專利名稱：用于評價內(nèi)臟痛知覺的動物模型的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過球囊導(dǎo)管和具有經(jīng)皮遙測能力的可植入傳感器模塊的方法測量內(nèi)臟痛的動物模型。安裝根據(jù)本發(fā)明的可植入傳感器模塊接受試驗動物內(nèi)臟運動和擬情感(pseudoaffective)應(yīng)答。具體地，本發(fā)明提供一種非人動物模型，其中球囊導(dǎo)管是可植入的球囊導(dǎo)管，優(yōu)選在試驗動物的十二指腸內(nèi)植入，安裝可植入傳感器接受來自至少一個雙極性電極對和至少一個血液導(dǎo)管的輸入信號。具體說來，安裝這種雙極性電極接受內(nèi)臟運動應(yīng)答，特別是腹部肌肉的肌電圖，安裝血液導(dǎo)管記錄腹主動脈的平均動脈壓和心率。
因此，本發(fā)明的另一個目的是提供一種制備所述動物的方法以及在制備所述動物的方法中使用的包括球囊導(dǎo)管和可植入傳感器模塊的試劑盒。
背景技術(shù)：
國際疼痛研究協(xié)會以下列方式定義疼痛“疼痛是一種與急性或潛在的組織損傷聯(lián)系的，或者以這樣的損傷來描述的不愉快的感覺和情緒體驗(Mertz 1979)”。然而，問題是不能在動物上直接測量疼痛，只能通過檢查它們對有疼痛反映的刺激的應(yīng)答來估計。絕大多數(shù)的痛覺模型是基于對疼痛的行為應(yīng)答，范圍從最基本的運動神經(jīng)元反射到更綜合性的行為(逃避、回避)。腹部疼痛的另一個問題是這種疼痛的特點是定位模糊，腹部痙攣(內(nèi)臟運動應(yīng)答)和自主(擬情感)應(yīng)答，包括在很難以可計量和可復(fù)現(xiàn)方式評分的呼吸、心率(HR)以及平均動脈壓(MAP)方面的改變。
一直最常使用疼痛扭動模型來研究動物的內(nèi)臟痛(Reichert，Daughters等，2001)。在這個模型中，將疼痛溶液腹膜內(nèi)注射到清醒的動物體內(nèi)，對扭動的數(shù)量(軀干的伸展、后肢向背部凹形拱起的伸展過度以及腹部收縮)進行評分。由于倫理道德的約束，不能在單個動物上進行反復(fù)評估，因此使評估對止痛劑產(chǎn)生耐受性的困難更加嚴重了。此外，這種模型缺乏可逃避性(escapability)和特異性，而且不與人類病理學(xué)相關(guān)。機械誘導(dǎo)的內(nèi)臟刺激(中空內(nèi)臟的膨脹)重現(xiàn)天然的內(nèi)臟刺激，其更接近模擬人的內(nèi)臟痛，并且發(fā)現(xiàn)在動物中是討厭的(回避/扭動行為)(Gebhart和Ness 1991；Ness，Randich等.1991；Ozaki，Bielefeldt等.2002)。這些內(nèi)臟痛模型產(chǎn)生可以計量的擬情感反射，其包括清醒動物中MAP和HR的增加(Danzebrink和Gebhart 1990；Danzebrink和Gebhart 1991)，盡管這些可通過某些麻醉劑被減弱或者甚至是被逆轉(zhuǎn)(Ness和Gebhart 1988；Diop，Riviere等.1994；Ness 1999)。
Colburn和他的同事(1989)通過對疼痛的行為應(yīng)答如發(fā)抖(shaking)、探查(exploring)、梳理腹部(grooming abdominalregion)，伸展或不動進行評分，以及通過對腹部收縮的發(fā)生進行評分，研究了在清醒狀態(tài)下自由活動的大鼠對固定體積的十二指腸膨脹的內(nèi)臟運動應(yīng)答。他們證明了膨脹體積和腹部痙攣頻率之間的分級關(guān)系。此外，它們證明通過以劑量依賴方式給予嗎啡，可抑制對十二指腸膨脹的內(nèi)臟運動應(yīng)答。
為了獲得更可計量和可再現(xiàn)的模型來研究對機械膨脹的內(nèi)臟運動應(yīng)答，幾個研究小組正在記錄腹部肌電圖(EMG)。通常，將電極絲插入到腹部或頸部肌肉內(nèi)以及將電極絲置于動物的背部，使其能與記錄器或計算機相連記錄EMG。這些研究是在清醒受約束的大鼠(Friedrich和Gebhart 2000；Ozaki，Bielefeldt，Sengupta，和Gebhart 2002；Bradesi，Eutamene等.2002)或輕度麻醉的大鼠(Ness，Lewis-Sides等.2001)中進行的，防止由于大鼠的撕咬導(dǎo)致球囊導(dǎo)管的外置部分和電極導(dǎo)線的損害，和/或?qū)⒂捎陬~外的身體動作(如探查(exploration)、理毛(exploration))引起的背景EMG噪聲減少到最小。然而，在這些研究中對內(nèi)臟痛的內(nèi)臟運動和擬情感應(yīng)答都受到存在的麻醉(Ness和Gebhart 1988；Ness 1999)和/或(約束/處理)脅迫(Coutinho，Plotsky等.2002)的影響。
