專利名稱：聚乙二醇修飾的降纖酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種降纖酶，具體地說是一種聚乙二醇修飾的降纖酶。
背景技術(shù)：
蛋白質(zhì)藥物臨床應(yīng)用的安全性和有效性一直是人們關(guān)注和研究的熱點(diǎn)。蛋白質(zhì)藥物由于穩(wěn)定性差，血漿清楚率高，體內(nèi)半衰期短，易產(chǎn)生抗原抗體反應(yīng)，因此在臨床治療中受到很大的限制。因此研究人員采用了各種藥物傳遞技術(shù)來提高蛋白質(zhì)藥物的療效，包括采用不同的給藥途徑(如口服，鼻腔給藥，透皮吸收)，不同的載體(如微球，脂質(zhì)體，紅細(xì)胞，單克隆抗體)，不同高分子材料(如多糖)，不同藥物釋放技術(shù)(如控釋緩釋技術(shù)，前藥)。而目前在藥物傳遞技術(shù)中研究最為廣泛的就是聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)修飾技術(shù)，這是近三十年來發(fā)展起來的一種用于改進(jìn)蛋白質(zhì)類藥物體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)性質(zhì)的新技術(shù)，它將活化的聚乙二醇分子鍵合到蛋白質(zhì)分子表面上，影響蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，最終導(dǎo)致蛋白質(zhì)各種生物化學(xué)性質(zhì)的改變。研究證實(shí)，通過共價(jià)鍵用PEG來修飾蛋白質(zhì)表面的氨基酸殘基可以有效降低蛋白質(zhì)的免疫原性，提高血漿半衰期，減少給藥次數(shù)。
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本發(fā)明所涉及的蛋白質(zhì)是從江浙尖吻蝮蛇蛇毒或東北白眉蝮蛇蛇毒中提純的降纖酶(Defibrase，Df)，它屬蛇毒類凝血酶((thrombin-like enzymes，TLE))中的一種，同生理凝血酶(Thrombin，Tb)相似，同時(shí)具有精氨酸酯酶活性，但不激活血漿中的XIII因子，因此進(jìn)入人體后僅形成松散的、可溶性的纖維蛋白凝膠，易從血液中清除，易被吞噬細(xì)胞系統(tǒng)或纖溶酶作用分解，從而達(dá)到使紅細(xì)胞和血小板解聚、降低血液粘度和去纖、溶栓的作用。
降纖酶在國內(nèi)臨床上有廣泛的應(yīng)用，其去纖、抗凝、降脂、擴(kuò)張血管和改善微循環(huán)等治療功能得到了充分的肯定，但是在使用過程中同樣具有蛋白質(zhì)藥物所共有的特點(diǎn)，如具有免疫原性，半衰期短，穩(wěn)定性差等。從1997年到現(xiàn)在，已有多篇文章報(bào)告降纖酶的臨床不良反應(yīng)，其中最常見的不良反應(yīng)是引起過敏反應(yīng)。(鄭萬剛.降纖酶不良反應(yīng)12例分析.蛇志[J].1998，(3)32.童延清，童世清，陳旭.降纖酶致蕁麻疹1例.卒中與神經(jīng)疾病[J].2002，9(1)5.王峰，張華，李成建.去纖酶的不良反應(yīng).醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)[J].2002，21136.)為此，如何獲得低免疫原性的降纖酶，改善該蛋白酶的藥物動(dòng)力學(xué)以提高耐受性及給藥便利程度，一直是研究的重點(diǎn)。
