專利名稱：抗hpv疫苗的載體以及該載體轉(zhuǎn)化的微生物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種表達(dá)抗乳突淋瘤病毒表面抗原疫苗的載體、微生物轉(zhuǎn)化株、以及利用所述微生物轉(zhuǎn)化株或其純化提取物的疫苗。
背景技術(shù)：
細(xì)胞表面展示是一種新的技術(shù)，利用該技術(shù)可表達(dá)目的蛋白并將其連接到微生物的細(xì)胞表面，其通過分子生物學(xué)信息對(duì)蛋白質(zhì)分泌的機(jī)制進(jìn)行闡述。更確切地說(shuō)，細(xì)胞表面展示使用來(lái)源于細(xì)菌、酵母等微生物細(xì)胞表面蛋白作為表而錨定基序(motif)而在細(xì)胞表面生成外源性蛋白。該技術(shù)應(yīng)用廣泛，可用于制備重組活疫苗、制備篩選肽、抗原文庫(kù)、以及制備全細(xì)胞吸收劑和全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化催化劑等。也就是說(shuō)，由于在細(xì)胞表面表達(dá)的多種外源性蛋白決定了工業(yè)應(yīng)用的范圍，因此該項(xiàng)技術(shù)具有潛在巨大的工業(yè)利用價(jià)值。
細(xì)胞表面載體對(duì)于外源性蛋白在細(xì)胞表面成功表達(dá)是最重要的因素。對(duì)于該項(xiàng)技術(shù)來(lái)說(shuō)，必須選擇一種用于在細(xì)胞表面表達(dá)外源性蛋白的有效的錨定基序。
相應(yīng)地，表面表達(dá)載體需要具有下述特征首先，一些分泌信號(hào)對(duì)于協(xié)助外源性蛋白穿過細(xì)胞內(nèi)膜和最終到達(dá)細(xì)胞表面是必須的。其次，在將外源性蛋白穩(wěn)定錨定在細(xì)胞外表免得過程中需要靶信號(hào)。第三，即使在細(xì)胞表面大量表達(dá)，錨定基序也不影響細(xì)胞生長(zhǎng)。第四，不論蛋白的尺寸多大，外源性蛋白需保持所表達(dá)的3維結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。但是，滿足上述條件的表面表達(dá)載體仍未發(fā)現(xiàn)，而僅能對(duì)上述缺點(diǎn)進(jìn)行部分克服。
廣義說(shuō)來(lái)，表面錨定載體目前被分為4類，包括細(xì)胞外膜蛋白、脂蛋白、分泌蛋白、以及諸如鞭毛蛋白等表面細(xì)胞器官蛋白。對(duì)于戈蘭氏陰性細(xì)菌來(lái)說(shuō)，諸如Lam B，Pho E(Charbit etal.，J.Immunol.，1391658-1664，1987；Agterbergetal.，Vaccine，885-91，1990)，以及Omp A等表達(dá)于細(xì)胞外表面的表面蛋白通常可用作表面錨定載體。除此之外，還采用諸如Tra T(Felici etal.，J.Mol.Biol.，222301-310，1991)、肽聚糖相關(guān)脂蛋白(PAL)(Fuchs etal.，Bio/Technology，91369-1372，1991)、Lpp(Francisco etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，4892713-2717，1992)等脂蛋白，以及諸如I型纖毛的Fim A或Fim H粘合素(Hedegaard etal.，Gene，85115-124，1989)等纖毛蛋白和諸如Pap A pilu亞單位等菌毛蛋白都曾嘗試用于制備外源性蛋白。此外，有報(bào)道說(shuō)，冰核蛋白(Jung etal.，Nat.Biotechnol，16576-560，1998；Jung etal.，Enzyme Microb.Technol，22(5)348-354，1998)；Lee etal.