專利名稱：一種聚乙二醇化艾塞那肽衍生物及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種化合物，具體地說(shuō)涉及聚乙二醇化艾塞那肽衍生物及其用途，SP在艾塞那肽C-端上引入I個(gè)半胱氨酸分子，以HiPEG-馬來(lái)酰亞胺作為聚乙二醇化試劑，通過(guò)艾塞那肽C端引入的半胱氨酸分子的巰基加成到mPEG-馬來(lái)酰亞胺的雙鍵上實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)的定點(diǎn)修飾，從而使修飾后的艾塞那肽化合物在血液循環(huán)中清除率減慢，提高穩(wěn)定性，半衰期延長(zhǎng)。屬于多肽藥物制備和應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
胰高血糖素樣肽-I (Glucogan like Peptide-1,GLP_1)作用于胰島β細(xì)胞胰高血糖素樣肽_1受體(Glucogan like Peptide-1 Receptor, GLP-1R),促進(jìn)胰島素基因的轉(zhuǎn)錄、胰島素的合成和分泌，并可刺激胰島β細(xì)胞的增殖和分化，抑制胰島β細(xì)胞凋亡，增加胰島β細(xì)胞數(shù)量。研究證明，GLP-I可通過(guò)多種機(jī)制明顯地改善2型糖尿病動(dòng)物模型或患 者的血糖情況，這為2型糖尿病的治療提供了一個(gè)非常好的前景。艾塞那肽(Exenatide,Exendin_4)是從生長(zhǎng)在美國(guó)西南部和墨西哥沙漠的希拉毒蜥(Gila monster)唾液發(fā)現(xiàn)的一種多肽物質(zhì)，氨基酸序列的53%與人類血液中調(diào)控血糖的GLP-I同源。艾塞那肽分子量為4186. 6道爾頓，其氨基酸序列如下
H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH20研究發(fā)現(xiàn)，Exenatide與GLP-I功能相似，具有促進(jìn)胰腺分泌胰島素，促進(jìn)機(jī)體對(duì)血糖的利用、減少肝糖原分解、通過(guò)減緩胃腸道的蠕動(dòng)使食物的吸收減慢，從而降低食物中的葡萄糖在血液內(nèi)出現(xiàn)的高峰，達(dá)到降低血糖作用。此外，它還有通過(guò)作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)控制食欲等多種生理功能。Exenatide不被二肽基肽酶-IV降解,其穩(wěn)定性明顯高于GLP-1。2001年,Neidigh等通過(guò)核磁共振得到了 Exenatide的空間結(jié)構(gòu)，其N端是一段不規(guī)則卷曲，第疒28氨基酸殘基構(gòu)成α -螺旋，Glul6對(duì)穩(wěn)定α -螺旋起重要作用，Leu21-Pro38殘基形成了一個(gè)緊密的結(jié)構(gòu)將Trp25包裹其中，形成了一個(gè)特殊的Trp籠(cage)。其C端氨基酸殘基形成不規(guī)則的親水結(jié)構(gòu)。在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，Exenatide與GLP-I具有相同的生理功能，它們作用于同一受體，即β受體家族的G偶聯(lián)蛋白。Exenatide與受體結(jié)合分為3個(gè)區(qū)域Ν端與受體的胞外環(huán)結(jié)合；中間-螺旋與受體的胞外N端結(jié)合,這是受體與Exenatide的主要結(jié)合部位；C端也可與受體N端結(jié)合。Exenatide與受體的親和力比GLP-I的更高。