本發(fā)明涉及藥物微球栓塞于動(dòng)脈后藥代動(dòng)力學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種含藥微球栓塞劑動(dòng)脈栓塞后局部藥物釋放的藥物代謝模型和檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

介入治療技術(shù)是目前醫(yī)學(xué)治療腫瘤、結(jié)核、咯血及血管性疾病的前沿醫(yī)學(xué)手段，其中利用含藥微球的介入治療在腫瘤、結(jié)核的治療上取得了明顯的療效，越來(lái)越得到臨床的重視。其原理是：在透視引導(dǎo)下通過(guò)將微導(dǎo)管經(jīng)外周血管送至目標(biāo)病變組織血管中，然后將藥物微球栓塞劑注入病變組織中，實(shí)現(xiàn)一方面阻斷病變組織血運(yùn)，另一方面利用微球所攜帶藥物給病變組織帶來(lái)針對(duì)性的治療，實(shí)現(xiàn)控制病變組織進(jìn)一步生長(zhǎng)的目的。例如，海藻酸鈉微球血管栓塞劑是一種天然、可降解的新型血管栓塞劑，已用于咯血、肝癌、脾功能亢進(jìn)、動(dòng)脈瘤、子宮肌瘤等動(dòng)脈栓塞臨床治療。采用微囊技術(shù)將海藻酸鈉微球包裹利福平，制備成一種新型載藥微球血管栓塞劑，即利福平海藻酸鈉微球栓塞劑(rifampicinsodiumalginatemicrosphereembolicagents，rfp-kmg)，rfp-kmg具有作用靶向性強(qiáng)、藥物緩釋、保持局部組織內(nèi)的藥物高濃度等優(yōu)點(diǎn)，在機(jī)械栓塞的同時(shí)增強(qiáng)了藥物生物利用度。

藥物微球栓塞治療后其所載藥物如何進(jìn)入周圍組織及其藥代動(dòng)力學(xué)一直有較大爭(zhēng)議，目前無(wú)一種理想的藥代動(dòng)力學(xué)模型。含藥微球的應(yīng)用目的是：保證病變組織局部藥物的高濃度的同時(shí)進(jìn)行局部栓塞治療，實(shí)現(xiàn)藥物和栓塞治療的雙重療效。若微球不能釋放藥物，含藥微球只能發(fā)揮栓塞的功效，若微球過(guò)快釋放藥物入血，則外周血藥濃度過(guò)高會(huì)給人體帶來(lái)副作用。所以明確微球局部藥代動(dòng)力學(xué)是含藥微球在臨床應(yīng)用的關(guān)鍵。傳統(tǒng)方法是通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，將藥物微球于靶組織動(dòng)脈栓塞后，然后分時(shí)間點(diǎn)測(cè)外周血藥濃度，以及取樣靶組織并勻漿后測(cè)組織血藥濃度。但這種測(cè)量方法存在兩個(gè)弊端：1.靶組織本身含有血管，組織血管中的血藥濃度干擾組織血藥濃度的準(zhǔn)確性；2.靶組織含有微球栓塞劑，微球栓塞劑本身的藥物濃度也會(huì)干擾組織的藥物濃度的測(cè)定。

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)在藥物微球檢測(cè)方面所面臨的困難，本發(fā)明提供一種可以準(zhǔn)確反映藥物微球動(dòng)脈栓塞的局部組織藥物濃度的藥代動(dòng)力學(xué)模型和檢測(cè)方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種藥物微球動(dòng)脈栓塞的局部組織藥物濃度的藥代動(dòng)力學(xué)模型和檢測(cè)方法，能夠排除血管內(nèi)殘留藥物的干擾，準(zhǔn)確檢測(cè)局部組織內(nèi)的藥物濃度。

具體而言，本發(fā)明的技術(shù)方案主要是通過(guò)以下方式實(shí)現(xiàn)的：

本發(fā)明提供一種藥物微球動(dòng)脈栓塞的局部組織藥物濃度的藥代動(dòng)力學(xué)模型，截試驗(yàn)動(dòng)物的股動(dòng)脈制成生物膜囊袋，并以藥物微球填充形成藥物囊袋，將藥物囊袋包埋入活體試驗(yàn)動(dòng)物的肝臟內(nèi)，考察肝臟局部組織滲透釋放特征。