，Nat.Biotechnol.，18645-648，2000)，Klebsiella oxytoca支鏈淀粉酶(Kornacker etal.，Mol.Micro.，41101-1109，1990)、以及Neisseria IgA蛋白酶(Klauser etal.，EMBOL.，91991-1999，1990)等也可作為表面錨定基序。對(duì)于戈蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌來(lái)說(shuō)，已知通過使用來(lái)源于葡萄狀球菌(Staphylococcus aureus)的蛋白A作為表面錨定基序能有效制備瘧疾抗原，并且來(lái)源于乳酸菌的一種表面包衣蛋白在細(xì)胞表面有良好展示。因此，已證實(shí)戈蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的表面蛋白可成為細(xì)胞表面錨定蛋白。
此前本發(fā)明人對(duì)來(lái)源于Bacillus sp.菌株的poly-x谷氨酸鹽和pgs BCA的合成復(fù)合基因是否能用作新的表面錨定基序進(jìn)行了研究。在實(shí)踐中，pgs BCA基因能用于開發(fā)在微生物表面表達(dá)外源性蛋白的新的表達(dá)載體以及用于在細(xì)胞表而大規(guī)模制備外源性蛋白(韓國(guó)專利申請(qǐng)No.10-2001-48373)。
此外，還嘗試使用上述表面表達(dá)載體通過基因工程技術(shù)在高表達(dá)細(xì)菌表面制備多種致病性抗原或抗原決定簇。特別地，有報(bào)道說(shuō)，與諸如減毒致病性細(xì)菌或病毒等傳統(tǒng)疫苗相比較，當(dāng)外源性免疫原表達(dá)在非致病性細(xì)菌表面并口服用作活疫苗時(shí)，能產(chǎn)生更加持久且強(qiáng)大的免疫反應(yīng)。
微生物表面結(jié)構(gòu)作為佐劑增強(qiáng)了在細(xì)胞表面表達(dá)的外源性蛋白質(zhì)的抗原性，因此已知免疫反應(yīng)能在機(jī)體內(nèi)被活細(xì)菌所誘導(dǎo)。通過該表面表達(dá)系統(tǒng)來(lái)開發(fā)出非致病性細(xì)菌的重組活疫苗是一件值得關(guān)注的事件。
據(jù)推測(cè)，人乳突淋瘤病毒(下文稱作“HPV”)在世界范圍內(nèi)感染了50％以上的成人。特別地，已經(jīng)證實(shí)包括HPV16，18，31和45的四種HPV其80％以上能夠?qū)е聦m頸癌(Lowry D.R.，Kimbauer R.，Schiller J.T.，Proc.Natl.Acad.Sci.，912436-2440，1994)。乳突淋瘤病毒是一種高度種屬特異性的小DNA腫瘤病毒，其屬于Papovaviridae家族，感染諸如人類、牛、兔、羊等哺乳動(dòng)物，使得皮膚或者粘膜長(zhǎng)疣或者乳突淋瘤(Pfister H..，Adv.Cancer Res.48113-147，1987)。在這些種屬中，已知HPV具有約70種不同類型，并且其中的20類以上能夠?qū)е缕つw粘膜或者口腔或者生殖器產(chǎn)生腫瘤。更特異地，有報(bào)道說(shuō)，HPV16(型)和HPV18能夠?qū)е屡缘膶m頸癌。
宮頸癌在女性中發(fā)生頻繁，在世界范圍內(nèi)，僅次于乳腺癌。WHO報(bào)道說(shuō)，世界范圍內(nèi)，每年新發(fā)作的宮頸癌超過5百萬(wàn)例，每年因?qū)m頸癌死亡的患者超過3百萬(wàn)例。尤其在發(fā)展中國(guó)家，宮頸癌是婦女死亡的主要原因(Pisani P.，Parkin D.M.，F(xiàn)erlay J.，Int.J.Cancer 55891-903，1993)。IARC統(tǒng)計(jì)表明，由于發(fā)展中國(guó)家中的慢性病人要遠(yuǎn)多于發(fā)達(dá)國(guó)家，因此根除乳突淋瘤病毒感染的最有效途徑是提前給予預(yù)防性疫苗。
