出的。
[0010] 本發(fā)明的一種長(zhǎng)期儲(chǔ)存及復(fù)蘇培養(yǎng)成人外周血單個(gè)核細(xì)胞的方法，它是按照以下 步驟進(jìn)彳丁的：
[0011] 一、對(duì)采集到的成人外周靜脈血進(jìn)行分離純化，獲得外周血單個(gè)核細(xì)胞；
[0012] 二、對(duì)得到的外周血單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行清洗，純化；
[0013] 三、用凍存液重懸外周血單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行稀釋，使細(xì)胞懸液密度達(dá)到1~10X 107個(gè)/mL ;
[0014] 四、將稀釋后的細(xì)胞懸液分裝至1. 8mL凍存管中，每管添加 lmL，并留樣待檢，將細(xì) 胞凍存管放入4°C預(yù)溫的程序降溫盒中，轉(zhuǎn)移到-80°C冰箱暫時(shí)儲(chǔ)存；
[0015] 五、預(yù)留的凍存細(xì)胞懸液進(jìn)行細(xì)菌、真菌、內(nèi)毒素和支原體等指標(biāo)的檢測(cè)，指標(biāo)檢 測(cè)合格后，凍存入庫(kù)做長(zhǎng)期保存；
[0016] 六、復(fù)蘇時(shí)，將從凍存入庫(kù)中取出的細(xì)胞轉(zhuǎn)入預(yù)溫至-80°C的凍存盒內(nèi)后，平衡 5min轉(zhuǎn)入37°C水浴融化；
[0017] 七、將融化后的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至含質(zhì)量百分含量為10%人血白蛋白的生理鹽水混合液 中洗滌，檢測(cè)細(xì)胞活率，之后將細(xì)胞重懸于含有質(zhì)量百分含量為10 %人血白蛋白的無(wú)血清 培養(yǎng)體系中接種培養(yǎng)，即完成所述的長(zhǎng)期儲(chǔ)存成人外周血單個(gè)核細(xì)胞。
[0018] 本發(fā)明包含以下有益效果：
[0019] 本發(fā)明有別于其他儲(chǔ)存免疫細(xì)胞方式，是以細(xì)胞純化及濃縮為手段，可將抽取的 血液中免疫細(xì)胞保留比例提高至傳統(tǒng)方法的2到3倍，細(xì)胞復(fù)蘇存活率高達(dá)95%以上，同 時(shí)凍存細(xì)胞收率在95%以上（凍存后與凍存前細(xì)胞計(jì)數(shù)比值），本發(fā)明的方法一次可凍存 超過(guò)15億個(gè)種類完整的免疫細(xì)胞，包含樹(shù)突狀細(xì)胞、自然殺傷（NK)細(xì)胞及T細(xì)胞等，可有 效應(yīng)用于多種免疫細(xì)胞療法并可供多次治療使用。正常情況下，免疫細(xì)胞保存期為20年左 右。目前國(guó)際上通用的免疫細(xì)胞保存技術(shù)是將獲得的免疫細(xì)胞儲(chǔ)存在_196°C深低溫狀態(tài)， 醫(yī)學(xué)研究與臨床實(shí)踐證明保存一百年以上的細(xì)胞仍然具有其生物活性。在免疫細(xì)胞保存期 間，可根據(jù)客戶要求進(jìn)行定期復(fù)蘇、擴(kuò)增，滿足客戶長(zhǎng)期存儲(chǔ)的需求的同時(shí)還可以用于客戶 指定的免疫細(xì)胞治療等服務(wù)。同時(shí)，由于儲(chǔ)存及后期復(fù)蘇培養(yǎng)過(guò)程中沒(méi)有任何動(dòng)物源血清 或蛋白的添加，保障了臨床應(yīng)用的安全性及穩(wěn)定性，大大降低應(yīng)用后的副反應(yīng)發(fā)生情況。
【附圖說(shuō)明】
[0020] 圖1為成人PBMC提取效率圖；
[0021 ] 圖2為成人PBMC復(fù)蘇活率圖；
[0022] 圖3為CIK誘導(dǎo)培養(yǎng)擴(kuò)增倍數(shù)圖；
[0023] 圖4為成人PBMC凍存后復(fù)蘇回收率圖。
【具體實(shí)施方式】
【具體實(shí)施方式】 [0024] 一：本實(shí)施方式的一種長(zhǎng)期儲(chǔ)存及復(fù)蘇培養(yǎng)成人外周血單個(gè)核細(xì)胞 的方法，它是按照以下步驟進(jìn)行的：
[0025] -、對(duì)采集到的成人外周靜脈血進(jìn)行分離純化，獲得外周血單個(gè)核細(xì)胞；
[0026] 二、對(duì)得到的外周血單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行清洗，純化；
[0027] 三、用凍存液重懸外周血單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行稀釋，使細(xì)胞懸液密度達(dá)到1~10X 107個(gè)/mL ;
[0028] 四、將稀釋后的細(xì)胞懸液分裝至1. 8mL凍存管中，每管添加 lmL，并留樣待檢，將細(xì) 胞凍存管放入4°C預(yù)溫的程序降溫盒中，轉(zhuǎn)移到_80°C冰箱暫時(shí)儲(chǔ)存；