GLP-I僅有31個(gè)氨基酸殘基，比Exenatide少8個(gè),缺少C端結(jié)合部位,這可能是其與受體親和力低的原因，但也可能存在強(qiáng)化Exend in-4與受體結(jié)合的特殊因子。如果Exenatide的N端8個(gè)氨基酸殘基缺失，雖然仍能與受體結(jié)合，但喪失了生理功能。由于Exenatide與GLP-I的同源氨基酸主要集中在N端，推測(cè)Exenatide的N端與受體結(jié)合可激活依賴G蛋白受體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，從而行使其生理功能。與GLP-I相比，Exenatide的C端更長(zhǎng)，不易被肽鏈內(nèi)切酶降解；N端第二個(gè)氨基酸為甘氨酸，不會(huì)被二肽基肽酶-IV分解，血漿半衰期更長(zhǎng)。美國(guó)Lilly公司和Amylin公司研制的Exenatide (Byetta )，2005年獲得了美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于治療2型糖尿病全新類型的藥物。在生理?xiàng)l件下，Byettae和GLP-I作用相似，它刺激胰島素分泌的作用受血糖濃度的調(diào)節(jié)，血糖濃度降低時(shí)其刺激作用減輕或消失，因而不會(huì)出現(xiàn)胰島素持續(xù)分泌而發(fā)生低血糖的現(xiàn)象，并有明顯減少2型糖尿病肥胖患者體重的作用。然而，Exenatide在人體內(nèi)的半衰期為數(shù)小時(shí)，患者還是需要每天注射Byetta 兩次，使用上仍然相當(dāng)不方便。為此，研究和開(kāi)發(fā)穩(wěn)定，半衰期長(zhǎng)，生物相容性好并且容易吸收的蛋白質(zhì)、多肽藥物體系一直是科學(xué)工作者們?cè)噲D解決的一個(gè)迫切課題。
對(duì)于改善蛋白和多肽藥物的臨床作用時(shí)間和療效,聚乙二醇修飾技術(shù)被公認(rèn)為最為有效的方法之一。蛋白質(zhì)或多肽的聚乙二醇(polyethyleneglycol,簡(jiǎn)稱PEG)修飾即PEG化(pegylation)，是將活化的PEG通過(guò)化學(xué)方法以共價(jià)鍵偶聯(lián)到蛋白質(zhì)或多肽分子上。聚乙二醇是由乙二醇單體聚合而成的以羥基結(jié)尾的線性或分支狀聚醚高分子化合物，是一種兩親性聚合物，既可溶于水，又可溶于絕大多數(shù)的有機(jī)溶劑，且具有生物相容性好、無(wú)毒、免疫原性低等特點(diǎn)，可通過(guò)腎排出體外，在體內(nèi)不會(huì)蓄積。PEG修飾能賦予蛋白質(zhì)和多肽類多種優(yōu)良性能，具體表現(xiàn)為循環(huán)半衰期延長(zhǎng)、免疫原性降低或消失、毒副作用減少以及物理、化學(xué)和生物穩(wěn)定性增強(qiáng)等，在很大程度上擴(kuò)寬了蛋白質(zhì)和多肽的的應(yīng)用范圍。蛋白質(zhì)PEG修飾后，相對(duì)分子質(zhì)量增大，當(dāng)修飾后的蛋白質(zhì)的分子量達(dá)到或超出腎小球?yàn)V過(guò)閾值時(shí)，蛋白質(zhì)隨血液循環(huán)進(jìn)入腎臟后就可以逃避腎小球的濾過(guò)作用；由于PEG的屏蔽效應(yīng)，使得修飾后的蛋白質(zhì)或多肽不易受到各種蛋白酶的攻擊，降解速率明顯降低，穩(wěn)定性提高，因而可以在血液循環(huán)中停留更長(zhǎng)的時(shí)間；PEG在溶液中呈無(wú)規(guī)則卷曲，包裹于藥物表面，能掩蓋蛋白質(zhì)表面的抗原決定簇，使得蛋白質(zhì)不能與各種細(xì)胞表面受體結(jié)合，不被機(jī)體的免疫系統(tǒng)識(shí)別，避免了相應(yīng)抗體的產(chǎn)生，降低了蛋白質(zhì)的免疫原性；PEG與蛋白質(zhì)偶聯(lián)后能將其優(yōu)良的理化性質(zhì)賦予蛋白質(zhì)，如能改善蛋白質(zhì)的生物分布和溶解性能。