進(jìn)一步地，試驗(yàn)動(dòng)物可選用雄性家兔。

進(jìn)一步地，藥物微球可為利福平海藻酸鈉微球栓塞劑(rifampicinsodiumalginatemicrosphereembolicagents，rfp-kmg)…等。

進(jìn)一步地，采用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的一段股動(dòng)脈，一端縫扎，將藥物微球塞入后縫扎另一端構(gòu)建成含藥微球藥物囊袋。

本發(fā)明還提供一種藥物微球動(dòng)脈栓塞的局部組織藥物濃度的檢測(cè)方法，包含截取試驗(yàn)動(dòng)物的股動(dòng)脈，制成生物膜囊袋，以藥物微球填充形成藥物囊袋，將藥物囊袋包埋入肝臟組織中，通過(guò)外周靜脈取血，并在不同時(shí)間點(diǎn)取出包埋藥物囊袋，檢測(cè)藥物代謝剩余量，以囊袋包埋肝臟點(diǎn)位中心，按照梯度遠(yuǎn)近的原則，通過(guò)高效液相色譜法(hplc)檢測(cè)近端濃度、中端濃度和遠(yuǎn)端濃度，考察載藥物微球栓塞劑的肝臟局部組織滲透釋放特征。

進(jìn)一步地，試驗(yàn)動(dòng)物可選用雄性家兔。

進(jìn)一步地，藥物微球可為利福平海藻酸鈉微球栓塞劑(rifampicinsodiumalginatemicrosphereembolicagents，rfp-kmg)…等。

進(jìn)一步地，將藥物囊袋包埋入肝臟組織后，可于1天、3天、1周、2周、1個(gè)月的不同時(shí)間點(diǎn)取出藥物囊袋。

進(jìn)一步地，可以在囊袋包埋肝臟點(diǎn)位中心，每隔1.5cm，取1cm³的肝臟組織。

進(jìn)一步地，可通過(guò)試驗(yàn)動(dòng)物耳緣取血。

進(jìn)一步地，可于30分鐘、1小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、1天、2天、3天、4天、5天、1周、2周、1個(gè)月經(jīng)家兔耳緣靜脈取血0.5ml。

進(jìn)一步地，通過(guò)hplc檢測(cè)藥物囊袋剩余藥量、肝臟局部組織梯度濃度，外周血藥濃度等肝臟局部組織滲透釋放特征

進(jìn)一步地，可采用pksolver2.0藥動(dòng)學(xué)軟件對(duì)血藥濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，根據(jù)理論血藥濃度值與實(shí)驗(yàn)測(cè)定值的aic最小的原則，同時(shí)參考相關(guān)系數(shù)(r2)最大，作為判斷標(biāo)準(zhǔn)，選擇最佳房室模型，并分別求得藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，計(jì)算出t1/2(α)、t1/2(β)、auc、cl、cmax等參數(shù)并擬合出血藥濃度-時(shí)間曲線圖。所有數(shù)據(jù)均用x±sd表示。其中，t1/2(α)表示分布半衰期，t1/2(β)表示消除半衰期，auc表示血藥濃度-時(shí)間曲線下面積，cmax表示藥峰濃度，aic表示akaike信息判據(jù)，r2表示相關(guān)指數(shù)。

本發(fā)明首次研究建立微球栓塞于動(dòng)脈后其所載藥物如何緩釋進(jìn)入周圍組織及藥代動(dòng)力學(xué)模型和檢測(cè)方法。通過(guò)模型可檢測(cè)包括在活體動(dòng)物體內(nèi)微球藥物釋放通過(guò)動(dòng)脈壁進(jìn)入周圍局部組織，動(dòng)脈內(nèi)代謝剩余量及外周血藥濃度，從而檢測(cè)藥物微球栓塞劑藥物緩釋代謝及局部組織滲透釋放特征，解決了待測(cè)組織的取材方法不能排除血管內(nèi)殘留藥物的影響的難題，并且應(yīng)用動(dòng)物自體動(dòng)脈制造囊袋，增加了模型的準(zhǔn)確性。

