本發(fā)明屬于檢測試紙技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種基于適配體納米金交聯(lián)復(fù)合物的tnf-α檢測試試劑盒及方法。

背景技術(shù)：

阿爾茨海默病(alzheimer’sdisease，ad)是一種危害性高、醫(yī)療護(hù)理成本巨大、尚無根治方法的神經(jīng)退行性疾病。隨著我國社會老齡化過程，患者人數(shù)逐年增加，給社會帶來了極大的負(fù)擔(dān)，因此ad的早期診斷和干預(yù)具有重大意義。

已有的ad臨床檢測手段主要為：依靠認(rèn)知量表測試結(jié)合核磁共振掃描，鑒定結(jié)果可靠度高，但對ad早期診治敏感性不佳(患者沒有明顯癥狀或具有輕微的認(rèn)知功能的減退(mildcognitiveimpairment，mci))；此外，檢測樣本為腦脊液，取樣時常采用脊椎穿刺等手段，有副作用，并且不能進(jìn)行多次取樣，給疾病的追蹤性檢測帶來困難。

體液標(biāo)志物作為一種敏感性佳、特異性高、易于使用的指示劑，可真實反應(yīng)ad的病理進(jìn)程。腫瘤壞死因子α(tumornecrosisfactor-α，tnf-α)是一種主要由巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞產(chǎn)生的炎癥因子，參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)。腦內(nèi)慢性炎癥反應(yīng)是ad的重要病理特征之一。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明解決的問題在于提供一種基于適配體納米金交聯(lián)復(fù)合物的tnf-α檢測試試劑盒及方法，利用核酸適配體和納米金交聯(lián)復(fù)合物比色檢測tnf-α，能夠簡便、快速的檢測待測樣品中是否含有tnf-α。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)：

一種基于適配體納米金交聯(lián)復(fù)合物的tnf-α檢測試劑盒，包括：

納米金溶液，其中包括用于形成納米金交聯(lián)復(fù)合物的納米金顆粒；

巰基化的單鏈序列dna1和dna2，dna1、dna2分別與納米金顆粒連接，形成aunps-dna1顆粒和aunps-dna2顆粒；

單鏈連接序列l(wèi)inker，linker含有與tnf-α特異性結(jié)合的適配體序列，且linker的兩端分別與dna1、dna2相互補；dna1、dna2和linker可雜交形成雙鏈；

在進(jìn)行檢測時，aunps-dna1顆粒、aunps-dna2顆粒和linker在緩沖液中孵育后雜交形成納米金交聯(lián)復(fù)合物。

所述的納米金交聯(lián)復(fù)合物在與tnf-α結(jié)合前為團(tuán)聚狀態(tài)，反應(yīng)溶液為藍(lán)色；納米金交聯(lián)復(fù)合物與tnf-α結(jié)合后，tnf-α與linker上的適配體序列結(jié)合，破壞適配體納米金交聯(lián)復(fù)合物，納米金由團(tuán)聚狀態(tài)變?yōu)榉稚顟B(tài)，反應(yīng)溶液由藍(lán)色變?yōu)榧t色。

所述的dna1的核苷酸序列為：tcacttcgctgaaaaaaa-(ch3)3-sh；

所述的dna2的核苷酸序列為：sh-(ch3)6-ctgtattgtcgc；

所述的linker的核苷酸序列為：tcctccatccgcgagtgggcgacaatactgtcagcgttcact。

一種基于適配體納米金交聯(lián)復(fù)合物的tnf-α檢測方法，包括以下操作：

1)納米金的制備：利用檸檬酸鈉還原法制備出粒徑13～20nm的納米金顆粒

2)巰基化的dna1、dna2分別與納米金經(jīng)鹽老化方法連接形成aunps-dna1顆粒和aunps-dna2顆粒；

3)將aunps-dna1顆粒、aunps-dna2顆粒和linker雜交形成藍(lán)色的適配體納米金交聯(lián)復(fù)合物；

4)將得到的適配體納米金交聯(lián)復(fù)合物離心，去除上清；沉淀重懸后得到重懸液；

5)向得到的重懸液中加入待檢液，用加等量水作對照，孵育；

6)觀察待檢液加入后重懸液的顏色變化，若待檢液中含有tnf-α，tnf-α特異性結(jié)合linker上的適配體，破壞納米金交聯(lián)復(fù)合物，納米金由團(tuán)聚狀態(tài)變?yōu)榉稚顟B(tài)，重懸液由藍(lán)色變?yōu)榧t色；同時用紫外可見分光光度計測定其全波長。