普通的聚乙二醇分子兩端各有一個(gè)羥基，若一端以甲基封閉則得到單甲氧基聚乙二醇(monomethoxypolyethyleneglycol,簡(jiǎn)稱mPEG),在多肽和蛋白質(zhì)的聚乙二醇化修飾研究中應(yīng)用最多的是mPEG的衍生物。先在mPEG的末端引入羧基、氨基或其他活性基團(tuán)，或者制備經(jīng)mPEG修飾的氨基酸衍生物，再利用固相或液相法將其偶聯(lián)到肽序列中去，實(shí)現(xiàn)對(duì)多肽的N端、C端及某些氨基酸側(cè)鏈的聚乙二醇化修飾。第一個(gè)聚乙二醇化蛋白質(zhì)制品一聚乙二醇化牛血清蛋白于1977年問(wèn)世后，聚乙二醇即被用于修飾多種蛋白質(zhì)。聚乙二醇是經(jīng)美國(guó)食品藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)的極少數(shù)能作為體內(nèi)注射藥用的合成聚合物之一。1991年第一種用PEG修飾的蛋白質(zhì)類藥物PEG-腺苷脫氨基酶(PEG-ADA)被FDA批準(zhǔn)上市，用于治療一種嚴(yán)重的兒童免疫缺陷癥。此后PEG修飾藥物技術(shù)發(fā)展迅速，而且很快得到了廣泛應(yīng)用，目前已有多種PEG修飾的蛋白質(zhì)和多肽用于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。如PEG-干擾素(PEG-α -2a、PEG_a -2b)、PEG_重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(PEG-GSF)、PEG-天冬酰胺酶(PEG-L-asparaginase)。多肽與蛋白質(zhì)在理化性質(zhì)上具有許多相似之處，肽類化合物的聚乙二醇化修飾研究晚于蛋白質(zhì)的相關(guān)研究。近年來(lái)關(guān)于肽類化合物在聚乙二醇化定點(diǎn)修飾方面較蛋白質(zhì)類物質(zhì)更易實(shí)現(xiàn)。傳統(tǒng)的PEG修飾多為隨機(jī)修飾(小分子量PEG修飾，<20000道爾頓)，PEG交聯(lián)的基團(tuán)是賴氨酸的α-氨基和ε_(tái)氨基，交聯(lián)度不均一，沒(méi)有特異性，PEG修飾后的蛋白產(chǎn)物是混合物，使修飾蛋白的分離純化和鑒定很困難，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。如果稱傳統(tǒng)PEG修飾為非定點(diǎn)修飾，那么現(xiàn)在的高分子量PEG修飾(> 20000道爾頓)則向定點(diǎn)修飾(特異性修飾)方向發(fā)展。定點(diǎn)修飾能夠選擇特定基團(tuán)進(jìn)行修飾，避免或減少對(duì)活性位點(diǎn)的修飾，并且可較好地控制修飾程度，提供活性保存率，有利于產(chǎn)品質(zhì)量控制和工業(yè)化生產(chǎn)。蛋白質(zhì)或多肽的定點(diǎn)PEG修飾主要從以下三方面著手一是蛋白質(zhì)和多肽方面，如定點(diǎn)突變、可逆性位點(diǎn)定向保護(hù)、非天然氨基酸的引入等；二是PEG的活化形式，如修飾氨基的PEG-醛和修飾巰基的PEG-乙烯基砜等；三是反應(yīng)條件的控制，如pH值、金屬離子或酶的催化。半胱氨酸在蛋白質(zhì)和多肽中出現(xiàn)幾率和數(shù)量很少，利用具有巰基反應(yīng)活性的PEG衍生物就可以實(shí)現(xiàn)蛋白定點(diǎn)修飾。