因此，令人感興趣的是使用腹部痛覺動物模型來分析新的藥物化合物的止痛性能，其中通過下列標準測定這種內(nèi)臟痛模型的有用性(Ness和Gebhart 1990；Gebhart和Sengupta 1996)(1)刺激應(yīng)當盡可能多的再現(xiàn)天然刺激并且必須產(chǎn)生人類的疼痛，(2)刺激必須誘導(dǎo)動物的厭惡行為(逃避、離開、回避)，(3)刺激必須引起與人類對內(nèi)臟痛的那些應(yīng)答一致的擬情感應(yīng)答，(4)對刺激的應(yīng)答必須可被防感受傷害的處理控制，(5)應(yīng)答應(yīng)當是可以計量的和可再現(xiàn)的，以及(6)模型應(yīng)當盡可能是非侵害性的，并且能夠在麻醉的動物身上使用。
上面所描述所有模型僅僅部分滿足這些要求。因此本發(fā)明的目的是提供一種研究內(nèi)臟痛的新的動物模型，特別是它能用于止痛性能的急性和慢性分析并且允許在清醒，自由活動的動物身上同時和連續(xù)測量內(nèi)臟運動(腹部EMGs)和擬情感應(yīng)答(MAP和HR)。
本發(fā)明解決了這個問題，通過使用在十二指腸中長期植入的球囊導(dǎo)管傳送十二指腸的膨脹，通過長期植入的與雙極性電極對和血液導(dǎo)管連接的發(fā)送器，同時和連續(xù)分別遙測內(nèi)臟運動(腹部EMGs)和擬情感應(yīng)答(MAP和HR)。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及通過球囊導(dǎo)管和具有經(jīng)皮遙測能力的可植入傳感器模塊的方法測量內(nèi)臟痛的動物模型?？芍踩雮鞲衅髂軌?qū)⑴c內(nèi)臟痛相關(guān)的數(shù)據(jù)傳送到在體外的儀器中，該儀器能連續(xù)監(jiān)控受試者的狀態(tài)，并且能夠同時或循序地接受大量輸入信號，優(yōu)選來自雙極性電極對和血液導(dǎo)管的輸入信號。這樣，這種模型為在非人動物上連續(xù)和同時測量對內(nèi)臟痛的內(nèi)臟運動和擬情感應(yīng)答提供了適當?shù)墓ぞ摺?br> 在另一個實施方案中，本發(fā)明提供在制備測量內(nèi)臟痛動物模型的方法中使用的試劑盒，包括有球囊導(dǎo)管、可植入的遙測傳感器模塊、雙極性電極對和血液導(dǎo)管。本發(fā)明的另一個目的是提供在上述動物模型中使用的球囊導(dǎo)管。
本發(fā)明的另一個目的是提供制備用于測量內(nèi)臟痛的動物模型的方法，包括在所述動物的十二指腸內(nèi)植入球囊導(dǎo)管；以及在所述動物的腹腔內(nèi)植入遙測傳感器模塊，其中安裝所述的遙測傳感器模塊接受至少一個雙極性電極對和至少一個血液導(dǎo)管的輸入信號。
附圖的簡要說明

圖1.非膨脹和膨脹狀態(tài)下硅氧烷球囊導(dǎo)管的胃十二指腸內(nèi)部分的示意圖。
圖2.由膨脹體積(ml)階梯性增加誘導(dǎo)的總活動(計數(shù)/分鐘)的變化。顯示每個膨脹期間觀察到的行為。bas＝基線，post＝膨脹期后。數(shù)據(jù)以均數(shù)±SEM表示。
圖3.誘導(dǎo)不舒適行為、疼痛行為、基線EMG信號增加和降低的膨脹的閾體積(ml)。數(shù)據(jù)以均數(shù)±SEM表示。
圖4.階梯膨脹(0.1到0.6ml)之前、之間和之后原始的、過濾后的以及矯正后的單個EMG波形的記錄。
圖5.由膨脹體積(ml)階梯性增加所誘導(dǎo)的EMG的最大幅度(MAX)和曲線下面積(AUC)對基線(＝100％)的百分率的變化。數(shù)據(jù)以均數(shù)±SEM表示。
圖6.由膨脹體積(ml)階梯性增加所誘導(dǎo)的平均動脈壓(MAP，以mm Hg表示)和心率(HR，以心跳/分表示)的變化。顯示每個膨脹期間觀察到的行為。bas＝基線，post＝膨脹期后。數(shù)據(jù)以均數(shù)±SEM表示。
圖7.階梯膨脹模型期間，平均動脈壓(MAP，以mm Hg表示)和MAX(mV)或AUC(mV×秒)之間的相關(guān)性。
圖8.由膨脹體積(ml)階段性增加所誘導(dǎo)的總活動(計數(shù)/分)的變化。顯示在每個膨脹期間觀察到的行為。bas＝基線，int＝未膨脹間期。數(shù)據(jù)以均數(shù)±SEM表示。
圖9.階段性膨脹(0.1、0.3和0.5ml)之前、之間和之后原始的、過濾后的以及矯正后的單個EMG波形的記錄。
圖10.由膨脹體積(ml)階段性增加所誘導(dǎo)的EMG的最大幅度(MAX)和曲線下面積(AUC)對基線(＝100％)的百分率的變化。數(shù)據(jù)以均數(shù)±SEM表示。