所述納米金的制備為：將氯金酸邊攪拌邊加熱至沸騰，然后加入檸檬酸三鈉水溶液，溶液由藍(lán)轉(zhuǎn)為紅色后持續(xù)加熱2～8min，冷卻后得到納米金溶液。

所述dna1、dna2在與納米金結(jié)合前，先將其溶于滅菌超純水中；dna1、dna2的濃度為0.1-1mm。

所述的linker的濃度為10-100μm；雜交條件為室溫反應(yīng)1小時，4℃過夜。

所述的dna1、dna2和linker的比例為1～10：1～10：1～10；

所述的重懸液含有100-300mmnacl和30mmtris-acetate；重懸液的ph為7～8；所述的待檢液中tnf-α為溶解狀態(tài)。

所述的孵育條件為室溫孵育1h；全波長掃描時的波長為400-900nm。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果：

本發(fā)明提供的基于適配體納米金交聯(lián)復(fù)合物的tnf-α檢測試紙條及方法，利用基于核酸適配體和納米金交聯(lián)復(fù)合物比色檢測tnf-α，基于靶標(biāo)特異性，優(yōu)選出核酸適配體，核酸適配體無需標(biāo)記，無需使用大型的儀器設(shè)備，克服了適配體需要標(biāo)記而導(dǎo)致成本提高和電化學(xué)操作相對復(fù)雜的不足，降低了檢測成本。

本發(fā)明提供的基于適配體納米金交聯(lián)復(fù)合物的tnf-α檢測試紙條及方法，選擇性和特異性好，這是由核酸適配體本身的特點和結(jié)構(gòu)決定的，在篩選適配體的過程中加入tnf-α，用selex篩選方法，選出能與tnf-α特異性結(jié)合而不與其他物質(zhì)發(fā)生特異性反應(yīng)的核酸適配體；

本發(fā)明提供的基于適配體納米金交聯(lián)復(fù)合物的tnf-α檢測試劑盒，基于ad進(jìn)程中伴隨的腦內(nèi)神經(jīng)炎癥反應(yīng)的發(fā)生，ad早期患者血清中tnf-α水平顯著升高，可用于ad早期檢測或其他炎癥相關(guān)疾病的快速診斷，具有簡便、快速、可靠性高等優(yōu)點。

附圖說明

圖1為nupack模擬分析dna1、dna2和linker交聯(lián)分析圖；通過模擬分析，這三條單鏈雜交形成雙鏈時所釋放出的自由能為-52.11kcal/mol，可以看出這三條單鏈可以形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)；

圖2為本發(fā)明的檢測原理示意圖，小球為分散狀態(tài)的納米金顆粒，為dna1、dna2、巰基連接的aunps-dna1和aunps-dna2通過linker可以雜交形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的復(fù)合物，溶液由紅色變?yōu)樗{(lán)色；引入tnf-α后，藍(lán)色復(fù)合物的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)破壞，復(fù)合物分離成為aunps-dna1和aunps-dna2，納米金呈現(xiàn)分散狀態(tài)，溶液顯示紅色。

圖3為適配體納米金交聯(lián)復(fù)合物交聯(lián)前后的對比圖，單分散狀態(tài)的納米金粒徑在10～20nm左右，溶液呈現(xiàn)紅色，當(dāng)其通過適配體和納米金表面的dna1、dna2交聯(lián)后，溶液顆粒變大，呈現(xiàn)藍(lán)紫色。

圖4為適配體納米金交聯(lián)復(fù)合物交聯(lián)前后的全波長掃描圖，分散狀態(tài)的納米金最大吸收峰在520nm左右，當(dāng)納米金團(tuán)聚后，溶液會發(fā)生紅移現(xiàn)象。