為了開發(fā)出針對(duì)病毒的某一疫苗，應(yīng)該正確裝備使用動(dòng)物培養(yǎng)系統(tǒng)以大規(guī)模制備純化病毒顆粒。但是，HPV在體外或體內(nèi)都難于轉(zhuǎn)變?yōu)椴《绢w粒，這是由于其病毒粒子僅在完全分化的角化細(xì)胞中形成。因此，開發(fā)用于預(yù)防和治療宮頸癌的疫苗以及制備足夠多的用于該項(xiàng)研究的病毒存在嚴(yán)重問題。廣義來(lái)說(shuō)，包括預(yù)防性疫苗以及治療性疫苗在內(nèi)的兩種類型的疫苗都集中在制備針對(duì)宮頸癌的疫苗的方法上。為了這一目的，預(yù)防性疫苗產(chǎn)生較強(qiáng)的針對(duì)HPVL1/L2抗原的中和抗體，從而阻止宿主的HPV感染。即使已經(jīng)感染，該疫苗也可使疾病不再發(fā)展。同時(shí)，治療疫苗使用HPV E6/E7，包括特異性的細(xì)胞免疫反應(yīng)，使損傷或者惡性腫瘤消退。
在對(duì)過去20年的研究中發(fā)現(xiàn)，感染人上皮細(xì)胞的HPV具有多種基因型，與幾種良性和惡性腫瘤相關(guān)。對(duì)HPV的這些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以及研究促進(jìn)了HPV疫苗的發(fā)展。在幾種HPV疫苗候選物中，HPV重組病毒樣的顆粒被認(rèn)為更具前景，這是由于在動(dòng)物和人的疫苗有效性實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，其比除乳突淋瘤病毒外的其它病毒具有更好的免疫反應(yīng)(Koutsky L.A.，Ault K.A.，Wheeler C.M.，Brown D.R.，Barr E.，Alvarez F.B.，Chiacchierini L.M.，Jansen K.U.，N.Engl.J.of Med.347(21)1645-1651，2002)。此外，近來(lái)還證實(shí)HPV感染是癌癥發(fā)作的基本原因，科學(xué)家對(duì)HPV研究的興趣濃厚，并直接參與到該項(xiàng)研究中，從而加速了全球HPV疫苗的研發(fā)。目前，已知的HPV疫苗有HPV重組蛋白，HPV重組病毒樣的顆粒，以及HPV DNA等加工制品。
在細(xì)菌、酵母、以及動(dòng)物細(xì)胞等中，通過重組DNA技術(shù)制備的一些HPV部分組合物以及一些主要表位通過化學(xué)合成的合成肽都試圖用于開發(fā)疫苗。一般說(shuō)來(lái)，重組蛋白通過諸如細(xì)菌、酵母、桿狀病毒、重組牛痘病毒等常規(guī)系統(tǒng)進(jìn)行制備，已經(jīng)完成了一些制備HPV重組蛋白的研究，并鑒別了其對(duì)血清中HPV的抗體形成能力以及誘導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)的能力等。但是，利用動(dòng)物和昆蟲細(xì)胞的病毒系統(tǒng)并不適于使用，因?yàn)槠湓谂囵B(yǎng)過程中容易污染且難于純化。由于在發(fā)展中國(guó)家經(jīng)常發(fā)現(xiàn)乳突淋瘤病毒感染患者，因此包括合成肽在內(nèi)，全部費(fèi)用過高，不適于工業(yè)應(yīng)用。