圖11.由膨脹體積(ml)階段性增加所誘導(dǎo)的平均動脈壓(MAP，以mm Hg表示)和心率(HR，以心跳/分表示)的變化。顯示在每個膨脹期間觀察到的行為。bas＝基線，int＝未膨脹間期。數(shù)據(jù)以均數(shù)±SEM表示。
圖12.階段性膨脹模型期間，平均動脈壓(MAP，以mm Hg表示)和MAX(mV)或AUC(mV×秒)之間的相關(guān)性。
圖13.用嗎啡(0.3，1.5和3mg/kg)預(yù)處理后，由膨脹體積(ml)階段性增加所誘導(dǎo)的EMG的最大幅度(MAX)和曲線下面積(AUC)對基線(＝100％)的百分率的變化。數(shù)據(jù)以均數(shù)±SEM表示。
圖14.置于開放場地中小平臺上的膨脹(0.6ml)和未膨脹的大鼠9次試驗中下臺(step-down)的潛伏期(秒)。數(shù)據(jù)以均數(shù)±SEM表示。
詳細描述本發(fā)明涉及通過球囊導(dǎo)管和具有經(jīng)皮遙測能力的可植入傳感器模塊的方法測量內(nèi)臟痛的動物模型?？芍踩雮鞲衅髂軌?qū)⑴c內(nèi)臟痛相關(guān)的數(shù)據(jù)傳送到在體外的儀器，該儀器能連續(xù)監(jiān)控受試者的狀態(tài)，并且能夠同時或循序地接受大量輸入信號，優(yōu)選來自雙極性電極對和血液導(dǎo)管的輸入信號。這樣，這種模型為在非人動物上連續(xù)和同時測量對內(nèi)臟痛的內(nèi)臟運動和擬情感應(yīng)答提供了適當?shù)墓ぞ?。具體地，本發(fā)明涉及用于測量內(nèi)臟痛的非人動物模型，其包括球囊導(dǎo)管和具有經(jīng)皮遙測能力的可植入傳感器模塊。優(yōu)選地，非人動物，其中在所述動物中長期植入球囊導(dǎo)管和傳感器模塊。優(yōu)選地，在十二指腸內(nèi)植入球囊導(dǎo)管，將傳感器模塊連于雙極性電極對和血液導(dǎo)管上。
在本模型中使用的球囊導(dǎo)管是可植入的球囊導(dǎo)管，特點是該球囊導(dǎo)管由生物相容性材料如聚對亞二甲苯基的無免疫原性聚合材料、聚乙烯、天然的或合成橡膠、硅氧烷或其它芳族為基礎(chǔ)的部分構(gòu)成，其具有有效阻滯免疫原性試劑通過的多孔的膜部分。本發(fā)明的球囊導(dǎo)管由在一端用彈性材料(2)封閉的生物相容的管(1)構(gòu)成。為了改善將球囊導(dǎo)管引入到根據(jù)本發(fā)明方法的動物中，將彈性材料在鄰近管末端(4)的位置(3)處附著到生物相容的管上。在提高彈性材料的徑向擴展的進一步改進中，也將彈性材料附著在生物相容的管的末端(5)，所述的管末端是嚴格密閉的(6)。為了使球囊能在這最后的構(gòu)型中膨脹，從許多孔(7)可預(yù)知管末端遠離附著點(3)。根據(jù)本發(fā)明，球囊導(dǎo)管的另一個特點是其包括防止由于腸道的蠕動導(dǎo)致導(dǎo)管活動的固定裝置。所述的固定裝置位于鄰近管末端的部位，使管固定到動物的胃壁上。在一個優(yōu)選的實施方案中，固定裝置由兩個結(jié)節(jié)(8)構(gòu)成。
通過使用的試驗動物決定管的直徑和長度。由于在根據(jù)本發(fā)明的方法中，在試驗動物的十二指腸內(nèi)引入可植入的球囊導(dǎo)管，因此，管的長度應(yīng)當允許從所述動物的十二指腸，經(jīng)過胃壁到達易于固定的頭顱。例如，在大鼠中，管的長度應(yīng)當在15和50厘米之間，優(yōu)選在20和30厘米之間，外徑從2到2.5毫米。
本發(fā)明的另一個目的是提供由在一端用彈性材料(2)封閉的生物相容的管(1)構(gòu)成的球囊導(dǎo)管，其特點是彈性材料在鄰近管末端(4)的位置(3)處附著到生物相容的管上。在另一個實施方案中，彈性材料也附著到生物相容的管的末端(5)，所述的管末端是嚴格密閉(6)的，進一步包括遠離附著點(3)的許多孔(7)。在具體的實施方案中，球囊導(dǎo)管進一步包括位于鄰近管末端以使管固定到動物胃壁上的固定裝置。在優(yōu)選的實施方案中，固定裝置由兩個結(jié)節(jié)(8)構(gòu)成。
可在根據(jù)本發(fā)明的動物模型中使用的具有經(jīng)皮遙測能力的可植入感受器模塊在現(xiàn)有技術(shù)中是已知的。例如，有可獲得的起搏器，當被植入并與心臟連接時，其能通過附著到起搏器上的電極監(jiān)控心電(electrocardial)活動。電極的功能是作為電位傳感器，起搏器包括界面電路，其緩沖傳感器信號，使信號格式化，然后通過連于外部通訊模塊的雙向射頻(RF)通訊的途徑傳送格式化的信號。通過外部模塊監(jiān)控并加工遙測的信號。