附圖說(shuō)明

圖1肝臟組織近端濃度-時(shí)間曲線

圖2利福平海藻酸鈉微球動(dòng)脈囊袋在家兔體內(nèi)血藥濃度與時(shí)間曲線圖

圖3囊袋中利福平剩余百分率

圖41周時(shí)的單室及二室模型的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)結(jié)果

圖51個(gè)月時(shí)的二室模型藥動(dòng)學(xué)參數(shù)結(jié)果

具體實(shí)施例說(shuō)明

1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)雄性新西蘭白兔30只，體重(2.3±0.2)kg，由解放軍第三○九醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心二級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室提供，室溫正常飼養(yǎng)1周。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1rfp-kmg動(dòng)脈囊袋肝臟包埋動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

2.1.1以利福平海藻酸鈉微球栓塞劑(rfp-kmg)為例，制作rfp-kmg動(dòng)脈囊袋(藥物囊袋)。30只雄性新西蘭白兔均分為5組(1天組、3天組、1周組、2周組、1個(gè)月組，每組6只(rfp-kmg試驗(yàn)組5只；kmg空白對(duì)照組1只)，試驗(yàn)兔麻醉，右后肢大腿內(nèi)側(cè)備皮，切口，分離出約3cm股動(dòng)脈，遠(yuǎn)端雙側(cè)結(jié)扎，近端一側(cè)結(jié)扎，剪取中間動(dòng)脈血管，套管針輔助下，試驗(yàn)組將避光稱量的定量(3mg·kg-1)rfp-kmg塞入血管，空白對(duì)照組填充入kmg，另一側(cè)結(jié)扎，將制作好的囊袋，放入生理鹽水中浸潤(rùn)備用，大腿內(nèi)側(cè)創(chuàng)口縫合。

2.1.2囊袋肝臟包埋

新西蘭白兔胸腹部備皮，上腹部橫向切口，暴露出肝臟，迅速將藥物囊袋包埋入肝臟，用明膠海綿壓住止血，腹部創(chuàng)口縫合。術(shù)后正常飼養(yǎng)。

2.1.3生物樣本制備

2.1.3.1血樣處理

新西蘭白兔手術(shù)后，于不同時(shí)間點(diǎn)(30分鐘、1小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、1天、2天、3天、4天、5天、1周、2周、1個(gè)月)經(jīng)耳緣靜脈取血0.5ml，置于肝素管中離心(溫度4℃，轉(zhuǎn)速30分鐘、1小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、1天、2天、3天、4天、5天、1周、2周、1個(gè)月3000r·min-1，時(shí)間5min)，取上清0.1ml，加乙腈0.1ml沉淀蛋白，旋渦混勻1min后離心(溫度4℃，轉(zhuǎn)速10000r·min-1，時(shí)間10min)，取上清液再離心(溫度4℃，轉(zhuǎn)速10000r·min-1，時(shí)間10min)，取上清液過(guò)0.45μm微孔濾膜，4℃保存，待測(cè)。

2.1.3.2肝臟組織樣本處理

新西蘭白兔手術(shù)后，于不同時(shí)間點(diǎn)(1天、3天、1周、2周、1個(gè)月)處死，立即解剖取出肝臟，首先將動(dòng)脈載藥囊袋剝離出(見(jiàn)圖3)，并以囊袋包埋點(diǎn)為中心，按照梯度遠(yuǎn)近的原則，每隔1.5cm，取約1cm³肝臟組織，用生理鹽水清洗表面浮血，濾紙吸干后稱重，剪碎，加入定量生理鹽水(體重∶生理鹽水＝1∶3)勻漿，取勻漿液0.4ml，加乙腈0.4ml沉淀蛋白，旋渦混勻1min后離心(溫度4℃，轉(zhuǎn)速10000r·min-1，時(shí)間10min)，取上清液0.4ml，加乙腈0.4ml沉淀蛋白，旋渦混勻1min后再離心(溫度4℃，轉(zhuǎn)速10000r·min-1，時(shí)間10min)，取上清液過(guò)0.45μm微孔濾膜，4℃保存，待測(cè)。載藥囊袋同上處理，4℃保存，待測(cè)。

2.2高效液相色譜法檢測(cè)生物樣本

2.2.1色譜條件

色譜柱：diamonsilods-2(4.6×250mm，5μm)；流動(dòng)相：甲醇-乙腈-0.075mol·l-1磷酸二氫鉀溶液-1.0mol·l-1枸櫞酸溶液(30∶32∶36∶4)；流速為1.0ml·min-1；柱溫35℃；檢測(cè)波長(zhǎng)254nm；進(jìn)樣量：10μl。

