Il-21配體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及與IL-21分子表面上的不連續(xù)表位結(jié)合的IL-21配體及其用途。
【專利說明】IL-21配體
[0001]本發(fā)明涉及存在于IL-21上的不連續(xù)表位和與該表位結(jié)合的配體。
[0002]IL-21是對先天性免疫應(yīng)答和獲得性免疫應(yīng)答兩者都發(fā)揮多效作用的I型細(xì)胞因子。它主要由活化⑶4+ T細(xì)胞、濾泡T細(xì)胞和天然殺傷細(xì)胞產(chǎn)生。另外，最新證據(jù)表明Thl7 細(xì)胞可產(chǎn)生大量的IL-21。
[0003]IL-21提高⑶8+ T細(xì)胞的細(xì)胞毒性，在抗原存在下可促進(jìn)⑶8+細(xì)胞增殖。IL-21 受IL-6 (—種已知促進(jìn)Thl7細(xì)胞發(fā)育的細(xì)胞因子)的誘導(dǎo)。IL-21以促進(jìn)其自身產(chǎn)生和支持T輔助細(xì)胞分化成為Thl7細(xì)胞的自分泌方式作用于T輔助細(xì)胞。與此一致，IL-21缺陷型小鼠顯示Thl7反應(yīng)受損。IL-21還作用于B細(xì)胞，并增加抗體產(chǎn)生；然而，IL-21不是功能性抗體產(chǎn)生所必需的，而IL-21Ra陰性小鼠顯示增殖降低以及CD8+細(xì)胞的細(xì)胞毒性受損兩者。最新的系列研究表明，由CD4+細(xì)胞產(chǎn)生的IL-21對CD8+ T細(xì)胞控制病毒感染的能力至關(guān)重要。
[0004]IL-21提高免疫力的能力在IL-21的治療應(yīng)用中激起了極大關(guān)注。最近在針對轉(zhuǎn)移性黑素瘤類型和腎癌的臨床試驗中對其進(jìn)行了評價。動物研究證實IL-21和腫瘤特異性抗體之間的協(xié)同效應(yīng)，這可能表明IL-21作為抗腫瘤抗體的增效劑的未來治療應(yīng)用。此夕卜，IL-21在自身免疫病中起復(fù)雜作用。IL-21減量調(diào)節(jié)IgE產(chǎn)生的能力表明，它可治療性地用于對抗哮喘和變態(tài)反應(yīng)。動物研究結(jié)果支持這個觀點。另一方面，IL-21促進(jìn)Thl7發(fā)育的能力使之成為促炎細(xì)胞因子，而且目前針對在治療各種不同的自身免疫病中的可能應(yīng)用，對多種不同的IL-21和IL-21Ra抑制劑進(jìn)行了研究。
[0005]IL-21具有4個螺旋束結(jié)構(gòu)，以I類細(xì)胞因子典型的上-上-下-下的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)排列。IL-21通過由專用鏈(private chain) IL_21Ra和共用Y C鏈組成的異二聚體受體復(fù)合物發(fā)出信號，后者由IL-2、IL-4、IL-7、IL-9和IL-15所共用。IL_21Ra鏈以高親和力結(jié)合IL-21，并提供大部分結(jié)合能。然而，信號傳導(dǎo)需要與Y C鏈相互作用，而且結(jié)合IL-21R a 但不能與Y C適當(dāng)相互作用的IL-21突變體是IL-21信號傳導(dǎo)的有效拮抗劑。IL-2和IL-15 兩者分別利用第三受體鏈IL-2Ra和IL-15Ra。這些受體對于信號傳導(dǎo)是消耗性的，但是在發(fā)生YC募集后，用作俘獲IL-2或IL-15并將其提供給IL-2R3的受體復(fù)合物的高親和力組分。
[0006]對IL-21有特異性的單克隆抗體是本領(lǐng)域已知的，例如W02007111714和 W02010055366 (Zymo-Genetics, Inc.)的單克隆抗體。具體地說，W02010055366 描述了以克隆號362.78.1.44命名的抗IL-21抗體，其對其關(guān)聯(lián)抗原具有高親和力并具有其它所需性質(zhì)，對人和食蟹猴(cynomolgus monkey) IL.-21顯示特異性。在W02010055366 中，克隆362.78.1.44以與人IL-21上的不連續(xù)表位結(jié)合為特征，所述表位包含來自跨越 W02010055366 中 SEQ ID N0.2 所示 IL-21 序列的殘基 Ile45_Leu56 和 Glul29_Leul44 的兩個肽的氨基酸。
[0007]發(fā)明概述
我們在本文定義了被較高親和力配體特征性結(jié)合的IL-21的新的表位。配體與該表位的結(jié)合使人IL-21 (hIL-21)的螺旋C穩(wěn)定。這導(dǎo)致IL-21的整體穩(wěn)定，這被認(rèn)為促進(jìn)高親和力結(jié)合和/或IL-21誘導(dǎo)作用的有效抑制。
[0008]本發(fā)明的表位被天然IL-21受體IL-21Ra (SEQ ID N0.14)結(jié)合。我們鑒定出 IL-21和IL-21Ra之間負(fù)責(zé)兩個分子相互作用的結(jié)合界面，因此設(shè)計出通過破壞IL-21與其關(guān)聯(lián)受體間的相互作用而抑制IL-21活性的抗體靶標(biāo)。
[0009]我們還描述了與本發(fā)明的表位特異性結(jié)合的配體，例如抗體，以及制備和使用這類配體的方法。
[0010]發(fā)明詳述
除非另有說明，否則本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。除非另有說明，否則本發(fā)明的實踐采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的化學(xué)、生物化學(xué)、生物物理學(xué)、分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)、免疫學(xué)和藥理學(xué)的常規(guī)方法。
[0011]附圖簡述
圖1:本文提及的序列。
[0012]圖2:通過質(zhì)譜法監(jiān)測的HX鑒定出參與NNC 0114-0005和NNC 0114-0019結(jié)合的 hIL-21的區(qū)域。(A)對應(yīng)于位于螺旋A的肽片段29-44即MQGQDRHMIRMRQLID的質(zhì)/荷譜 (Mass/charge spectra) (m/z = 676.68, z= 3)。(B)對應(yīng)于位于螺旋 C 的肽片段 93-98 即ERIINV的質(zhì)/荷譜(m/z = 743.47, z= I)。對于所有波譜,上組圖顯示非氣化對照,第二組圖顯示與D2O交換100秒鐘后的肽，第三組圖和下組圖顯示分別在NNC 0114-0005或 NNC 0114-0019存在下交換100秒鐘后的肽。