此外，現(xiàn)有技術(shù)中已知能提供允許循序或同時測量至多8個單個參數(shù)的植入遙測裝置實現(xiàn)兩個或多個功能。在根據(jù)本發(fā)明的動物模型中，可植入的傳感器模塊能循序或同時接受大量輸入信號。在優(yōu)選的實施方案中傳感器模塊包括至少兩個輸入端口并且與至少一個雙極性電極對和至少一個血液導(dǎo)管相連。在更優(yōu)選的實施方案中，傳感器模塊是一種無線電遙測裝置，其與用于測量腹部肌肉肌電圖的雙極性電極對相連，并且與通過股動脈安裝的用于記錄腹主動脈的平均動脈壓和心率的血液導(dǎo)管相連。本領(lǐng)域技術(shù)人員將很容易地意識到，這里使用的可植入的傳感器模塊需要外部模塊來探測和將傳感器模塊的輸出信號解調(diào)成適合驅(qū)動輸出描計裝置的輸出信號。例如，用于記錄電流幅度對時間變化的記錄儀。
因此，本發(fā)明的目的是提供一種測量內(nèi)臟痛的系統(tǒng)，包括球囊導(dǎo)管、通過球囊導(dǎo)管的近端引入測定量膨脹介質(zhì)的裝置、具有經(jīng)皮遙測能力的可植入傳感器、以及能監(jiān)控和加工遙測信號的外部模塊。一種將球囊導(dǎo)管植入試驗動物的十二指腸內(nèi)以及安裝接受試驗動物的內(nèi)臟運動(EMG)和擬情感(MAP、HR)應(yīng)答的可植入傳感器的系統(tǒng)。在具體的實施方案中，該系統(tǒng)包括一種無線電遙測裝置，其與測量腹部肌肉肌電圖的雙極性電極對相連，并且與通過股動脈安裝的用于記錄腹主動脈平均動脈壓和心率的血液導(dǎo)管相連。在前述系統(tǒng)中使用的球囊導(dǎo)管典型地由在一端用彈性材料(2)封閉的生物相容的管(1)構(gòu)成，導(dǎo)管的特點是彈性材料在鄰近管末端(4)的位置(3)處附著到生物相容的管上。在另一個實施方案中，彈性材料也附著在生物相容的管末端(5)，并且所述的管末端是嚴格密閉(6)的，進一步包括遠離附著點(3)的許多孔(7)。在具體的實施方案中，球囊導(dǎo)管進一步包括位于鄰近管末端使管固定到動物胃壁上的固定裝置。在優(yōu)選的實施方案中，固定裝置由兩個結(jié)節(jié)(8)構(gòu)成。引入測定量膨脹介質(zhì)的裝置典型地包括包含液體注入泵的注射器，其在伺服系統(tǒng)或stepper馬達的控制下驅(qū)動，其中膨脹介質(zhì)典型地是無菌、相對無泡和實際上不能壓縮的液體，如生理鹽水。在本發(fā)明中將通過使用的試驗動物決定膨脹介質(zhì)的體積。例如，在大鼠中膨脹介質(zhì)的體積是在0.05-1.00ml的范圍內(nèi)，優(yōu)選在0.1-0.6ml的范圍內(nèi)。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供在制備測量內(nèi)臟痛動物模型的方法中使用的試劑盒，包括球囊導(dǎo)管、可植入遙測傳感器模塊、雙極性電極對和血液導(dǎo)管?？扇芜x地，進一步包括能監(jiān)控和加工遙測信號的外部模塊和/或引入測定量膨脹介質(zhì)的裝置。在具體的實施方案中，試劑盒包括根據(jù)本發(fā)明的球囊導(dǎo)管和能循序或同時接受大量輸入信號并且具有經(jīng)皮遙測能力的可植入遙測傳感器模塊。在優(yōu)選的實施方案中，傳感器模塊包括至少兩個輸入端口。
因此，本發(fā)明的另一個目的是提供制備測量內(nèi)臟痛動物模型的方法，包括在所述動物的十二指腸內(nèi)植入球囊導(dǎo)管；和在所述動物的腹腔內(nèi)植入遙測傳感器模塊，其中安裝所述的遙測傳感器模塊接受至少一個雙極性電極對和至少一個血液導(dǎo)管的輸入信號。一種制備根據(jù)本發(fā)明動物模型的方法，其中使用可植入球囊導(dǎo)管的固定裝置(8)將球囊導(dǎo)管固定到試驗動物的胃壁上。一種制備根據(jù)本發(fā)明動物模型的方法，其中將可植入球囊導(dǎo)管的生物相容的管(1)引導(dǎo)到易于固定的試驗動物的頭顱，優(yōu)選皮下進行。在優(yōu)選的實施方案中，將管末端固定到注射器連接器上，優(yōu)選可買到的90°環(huán)連接器。將注射器連接器固定到試驗動物的頭顱上，例如使用牙科水泥。一種制備根據(jù)本發(fā)明動物模型的方法，其中將雙極性電極對的電極縫合到腹部肌肉內(nèi)測量EMG。一種制備根據(jù)本發(fā)明動物模型的方法，其中將血液導(dǎo)管穿到腹主動脈內(nèi)，優(yōu)選通過股動脈。
通過參考下列實施例的詳細描述將更好地理解本發(fā)明，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將很容易地意識到這些實施例僅僅是本發(fā)明其后權(quán)利要求中更充分地描述的說明。另外，在整個本申請中引用了各種出版物。這里將這些出版物公開的內(nèi)容并入本申請中作為參考，更充分地描述本發(fā)明所涉及技術(shù)的狀態(tài)。