實(shí)際上，已有報(bào)道說(shuō)將HPV L1病毒樣的顆粒(下文稱作“VLP”)通過哺乳動(dòng)物腺細(xì)胞培養(yǎng)制備成為活的重組牛痘病毒(Hagensee，M.E.，Yaegashi，N.，Gallowat，D.A.，J.Virol.67315-322，1993)，并報(bào)道說(shuō)VLP在小鼠模型系統(tǒng)中產(chǎn)生中和抗體(Schiller J.T.，Lowry，D.R.，Seminars in Cancer Biol.7373-382，1996)。利用僅在宮頸癌中表達(dá)的HPV E6和E7蛋白來(lái)開發(fā)治療疫苗(Bubenik J.，Neoplasma 49285-289，2002)。此外，研究發(fā)現(xiàn)HPV E6/E7蛋白是治療宮頸癌的免疫靶點(diǎn)，并且由于其是癌癥特異性抗原并且與HPV感染細(xì)胞的癌化相關(guān)，因此將其用于開發(fā)治療疫苗。實(shí)際上已經(jīng)證實(shí)，當(dāng)給腫瘤細(xì)胞感染小鼠注射由微生物系統(tǒng)制備的HPV E6/E7蛋白時(shí)，腫瘤形成將得到阻止及延遲(GaoL.，Chain B.，Sinclair C.，J.Gen.Virol.75157-164，1994；MeneguzziG.，Cern C.，Kieny M.P.，Virology 18162-69，1991)。如在其它情況下所示，活病毒疫苗具有促進(jìn)病毒過度增殖以及易于保持在研究水平的問題。不幸地，需要很長(zhǎng)時(shí)間才能將其商業(yè)化并且需要相當(dāng)?shù)呐R床試驗(yàn)。為了克服上述問題，嘗試了被抑制或具有復(fù)制缺陷的病毒載體，但是還尚未商業(yè)應(yīng)用(Moss B.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9311341-11348，1996)另一方而，目前利用細(xì)菌載體進(jìn)行疫苗研究非常活躍。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)由減毒Salmonella typhimurium生成的HPV 16VLP在小鼠黏膜或者整個(gè)體內(nèi)能夠誘導(dǎo)性生成抗原特異性抗體。此外，由合成肽所構(gòu)成的疫苗僅使用必要合成表位就能誘導(dǎo)接種疫苗的免疫反應(yīng)，并特別闡述了誘導(dǎo)針對(duì)HPV 16 E6/E7細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)(Ressing M.E.，Sette A.，Brandt R.M.，J.Immunol.1545934-5943，1995)。
除了上述研究外，還利用包括番茄、馬鈴薯等蔬菜在植物中制備病毒抗原，并且還嘗試?yán)檬卟宿D(zhuǎn)化株本身制備成疫苗或者可食用的疫苗。作為模型，舉出了乙型肝炎表面抗原顆粒(Thavala Y.F.and C.J.Artzen.Proc.Natl.Acd.Sci.USA 923358-3361)以及乳突淋瘤病毒的衣殼蛋白L1和L2(韓國(guó)專利申請(qǐng)10-2000-0007022)。但是，在植物系統(tǒng)中，HPV L1蛋白的表達(dá)量太小，難于進(jìn)行純化，因此限制了其商業(yè)應(yīng)用。
因此，由于入乳突淋瘤病毒被認(rèn)為通常感染發(fā)展中國(guó)家的人群，為了抑制并有效控制由于皮膚粘膜或者口腔或者生殖器官的乳突淋瘤病毒引起的腫瘤，迫切需要開發(fā)出更加經(jīng)濟(jì)穩(wěn)定的制備人乳突淋瘤病毒抗原的新方法。
本發(fā)明公開為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的目的在于提供重組載體以及微生物轉(zhuǎn)化株，其能通過微生物表面表達(dá)系統(tǒng)生成HPV抗原。
另外，本發(fā)明另一目的在于提供一種治療和預(yù)防粘膜腫瘤的疫苗，該疫苗包括HPV抗原表達(dá)至細(xì)胞表面的微生物轉(zhuǎn)化株、由轉(zhuǎn)化株提取的粗的HPV抗原或者由微生物轉(zhuǎn)化株純化的HPV抗原作為有效成分。