[0013]圖3:在NNC 0114-0005或NNC 0114-0019不存在或存在時hIL_21的代表性肽的氫交換時間曲線。在不存在( )或存在NNC 0114-0005 (X)或NNC 0114-0019 (A)時， hIL-21肽的氘摻入(Da)以對數(shù)標(biāo)度針對時間作圖。肽Q30-M39表示其中NNC 0114-0005和 NNC 0114-0019兩者結(jié)合的hIL-21螺旋A的區(qū)域。肽E93-V98表示其中僅NNC 0114-0005 而非NNC 0114-0019結(jié)合的hIL-21螺旋C的區(qū)域。肽R40-N51和F136-S162表示其中NNC 0114-0005 和 NNC 0114-0019 無一結(jié)合的 hIL-21 的區(qū)域。然而，當(dāng) NNC 0114-0005 而非 NNC 0114-0019與hIL-21結(jié)合時，觀察到hIL-21結(jié)構(gòu)顯著穩(wěn)定，如在300秒鐘以上長的時間點上氘交換顯著降低所顯示的。
[0014]圖4:在NNC 0114-0005存在和不存在時hIL_21的HX分析的肽的序列覆蓋(Sequence coverage)。在HX分析的肽(表示為水平棒)上方顯示原始序列。在 NNC 0114-0005存在和不存在兩種情況下顯示類似交換模式的肽以白色顯示，而在NNC 0114-0005結(jié)合時顯示氘摻入減少的肽著黑色。用框標(biāo)出的序列區(qū)界定表位。
[0015]圖5:在NNC 0114-0019存在和不存在時hIL-21的HX分析的肽的序列覆蓋。在 HX分析的肽(表示為水平棒)上方顯示原始序列。在NNC 0114-0019存在和不存在兩種情況下顯示類似交換模式的肽以白色顯示，而在NNC 0114-0019結(jié)合時顯示氘摻入減少的肽著黑色。用框標(biāo)出的序列區(qū)界定表位。
[0016]圖 6:在 0114-0005、-0038、-0039、-0040、-0041 或-0042 不存在或存在時 hIL-21 的代表性肽的氫交換時間曲線。在不存在( ， )或存在-0005 (X) ,-0038 ( A ) >-0039 (□ )、-0040 (+)、-0041 (〇)或-0042 (-)時，將hIL-21肽的氘摻入(Da)以對數(shù)標(biāo)度針對時間作圖。肽 M29-D44 表示其中 0114-0005、-0038、-0039、-0040、-0041 和-0042 結(jié)合的hIL-21螺旋A的區(qū)域。肽I45-N51表示這樣的hIL-21區(qū)域，其中在早期時間點上0114-0005、-0038、-0039、-0040、-0041和-0042的結(jié)合可看作是極弱的氘交換差異。此外，通過在300秒鐘以上長的時間點上氘交換的明顯降低，觀察到在0114-0005、-0038、-0039、-0 040、-0041或-0042與hIL-21結(jié)合時hIL-21結(jié)構(gòu)的顯著穩(wěn)定。肽E93-V98表示其中011 4-0005、-0038、-0039、-0040、-0041 和-0042 結(jié)合的 hIL-21 螺旋 C 的區(qū)域。肽 E138-S162 表示其中無一 mAb 結(jié)合的 hIL-21 的區(qū)域。然而，當(dāng) 0114-0005、-0038、-0039、-0040、-0041 或-0042與hIL-21結(jié)合時觀察到hIL-21結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，如在300秒鐘以上長的時間點上顯示的氘交換降低。
[0017]圖7:在 0114-0005、-0038、-0039、-0040、-0041 和-0042 存在和不存在時 hIL-21 的HX分析的肽的序列覆蓋。在HX分析的肽(表示為水平棒)上方顯示原始序列。在所研究的任何mAb結(jié)合時，所有肽顯示類似的交換特性。在0114-0005、-0038、-0039、-0040、-00 41或-0042存在和不存在的兩種情況下，在早期時間點上顯示類似交換模式的肽以白色顯示，而在0114-0005、-0038、-0039、-0040、-0041或-0042結(jié)合時顯示氘摻入減少的肽著黑色。
[0018]定義
本文所用術(shù)語“治療”是指醫(yī)學(xué)治療有需要的任何人或其它動物受試者。預(yù)期所述受試者已由醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)從業(yè)人員進(jìn)行了身體檢查，醫(yī)師已做出了可表明采用所述具體治療有益于所述人或其它動物受試者健康的試驗性或確定性診斷。根據(jù)受試者的健康現(xiàn)狀，所述治療的時機(jī)和目的可在個體與個體間不同。因此，所述治療可為預(yù)防性、治標(biāo)性的、針對癥狀的和/或治愈性的。
[0019]就本發(fā)明而言，預(yù)防性、治標(biāo)性、針對癥狀的和/或治愈性治療可表示本發(fā)明的各個方面。
[0020]已通過X射線晶體學(xué)和HX-MS界定了被抗體NNC 0114-0005結(jié)合的hIL_21的表位，本文進(jìn)行了描述。
[0021]在該上下文中，在免疫球蛋白分子的情況下，特異性結(jié)合是由于免疫球蛋白結(jié)合部位(通過作為免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域的部分的至少一個⑶R所形成)與表位之間相互作用而發(fā)生的結(jié)合。優(yōu)選特異性結(jié)合由于形成免疫球蛋白結(jié)合部位的免疫球蛋白輕鏈的一個或多個(例如2個或3個)CDR和免疫球蛋白重鏈的一個或多個(例如2個或3個)CDR 與表位之間相互作用而發(fā)生。
[0022]特異性結(jié)合還可表征為以規(guī)定的結(jié)合親和力產(chǎn)生的結(jié)合。例如，結(jié)合常數(shù)優(yōu)選為 I U M或更小的數(shù)量級，例如100nM、IOnM, InM、100pM、IpM或更小。
[0023]“不連續(xù)”表位是由多肽的兩個或更多個間隔區(qū)域形成的表位，所述間隔區(qū)域在線性肽序列中彼此不相鄰，但在多肽的三維結(jié)構(gòu)中排列形成表位。
[0024]本文所用“分離的”化合物是從其天然環(huán)境移出的化合物?！凹兓摹被衔锸羌兌忍岣叩幕衔?，使得化合物以比其天然環(huán)境存在時更純的形式存在。
[0025]抗體
可用于本發(fā)明的優(yōu)選配體以免疫球蛋白為基礎(chǔ)。適于本發(fā)明的免疫球蛋白包括抗體和 T細(xì)胞受體(TCR)分子。