實施例材料和方法動物在實驗開始時，使用體重280-300克重的雄性純白化病Wistar大鼠(WU；Harlan，荷蘭)。在周圍恒溫(21±1℃)、恒定濕度(60±15％)以及恒定晝夜節(jié)律(光照從早7點到晚7點)條件下，將大鼠分別圈養(yǎng)在含有一層木屑的Macrolon單個通風(fēng)籠中(25×40×22厘米)。手術(shù)后，將動物在手術(shù)前的條件下單獨圈養(yǎng)。整個實驗中以易于獲得的方式提供食物(完全的實驗室食物)和水。
手術(shù)在大鼠十二指腸內(nèi)安置誘導(dǎo)十二指腸膨脹的球囊導(dǎo)管以及遙測發(fā)送器，研究腹部肌電圖(EMGs)、平均動脈壓(MAP)、心率(HR)和身體活動。手術(shù)在芬太尼/氟丁酰酮(fluanisone)(Hypnorm，JanssenPharmaceutica，Beerse，比利時；0.1ml/100g體重(BW)，肌肉內(nèi)注射)麻醉和鹽酸咪達唑侖(Dormicum，Hoffman-LaRoche，Mijdrecht，荷蘭；0.05ml，腹膜內(nèi)注射(ip))作為肌肉松弛藥的情況下進行。在注射肌肉松弛藥前，通過檢查大鼠足反射和角膜反射是否喪失檢驗芬太尼麻醉的止痛效果。正常似乎10分鐘后痛覺反應(yīng)全部喪失，然后注射肌肉松弛藥。手術(shù)在無菌層流櫥內(nèi)進行以將感染的風(fēng)險減少到最低。在腹前白線處作一個小的縱向切口。根據(jù)Colburn等.(1989)描述的方法，將自制的有一些改動的硅氧烷球囊導(dǎo)管(i.d.1.02mm/o.d.2mm)(見圖1)長期植入十二指腸內(nèi)。在胃壁上作一個插入導(dǎo)管的小切口(3mm)，引導(dǎo)導(dǎo)管進入十二指腸內(nèi)，直到球囊導(dǎo)管上的小結(jié)節(jié)恰好穿過胃壁。然后在兩個結(jié)節(jié)之間緊密縫合胃壁以固定導(dǎo)管。將球囊導(dǎo)管的另一端穿過皮下進入頭顱，固定到90°環(huán)連接器(Bilaney，Dusseldorf，德國)上。用牙科水泥將連接器固定到頭顱上(Dentimex BV，Zeist，荷蘭)。將由雙極性電極對和血液導(dǎo)管構(gòu)成的遙測發(fā)送器(TL11M2-C50-PXT，Data Sciences International，St.Paul，美國)長期植入大鼠的腹腔內(nèi)。將電極的非絕緣端(不銹鋼金屬絲螺旋；0.45mm、8mm)平行(5mm極間空間)縫合到腹部肌肉內(nèi)測量EMG，而將血液導(dǎo)管穿過股動脈進入腹主動脈內(nèi)記錄MAP和HR。手術(shù)后動物接受0.1mg/kg長效阿片制劑止痛劑鹽酸丁丙諾啡(Buprenorfine hydrochloride)(Temgesic，Reckitt &Colman，Kingston-upon-Hull；英國；0.1ml，皮下注射)。
實驗設(shè)計給大鼠(n＝14)手術(shù)安裝十二指腸球囊導(dǎo)管和遙測傳送器，并允許大鼠手術(shù)后恢復(fù)12天。在恢復(fù)期間對動物每天進行稱重和適應(yīng)實驗?zāi)康?。使大鼠?xí)慣于實驗過程(實驗前兩次)。在實驗期間，同時和連續(xù)記錄十二指腸膨脹之前(基線)、之間和之后的EMG、身體活動、MAP和HR。記錄30秒鐘基線值。隨后，大鼠接受300(階梯性模型n＝7)或者690(階段性模型n＝7)秒(見下文)的固定體積的十二指腸膨脹方案。然后，進行另一個120(階梯性模型)或300(階段性模型)秒的膨脹后記錄。
為了驗證我們的模型，用一組新動物進行另外的實驗。在階段性十二指腸膨脹前30分鐘，給予大鼠腹膜內(nèi)注射嗎啡(0.3(n＝8)，1.5(n＝7)或3(n＝8)mg/kg體重)或者鹽水(n＝8)。
在驗證我們模型的最后的實驗中，以下稱作消極回避實驗，給12只大鼠手術(shù)安裝十二指腸球囊導(dǎo)管，并允許手術(shù)后恢復(fù)12天。每天對這些動物進行稱重和適應(yīng)實驗?zāi)康?。在消極回避試驗中，對下臺的潛伏期進行評分。
所有實驗都是在晝夜節(jié)律周期的光照期間早8點和晚12點之間在籠中進行。實驗后，通過過量(0.5ml)注射戊巴比妥(Nembutal，Sanofi，比利時；60mg/ml，腹膜內(nèi)注射)處死所有的大鼠，解剖并肉眼檢查感染。沒有在任何一個動物中發(fā)現(xiàn)任何感染的跡象。