目前可用于巰基修飾的mPEGs包括mPEG-馬來(lái)酰亞胺(mPEG-MAL)、mPEG-鄰吡啶-二硫醚、mPEG-乙烯基砜及mPEG-碘乙酰胺等，其中mPEG-MAL制備簡(jiǎn)單，可通過(guò)商品化試劑買到，應(yīng)用較多。Vanwetsswinkel等用定點(diǎn)突變法在蛋白質(zhì)中引入半胱氨酸，以mPEG-MAL作為聚乙二醇化試劑，通過(guò)蛋白質(zhì)上的巰基加成到mPEG-MAL的 雙鍵上實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)的定點(diǎn)修飾。但缺點(diǎn)是半胱氨酸的巰基通常處于蛋白的活性中心，修飾后會(huì)使蛋白活性損失較大。如果在肽鏈中引入半胱氨酸，也可以實(shí)現(xiàn)此類反應(yīng)。這一方法不但能夠?qū)崿F(xiàn)高度選擇性修飾，而且能夠減少蛋白生物活性的喪失，并降低免疫原性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種聚乙二醇化艾塞那肽衍生物，該衍生物的結(jié)構(gòu)為在艾塞那肽的C端上引入I個(gè)半胱氨酸分子，以mPEG-馬來(lái)酰亞胺作為聚乙二醇化試劑，通過(guò)艾塞那肽C端引入的半胱氨酸分子的巰基加成到mPEG-MAL的雙鍵上實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)的定點(diǎn)修飾。本發(fā)明的另一目的是公開(kāi)聚乙二醇化艾塞那肽衍生物用途。本發(fā)明通過(guò)體外活性評(píng)價(jià)觀察到聚乙二醇化艾塞那肽衍生物具有較好的生物學(xué)活性；體內(nèi)活性評(píng)價(jià)觀察到聚乙二醇化艾塞那肽衍生物具有良好降血糖作用，且與艾塞那肽相比，半衰期延長(zhǎng)。聚乙二醇化艾塞那肽衍生物與一種或多種賦形劑結(jié)合制成適用于人的劑型，如用甘露醇作賦形劑制成注射劑，經(jīng)皮下給藥治療單服二甲雙胍或磺脲類藥或聯(lián)用二甲雙胍和磺酰脲類藥后均未達(dá)到充分控制血糖的2型糖尿病患者。本發(fā)明的技術(shù)方案一種聚乙二醇化艾塞那肽衍生物，簡(jiǎn)稱Exendin-4-Cys-PEG，在艾塞那肽分子的非活性區(qū)C端引入I個(gè)半胱氨酸，并偶聯(lián)馬來(lái)酰胺基聚乙二醇。所述艾塞那肽分子的非活性區(qū)C端引入I個(gè)半胱氨酸的多肽(Exendin-4-Cys)，其氨基酸序列為SEQ ID NO: I
H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Xaa4tl-NH2,其中 Xaa4tl 為 Cys,或(Gly) n_Cys, n=l_8。即在艾塞那肽C末端中引入I個(gè)半胱氨酸，以單甲氧基聚乙二醇-馬來(lái)酰亞胺mPEG-MAL作為特性聚乙二醇化試劑，通過(guò)艾塞那肽C端引入的半胱氨酸分子的巰基加成到mPEG-MAL的雙鍵上實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)的定點(diǎn)修飾。本發(fā)明所用的定點(diǎn)修飾劑mPEG-MAL平均分子量為2000(Γ40000道爾頓。所述聚乙二醇化艾塞那肽衍生物Exendin-4-Cys-PEG的制備方法,步驟為(1)合成以分子量為20，000-40,000道爾頓的單甲氧基聚乙二醇-馬來(lái)酰亞胺和長(zhǎng)度40 氨基酸的 Exendin-4-Cys 為原料，精密稱定 Exendin-4-Cys IOmg (O. 002mmol),溶解于pH7. 0、5mL 50 mM的磷酸鹽緩沖液中，精密稱取單甲氧基聚乙二醇-馬來(lái)酰亞胺mPEG-MAL，控制mPEG-MAL:Exendin-4_Cys 摩爾比=1. 3:1,將mPEG-MAL加入 Exendin-4-Cys 溶液中，在室溫條件下反應(yīng)90min,得Exendin-4-Cys-PEG粗品溶液；