[0026]本文所用術(shù)語“抗體”、“單克隆抗體”和“mAb”欲指具有與抗原特異性結(jié)合的能力的本發(fā)明的免疫球蛋白分子及其片段。全長抗體包含4條多肽鏈，通過二硫鍵相互連接的2條重(H)鏈和2條輕(L)鏈。每條重鏈由重鏈可變區(qū)(本文簡稱為VH)和重鏈恒定區(qū)組成。重鏈恒定區(qū)由3個結(jié)構(gòu)域CH1、CH2和CH3組成。每條輕鏈由輕鏈可變區(qū)(本文簡稱為VL)和輕鏈恒定區(qū)組成。輕鏈恒定區(qū)由I個結(jié)構(gòu)域CL組成。VH和VL區(qū)可進(jìn)一步細(xì)分成超變性區(qū)，稱為互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，散布在稱為構(gòu)架區(qū)(FR)的更保守的區(qū)域內(nèi)。VH和VL 各由3個⑶R和4個FR組成，按下列順序從氨基端到羧基端排列:FR1、⑶Rl、FR2、⑶R2、 FR3、⑶R3、FR4?？赏ㄟ^將序列與已知可變區(qū)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對來鑒定抗體序列中的可變區(qū)和⑶R (構(gòu)架區(qū)和⑶R在本文按照Kabat編號方案定義一Kabat，EA, Wu，TT, Perry, HM 等.Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5版.US Department of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health, NIH 公布號 91-3242，1991)。
[0027]抗體的片段可結(jié)晶區(qū)(“Fe區(qū)”/”Fc結(jié)構(gòu)域”)是與細(xì)胞表面受體(稱為Fe受體)和補(bǔ)體系統(tǒng)的一些蛋白質(zhì)相互作用的抗體尾區(qū)。該性質(zhì)允許抗體激活免疫系統(tǒng)。然而， Fe結(jié)構(gòu)域可包含導(dǎo)致這些效應(yīng)子功能改變的氨基酸突變。優(yōu)選修飾的Fe結(jié)構(gòu)域包含一個或多個、優(yōu)選所有的下列突變:可分別導(dǎo)致對某些Fe受體的親和力降低(L234A、L235E和 G237A)和Clq介導(dǎo)的補(bǔ)體結(jié)合降低(A330S和P331S)(殘基編號按照EU指數(shù))。這類Fe 結(jié)構(gòu)域仍可保持長的體內(nèi)半衰期。
[0028]抗體的其它部分，稱為“Fab區(qū)”/”Fab結(jié)構(gòu)域”/”Fab片段”含有界定抗體可結(jié)合的特定靶標(biāo)的可變部分?？刹捎帽娝苤姆椒?，例如通過用酶例如木瓜蛋白酶(產(chǎn)生Fab 片段)或胃蛋白酶(產(chǎn)生F(ab’)2片段)進(jìn)行蛋白水解性切割，從完整抗體產(chǎn)生這些片段。 或者，可采用標(biāo)準(zhǔn)重組DNA和蛋白質(zhì)表達(dá)技術(shù)，重組產(chǎn)生抗體片段。
[0029]因此，包括在術(shù)語“抗體”內(nèi)的結(jié)合片段的實例包括但不限于:⑴Fab片段，一種由VL、VH、CL和CHl結(jié)構(gòu)域組成的一價片段；(ii) F(ab)2和F(ab’)2片段，一種包含在鉸鏈區(qū)通過二硫橋連接的2個Fab片段的二價片段；(iii)由VH和CHl結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段；(iv)由抗體單臂的VL和VH結(jié)構(gòu)域組成的scFv片段，(v) dAb片段(Ward等，(1989) Nature 341:544-546)，其由VH結(jié)構(gòu)域組成；和(vi)分離的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。此外，雖然 Fv片段的2個結(jié)構(gòu)域VL和VH由各自的基因編碼，但是可采用重組 方法，通過合成接頭將它們連接，這使得將其制備成為其中VL和VH區(qū)配對形成一價分子的單條蛋白質(zhì)鏈(稱為單鏈 Fv (scFv);參見例如 Bird 等(1988) Science 242:423-426 ;以及 Huston 等(1988) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 85:5879-5883)。這類單鏈抗體也欲包括在術(shù)語“抗體”內(nèi)。 單鏈抗體的其它形式，例如雙鏈抗體(diabodies)也包括在術(shù)語“抗體”內(nèi)。雙鏈抗體為二價雙特異性抗體，其中VH和VL結(jié)構(gòu)域在單條多肽鏈上表達(dá)，但使用太短以致于不允許同一鏈上的兩個結(jié)構(gòu)域配對的接頭，從而迫使所述結(jié)構(gòu)域與另一條鏈的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對，并產(chǎn)生兩個抗原結(jié)合部位(參見例如Hol-liger, P.等(1993) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 90:6444-6448 ；Poljak, R.J.等(1994) Structure 2:1121-1123)。
[0030]了解的是，抗原可具有一個或多個抗原決定簇(表位)，其包含⑴肽抗原決定簇， 由單條肽鏈組成，(2)構(gòu)象抗原決定簇，由一個以上空間上鄰接的肽鏈組成，所述肽鏈各自的氨基酸序列沿著多肽序列不連貫地定位；和(3)翻譯后抗原決定簇，其由翻譯后與抗原共價連接的分子結(jié)構(gòu)的全部或部分組成，例如碳水化合物基團(tuán)等。
[0031]本文所用術(shù)語“人抗體”、“多種人抗體”意指具有來源于人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū)的抗體。本發(fā)明的人抗體可包括例如在CDR中、特別是在CDR3中不是由人種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基(例如通過體外隨機(jī)誘變或位點專一誘變或通過體內(nèi)體細(xì)胞突變引入的突變)。
[0032]其中自來源于另一哺乳動物物種(例如小鼠)的抗體衍生的抗體的CDR序列被移植到人構(gòu)架序列，且任選可能通過誘變進(jìn)一步改造的本發(fā)明抗體被稱為“人源化抗體”。
[0033]術(shù)語“嵌合抗體”或“多種嵌合抗體”是指其輕鏈和重鏈基因通常通過遺傳工程自屬于不同物種的免疫球蛋白可變區(qū)和恒定區(qū)基因構(gòu)建的本發(fā)明抗體。例如，來自小鼠單克隆抗體基因的可變區(qū)段可與人恒定區(qū)段連接。
[0034]表位
在“抗原結(jié)合性多肽”例如抗體(Ab)與其相應(yīng)的抗原(Ag)之間的分子相互作用的情況下定義本文所用術(shù)語“表位”?！氨砦弧币话闶侵窤b與之特異性結(jié)合的Ag上的區(qū)或區(qū)域， 即與Ab物理接觸的區(qū)或區(qū)域。對于Ab和Ag分子中的原子，可通過各種標(biāo)準(zhǔn)來定義物理接觸(例如2-6A、例如3A、例如4 A、例如5A的距離截止值(cut-off);或溶劑可及性)。蛋白質(zhì)表位可包含Ag中直接參與與Ab結(jié)合的氨基酸殘基(亦稱為表位的免疫顯性組分)和不直接參與結(jié)合的其它氨基酸殘基，例如被Ab有效封閉的Ag的氨基酸殘基，即Ab的“溶劑排斥表面(solvent-excluded surface) ”和/或“足跡(footprint) ”內(nèi)的氨基酸殘基。