十二指腸膨脹在基線記錄前45分鐘，將球囊導(dǎo)管的頭顱骨連接器用注射器附著到裝滿液體的長線上(1m；聚乙烯管，Becton Dickinson，英國)，使得可從籠外給予各種固定體積的膨脹，而用不限制大鼠的活動。在這個適應(yīng)期間，大鼠保持睡眠，以便開始無脅迫的基線記錄。使用兩種方案1)階梯性膨脹將球囊從0.1到0.6ml開始，每次增加0.1ml體積(每次30秒)膨脹；2)階段性膨脹用0.1、0.3和0.5ml膨脹30秒，其間休息不膨脹5分鐘。
行為測量在實驗期間，通過實驗者對籠中動物對十二指腸膨脹的行為反應(yīng)進行評分。使用下列行為評分睡眠、醒著、覺醒、發(fā)抖、探查、梳理腹區(qū)(groom abdominal region)、腹部收縮、伸展行為(軀干的伸展、以及后肢向背部凹拱的伸展過度)和不動。在階梯性模型中，測定誘導(dǎo)不舒適(發(fā)抖、探查)和/或疼痛(梳理腹區(qū))、伸展和不動)行為的閾值(膨脹體積(ml))。
消極回避實驗為了驗證是否感覺到十二指腸膨脹是討厭的，對大鼠(n＝12)進行消極回避實驗。第一天，將大鼠置于位于大的開放區(qū)域(80cm)的小平臺上。當大鼠走下平臺時，將其從開放的區(qū)域移走。為了適應(yīng)實驗的目的，在每間隔10分鐘的9次學(xué)習(xí)試驗中對每只大鼠重復(fù)這個過程。當大鼠不走下平臺時，150秒后將其移走。第二天，對同樣的大鼠進行同樣的過程(不膨脹，對照組；n＝6)或者走下平臺后立即接受5秒鐘0.6ml的十二指腸膨脹(n＝6)。在每間隔10分鐘的9次學(xué)習(xí)試驗中對每只大鼠重復(fù)這個過程。下臺的潛伏期的增加可用作疼痛感覺增加的指示。
遙控測量通過檢測動物在其籠中四處走動時傳送器信號強度的變化遙控測量身體的活動。通過數(shù)據(jù)獲得程序ART 2.2(Data SciencesInternational，St.Paul，美國)記錄EMGs，、身體活動、MAP和HR。連續(xù)收集原始EMG活動形成一種波形(在1000Hz頻率)，在50Hz處向下削減過濾除去運動干擾，并通過Spike2，version 4.11(Cambridge Electronic Design，Cambridge，英國)充分矯正。從矯正的EMG中，分析曲線下的面積(AUC；mV×秒)和最大值(EMGmax，；mV)。在階梯性模型中，測定誘導(dǎo)基線EMG幅度增加或降低的閾值(膨脹體積(ml))。
統(tǒng)計以均值±SEM表示膨脹閾值(ml)、EMG數(shù)據(jù)(對基線的百分率)、總活動(計數(shù)/分)、MAP(mmHg)和HR(心跳/分)。在用單因素方差分析(ANOVA)和post-hoc Student′st檢驗進行統(tǒng)計學(xué)分析前，將每只單個大鼠的心血管數(shù)據(jù)平均到每一基線和膨脹期的1點上。對于嗎啡實驗，使用重復(fù)測量的兩因素復(fù)合ANOVA(MANOVA)。P值＜0.05認為是有統(tǒng)計學(xué)意義。
在階段性膨脹方案中，對心血管數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)分析上排除一只由于不良信號傳導(dǎo)的大鼠。
結(jié)果和討論階梯性模型行為反應(yīng)和內(nèi)臟運動反應(yīng)從0.2毫升體積開始，十二指腸的階梯性膨脹產(chǎn)生“不舒適”行為(發(fā)抖(shaking)、探查(exploring))。在較高的體積(0.4到0.6毫升)時，大鼠另外顯示“疼痛”行為(梳理腹區(qū)、伸展、不動)(圖2和3)。在發(fā)生痛覺相關(guān)行為前，顯示腹部收縮。圖4顯示階梯性膨脹前(基線)、膨脹期間(0.1到0.6毫升)和膨脹后(post)的原始、過濾后以及矯正的EMG信號的單個記錄實例。“積極”行為(發(fā)抖、探查、梳理、腹部痙攣)伴隨著EMG幅度的顯著增加，而在較高膨脹體積期間(0.4到0.6毫升)的伸展行為則反映在基線EMG信號的降低(圖3和4)。
階梯性膨脹產(chǎn)生EMGmax和AUC體積依賴性增加(圖5)。EMGmax(F(6，48)＝2.9，p＜0.05)和AUC(F(6，48)＝3.1，p＜0.05)的單因素方差顯示有顯著意義，post-hoc分析顯示與基線相比，在0.2(p＜0.05)、0.3(p＜0.05)、0.4(p＜0.05)、0.5(p＜0.005)和0.6(p＜0.005)毫升膨脹體積處AUC和EMGmax顯著增加。
心血管反應(yīng)十二指腸的階梯性膨脹產(chǎn)生MAP的體積依賴性增加(圖6A)。對MAP的單因素方差分析顯示有顯著意義(F(6，48)＝22.6，p＜0.0001)，post-hoc分析顯示與基線相比，膨脹體積在0.3(p＜0.005)、0.4(p＜0.0001)、0.5(p＜0.0001)和0.6(p＜0.0001)毫升時MAP顯著增加。