(2)純化將Exendin-4-Cys-PEG粗品溶液選擇MacroCapSP為純化介質(zhì)，柱體積為IOmL,以pH4. 0、20mM NaAc緩沖液為緩沖液A，pH4. O、含IM NaCl的20mM NaAc緩沖液為緩沖液B ;先以緩沖液A平衡層析柱，樣品以5倍的緩沖液A稀釋后上樣；上樣完成后，用緩沖液A清洗5個(gè)柱體積；緩沖液B梯度洗脫梯度為15%B + 85%A，25%B + 75%A，80%B + 20%A,流速4mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)220nm檢測(cè)；層析圖之峰I為穿透峰，峰2為15%B洗脫峰，峰3為25%B洗脫峰，峰4為80%B洗脫峰；
(3)SDS-PAGE電泳檢定按照常規(guī)蛋白電泳的方法進(jìn)行電泳，15%分離膠，5%濃縮膠，上樣量為10 μ g，染色方法按以下方法操作12%三氯乙酸固定2h ；200mL染色液和50mL甲醇 的混合液染色16-24h，所述染色液490mL含2% H3PO4溶液中加入50g (NH4) 2S04,0. 5g考馬斯亮藍(lán) G250，定容至 500mL ；pH6. 5,0. lmol/L Tris-H3PO4 漂洗 2min，SDS-PAGE 電泳檢定結(jié)果，顯示層析圖中洗脫峰25%B+75%A為目的物峰，且目的物條帶為Exendin-4-Cys-PEG單一條帶。所述聚乙二醇化艾塞那肽衍生物Exendin-4-Cys-PEG的應(yīng)用，其特征在于用于制備治療2-型糖尿病的藥物。普通的PEG修飾多為隨機(jī)修飾，PEG交聯(lián)的基團(tuán)是賴氨酸的α -氨基和ε -氨基，艾塞那肽化合物本身含有兩個(gè)賴氨酸，但是交聯(lián)度不均一，沒(méi)有特異性。PEG修飾后的蛋白產(chǎn)物是混合物，使修飾蛋白的分離純化和鑒定很困難，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。因此在艾塞那肽C端引入I個(gè)半胱氨酸分子，選取特異性高的定點(diǎn)修飾劑mPEG-MAL能夠?qū)崿F(xiàn)高度選擇性修飾。同時(shí)，在艾塞那肽C端引入半胱氨酸分子，沒(méi)有對(duì)艾塞那肽化合物原先的氨基酸序列進(jìn)行突變，對(duì)艾塞那肽化合物的藥理、毒理作用不構(gòu)成影響，而且能夠減少蛋白生物活性的喪失，并降低免疫原性。本發(fā)明在艾塞那肽C端僅僅只引入I個(gè)半胱氨酸分子。試驗(yàn)結(jié)果證明，C端連接兩個(gè)或兩個(gè)以上的半胱氨酸分子，則交聯(lián)度不均一，沒(méi)有特異性，PEG修飾后的多肽產(chǎn)物是混合物，使修飾蛋白的分離純化和鑒定很困難，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明的聚二乙醇化艾塞那肽衍生物(Exendin-4-Cys-PEG)在血液循環(huán)中清除率減慢，半衰期延長(zhǎng)，可用于制備降低血糖、減少攝食、降低胃腸排空、增加β細(xì)胞數(shù)量或者降低胃腸蠕動(dòng)有關(guān)疾病的治療藥物。生物材料樣品保藏一株人胚腎293細(xì)胞株GLP-1R/HEK293，已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，簡(jiǎn)稱CGMCCJia :北京中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)CGMCC No. 5909，保藏日期2012年3月22日。


圖I聚乙二醇化艾塞那肽衍生物的純化層析圖結(jié)果。I、穿透峰，2、10%Β洗脫峰，