為了完成上述目的，本發(fā)明提供了用于制備疫苗的表面表達(dá)載體，該載體包括一種或兩種以上編碼poly-x-谷氨酸合成酶復(fù)合物的基因，選自pgs B、pgsC和pgs A和人乳突淋瘤病毒(HPV)的表面抗原蛋白基因。
本發(fā)明所提及的基因pgs B，pgs C和pgs A分別包括SEQ ID NO.1，SEQ IDNO.2和SEQ ID NO.3序列。
本發(fā)明的表面抗原蛋白基因可以是編碼HPV表面成分蛋白的任意基因。例如，人乳突淋瘤病毒的衣殼蛋白，HPV L1或HPV L2蛋白基因可單獨(dú)使用或者兩種以上基因一同使用。優(yōu)選使用主要衣殼，HPV L1抗原蛋白基因。
本發(fā)明的腫瘤相關(guān)抗原基因可以是編碼HPV的腫瘤相關(guān)蛋白和人乳突淋瘤病毒的腫瘤相關(guān)抗原HPV E6或HPV E7的抗原蛋白基因中任意類型的基因，可單獨(dú)使用或者兩種以上基因一同使用。還可將修飾的腫瘤相關(guān)基因E6和E7用作抗原，并且HPV的主要腫瘤相關(guān)抗原蛋白E7抗原蛋白優(yōu)選被使用。
更優(yōu)選地，編碼本發(fā)明的poly-x-谷氨酸合成酶復(fù)合物的基因可以是pgs A。
進(jìn)一步地，本發(fā)明涉及利用重組載體轉(zhuǎn)化的微生物轉(zhuǎn)化株來(lái)制備上述疫苗。
只要對(duì)活體無(wú)毒或者減毒，任意類型的微生物都可用于本發(fā)明。例如，大腸桿菌、傷寒沙門菌、鼠傷寒沙門氏菌、霍亂弧菌、牛分枝桿菌、以及志賀氏痢疾桿菌等可選擇作為戈蘭氏陰性細(xì)菌，桿狀菌、乳酸菌、乳球菌、葡萄球菌、單核細(xì)胞增生利斯特菌(Lysteria monocytogenesis)、鏈球菌等可作為戈蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。
本發(fā)明提供了多種用于治療和預(yù)防粘膜腫瘤的疫苗，其利用在細(xì)胞表面表達(dá)抗原蛋白的微生物轉(zhuǎn)化株本身，或利用裂解微生物之后提取的細(xì)胞膜成分的粗提取物，或者利用由微生物提純的抗原蛋白本身作為有效成分。也就是說(shuō)，本發(fā)明的疫苗能被用于治療或預(yù)防由HPV引起的并在口腔或生殖器的粘膜中發(fā)生的腫瘤的治療劑或預(yù)防劑，尤其用作女性宮頸癌的治療劑或預(yù)防劑。
本發(fā)明的疫苗可口服給藥或者可食用，可通過皮下或者腹膜內(nèi)給藥，也可做成生殖器官用的洗液。當(dāng)直接施用至女性生殖器官時(shí)，宿主細(xì)胞優(yōu)選自本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的乳酸菌sp菌株等可用細(xì)菌。
此外，本發(fā)明的疫苗還可為鼻腔噴霧劑。
由于HPV感染通常發(fā)生于粘膜表面，因此黏液免疫對(duì)于控制HPV感染是非常重要的。由于在細(xì)胞表面表達(dá)HPV抗原的微生物能更有效地誘導(dǎo)膜上的黏液反應(yīng)，因此預(yù)計(jì)利用微生物轉(zhuǎn)化株本身的疫苗在抑制HPV方面要比傳統(tǒng)的疫苗具有更好的效果。
具體地說(shuō)，本發(fā)明提供了用于疫苗的重組載體，pHCE2LBpgsA-HPV L1(參見

圖1)，其包括pgs A基因，它是來(lái)源于桿狀菌sp菌株并能表達(dá)HPV L1蛋白的poly-x-谷氨酸合成酶復(fù)合物基因、將pgs A的C-末端和HPV L1的N-末端連接到戈蘭氏陰性細(xì)菌或者戈蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的細(xì)胞表面的融合蛋白、以及用于表面表達(dá)的微生物轉(zhuǎn)化株。將利用上述載體轉(zhuǎn)化的用于疫苗的大腸桿菌進(jìn)行了單獨(dú)的保藏(保藏號(hào)KCTC 10349 BP)。