[0035]可采用各種實驗和計算表位作圖方法，以不同的細(xì)節(jié)層次描述和表征給定抗體 (Ab)/抗原(Ag)對的表位。實驗方法包括誘變、X射線晶體學(xué)、核磁共振(NMR)波譜學(xué)、氫氣交換質(zhì)譜法(Hydrogen deuterium eXchange Mass Spectrometry,HX-MS)和各種競爭結(jié)合方法、本領(lǐng)域已知的方法。由于每種方法依賴于獨特的原理，因此表位的描述與測定表位的方法密切相關(guān)。因此，根據(jù)所采用的表位作圖方法，可對給定Ab/Ag對的表位進(jìn)行不同的描述。
[0036]可根據(jù)本發(fā)明抗體識別或特異性結(jié)合的IL-21蛋白的一個或多個表位或部分來描述或確定本發(fā)明的抗體。例如可通過N端和C端位置或連續(xù)氨基酸殘基的大小,來確定一個或多個表位或多肽部分。還可根據(jù)其交叉反應(yīng)性來描述或確定本發(fā)明的抗體。包括了不結(jié)合多肽的任何其它類似物、直向同源物(ortholog)或同源物的抗體。
[0037]可關(guān)于抗體與其共同抗原同時結(jié)合的能力，來表征與相同抗原結(jié)合的抗體，并且可對抗體進(jìn)行“競爭結(jié)合”/ “分箱(binning)”。本文中，術(shù)語“分箱”是 指對與相同抗原結(jié)合的抗體歸類的方法?？贵w的“分箱”可以在基于標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)例如表面等離振子共振(SPR)、 ELISA或流式細(xì)胞術(shù)的測定法中兩種抗體與其共同抗原的競爭結(jié)合為基礎(chǔ)。
[0038]使用參比抗體來定義“箱(bin)”。如果第二抗體不能在與參比抗體相同的時間與抗原結(jié)合，則第二抗體被稱為屬于與參比抗體相同的“箱”，在這種情況下，參比抗體和第二抗體對于與抗原結(jié)合是競爭性的，因此該抗體對被稱為“競爭性抗體”。如果第二抗體能夠在與參比抗體相同的時間與抗原結(jié)合，則第二抗體被稱為屬于各自的“箱”。在這種情況下參比抗體和第二抗體對于與抗原結(jié)合不是競爭性的，因此該抗體對被稱為“非競爭性抗體”。
[0039]抗體“分箱”不提供有關(guān)表位的直接信息。競爭性抗體，即屬于相同“箱”的抗體可具有相同的表位、重疊表位或甚至各自的表位。后者是這樣的情況:如果與抗原上的表位結(jié)合的參比抗體占據(jù)第二抗體與其抗原上的表位接觸所需要的空間(“位阻”)。非競爭性抗體一般具有各自的表位。
[0040]本文所用術(shù)語“親和力”定義了抗體與表位結(jié)合的強(qiáng)度。抗體的親和力通過平衡解離常數(shù)KD測量，平衡解離常數(shù)定義為[Ab] X [Ag] / [Ab-Ag]，其中[Ab-Ag]是平衡時抗體-抗原復(fù)合物的摩爾濃度，[Ab]是未結(jié)合抗體的摩爾濃度，[Ag]是未結(jié)合抗原的摩爾濃度。還可根據(jù)通過例如SPR方法測定的復(fù)合物形成和解離的動力學(xué)來描述KD。一價復(fù)合物結(jié)合和解離相應(yīng)的速率常數(shù)分別稱為結(jié)合速率常數(shù)ka (或kj和解離速率常數(shù)kd (或 kf)。然后通過等式KD = kd / ka將KD與ka和kd相關(guān)聯(lián)。親和常數(shù)KA定義為I/ KD。 用于通過競爭抑制測定抗體特異性和親和力的優(yōu)選方法可參見Harlow等，Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988), Colligan 等， 主編，Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc, and Wiley Interscience, N.Y., (1992, 1993);以及Muller, Meth.Enzymo1.92:589-601 (1983)。
[0041]可對抗體或其片段進(jìn)行修飾以延長其血清半衰期，例如通過與分子(例如脂肪酸或脂肪酸衍生物、PEG (聚乙二醇)或其它水溶性聚合物，包括多糖聚合物和肽衍生的聚合物)綴合來延長半衰期。
[0042]配體的結(jié)構(gòu)
如上所述，如本文提及的配體可以是抗體(例如IgG、IgM、IgA、IgA、IgE)或包含彼此互補(bǔ)因此彼此締合形成VH/VL對的至少一個重鏈可變結(jié)構(gòu)域和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的片段(例如Fab、Fv、二硫鍵連接的Fv、scFv、雙鏈抗體)。它可來源于天然產(chǎn)生抗體的任何物種,或通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生；或使用分子展示技術(shù)由序列文庫分離，例如噬菌體展示，不論文庫序列分離自血清、B細(xì)胞、雜交瘤、轉(zhuǎn)染瘤、酵母還是細(xì)菌。
[0043]在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，配體包含抗體的至少一個單一重鏈可變結(jié)構(gòu)域和抗體的一個單一輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，使得兩個區(qū)能夠締合形成互補(bǔ)的VH/VL對。
[0044]如果使用V基因庫，則多肽序列的變異優(yōu)選位于可變結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)環(huán)內(nèi)。可通過 DNA改組或通過突變改變?nèi)我豢勺兘Y(jié)構(gòu)域的多肽序列，以提高各可變結(jié)構(gòu)域與互補(bǔ)對的相互作用。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，配體是單鏈Fv片段。在本發(fā)明的一個備選實施方案中，配體由抗體的Fab區(qū)組成。
[0045]又一方面，本發(fā)明.提供編碼至少本文定義的配體的核酸。因此，又一方面，本發(fā)明提供包含編碼至少本文定義的配體的核酸的載體。
[0046]治療應(yīng)用