目前大多數(shù)的研究是將多肽分子中的氨基作為修飾位點(diǎn)。制備蛋白質(zhì)和聚乙二醇結(jié)合物的最常用的方法是利用PEG活化后形成的親電子基團(tuán)和蛋白質(zhì)上的氨基進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)后可以在一個(gè)球蛋白分子上共價(jià)連接數(shù)個(gè)聚合物長(zhǎng)鏈，聚合物長(zhǎng)鏈的數(shù)目取決于蛋白質(zhì)分子上可供結(jié)合的位點(diǎn)數(shù)(自由氨基和其他親電子基團(tuán))、修飾劑的化學(xué)性質(zhì)，修飾劑的過量比例及反應(yīng)條件。PEG的衍生物有芳化試劑(含氯化芳基基團(tuán)，可以與蛋白質(zhì)上的親核基團(tuán)反應(yīng))、酰化試劑(含?；c蛋白質(zhì)通過?；I相連)或烷化試劑(與蛋白質(zhì)上的氨基形成仲氨連接)。上述方法還存在活化的PEG對(duì)產(chǎn)物的多位點(diǎn)修飾，修飾產(chǎn)物的生物活性保留較低和修飾后產(chǎn)物難于純化的不足，不能滿足降纖酶在臨床應(yīng)用方面的要求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題是公開一種聚乙二醇修飾的降纖酶及其制備方法，以滿足降纖酶在臨床應(yīng)用方面的需求。
本發(fā)明的具體的技術(shù)方案如下一種聚乙二醇修飾的降纖酶，其結(jié)構(gòu)通式如下 其中m為單甲氧基(monomethoxy)的縮寫，n＝0～3；R代表去除一個(gè)氨基(NH2)的降纖酶分子。
本發(fā)明的特點(diǎn)是在降纖酶上連接聚乙二醇鏈。
所說的降纖酶包括從蛇毒中提取或用基因工程手段制備的重組降纖酶；所說的聚乙二醇鏈的分子量為2000～100000。
本發(fā)明的聚乙二醇修飾的降纖酶的制備方法包括如下步驟在降纖酶溶液中，加入磷酸氫二鈉溶液，調(diào)節(jié)其pH值在4.5-9.5，然后加入活化的聚乙二醇或其衍生物，反應(yīng)溫度為4-40℃，反應(yīng)時(shí)間為5～120分鐘，反應(yīng)中活化的聚乙二醇或其衍生物與降纖酶的摩爾比為0.1～100，將反應(yīng)混合液采用凝膠過濾色譜柱進(jìn)行色譜分離，流動(dòng)相為含NaCl的磷酸鹽緩沖液，即可得聚乙二醇修飾的降纖酶。
制備反應(yīng)按下式進(jìn)行
其中R-NH2為降纖酶。mPEG為CH3O-(CH2CH2O)n-CH2CH2OH其中m＝單甲氧基(monomethoxy)的縮寫，n＝44～2200；R代表代表去除一個(gè)氨基(NH2)的降纖酶分子。
所說的活化的聚乙二醇或其衍生物是本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所公知的，并且描述于例如Robert MJ等，先進(jìn)的藥物傳遞評(píng)論(Advanced DrugDilivery Reviews)(2002；54459-476)。最優(yōu)選地，使用丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯或丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯，可采用美國NektarTherapeutics公司生產(chǎn)的產(chǎn)品。
本發(fā)明的聚乙二醇修飾的降纖酶可用于制備高效低毒的抗凝溶栓藥物。
本發(fā)明的聚乙二醇修飾的降纖酶能夠基本保持降纖酶的生物活性，同時(shí)它比未修飾的降纖酶有較低的免疫原性和更好的穩(wěn)定性，因此作為抗凝溶栓藥物，它比未修飾的降纖酶有更大的優(yōu)越性。本發(fā)明的聚乙二醇修飾的降纖酶的制備方法，簡(jiǎn)單易行。


圖1是SDS-PAGE電泳檢測(cè)圖。
圖2是Superdex-75TM75 HR 10/30柱分析聚乙二醇修飾的降纖酶的層析圖。
圖3是Superdex-75TM75 HR 10/30柱分析降纖酶的層析圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯5000(mPEG-SPA-5000)對(duì)降纖酶修飾條件的選擇反應(yīng)溫度的選擇取0.8mg/ml的降纖酶溶液2ml，加2ml磷酸鹽緩沖液使溶液的pH值為6.5，再加入mPEG-SPA-5000固體0.12mg，溶解，混勻，各取0.3ml置于4支帶塞試管中，然后分別置于4℃、10℃、25℃和37℃反應(yīng)30min后終止反應(yīng)。比較修飾率，確定修飾條件。結(jié)果表明在這些溫度下都能得到聚乙二醇修飾的降纖酶，其中25℃的修飾率最高。