[0029] 五、預(yù)留的凍存細(xì)胞懸液進(jìn)行細(xì)菌、真菌、內(nèi)毒素和支原體等指標(biāo)的檢測(cè)，指標(biāo)檢 測(cè)合格后，凍存入庫(kù)做長(zhǎng)期保存；
[0030] 六、復(fù)蘇時(shí)，將從凍存入庫(kù)中取出的細(xì)胞轉(zhuǎn)入預(yù)溫至-80°C的凍存盒內(nèi)后，平衡 5min轉(zhuǎn)入37°C水浴融化；
[0031] 七、將融化后的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至含質(zhì)量百分含量為10%人血白蛋白的生理鹽水混合液 中洗滌，檢測(cè)細(xì)胞活率，之后將細(xì)胞重懸于含有質(zhì)量百分含量為10 %人血白蛋白的無(wú)血清 培養(yǎng)體系中接種培養(yǎng)，即完成所述的長(zhǎng)期儲(chǔ)存成人外周血單個(gè)核細(xì)胞。
[0032] 本實(shí)施方式有別于其他儲(chǔ)存免疫細(xì)胞方式，是以細(xì)胞純化及濃縮為手段，可將抽 取的血液中免疫細(xì)胞保留比例提高至傳統(tǒng)方法的2到3倍，細(xì)胞復(fù)蘇存活率高達(dá)95%以上， 同時(shí)凍存細(xì)胞收率在95%以上（凍存后與凍存前細(xì)胞計(jì)數(shù)比值），本實(shí)施方式的方法一次 可凍存超過(guò)15億個(gè)種類完整的免疫細(xì)胞，包含樹(shù)突狀細(xì)胞、自然殺傷（NK)細(xì)胞及T細(xì)胞 等，可有效應(yīng)用于多種免疫細(xì)胞療法并可供多次治療使用，是業(yè)界儲(chǔ)存免疫細(xì)胞種類最多、 數(shù)量最完整的細(xì)胞儲(chǔ)存技術(shù)。正常情況下，免疫細(xì)胞保存期為20年左右。目前國(guó)際上通用 的免疫細(xì)胞保存技術(shù)是將獲得的免疫細(xì)胞儲(chǔ)存在_196°C深低溫狀態(tài)，醫(yī)學(xué)研究與臨床實(shí)踐 證明保存一百年以上的細(xì)胞仍然具有其生物活性。在免疫細(xì)胞保存期間，可根據(jù)客戶要求 進(jìn)行定期復(fù)蘇、擴(kuò)增，滿足客戶長(zhǎng)期存儲(chǔ)的需求的同時(shí)還可以用于客戶指定的免疫細(xì)胞治 療等服務(wù)。
【具體實(shí)施方式】 [0033] 二：本實(shí)施方式與一不同的是：步驟一中獲得外周 血單個(gè)核細(xì)胞的方法為：離心收集成人外周靜脈血，并水浴滅活，離心收集血漿上清液，每 10mL分裝一支，-80°C保存，備用；采用淋巴細(xì)胞分離液分離血細(xì)胞中的單個(gè)核細(xì)胞，并收 集單個(gè)核細(xì)胞。其它與一相同。
【具體實(shí)施方式】 [0034] 三：本實(shí)施方式與一不同的是：步驟二中對(duì)得到的外 周血單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行清洗，純化的具體操作如下：用復(fù)方電解質(zhì)溶液洗滌單個(gè)核細(xì)胞兩次， 收集最后一次洗滌的上清液，并進(jìn)行細(xì)菌、真菌、支原體和內(nèi)毒素檢測(cè)，檢測(cè)合格后，離心收 集的細(xì)胞待用。其它與一相同。
[0035]
【具體實(shí)施方式】四：本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一不同的是：步驟三中的凍存液配 制如下：按細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基、人血白蛋白和DMSO的體積比為4:5:1的比例混合而成。其 它與【具體實(shí)施方式】一相同。
【具體實(shí)施方式】 [0036] 五：本實(shí)施方式與一不同的是：凍存液中的人血白蛋 白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)至少為10%。其它與一相同。
【具體實(shí)施方式】 [0037] 六：本實(shí)施方式與一不同的是：步驟五中指標(biāo)檢測(cè)合 格是指：細(xì)菌、真菌、支原體檢測(cè)皆為陰性，內(nèi)毒素含量不高于0. 25EU/mL。其它與具體實(shí)施 方式一相同。
【具體實(shí)施方式】 [0038] 七：本實(shí)施方式與一不同的是：該方法所用試劑為藥 用或GMP級(jí)別。其它與一相同。
【具體實(shí)施方式】 [0039] 八：本實(shí)施方式與一不同的是：步驟七中無(wú)血清培 養(yǎng)體系中含有單克隆抗體和細(xì)胞因子；其中，單克隆抗體的在無(wú)血清培養(yǎng)體系中的濃度為 500ng/mL。其它與一相同。
【具體實(shí)施方式】 [0040] 九：本實(shí)施方式與一不同的是：細(xì)胞因子為濃度20~ 100ng/ml GM-CSF、0. 5 ~4ng/ml IL-1α、1〇〇〇 ~4000IU/ml IL-2、5 ~30ng/ml IL-4、 0.25 ~2ng/ml IL-7、0.2 ~2ng/ml IL-12、0.25 ~2ng/ml I