IL-21參與T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫，并且已表明促進(jìn)多種炎性細(xì)胞因子。因此，本發(fā)明的配體可用于治療涉及不當(dāng)或不需要的免疫應(yīng)答(免疫病癥)的疾病，例如炎癥、自身免疫、涉及這類機(jī)制的病況以及移植物抗宿主病。在一個實施方案中，這類疾病或病癥是自身免疫病和/或炎性疾病。這類自身免疫病和/或炎性疾病的實例為系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)和炎性腸病(IBD)(包括潰瘍性結(jié)腸炎(UC)和克羅恩病(Crohn’s disease, CD))、多發(fā)性硬化(MS)、硬皮病和I型糖尿病(Tl D)及其它疾病和病癥，例如PV (尋常性天皰瘡)、銀屑病、特應(yīng)性皮炎、乳糜瀉、kol、橋本氏甲狀腺炎 (hashimoto’s thyroiditis)、格雷夫斯病(graves’ disease)(甲狀腺)、斯耶格倫綜合征(Sjogren’s syndrome)、格-巴綜合征(guillain-barre syndrome)、古德帕斯徹綜合征(goodpasture，s syndrome)、艾迪生病(additon，s disease)、韋格納肉芽腫病(Wegener，s granulomatosis)、原發(fā)性膽管硬化癥、硬化性膽管炎、自身免疫性肝炎、風(fēng)濕性多肌痛、雷諾現(xiàn)象(paynaud’ s phenomenon)、顳動脈炎、巨細(xì)胞性動脈炎、自身免疫性溶血性貧血、惡性貧血、結(jié)節(jié)性多動脈炎、貝切特病(behcet’s disease)、原發(fā)性膽汁性肝硬化、眼色素層炎(uveitis)、心肌炎、風(fēng)濕熱、關(guān)節(jié)強(qiáng)硬性脊椎炎、腎小球性腎炎(glomerulenephritis)、 結(jié)節(jié)病、皮肌炎、重癥肌無力、多肌炎、斑禿、I型糖尿病、結(jié)腸炎相關(guān)性腫瘤發(fā)生和白癜風(fēng) (Vitilgo)0其它實例可參見PCT申請WO 01/46420，其涉及使用IL-17治療自身免疫病和 /或炎性疾病，其中給出若干這類疾病的實例，以及W02010/055366，所述文獻(xiàn)的內(nèi)容通過引用明確結(jié)合到本文中。
[0047]在一個實施方案中，這類疾病或病癥是SLE、RA或IBD。在一個實施方案中，這類疾病或病癥是MS。
[0048]本發(fā)明的IL-21配體可與本領(lǐng)域已知的其它藥物組合給予。
[0049]藥物組合物
本發(fā)明還包括包含藥學(xué)上可接受的載體和本發(fā)明的多肽/配體/抗體的藥物組合物/ 制劑以及包含這類組合物的藥盒。本發(fā)明的藥物組合物可呈含水制劑或無水制劑的形式， 所述無水制劑在給予前在水/水性緩沖液中復(fù)溶。
[0050]包含本發(fā)明的配體/抗體/多肽的藥物組合物可以藥盒供應(yīng)，藥盒包括裝有本發(fā)明的化合物的容器。治療性多肽可以單劑量或多劑量注射溶液劑的形式或作為將在注射前復(fù)溶的無菌散劑的形式提供。包含本發(fā)明的化合物的藥物組合物可適于皮下和/或IV給藥。
[0051]此外，提供用于治療與免疫應(yīng)答異常有關(guān)的病況的方法，所述方法包括給予受試者治療有效量配體，所述配體可采用上述測定方法鑒定。
[0052]氨基酸I37-Y52和 N92-P108界定人IL-21的新的表位。我們確認(rèn)與IL-21結(jié)合的高親和力配體更可能與落入所述氨基酸范圍的IL-21接觸。通過與該表位結(jié)合，配體對 IL-21具有穩(wěn)定作用。具體地說，極易活動的螺旋C被穩(wěn)定在結(jié)合狀態(tài)，大大降低了存在于游離狀態(tài)的IL-21分子中的能量。
[0053]此外，我們還確認(rèn)，該表位被單克隆抗體NNC 0114-0005 (本文亦可稱為例如 “‘0005”)特異性結(jié)合。輕鏈和重鏈可變結(jié)構(gòu)域的序列分別如SEQ ID No 10和SEQ ID No 11所示。該抗體與公開于W02010/055366的抗體相同，該文中命名為雜交瘤克隆號 362.78.1.44。本文還可以若干方式提及該抗體0005，，、“NNC-0000-0005，，、“0006”和 “NNC-0000-0006”。然而，在W02010/055366中，被相同抗體靶向的表位被不正確地界定為包含殘基Ile45-Leu56和Glul29_Leul44。我們目前已表明這是不正確的。
[0054]同樣地，本文界定的表位還被單克隆抗體NNC 0114-0015 (本文亦可稱為 “0015”)結(jié)合，其公開于W02010/055366，被命名為雜交瘤克隆號362.597.3.15。輕鏈和重鏈可變結(jié)構(gòu)域的序列分別如SEQ ID IN No 12和SEQ ID No 13所示。與NNC 0114-0005 相比，NNC 0114-0015具有單個氨基酸改變，HC S31T (按照Kabat的編號——Kabat, EA, ffu, TT, Perry, HM 等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版.US Department of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health, NIH 公布號 91-3242，1991)。[0055]第一方面，提供與本文定義的表位特異性結(jié)合的配體，優(yōu)選抗體，條件是配體不是天然存在的IL-21Ra (SEQ ID N0.14給出包括不是成熟IL-21Ra蛋白的部分的信號序列的完整IL-21Ra序列)或包含本文所述IL-21結(jié)合部位的任何前述IL-21R變體，或單克隆抗體NNC 0114-0005或NNC 0114-0015，其輕鏈和重鏈分別在本文SEQ ID N0.10和 SEQ ID N0.11 及 SEQ ID N0.12 和 SEQ ID N0.13 中示出。
[0056]優(yōu)選配體是免疫球蛋白，例如抗體或抗體片段或TCR (T細(xì)胞受體)或其片段。
[0057]我們表明，結(jié)合所述表位的配體通過使螺旋C和整個分子穩(wěn)定而使IL-21穩(wěn)定。認(rèn)為IL-21分子的穩(wěn)定作用提高結(jié)合配體的親和力，因為與未結(jié)合分子相比，結(jié)合的IL-21達(dá)到極低能態(tài)。
[0058]本發(fā)明實施方案的另一方面，配體是抗體或抗體片段，其中重鏈包含SEQ ID N0.11所示的CDRl、CDR2或CDR3的至少一個，輕鏈包含SEQ ID N0.10所示的CDRl、CDR2或 CDR3的至少一個。所列出的SEQ ID N0.10和11的CDR按照Kabat方案定義(Kabat, EA, ffu, TT, Perry, HM 等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版.US Department of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health, NIH 公布號 91-3242，1991)。
[0059]在一個實施方案中，輕鏈包含SEQ ID N0.10所示序列。
[0060]在一個實施方案中，重鏈包含SEQ ID N0.11所示序列。
[0061]配體還可另外包含F(xiàn)e，其介導(dǎo)抗體效應(yīng)子功能。