反應(yīng)時(shí)間的選擇取0.8mg/ml的降纖酶溶液2ml，加2ml磷酸鹽緩沖液使溶液的pH值為6.5，再加入mPEG-SPA-5000固體0.12mg，溶解，混勻，各取0.3ml置于4支帶塞試管中，然后于25℃分別反應(yīng)5、15、30、60、120min后終止反應(yīng)。比較修飾率，確定修飾條件。結(jié)果表明在這些條件下都能得到聚乙二醇修飾的降纖酶，其中30min后的修飾率沒有明顯提高。
mPEG-SPA-5000同降纖酶的摩爾比的選擇反應(yīng)溫度的選擇取0.8mg/ml的降纖酶溶液2ml，加2ml磷酸鹽緩沖液使溶液的pH值為6.5，各取0.3ml置于4支帶塞試管中，然后分別加入mPEG-SPA-5000固體0.0012、0.012、0.12、1.2mg(相當(dāng)于mPEG-SPA-5000同降纖酶的摩爾比在0.1～100)，溶解，混勻，反應(yīng)30min后終止反應(yīng)。比較修飾率，確定修飾條件。結(jié)果表明在這些條件下都能得到聚乙二醇修飾的降纖酶，當(dāng)mPEG-SPA-5000同降纖酶的摩爾比在10時(shí)修飾率已達(dá)到最高，進(jìn)一步增加mPEG-SPA-5000的量修飾率也沒有明顯地增加。
反應(yīng)pH值的選擇各取0.1mg/ml的降纖酶溶液2ml，置于6支帶塞試管中，分別加2ml不同pH值的磷酸鹽緩沖液使溶液的pH值為4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、9.5，再加入mPEG-SPA-5000固體0.20mg，溶解，混勻，于25℃反應(yīng)30min后終止反應(yīng)。比較修飾率，確定修飾條件。結(jié)果表明在這些條件都能得到聚乙二醇修飾的降纖酶，其中pH值為6.5時(shí)修飾率最高。
實(shí)施例2修飾產(chǎn)物的分離純化與鑒定取1.1mg/ml的降纖酶溶液2ml，加磷酸鹽緩沖液使溶液的pH值為6.5，再加入mPEG-SPA-5000固體8.5mg，溶解，混勻，于25℃反應(yīng)30min，加入3g甘氨酸固體終止反應(yīng)。
取上述反應(yīng)液，用截流分子量為10000的超濾膜濃縮至2ml，上柱分離。色譜條件如下層析填料Superdex 75 pre grade柱規(guī)格1.6×60cm流動(dòng)相0.05M Na2HPO4-NaH2PO4，pH7.0流速0.5ml/min檢測(cè)波長(zhǎng)215nm收集每管3ml結(jié)果得到兩個(gè)洗脫峰，分別為聚乙二醇修飾的降纖酶和降纖酶。
將上述兩個(gè)洗脫峰適當(dāng)透析、濃縮，采用SDS-PAGE電泳檢測(cè)，分離膠10％，濃縮膠5％。結(jié)果見圖1，圖中，1為蛋白質(zhì)分子量的標(biāo)樣；2為降纖酶；3為聚乙二醇修飾的降纖酶，其表明各組分呈單一條帶。同時(shí)，用凝膠過濾分析柱(Superdex-75TM75 HR 10/30)檢測(cè)，各組分也為單一峰，結(jié)果見圖2-1和圖2-2。因此，確定得到了單一組分的聚乙二醇修飾的降纖酶。
實(shí)施例3 修飾產(chǎn)物的生物活性(比活力)測(cè)定(國家食品藥品監(jiān)督管理局國家藥品標(biāo)準(zhǔn)降纖酶)用降纖酶標(biāo)準(zhǔn)品作為對(duì)照，測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品和樣品凝固纖維蛋白原的初凝時(shí)間，然后計(jì)算樣品的比活力(U/mg)。結(jié)果見表1。
表1降纖酶及聚乙二醇修飾的降纖酶的生物活性樣品比活力(U/mg)降纖酶 2500聚乙二醇修飾的降纖酶1500
實(shí)施例4聚乙二醇修飾的降纖酶穩(wěn)定性的研究熱穩(wěn)定性取降纖酶和聚乙二醇修飾的降纖酶(在液體狀態(tài)，無任何保護(hù)劑)，分別置于25℃、37℃、45℃、60℃條件下，定時(shí)取樣測(cè)定其生物活性。結(jié)果表明，降纖酶在60℃下15min內(nèi)活性不變，而聚乙二醇修飾的降纖酶在90min內(nèi)活性不變。在25℃時(shí)降纖酶5天內(nèi)活性不變，而聚乙二醇修飾的降纖酶在15天內(nèi)活性不變。因此，可以初步認(rèn)為聚乙二醇修飾的降纖酶可以明顯增加降纖酶的熱穩(wěn)定性。