3、25%Β洗脫峰，4、80%Β洗脫峰。
圖2聚乙二醇化艾塞那肽衍生物的SDS-PAGE電泳檢定結(jié)果。I、蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，
2、上樣，3、穿透樣品，4、10%B洗脫樣品，5、25%B洗脫樣品，6、80%B洗脫樣品。圖3 聚乙二醇化艾塞那肽衍生物的生物活性檢測(cè)結(jié)果。(a)艾塞那肽Exendin-4, (b)艾塞那肽衍生物Exendin-4-Cys, (c)聚乙二醇化艾塞那肽衍生物Exendin-4-Cys_PEG20kD, (d)聚乙二醇化艾塞那妝衍生物 Exendin-4-Cys_PEG30kD, (e)聚乙二醇化艾塞那肽衍生物Exendin-4-Cys-PEG40kD。圖4 C57BL/6J小鼠單次注射聚乙二醇化艾塞那肽衍生物的糖耐量試驗(yàn)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例代表本發(fā)明的說(shuō)明性實(shí)施方案，但本發(fā)明不受這些實(shí)施例的限制。實(shí)施例中所用的艾塞那肽衍生物(Exendin-4-Cys)為上海楚肽生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，平均 分子量為20，000,30, 000,40, 000道爾頓的mPEG-馬來(lái)酰亞胺為上海景宇生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，MacroCap SP填料為GE公司產(chǎn)品。實(shí)施例I聚乙二醇化艾塞那肽衍生物的制備
艾塞那肽化合物多肽與PEG-馬來(lái)酰亞胺是通過(guò)硫醚鍵共價(jià)聚乙二醇衍生物的反應(yīng)產(chǎn)生的。以分子量為40，000道爾頓的單甲氧基聚乙二醇-馬來(lái)酰亞胺為例，精密稱定長(zhǎng)度40氨基酸的Exendin-4-Cys 10mg(0. 002mmol),溶解于pH7. 0、5mL 50 mM的憐酸鹽緩沖液中。聚乙二醇馬來(lái)酰亞胺121mg (mPEG-MAL:Exendin-4-Cys摩爾比=1. 3:1)加入艾塞那肽衍生物溶液中。反應(yīng)在室溫條件下進(jìn)行90min,得Exendin-4-Cys-PEG粗品溶液。聚乙二醇化艾塞那肽采用離子交換等方法純化，電泳或高效液相檢定。實(shí)施例2聚乙二醇化艾塞那肽衍生物的純化與檢定
以平均分子量40，000道爾頓的單甲氧基聚乙二醇-馬來(lái)酰亞胺連接艾塞那肽化合物為例，選擇MacroCap SP (GE)為純化介質(zhì)，柱體積為10mL。以20mM NaAc緩沖液pH4. O為緩沖液A，20mM NaAc緩沖液pH4. O含IM NaCl為緩沖液B。先以緩沖液A平衡層析柱，樣品以5倍的緩沖液A稀釋后上樣。上樣完成后，用緩沖液A清洗5個(gè)柱體積。緩沖液B梯度洗脫，梯度為 15%B + 85%A, 25%B + 75%A, 80%B + 20%A，流速4mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)220nm檢測(cè)。具體層析圖見(jiàn)圖I。層析圖可見(jiàn)峰I為穿透峰，峰2為15%B + 85%A洗脫峰，峰3為25%B + 75%A洗脫峰，峰4為80%B + 20%A洗脫峰。SDS-PAGE電泳檢定按照常規(guī)蛋白電泳的方法進(jìn)行電泳，15%分離膠，5%濃縮膠，上樣量為 ο μ g。染色方法按以下方法操作12%三氯乙酸固定2h ;200mL染色液和50mL甲醇的混合液染色16-24h (染色液490mL含2% H3PO4溶液中加入50g (NH4) 2S04,0. 5g考馬斯亮藍(lán) G250，定容至 500mL) ;0. lmol/L Tris-H3PO4 (pH6. 5)漂洗 2 min。聚二乙醇化艾塞那肽衍生物的SDS-PAGE電泳檢定結(jié)果(圖2)顯示層析圖中洗脫峰25%B+75%A為目的物峰，且目的物條帶為Exendin-4-Cys-PEG單一條帶。實(shí)施例3聚乙二醇化艾塞那肽衍生物的體外生物活性研究