[0062]另一方面，提供配體，優(yōu)選抗體，其與本文鑒定的在IL-21和IL-21R a之間形成的界面上的IL-21表位特異性結(jié)合。優(yōu)選配體在包括下列殘基的任一個或多個的表位上結(jié)合:R34、R38、Q41、K102 和 R105。優(yōu)選配體與至少 R34 和 K102 ;或 R34 和 R105 ;或 R34、K102 和 R105 ;或 R38 和 K102 ;或 R38 和 R105 ;或 R38、K102 和 R105 ;或 Q41 和 K102 ;或 Q41 和 R105 ;或041、1(102 和 R105 ;或町05、1?34 和 R38 ;或 R105、R34、R38 和 Q41 ;或1(102、1?34 和 Q41 ;*R34、R38、Q41、K102 和 R105 ;或 R38、Q41、K102 和 R105 ;或 R34、Q41、K102 和 R105 ； 或 R34、R38、K102 和 R105 結(jié)合。
[0063]還包括在本文鑒定的IL-21:1L_21R結(jié)合界面上與IL_21Ra結(jié)合的的抗IL_21Ra 配體。
.[0064]另一方面，提供與本發(fā)明IL-21的不連續(xù)表位特異性結(jié)合的配體，優(yōu)選抗體，條件是配體不是:(i)天然存在的IL-21Ra (SEQ ID N0.14)，(ii)單克隆抗體NNC 0114-0005， 其輕鏈和重鏈分別如SEQ ID N0.10和SEQ ID N0.11所示，和(iii)單克隆抗體NNC 0114-0015，其輕鏈和重鏈分別如SEQ ID N0.12和SEQ ID N0.13所示。因此，本發(fā)明包含具有這類性質(zhì)的任何配體，下列化合物除外:IL-21Ra、單克隆抗體NNC 0114-0005和單克隆抗體 NNC 0114-0015。
[0065]另一方面，提供與IL-21上的不連續(xù)表位結(jié)合的配體，優(yōu)選抗體，其中所述表位包含如SEQ ID N0.1所示IL-21的氨基酸I37-Y52的至少一個和氨基酸N92-P108的至少一個，條件是配體不是:(i)天然存在的IL_21Ra (SEQ ID N0.14)，(ii)單克隆抗體NNC 0114-0005，其輕鏈和重鏈分別如SEQ ID N0.10和SEQ ID N0.11所示，和(iii)單克隆抗體NNC 0114-0015，其輕鏈和重鏈分別如SEQ ID N0.12和SEQ ID N0.13所示。因此，本發(fā)明包含具有這類性質(zhì)的任何配體，下列化合物除外:IL-21Ra、單克隆抗體NNC 0114-0005和單克隆抗體NNC 0114-0015。
[0066]在一個實施方案中，本發(fā)明的配體與包含如SEQ ID N0.1所示IL-21的氨基酸 I37-Y52和N92-P108的表位結(jié)合。
[0067]本發(fā)明的另一方面或?qū)嵤┓桨?，配體含有包含對應(yīng)于SEQ ID N0.10的下列殘基的⑶R1XDR2或⑶R3中至少一個的輕鏈和包含對應(yīng)于SEQ ID N0.11的下列殘基的⑶R1、 ⑶R2或⑶R3中至少一個的重鏈。
[0068]0114-0005 CDR_L1: SEQ ID N0.10 的 R24-A35。
[0069]0114-0005 CDR_L2: SEQ ID N0.10 的 G51-T57。
[0070]0114-0005 CDR_L3: SEQ ID N0.10 的 Q90-T96。
[0071]0114-0005 CDR_H1: SEQ ID N0.11 的 S31-H35。
[0072]0114-0005 CDR_H2: SEQ ID N0.11 的 F50-G66。
[0073]0114-0005 CDR_H3: SEQ ID N0.11 的 D99-V115。
[0074]在另一個實施方案中，本發(fā)明的配體含有包含SEQ ID N0.10所示⑶Rl和⑶R3 中至少一個的輕鏈和包含SEQ ID N0.11所示⑶R2和⑶R3中至少一個的重鏈。
[0075]另一方面，提供在IL-21和IL-21Ra之間的結(jié)合界面上與IL-21結(jié)合的配體， 優(yōu)選抗體，其中所述配體與包括SEQ ID No I所示IL-21序列中的R34、R38、Q41、R105和 K102至少一個、優(yōu)選至少兩個、優(yōu)選至少三個、優(yōu)選至少四個的表位結(jié)合，條件是配體不是: (i)天然存在的IL-21Ra (SEQ ID N0.14) (ii)單克隆抗體NNC 0114-0005，其輕鏈和重鏈分別如SEQ ID N0.10和SEQ ID N0.11所示，和(iii)單克隆抗體NNC 0114-0015，其輕鏈和重鏈分別如SEQ ID N0.12和SEQ ID N0.13所示。因此，本發(fā)明包含具有這類性質(zhì)的任何配體，下列化合物除外:IL-21Ra、單克隆抗體NNC 0114-0005和單克隆抗體NNC 0114-0015。
[0076]在一個實施方案中，本發(fā)明的配體與包含R34、R38、Q41、R105和K102的IL-21上的表位結(jié)合。
[0077]在另一個實施方案中，本發(fā)明的配體干擾IL-21與IL_21Ra結(jié)合。
[0078]在另一個實施方案中，人IL-21與本發(fā)明的配體相互作用的KD為10_12 (M)或更小。在另一個實施方案中，本發(fā)明的配體優(yōu)選為抗體，其中所述抗體與SEQ ID No I所示 IL-21序列中的R34、R38、Q41、R105和K102結(jié)合，且其中人IL-21與抗體相互作用的KD為 Kr12 (M)或更小。
[0079]在另一個實施方案中，本發(fā)明的配體是抗體，其中所述抗體包含如SEQ ID NO 10 所示的⑶R3氨基酸序列和如SEQ ID NO 11所示的⑶R3氨基酸序列。
[0080]在另一個實施方案中，本發(fā)明的配體是抗體，其中人IL-21與所述抗體相互作用的KDSKT12 (M)或更小，其中所述抗體與SEQ ID No I所示IL-21序列中的R34、R38、Q41、 R105和K102結(jié)合，且其中所述抗體與IL-21競爭結(jié)合IL-21R。
[0081]在另一個實施方案中，本發(fā)明的配體是抗體，例如抗體、單克隆抗體、一價抗體或二價抗體。
[0082]在本發(fā)明的另一方面或?qū)嵤┓桨钢?，配體是作為單克隆抗體NNC 0114-0005的變體的抗體，其輕鏈和重鏈分別如SEQ ID N0.10和SEQ ID N0.11所示，其中所述配體包含 SEQ ID N0.10和/或SEQ ID N0.11的⑶R序列中的一個或多個突變，其中所述突變選自下列的一個或多個:CDR Hl S31A、CDR H2 Y53F、CDR H2 A61S、CDR H2 S63T、CDR H2S63A、 CDR H2 K65R、CDR LI R24K、CDR LI S26T、CDR LI S31T、CDR LI S31A、CDR L2 S53T、CDR L2 S52A、CDR L2 S54A、CDR L2 S54T和CDR L2 R55K。當(dāng)然要了解，這類變體抗體可只在給
定位置上包含一個突變。