酶穩(wěn)定性取0.1％胰蛋白酶溶液(pH7.8)2.7ml，分別加入0.3ml降纖酶和聚乙二醇修飾的降纖酶樣品，37℃水浴，于0、0.5、1、2、4h取樣0.3ml，測(cè)定樣品的生物活性。結(jié)果表明降纖酶在0.5h內(nèi)活性迅速降到原來的30％，而聚乙二醇修飾的降纖酶在1h內(nèi)活性僅降到原來的40％。因此，聚乙二醇修飾的降纖酶能明顯增加降纖酶抵抗胰蛋白酶水解的能力。
實(shí)施例5聚乙二醇修飾的降纖酶對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的去纖維蛋白作用的研究對(duì)兔和大鼠兩種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分別由靜脈注射降纖酶和聚乙二醇修飾的降纖酶，在注藥前及注藥后1、3、6、12、24、36、48h靜脈采血，測(cè)量纖維蛋白原值。兩種降纖酶均為對(duì)兔靜脈一次給藥，劑量為1.25U/kg；對(duì)大鼠也為一次給藥，劑量為8U/kg。
兔給藥前纖維蛋白原的濃度為226±16.25mg/dl，給藥降纖酶后3h降至110±15.23mg/dl(降至原來的50.9％)，給藥后12h開始回升，24h回升至正常；給藥聚乙二醇修飾的降纖酶后3h降至108±16.72mg/dl(降至原來的47.8％)，給藥后24h開始回升，36h回升至正常。
大鼠給藥前纖維蛋白原的濃度為290±18.35mg/dl，給藥降纖酶后3h降至102±17.62mg/dl(降至原來的35.2％)，給藥后12h開始回升，24h回升至正常；給藥聚乙二醇修飾的降纖酶后3h降至91±16.26mg/dl(降至原來的31.4％)，給藥后24h開始回升，36h回升至正常。
以上結(jié)果表明聚乙二醇修飾的降纖酶在體內(nèi)不但保留了降纖酶降低纖維蛋白原濃度的生理作用，而且能延長(zhǎng)其作用時(shí)間。因此，預(yù)期在人體內(nèi)聚乙二醇修飾的降纖酶會(huì)有更好的溶栓抗凝的效果。
實(shí)施例6聚乙二醇修飾的降纖酶對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物免疫原性的研究以家兔作為制備抗血清的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，采用福氏佐劑免疫法，并分別以降纖酶和聚乙二醇修飾的降纖酶作為抗原，劑量均為5U/kg/次，每周1次，共5次。
分別以降纖酶和聚乙二醇修飾的降纖酶作為抗原，用雙向免疫擴(kuò)散法測(cè)定它們各自抗血清的效價(jià)，測(cè)定結(jié)果為降纖酶組抗血清的效價(jià)為1∶16；聚乙二醇修飾的降纖酶組抗血清的效價(jià)測(cè)不出。
分別以降纖酶和聚乙二醇修飾的降纖酶作為抗原，然后用降纖酶組的抗血清作為第一抗體，再以辣根過氧化酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG作為第二抗體，用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定它們各自的免疫原性，測(cè)定結(jié)果為降纖酶組為陽性，聚乙二醇修飾的降纖酶組為陰性。
以上結(jié)果表明，同降纖酶比較，聚乙二醇修飾的降纖酶的免疫原性顯著降低。
實(shí)施例7用丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯2000(mPEG-SPA-2000)、丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯10000(mPEG-SPA-10000)、丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯20000(mPEG-SPA-20000)或丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯30000(mPEG-SPA-30000)代替實(shí)施例1中的mPEG-SPA-5000，得到了實(shí)施例中1-6相似的結(jié)果。