十二指腸的階梯性膨脹產(chǎn)生HR的體積依賴性增加(圖6B)。HR的單因素方差顯示有統(tǒng)計學(xué)意義(F(6，48)＝3.9，p＜0.005)，post-hoc分析顯示與基線相比，膨脹體積在0.3(p＜0.05)、0.4(p＜0.01)、0.5(p＜0.005)和0.6(p＜0.01)毫升時HR顯著增加。
內(nèi)臟運動-擬情感應(yīng)答的關(guān)系圖7顯示在階梯性膨脹期間，平均MAP和EMGmax(MAP＝63EMGmax+109，r＝0.9)或者AUC(MAP＝143 AUC+87，r＝0.8)之間正相關(guān)。平均MAP也顯示和HR正相關(guān)(HR＝1.2 MAP+242，r＝0.9)，平均HR顯示和EMGmax(HR＝75EMGmax+375，r＝0.8)以及和AUC(HR＝185 AUC+343，r＝0.8)正相關(guān)；沒有顯示數(shù)據(jù)。
階段性模型行為反應(yīng)和內(nèi)臟運動反應(yīng)十二指腸的階段性膨脹在0.3和0.5毫升體積時產(chǎn)生“不舒適”和“疼痛”行為(圖8)。如在階梯性方案中顯示的那樣，伸展行為很少反應(yīng)在基線EMG幅度的降低(見圖9)。階段性膨脹產(chǎn)生EMGmax和AUC體積依賴性增加(圖10)。EMGmax(F(3，27)＝4.4，p＜0.05)和AUC(F(3，27)＝3.8，p＜0.05)的單因素方差顯示有統(tǒng)計學(xué)意義，post-hoc分析顯示與基線相比，膨脹體積在0.3(p＜0.05)和0.5(p＜0.01)毫升時AUC和EMGmax顯著增加。
心血管反應(yīng)十二指腸的階段性膨脹產(chǎn)生MAP體積依賴性增加(圖11A)。MAP的單因素分析顯示有統(tǒng)計學(xué)意義(F(3，23)＝11.8，p＜0.0001)，post-hoc分析顯示與基線相比，膨脹體積在0.5(p＜0.005)毫升時MAP顯著增加。
階段性膨脹產(chǎn)生HR體積依賴性增加(圖11B)。HR的單因素方差分析顯示有統(tǒng)計學(xué)意義(F(3，23)＝5.8，p＜0.005)，post-hoc分析顯示與基線相比，膨脹體積在0.3(p＜0.005)和0.5(p＜0.05)毫升時HR顯著增加。
內(nèi)臟運動-擬情感應(yīng)答的關(guān)系圖12顯示在階段性膨脹期間，平均MAP和EMGmaX(MAP＝26EMGmax+101，r＝0.8)或者AUC(MAP＝64 AUC+90，r＝0.8)之間正相關(guān)。平均MAP也顯示與HR正相關(guān)(HR＝1.5 MAP+204，r＝0.7)，平均HR顯示與EMGmaX(HR＝67 EMGmaX+347，r＝0.98)以及和AUC(HR＝152 AUC+321，r＝0.95)正相關(guān)；數(shù)據(jù)沒有顯示。
嗎啡實驗用嗎啡的預(yù)處理抑制膨脹誘導(dǎo)的疼痛行為(伸展行為、梳理腹區(qū)、不動；p＜0.0001，數(shù)據(jù)沒有顯示)。嗎啡劑量依賴性減少的處理減少膨脹誘導(dǎo)的EMGmaX增加，抑制膨脹誘導(dǎo)的AUC增加(圖13)。MANOVA顯示對EMGmaX(F(3，27)＝4.8，p＜0.01)和AUC(F(3，27)＝4.3，p＜0.05)有顯著治療效果，對EMGmaX(F(2，26)＝14.9，p＜0.0001)和AUC(F(2，26)＝10.8，p＜0.0005)有顯著膨脹效果，對EMGmaX(F(6，52)＝3.0，p＜0.05)和AUC(F(6，52)＝2.8，p＜0.05)有顯著的膨脹x治療相互作用。Post-hoc MANOVA顯示通過給予0.3、1.5和3mg/kg劑量的嗎啡處理，EMGmaX顯著降低(p＜0.05)。Post-hocMANOVA顯示通過給予1.5和3mg/kg劑量的嗎啡處理，AUC顯著降低(p＜0.05)以及給予0.3mg/kg劑量的嗎啡處理，AUC有減少的趨勢(p＝0.07)。
消極回避實驗為了評價傳送急性十二指腸痛覺的傳入途徑和皮層痛覺，可研究動物對疼痛的行為反應(yīng)。在這個研究中我們使用消極回避實驗評價有害相關(guān)的行為。同意以前的研究，我們的研究顯示十二指腸膨脹增加了下臺的潛伏期(圖14顯示在消極回避實驗的第二天，大鼠下臺的潛伏期。與未膨脹大鼠下相比，0.6毫升體積的十二指腸膨脹導(dǎo)致走下平臺(step-down)的潛伏期顯著增加(F(1，10)＝7.3，p＜0.05))。與上述行為數(shù)據(jù)一起考慮，本發(fā)明的研究顯示在我們的動物模型中十二指腸膨脹被感覺是有害、討厭的刺激。