[0083]另一方面，提供包含本發(fā)明的配體、優(yōu)選抗體和任選一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑/載體的藥物組合物。這類賦形劑/載體是本領(lǐng)域眾所周知的。這類藥物組合物優(yōu)選欲用于IV給藥和/或皮下給藥。
[0084]另一方面，提供用于治療免疫病癥的本發(fā)明的配體、優(yōu)選抗體的用途。所述免疫病癥優(yōu)選為自身免疫病。
[0085]最后一個方面，提供治療免疫病癥的方法，其中所述方法包括給予有需要的人適當(dāng)劑量的本發(fā)明的配體、優(yōu)選抗體。在一個實施方案中，本發(fā)明的配體可在自身免疫病的治療中用于減少B細(xì)胞分化。
[0086]本發(fā)明的配體適用于治療免疫應(yīng)答異常、包括自身免疫病的病況。在多種T細(xì)胞特異性相互作用中需要IL-21，且IL-21是免疫調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子。因此，提供本文所述IL-21 特異性配體用于治療涉及免疫應(yīng)答異常的病況。此外，提供治療涉及免疫應(yīng)答異常的病況的方法，所述方法包括給予有需要的受試者本發(fā)明的配體。
[0087]本文提供的IL-21:1L_21Ra和Fab NNC 0114-0009:1L-21復(fù)合物的詳細(xì)三維結(jié)構(gòu)知識，包括其結(jié)合界面，可構(gòu)成合理設(shè)計具有所需性質(zhì)的相互作用分子的變體的基礎(chǔ)。對于抗體可能需要改進(jìn)的性質(zhì)可為化學(xué)或物理性質(zhì)，例如溶解度、粘度和穩(wěn)定性?？赡苄枰{(diào)節(jié) 的其它性質(zhì)是抗體的抗原性質(zhì)及其被抗抗體結(jié)合并誘導(dǎo)效應(yīng)子功能的能力。
[0088]要了解，本發(fā)明的不同方面和實施方案可以組合。
實施例
[0089]實施例1
hIL-21與抗IL-21 Fab的復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)
解析了 hIL-21與人抗IL-21單克隆抗體NNC 0114-0005的Fab片段NNC 0114-0009 (該Fab片段在本文亦可稱為例如“Fab 0114-0005”)的復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)，并采用X射線晶體學(xué)精修至1.75 A分辨率。結(jié)果表明，hIL-21上的表位與專用hIL-21受體鏈(IL21Ra ) 的結(jié)合部位廣泛重疊。因此，憑借其高親和力，抗IL-21 mAb有效地阻斷hIL-21與IL21Ra 結(jié)合，并因此抑制由hIL-21通過其關(guān)聯(lián)受體介導(dǎo)的生物作用。
[0090]將hIL-21 (SEQ ID NO:1 的殘基 30-162)和抗 IL-21 Fab NNC 0114-0009 (包含對應(yīng)于SEQ ID NO: 16的輕鏈和對應(yīng)于SEQ ID NO: 17的殘基1-234的重鏈片段)與摩爾濃度略微過量的hIL-21混合，復(fù)合物采用大小排阻層析法純化。然后將復(fù)合物濃縮至約
10.3mg/ml。用懸滴技術(shù)使晶體在以1:2 (沉淀劑溶液體積:蛋白質(zhì)溶液體積)比率混合的25% w/v PEG 3350、0.1M檸檬酸(pH 3.5)中生長。總的液滴大小為3.0 u 10通過將含有75%沉淀劑溶液和25%甘油的3 u I冷凍溶液(cryo-solution)轉(zhuǎn)移到含晶體的液滴中，并允許浸泡約15秒鐘,來制備晶體用于低溫冷凍(cryo-freezing)。然后使晶體在液氮中速凍，并在數(shù)據(jù)收集期間通過低溫N2氣流保持在100 K溫度下。在MAX-1ab，Lund， Sweden,收集晶體學(xué)數(shù)據(jù)，最初在Rigaku 007HF旋轉(zhuǎn)陽極源至2.03 A的分辨率，之后使用相同晶體在束線BL911-2 [1]至1.75 A分辨率。通過XDS軟件包[2]進(jìn)行空間群測定、數(shù)據(jù)的積分和標(biāo)定，并通過Pointless軟件[3]進(jìn)一步檢查。測定用于同步加速器數(shù)據(jù)的晶胞參數(shù)分別為 40.7，133.3，53.4 A，90。,106.87° 和 90。，空間群為 P2lt) M 1.75 A 分辨率的R-sym為5.1%，完整性98.1%。應(yīng)用CCP4套件[6]的Phaser軟件程序[4; 5]的分子置換用于結(jié)構(gòu)測定。來自蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(Protein Data Bank, PDB)保藏的[7]結(jié)構(gòu)3KDM [8]的Fab分子和來自較早前測定的1L-21/IL-21Ra復(fù)合物結(jié)構(gòu)X射線結(jié)晶學(xué)結(jié)構(gòu)(實施例2)的hIL-21分子用于結(jié)構(gòu)測定。
[0091]將Fab分子分成分別含有可變和恒定結(jié)構(gòu)域的兩個部分。兩個部分在分子置換計算中分別各用作搜索模型。對于IL-21，除未確定的柔性環(huán)以外，使用完整分子作為搜索模型。隨后如果模型建立，則應(yīng)用軟件ARP/wARP [9]用于起始回合，接著應(yīng)用CCP4軟件包的軟件程序Refmac5 [10]和Phenix軟件包[12]的Phenix.ref ine [11]進(jìn)行晶體學(xué)精修， 接著應(yīng)用Coot軟件程序[13]進(jìn)行電子密度圖的計算機(jī)圖形檢查、模型校正和建立。使該步驟循環(huán)直到不可進(jìn)一步顯著改進(jìn)該模型。所有數(shù)據(jù)最終的R和自由R (R-free)分別為 0.191和0.241，模型顯示與理想鍵長的均方根差(RMSD)為0.023 A0來自最終精修循環(huán)的 PDB文檔的標(biāo)題見表I。
[0092]結(jié)果
抗IL-21 Fab有效地阻斷IL-21Ra與hIL-21分子結(jié)合。
[0093]通過CCP4 程序套件[6]的軟件程序 Areaimol (B.Lee 和 F.M.Richards, J.Mol.Biol.，55，379-400 (1971)，E.B.Saff 和 A.B.J.Kui jlaars，The Mathematical Intelligencer, 19,5-11 (1997)),針對晶體結(jié)構(gòu)的 hIL-21/ 抗 IL-21 Fab 分子復(fù)合物計算成對相互作用中所排除的面積，分別得到hIL-21為1189 A2，抗IL-21為1084 A2。計算 IL-21分子和抗IL-21 Fab間的成對相互作用中所排除的平均面積為1136 A2。
[0094]使用抗IL-21 Fab和hIL-21分子間4.0 A的截止距離，通過運行CCP4程序套件