以平均分子量為20，000、30，000、或40，000道爾頓的單甲氧基聚乙二醇-馬來(lái)酰亞胺連接Exendin-4-Cys為例，體外生物學(xué)活性采用細(xì)胞報(bào)告系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)定。細(xì)胞株為能穩(wěn)定表達(dá)GLP-I受體的HEK-293細(xì)胞株(GLP-1R/HEK293)，該細(xì)胞株已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)CGMCC No. 5909 (專利申請(qǐng)?zhí)?01210117317. 4，發(fā)明名稱一種用于測(cè)定GLP-I及其功能類似物生物活性的細(xì)胞株及其應(yīng)用)。測(cè)定過(guò)程如下首先將細(xì)胞株以含低濃度血清的DMEM/F12培養(yǎng)基稀釋，按30000細(xì)胞/100 μ L/孔分別鋪板于96孔板。37°C、5%C02條件下培養(yǎng)24h。第二天撤去所用培養(yǎng)基，再加入不含血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)夜(15h左右)。移棄培養(yǎng)基，對(duì)測(cè)試蛋白和標(biāo)準(zhǔn)樣進(jìn)行10倍比稀釋(稀釋液不含血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，含有cAMP抑制劑IOOnM IBMX和IOOnM Ro20-1724)。37°C >5% CO2條件下培養(yǎng)lh。用cAMP試劑檢測(cè)盒(購(gòu)于AB公司，貨號(hào)T1502)測(cè)定上述聚乙 二醇化艾塞那肽衍生物刺激GLP-1R/HEK293細(xì)胞后胞內(nèi)的cAMP含量。通常情況下保證稀釋后測(cè)試蛋白在O. 00001ng/mL 1000ng/mL之間。具體結(jié)果見(jiàn)表I和圖3。表I樣品對(duì)GLP-1R/HEK293細(xì)胞株的刺激作用
權(quán)利要求
1.一種聚乙二醇化艾塞那肽衍生物，簡(jiǎn)稱Exendin-4-Cys-PEG，其特征在于在艾塞那肽分子的非活性區(qū)C端引入I個(gè)半胱氨酸，并偶聯(lián)馬來(lái)酰胺基聚乙二醇。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的聚乙二醇化艾塞那肽衍生物，其特征在于所述艾塞那肽分子的非活性區(qū)C端引入I個(gè)半胱氨酸的多肽Exendin-4-Cys具有氨基酸序列為SEQ ID NO:IH-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Xaa4Q-NH2 ;其中 Xaa4tl 為 Cys,或(Gly)n-Cys, n=l_8。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的聚乙二醇化艾塞那肽衍生物，其特征在于，使用單甲氧基聚乙二醇-馬來(lái)酰亞胺作為特性聚乙二醇化試劑，通過(guò)艾塞那肽多肽C端引入的半胱氨酸分子上的巰基與單甲氧基聚乙二醇-馬來(lái)酰亞胺的雙鍵加成反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)多肽化合物的定點(diǎn)修飾。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的聚乙二醇化艾塞那肽衍生物，其特征在于，單甲氧基聚乙二醇-馬來(lái)酰亞胺的分子量為20，000-40, 000道爾頓。