結(jié)論本發(fā)明數(shù)據(jù)顯示無線電遙測技術(shù)是一種在清醒和自由運動大鼠中連續(xù)和同時測量對內(nèi)臟痛的內(nèi)臟運動和心血管反應(yīng)的適當工具，不需要額外的相關(guān)處理或約束脅迫。十二指腸膨脹在大鼠中誘導(dǎo)“不舒適的”和“疼痛”行為以及體積依賴性的內(nèi)臟運動和心血管反應(yīng)。階梯性膨脹模型適合研究對十二指腸膨脹的討厭行為(梳理腹區(qū)、伸展)、內(nèi)臟運動(腹部收縮、EMG幅度和AUC的增加)以及擬情感(MAP和HR)反應(yīng)的閾值。對十二指腸膨脹的心血管和內(nèi)臟運動的反應(yīng)都可用于測量內(nèi)臟痛，以及由藥物引起的這些反應(yīng)的消失，預(yù)測藥物的止痛功效。階梯性和階段性膨脹模型都適于研究新的藥物化合物對回動的內(nèi)臟痛的效力。
權(quán)利要求
1.一種測量內(nèi)臟痛的動物模型，其包括球囊導(dǎo)管和具有經(jīng)皮遙測能力的可植入傳感器模塊。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的動物模型，其中球囊導(dǎo)管是可植入的球囊導(dǎo)管。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的動物，其中可植入球囊導(dǎo)管包含優(yōu)選由用于固定導(dǎo)管的兩個結(jié)節(jié)構(gòu)成的固定裝置。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的動物，其中將球囊導(dǎo)管植入到十二指腸中。
5.根據(jù)前面權(quán)利要求中的任何一項的動物，其中可植入傳感器模塊能夠接受大量輸入信號。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的動物，其中安裝可植入傳感器模塊接受試驗動物的內(nèi)臟運動和擬情感應(yīng)答。
7.根據(jù)權(quán)利要求5的動物，其中可植入傳感器包括至少兩個輸入端口。
8.根據(jù)權(quán)利要求5的動物，其中將可植入傳感器與雙極電極對和血管導(dǎo)管相連。
9.一種由用彈性材料(2)在一端封閉的生物相容的管(1)構(gòu)成的球囊導(dǎo)管，其特點是彈性材料在接近管末端(4)的位置(3)處附著到生物相容的管上。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的球囊導(dǎo)管，其中彈性材料也附著在生物相容的管的末端(5)，所述的管末端嚴格密閉(6)，進一步包括遠離附著點(3)處的許多孔(7)。
11.根據(jù)權(quán)利要求9或10的球囊導(dǎo)管，進一步包括位于鄰近管末端的固定裝置。
12.一種測量內(nèi)臟痛的系統(tǒng)，包括根據(jù)權(quán)利要求9-11中任意一項的球囊導(dǎo)管；具有經(jīng)皮遙測能力的可植入傳感器模塊；以及能監(jiān)控和加工遙控信號的外部模塊。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的系統(tǒng)，其中在試驗動物的十二指腸內(nèi)植入球囊導(dǎo)管；其中安裝可植入傳感器模塊接受試驗動物的內(nèi)臟運動和擬情感應(yīng)答。
14.根據(jù)權(quán)利要求12或13的系統(tǒng)，進一步包括通過球囊導(dǎo)管的近端引入測定量膨脹介質(zhì)的裝置。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的系統(tǒng)，其中引入測定量膨脹介質(zhì)的裝置包括注射器。
16.產(chǎn)生根據(jù)權(quán)利要求1動物的試劑盒，包括球囊導(dǎo)管；具有經(jīng)皮遙測能力的可植入傳感器模塊；雙極性電極對；以及血液導(dǎo)管。
全文摘要
測量內(nèi)臟痛的動物模型包括球囊導(dǎo)管和具有經(jīng)皮遙測能力的可植入傳感器模塊。安裝可植入傳感器模塊接受試驗動物內(nèi)臟運動和擬情感應(yīng)答。具體地，球囊導(dǎo)管是可植入的球囊導(dǎo)管，優(yōu)選在試驗動物的十二指腸內(nèi)植入，并且安裝可植入傳感器接受來自至少一個雙極性電極對和至少一個血液導(dǎo)管的輸入信號。也描述了一種制備所述動物的方法以及在制備所述動物的方法中使用的包括有球囊導(dǎo)管和可植入傳感器模塊的試劑盒。
文檔編號A61B5/03GK1705453SQ200380101384
公開日2005年12月7日 申請日期2003年10月13日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月15日
發(fā)明者M·J·M·A·尼森 申請人:詹森藥業(yè)有限公司