2.2.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

2.2.2.1標(biāo)準(zhǔn)溶液儲(chǔ)備液

精密稱取利福平對(duì)照品10mg，置于10ml的棕色容量瓶中，加入乙腈溶解后，乙腈定容，配制成濃度為1000μg·ml-1的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，避光置于4℃冰箱備用。

2.2.2.2二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)溶液儲(chǔ)備液

移取1000μg·ml-1的利福平標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，配制濃度分別為100μg·ml-1和10μg·ml-1利福平二級(jí)濃度標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，避光置于4℃冰箱備用。

2.2.3系統(tǒng)適應(yīng)性考察(空白、對(duì)照品、供試品、陰性)

2.2.4血漿樣本檢測(cè)方法學(xué)考察

2.2.4.1精密度試驗(yàn)

取10μg·ml-1利福平對(duì)照品儲(chǔ)備液，精取0.25ml至5ml棕色容量瓶，加空白血漿樣本定容至刻度，混勻，按“2.1.3.1”項(xiàng)下方法操作除蛋白，制備成0.5μg·ml-1對(duì)照品血漿生物樣品，所制得的樣品按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算精密度結(jié)果。

2.2.4.2重復(fù)性試驗(yàn)

平行制備6份0.5μg·ml-1對(duì)照品血漿生物樣品(按“2.2.4.1”項(xiàng)下方法操作)，所制得的樣品按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別進(jìn)樣1次，計(jì)算重復(fù)性結(jié)果。

2.2.4.3穩(wěn)定性試驗(yàn)

配置對(duì)照品血漿生物樣品，分別于0，2，4，6，8，12和24h時(shí)進(jìn)樣分析，計(jì)算該樣品在24h內(nèi)的穩(wěn)定性；采用hplc測(cè)定對(duì)照品血漿生物樣品經(jīng)從-20℃到室溫3次凍融穩(wěn)定性。

2.2.4.1.4線性回歸

使用乙腈將利福平對(duì)照品二級(jí)濃度儲(chǔ)備液稀釋，制得60，30，10，5，1μg·ml-1的利福平對(duì)照品溶液，見(jiàn)圖3，充分混合均勻后避光置于4℃冰箱。移取上述系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液工作液50μl加入450μl空白血漿基質(zhì)中，避光梯度配置0.1，0.5，1，3，6μg·ml-1的對(duì)照品血漿生物樣品溶液，按“2.1.3.1”項(xiàng)下方法操作除蛋白后，渦旋混勻，過(guò)0.45μm微孔濾膜后進(jìn)樣，記錄利福平的峰面積，繪制空白血漿利福平標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2.4.5回收率試驗(yàn)

取空白血漿樣本，分別加入適量利福平對(duì)照品溶液，制成高、中、低3個(gè)濃度的樣品溶液，依“2.1.3.1”項(xiàng)下制備供試品溶液，每種濃度平行做3份，hplc測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。

2.2.5肝臟樣本檢測(cè)方法學(xué)考察

2.2.5.1精密度試驗(yàn)

取10μg·ml-1利福平對(duì)照品儲(chǔ)備液，精取5ml至10ml棕色容量瓶，加空白肝臟組織勻漿樣本定容至刻度，混勻，按“2.1.3.2”項(xiàng)下方法操作除蛋白，制備成5μg·ml-1對(duì)照品肝臟組織生物樣品，所制得的樣品按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算精密度結(jié)果。

2.2.5.2重復(fù)性試驗(yàn)

平行制備6份5μg·ml-1對(duì)照品肝臟組織生物樣品(按“2.2.5.1”項(xiàng)下方法操作)，所制得的樣品按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別進(jìn)樣1次，計(jì)算重復(fù)性結(jié)果。

2.2.5.3穩(wěn)定性試驗(yàn)

配置對(duì)照品肝臟組織生物樣品，分別于0，2，4，6，8，12和24小時(shí)進(jìn)樣分析，計(jì)算該樣品在24小時(shí)內(nèi)的穩(wěn)定性；采用hplc測(cè)定對(duì)照品肝臟組織生物樣品經(jīng)從-20℃到室溫3次凍融穩(wěn)定性。