實(shí)施例8用丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯2000(mPEG-SBA-2000)、丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯10000(mPEG-SBA-10000)、丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯20000(mPEG-SBA-20000)或丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯30000(mPEG-SBA-30000)代替實(shí)施例1中的mPEG-SPA-5000，得到了實(shí)施例中1-6相似的結(jié)果。
權(quán)利要求
1.一種聚乙二醇修飾的降纖酶，其特征在于，結(jié)構(gòu)通式如下 其中m為單甲氧基(monomethoxy)的縮寫，n＝0～3；R代表去除一個(gè)氨基(NH2)的降纖酶分子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的聚乙二醇修飾的降纖酶的制備方法，其特征在于，在降纖酶溶液中，加入磷酸氫二鈉溶液，調(diào)節(jié)其pH值在4.5-9.5，然后加入活化的聚乙二醇或其衍生物，反應(yīng)溫度為4-40℃，反應(yīng)時(shí)間為5～120分鐘，然后采用凝膠過濾色譜柱進(jìn)行色譜分離，即可得聚乙二醇修飾的降纖酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所說的降纖酶包括從蛇毒中提取或用基因工程手段制備的重組降纖酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所說的聚乙二醇鏈的分子量為2000～100000。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，反應(yīng)中活化的聚乙二醇或其衍生物與降纖酶的摩爾比為0.1～100。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，采用凝膠過濾色譜柱進(jìn)行色譜分離，流動(dòng)相為含NaCl的磷酸鹽緩沖液。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，活化的聚乙二醇或其衍生物為丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯或丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的聚乙二醇修飾的降纖酶的應(yīng)用，其特征在于，用于制備高效低毒的抗凝溶栓藥物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種聚乙二醇修飾的降纖酶及其制備方法。在降纖酶溶液中，加入磷酸氫二鈉溶液，然后加入活化的聚乙二醇或其衍生物進(jìn)行反應(yīng)，將反應(yīng)混合液采用凝膠過濾色譜柱進(jìn)行色譜分離，即可得聚乙二醇修飾的降纖酶。發(fā)明的聚乙二醇修飾的降纖酶能夠基本保持降纖酶的生物活性，同時(shí)它比未修飾的降纖酶有較低的免疫原性和更好的穩(wěn)定性，因此作為抗凝溶栓藥物，它比未修飾的降纖酶有更大的優(yōu)越性。本發(fā)明的聚乙二醇修飾的降纖酶的制備方法，簡(jiǎn)單易行。所述聚乙二醇修飾的降纖酶，其結(jié)構(gòu)通式如上。
文檔編號(hào)A61K38/43GK1563367SQ200410017779
公開日2005年1月12日 申請(qǐng)日期2004年4月20日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月20日
發(fā)明者馮軍, 趙文杰 申請(qǐng)人:上海醫(yī)藥工業(yè)研究院