具體實施方式

下面結(jié)合具體的實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，所述是對本發(fā)明的解釋而不是限定。

本發(fā)明提供的基于適配體納米金交聯(lián)復(fù)合物的tnf-α檢測試紙條及方法，利用核酸適配體和納米金交聯(lián)復(fù)合物比色檢測tnf-α，基于核酸適配體和納米金交聯(lián)復(fù)合物來進(jìn)行的，下面分別對其進(jìn)行說明。

關(guān)于核酸適配體：

適配體是在體外通過selex過程人工篩選出來的一類和靶分子有著高度的特異性親和能力的短鏈寡核苷酸序列，就像抗原-抗體結(jié)合一樣，靶分子可以和它對應(yīng)的適配體特異性地結(jié)合。

selex技術(shù)即指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment，selex)，利用分子生物學(xué)的技術(shù)，構(gòu)建人工合成的單鏈隨機(jī)寡核苷酸文庫，將寡核苷酸文庫和靶分子相互作用，保留結(jié)合的寡核苷酸配基，經(jīng)反復(fù)擴(kuò)增、篩選數(shù)個循環(huán)，即可使與該靶分子特異性結(jié)合的寡核苷酸序列得到富集，利用該技術(shù)可以從隨機(jī)單鏈核酸序列庫中篩選出特異性與靶物質(zhì)高度親和的適配體。

dna1和dna2首先需與linker的對應(yīng)區(qū)域互補，并通過linker連接后形成線性分子；同時，dna1、dna2自身以及之間不形成穩(wěn)定的互補結(jié)構(gòu)；linker設(shè)計時除考慮與dna1和dna2互補外，還考慮互補序列自身結(jié)構(gòu)對適配體構(gòu)象的影響，避免獨自形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)等，影響對靶分子的識別。

具體的設(shè)計結(jié)果如表1所示，其中序列1為tnf-α適配體序列，序列2為dna1序列，序列3為dna2序列，序列4為linker序列。

序列表1

參見圖1，圖1為nupack模擬分析dna1、dna2和linker交聯(lián)分析圖，通過軟件模擬分析，這三條單鏈雜交形成雙鏈時所釋放出的自由能為-52.11kcal/mol，可以看出這三條單鏈可以形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)。

參見圖2，紅色小球為分散狀態(tài)的納米金顆粒，為dna1，為dna2，巰基連接的aunps-dna1和aunps-dna2通過linker可以雜交形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的復(fù)合物，溶液由紅色變?yōu)樗{(lán)色；引入tnf-α后，藍(lán)色復(fù)合物的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)破壞，復(fù)合物分離成為aunps-dna1和aunps-dna2，納米金呈現(xiàn)分散狀態(tài)，溶液顯示紅色。

具體的，本發(fā)明所提供的dna1、dna2、linker均由上海生工生物工程有限公司合成。

下面給出具體的檢測方法：

(1)納米金的制備：利用檸檬酸鈉還原法制備出粒徑13～20nm的納米金備用；

(2)巰基化的dna1、dna2分別與納米金經(jīng)鹽老化方法連接形成顆粒1(aunps-dna1)和顆粒2(aunps-dna2)；所述dna在和納米金結(jié)合前，先將1od的dna溶解于60μl滅菌超純水中，其中，dna1、dna2的濃度為0.1-1mm；具體的，dna1、dna2的濃度為0.5mm；

(3)aunps-dna1、aunps-dna2和linker雜交形成藍(lán)色的適配體納米金交聯(lián)復(fù)合物；其中，雜交條件為室溫反應(yīng)1小時，4℃過夜；linker的濃度為10-100μm；

(4)將上一步驟中得到的適配體納米金交聯(lián)復(fù)合物離心，去除上清；離心條件為11600g，10min；dna1、dna2和linker的比例為1～10：1～10：1～10；