2.2.5.4線性回歸

使用乙腈將利福平對(duì)照品二級(jí)濃度儲(chǔ)備液稀釋，制得500，300，100，70，50，30，10，7，3，1μg·ml-1的利福平對(duì)照品溶液，充分混合均勻后避光置于4℃冰箱。移取上述系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液工作液50μl加入450μl空白組織勻漿基質(zhì)中，避光梯度配置0.1，0.3，0.7，1，3，5，7，10，30，50μg·ml-1的對(duì)照品肝臟組織生物樣品溶液，按“2.1.3.2”項(xiàng)下方法操作除蛋白后，渦旋混勻，過(guò)0.45μm微孔濾膜后進(jìn)樣，記錄利福平的峰面積，繪制空白肝臟組織利福平標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2.5.5回收率試驗(yàn)

取空白肝臟組織勻漿樣本，分別加入適量利福平對(duì)照品溶液，制成高、中、低3個(gè)濃度的樣品溶液，依“2.1.3.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，每種濃度平行做3份，hplc測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。

2.2.6生物樣本檢測(cè)

按“2.1.3.1”項(xiàng)下操作，取已制備好的血漿樣品，hplc測(cè)定，記錄利福平的峰面積，外標(biāo)法測(cè)定血漿樣本中藥物的濃度。

按“2.1.3.2”項(xiàng)下操作，取已制備好的組織樣品，hplc測(cè)定，記錄利福平的峰面積，外標(biāo)法測(cè)定組織樣本中藥物的濃度。

2.2.7數(shù)據(jù)處理

采用pksolver2.0藥動(dòng)學(xué)軟件[24]對(duì)血藥濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，根據(jù)理論血藥濃度值與實(shí)驗(yàn)測(cè)定值的aic最小的原則，同時(shí)參考相關(guān)系數(shù)(r2)最大，作為判斷標(biāo)準(zhǔn)，選擇最佳房室模型，并分別求得藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，計(jì)算出t1/2(α)、t1/2(β)、auc、cl、cmax等參數(shù)并擬合出血藥濃度-時(shí)間曲線圖。所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

3檢測(cè)結(jié)果

3.1囊袋中利福平剩余百分率

包埋1d后，代謝剩余百分率為(74.59±1.48)％；包埋3d后，代謝剩余百分率為(52.56±1.24)％；包埋1周后，代謝剩余百分率為(33.11±1.95)％；包埋2周后，代謝剩余百分率為(19.48±1.87)％；包埋1個(gè)月后，代謝剩余百分率為(1.34±0.65)％。見(jiàn)圖3。

3.2局部釋放

肝臟組織近端濃度-時(shí)間曲線見(jiàn)圖1，結(jié)果顯示在釋放前期有突釋效應(yīng)，在包埋植入7d后濃度最大，局部濃度可達(dá)8.46μg·ml-1，在前14天內(nèi)的釋放均保持在較高濃度，隨后緩慢釋放，1個(gè)月時(shí)，局部濃度為2.14μg·ml-1，仍高于對(duì)結(jié)核桿菌的最低殺菌濃度。相同時(shí)間點(diǎn)處死的平行實(shí)驗(yàn)新西蘭大白兔，以囊袋包埋肝臟點(diǎn)為中心，按照梯度遠(yuǎn)近的原則，hplc檢測(cè)結(jié)果顯示：近端濃度＞中端濃度＞遠(yuǎn)端濃度。1個(gè)月處死時(shí)間點(diǎn)，個(gè)別樣本出現(xiàn)：近端濃度＞遠(yuǎn)端濃度＞中端濃度。

3.3外周血藥濃度

試驗(yàn)兔血藥濃度檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，載藥囊袋在局部包埋時(shí)，血藥濃度在術(shù)后20h達(dá)到最高，保持有效藥物濃度的緩釋時(shí)間為96h。1周時(shí)的房室模型與藥動(dòng)學(xué)參數(shù)結(jié)果如圖4、圖5所示。利福平海藻酸鈉微球動(dòng)脈囊袋在家兔體內(nèi)血藥濃度與時(shí)間曲線如圖2所示。利用pksolver2.0軟件對(duì)其在家兔體內(nèi)的血藥濃度按一室模型，二室模型進(jìn)行擬合，得到載藥囊袋動(dòng)脈包埋后在兩種模型下理論血藥濃度與實(shí)測(cè)血藥濃度的相關(guān)系數(shù)(r2)與aic值。給藥方式的藥動(dòng)學(xué)過(guò)程用二室模型來(lái)描述較為合理(權(quán)重系數(shù)1/c2)。