[6]的CONTACT軟件，鑒定出hIL-21與抗IL-21 Fab之間的直接接觸點。hIL-21/抗IL-21 Fab復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)的結(jié)果見表2。發(fā)現(xiàn)所得抗IL-21的hIL-21表位包含hIL_21 (SEQ ID NO:1)的下列殘基:Ile 37>Arg 38、Gln 41、Asp 44、Ile 45>Asp 47、Gln 48>Asn 51>Tyr 52、Asn 92、Arg 94、lie 95、Asn 97、 Val 98、Val 98、 Ser 99、 Lys IOK Lys 102、Arg 105、 Lys 106、Pro 107 和 Pro 108。
[0095]因此，抗IL-21 hIL-21表位包含螺旋A和C的殘基。此外，在螺旋C之前 (proceeding)的環(huán)區(qū)段中鑒定出幾個接觸殘基(Arg 105-Pro 108)。這些接觸區(qū)域與 hIL-21上確定為IL-21Ra結(jié)合部位的區(qū)域(實施例2)極其一致。
[0096]hIL-21的抗IL-21抗原互補(bǔ)位包括輕(L)鏈(SEQ ID NO: 16，表2)的殘基Glu U Gln 27、Ser 28、Val 29、Ser 30、Ser 32、Tyr 33、Gln 91、Tyr 92、Gly 93、Ser 94 和 Trp 95 以及重(H)鏈(SEQ ID NO: 17、表 2)的殘基 Trp 47、Trp 52、Ser 56、Asp 57、Tyr 59> Tyr 60>Asp 99>Asp 101> Ser 102> Ser 103>Asp 104> Trp 105> Tyr 106> Gly 107>Asp 108、Tyr 109和Phe 111。表2的hIL_21的氨基酸序列還標(biāo)示了 hIL_21表位和參與氫結(jié)合的殘基。
[0097]表1.通過CCP4程序軟件包[6]的軟件程序Refmac5 [10]對IL-21/抗IL-21 Fab復(fù)合物的觀察數(shù)據(jù)進(jìn)行X射線模型精修的結(jié)果。
【權(quán)利要求】
1.一種與IL-21上的不連續(xù)表位結(jié)合的配體，其中所述表位包含SEQ ID N0.1所示 IL-21氨基酸I37-Y52的至少一個和氨基酸N92-P108的至少一個，條件是所述配體不是: ⑴天然存在的IL-21Ra (SEQ ID N0.14)，(ii)單克隆抗體NNCOl 14-0005，其輕鏈和重鏈分別如SEQ ID N0.10和SEQ ID N0.11所示，和(iii)單克隆抗體NNCOl 14-0015，其輕鏈和重鏈分別如SEQ ID N0.12和SEQ ID N0.13所示。
2.權(quán)利要求1的配體，其中所述配體與包含如SEQID N0.1所示IL-21的氨基酸 I37-Y52和N92-P108的表位結(jié)合。
3.權(quán)利要求1-2中任一項的配體，其中所述配體是抗體。
4.權(quán)利要求3的抗體，其中所述抗體含有包含SEQID N0.10所示的⑶R1XDR2或⑶R3 的至少一個的輕鏈和包含SEQ ID N0.11所示的⑶R1、⑶R2或⑶R3的至少一個的重鏈。
5.權(quán)利要求4的抗體，其中所述抗體含有包含SEQID N0.10所示⑶Rl和⑶R3的至少一個的輕鏈和包含SEQ ID N0.11所示⑶R2和⑶R3的至少一個的重鏈。
6.一種在IL-21和IL-21Ra之間的結(jié)合界面上與IL-21結(jié)合的配體，其中所述配體與包括SEQ ID Nol所示IL-21的氨基酸序列中的R34、R38、Q41、R105和K102的至少一個的表位結(jié)合，條件是所述配體不是:(i)天然存在的IL-21Ra (SEQ ID N0.14)，(ii)單克隆抗體NNCOl 14-0005，其輕鏈和重鏈分別如SEQ ID N0.10和SEQ ID N0.11所示，和(iii)單克隆抗體NNC0114-0015，其輕鏈和重鏈分別如SEQ ID N0.12和SEQ ID N0.13所示。
7.權(quán)利要求6的配體，其中所述配體與SEQID如1所示11-21序列中的1?34、1?38、041、 R105和K102結(jié)合。
8.權(quán)利要求1-7中任一項的配體，其中所述配體干擾IL-21與II_21Ra的結(jié)合。
9.權(quán)利要求1-8中任一項的配體，其中人IL-21與配體相互作用的KD為KT12(M)或更小。`
10.權(quán)利要求1-9中任一項的配體，其中所述配體是作為單克隆抗體NNC0114-0005的變體的抗體，其輕鏈和重鏈分別如SEQ ID N0.10和SEQ ID N0.11所示，其中所述配體包含 SEQ ID N0.10和/或SEQ ID N0.11的⑶R序列中的一個或多個突變，其中所述突變選自下列的一個或多個:CDR H1S31A、CDR H2Y53F、CDR H2A61S、CDR H2S63T、CDR H2S63A、CDR H2K65R、CDR L1R24K、CDR L1S26T、CDR L1S31T、CDR L1S31A、CDR L2S53T、CDR L2S52A、CDR L2S54A、CDR L2S54T 和 CDR L2R55K。10.權(quán)利要求1-9中任一項的配體，其中所述配體是抗體，且其中所述抗體包含SEQID NOlO所示的⑶R3氨基酸序列和SEQ ID NOll所示的⑶R3氨基酸序列。
11.權(quán)利要求1-10中任一項的配體，其中所述配體是抗體，其中人IL-21與所述抗體相互作用的KD為KT12(M)或更小，其中所述抗體與SEQ ID Nol所示IL-21序列中的R34、 R38、Q41、R105和K102結(jié)合，且其中所述抗體與IL-21競爭結(jié)合IL-21R。
12.一種藥物組合物，其包含權(quán)利要求1-11中任一項的配體和任選一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑。
13.用于治療免疫病癥的權(quán)利要求1-11中任一項的配體或權(quán)利要求12的藥物組合物的用途。
14.一種治療免疫病癥的方法，其中所述方法包括給予有需要的人適當(dāng)劑量的權(quán)利要求1-11的配體或權(quán)利要求12的藥物組合物。
15.一種治療免疫病癥的方法，其中所述方法包括給予有需要的人適當(dāng)劑量的權(quán)利要求1-11的配體或權(quán)利要求12的藥物組合物，其中所述配體用于在 自身免疫病的治療中減少B細(xì)胞分化。
【文檔編號】C07K14/54GK103443124SQ201280013862
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2012年1月17日 優(yōu)先權(quán)日:2011年1月17日
【發(fā)明者】L.A.斯文斯森, M.D.安德森, J.布雷恩霍特, C.維伯格, B.O.克羅格, D.倫德斯加爾德, H.B.拉斯穆森 申請人:諾沃—諾迪斯克有限公司