(5)沉淀用buffer重懸，得到重懸液；重懸液含有100-300mmnacl、30mmtris-acetate；重懸液的ph為7～8；

(6)向上一步驟中得到的重懸液中加入tnf-α，用加等量水作對照，孵育；孵育條件為室溫，1h；所述的tnf-α溶解于200μl滅菌超純水中，得到0.25mg/ml母液。

(7)觀察顏色變化，加入tnf-α后溶液會由藍(lán)色變?yōu)榧t色或者紫紅色；同時用紫外可見分光光度計測定其400-900nm的全波長，觀察樣品最大吸收峰的波長，單分散狀態(tài)的納米金最大吸收峰在520nm處，當(dāng)在linker的作用下發(fā)生團(tuán)聚時，最大吸收峰的波長會紅移至某一大于520nm的波長處(本發(fā)明中紅移至550nm)，當(dāng)加入tnf-α后，最大吸收峰會藍(lán)移至520nm左右，通過一系列濃度梯度的tnf-α標(biāo)品的a520/a550可以做出隨tnf-α濃度變化的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

上述方法中，tnf-α可以特異性結(jié)合其適配體，破壞適配體納米金交聯(lián)復(fù)合物，納米金由團(tuán)聚狀態(tài)變?yōu)榉稚顟B(tài)，溶液由藍(lán)色變?yōu)榧t色，檢測過程無需復(fù)雜的儀器和專業(yè)的操作人員，顯色迅速，在室溫下就可以進(jìn)行，具有良好的靈敏性和特異性。

檢測結(jié)果表明，本發(fā)明的靈敏度檢測可達(dá)tnf-α190nm；檢測速度：室溫孵育1h后測定結(jié)果。

本發(fā)明的檢測以定性為主，可進(jìn)行半定量：在190～600nm濃度范圍內(nèi)，通過酶標(biāo)儀測量結(jié)果可進(jìn)行半定量。

進(jìn)一步的，所述納米金溶液的制備方法為：取50.0ml0.01％的氯金酸于100ml燒瓶中，在磁力加熱攪拌器上加熱至沸騰，加入1.0～5.0ml1％檸檬酸三鈉水溶液，溶液由藍(lán)轉(zhuǎn)為紅色后持續(xù)加熱5min，即得所述納米金溶液。

本發(fā)明的技術(shù)方案是基于以下原理實現(xiàn)的：dna1、dna2和linker是互補的單鏈核酸，在一定條件下，這三條單鏈可以雜交形成雙鏈；linker中含tnf-α適配體序列，可與tnf-α特異性結(jié)合。巰基連接的aunps-dna1和aunps-dna2通過linker可以雜交形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的復(fù)合物，溶液由紅色變?yōu)樗{(lán)色；檢測時，無tnf-α，復(fù)合物不會發(fā)生變化，溶液仍為藍(lán)色；引入tnf-α后，藍(lán)色復(fù)合物的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)破壞，復(fù)合物分離成為aunps-dna1和aunps-dna2，納米金呈現(xiàn)分散狀態(tài)，溶液顯示紅色。

參見圖3所示的，適配體納米金交聯(lián)復(fù)合物交聯(lián)前后的全波長掃描圖，分散狀態(tài)的納米金最大吸收峰在520nm左右，當(dāng)納米金團(tuán)聚后，溶液會發(fā)生紅移現(xiàn)象。

圖4為適配體納米金交聯(lián)復(fù)合物交聯(lián)前后的全波長掃描圖，分散狀態(tài)的納米金最大吸收峰在520nm左右，當(dāng)納米金團(tuán)聚后，溶液會發(fā)生紅移現(xiàn)象；全波長掃描用以判斷檢測前后的具體狀態(tài)的變化，輔助定性。

結(jié)果表明：酶標(biāo)儀測定全波長表明，和0μl的tnf-α溶液對比，最大吸收峰從555nm移至530nm處，納米金團(tuán)聚體顆粒變小，溶液的藍(lán)色增加。

以上給出的實施例是實現(xiàn)本發(fā)明較優(yōu)的例子，本發(fā)明不限于上述實施例。本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明技術(shù)方案的技術(shù)特征所做出的任何非本質(zhì)的添加、替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。