5.權(quán)利要求I所述聚乙二醇化艾塞那肽衍生物Exendin-4-Cys-PEG的制備方法,其特征在于步驟為 (1)合成以分子量為20，000-40,000道爾頓的單甲氧基聚乙二醇-馬來(lái)酰亞胺和長(zhǎng)度40 氨基酸的 Exendin-4-Cys 為原料，精密稱定 Exendin-4-Cys O. 002mmol,溶解于 pH7. O、5mL 50 mM的磷酸鹽緩沖液中，精密稱取單甲氧基聚乙二醇-馬來(lái)酰亞胺mPEG-MAL，控制mPEG-MAL:Exendin-4-Cys 摩爾比=1. 3:1,將 mPEG-MAL 加入 Exendin-4-Cys 溶液中，在室溫條件下反應(yīng)90min,得Exendin-4-Cys-PEG粗品溶液； (2)純化將Exendin-4-Cys-PEG粗品溶液選擇MacroCapSP為純化介質(zhì)，柱體積為IOmL,以pH4. 0、20mM NaAc緩沖液為緩沖液A，pH4. O、含IM NaCl的20mM NaAc緩沖液為緩沖液B ;先以緩沖液A平衡層析柱，樣品以5倍的緩沖液A稀釋后上樣；上樣完成后，用緩沖液A清洗5個(gè)柱體積；緩沖液B梯度洗脫梯度為15%B + 85%A，25%B + 75%A，80%B + 20%A,流速4mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)220nm檢測(cè)；層析圖之峰I為穿透峰，峰2為15%B洗脫峰，峰3為25%B洗脫峰，峰4為80%B洗脫峰； (3)SDS-PAGE電泳檢定按照常規(guī)蛋白電泳的方法進(jìn)行電泳，15%分離膠，5%濃縮膠，上樣量為10 μ g，染色方法按以下方法操作12%三氯乙酸固定2h ;200mL染色液和50mL甲醇的混合液染色16-24h，所述染色液490mL含2% H3PO4溶液中加入50g (NH4) 2S04,0. 5g考馬斯亮藍(lán) G250，定容至 500mL ；pH6. 5,0. lmol/L Tris-H3PO4 漂洗 2min，SDS-PAGE 電泳檢定結(jié)果，顯示層析圖中洗脫峰25%B+75%A為目的物峰，且目的物條帶為Exendin-4-Cys-PEG單一條帶。
6.權(quán)利要求I所述聚乙二醇化艾塞那肽衍生物Exendin-4-Cys-PEG的應(yīng)用，其特征在于用于制備治療2-型糖尿病的藥物。
全文摘要
一種聚乙二醇化艾塞那肽衍生物(Exendin-4-Cys-PEG)及其用途，屬于多肽藥物制備和應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的聚乙二醇化艾塞那肽衍生物為在艾塞那肽的C-端引入1個(gè)半胱氨酸，并偶聯(lián)馬來(lái)酰胺基聚乙二醇，形成聚乙二醇化艾塞那肽衍生物。本發(fā)明的聚乙二醇化艾塞那肽衍生物在血液循環(huán)中清除率減慢，半衰期延長(zhǎng)，可用于制備降低血糖、減少攝食、降低胃腸排空、增加β細(xì)胞數(shù)量或者降低胃腸蠕動(dòng)有關(guān)疾病的治療藥物。
文檔編號(hào)C07K1/16GK102827270SQ201210338139
公開(kāi)日2012年12月19日 申請(qǐng)日期2012年9月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月13日
發(fā)明者楊建良, 陸晶, 孟如杰, 莊少穎 申請(qǐng)人:無(wú)錫和邦生物科技有限公司