此外，本發(fā)明還提供了用于疫苗的表面表達(dá)重組載體pHCE2LBpgsBCA-HPV E7(參見圖5)，其包括pgs BCA基因、來(lái)源于桿狀菌sp菌株并能表達(dá)HPV E7蛋白的poly-x-谷氨酸合成酶復(fù)合物基因、將pgs A的C-末端和HPV E7的N-末端連接到戈蘭氏陰性細(xì)菌或者戈蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的細(xì)胞表面的融合蛋白、以及用于表面表達(dá)的微生物轉(zhuǎn)化株。將利用上述載體轉(zhuǎn)化的用于疫苗的大腸桿菌進(jìn)行了單獨(dú)的保藏(保藏號(hào)KCTC 10520 BP)。
附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明本發(fā)明的上述以及其它目的、特征、優(yōu)點(diǎn)將通過下述描述并結(jié)合附圖進(jìn)行詳細(xì)描述。其中圖1描述了重組載體pHCE2LBpgsA-HPV L1的基因圖譜，其使用戈蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌和戈蘭氏陰性細(xì)菌用于表面表達(dá)。
圖2A和圖2B描述了在沙門氏菌株和乳酸菌株內(nèi)與pgs A融合的HPV L1抗原的表達(dá)，其中所述菌株被表面表達(dá)重組載體pHCE2LBpgsA-HPV L1所轉(zhuǎn)化。
圖3A描述了小鼠血清中針對(duì)HPV L1抗原的IgG抗體的滴度，其中所述小鼠采用合適的劑量幾次口服用本發(fā)明的重組載體pHCE2LBpgsA-HPV L1轉(zhuǎn)化了的干酪乳桿菌，然后檢測(cè)細(xì)胞表面表達(dá)的抗原決定簇。
圖3B描述了針對(duì)小鼠腸、支氣管、肺和陰道的洗出液中的HPV L1抗原的IgG抗體的滴度，其中所述小鼠采用合適的劑量幾次口服用本發(fā)明的重組載體pHCE2LBpgsA-HPV L1轉(zhuǎn)化了的干酪乳桿菌，然后檢測(cè)細(xì)胞表面表達(dá)的抗原決定簇。
圖4描述了由小鼠獲得的脾細(xì)胞中細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞毒活性，其中所述小鼠采用合適的劑量幾次口服用本發(fā)明的重組載體pHCE2LBpgsA-HPV L1轉(zhuǎn)化了的干酪乳桿菌，然后檢測(cè)細(xì)胞表面表達(dá)的抗原決定簇。
圖5描述了重組載體pHCE2LBpgsBCA-HPV E7的基因圖譜，所述重組載體用于在戈蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌和戈蘭氏陰性細(xì)菌宿主中進(jìn)行表面表達(dá)。
圖6描述了與乳桿菌菌株中的pgs A融合的HPV E7抗原的表達(dá)，所述表達(dá)通過對(duì)特定抗體的Western印跡法進(jìn)行，其中所述菌株被用于表面表達(dá)的重組載體pHCE2LBpgsBCA-HPV E7所轉(zhuǎn)化。
圖7描述了從小鼠獲得的腫瘤細(xì)胞的增殖速率，其中所述小鼠采用合適的劑量幾次口服以本發(fā)明的重組載體pHCE2LBpgsA-HPV L1轉(zhuǎn)化了的干酪乳桿菌，然后檢測(cè)細(xì)胞表面表達(dá)的抗原決定簇。
圖8描述了本發(fā)明間接實(shí)施例所述的克隆載體pGNBCA和用于表面表達(dá)的重組載體pGNBCA-HB168的基因圖譜。
圖9描述了采用本發(fā)明間接實(shí)施例所述的Western印跡和熒光激活細(xì)胞分揀法對(duì)乙型肝炎病毒的表面抗原蛋白的表面表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，其中所述表面抗原蛋白來(lái)自被重組載體pGNBCA-HB 168轉(zhuǎn)化的戈蘭氏陰性細(xì)菌。
圖10描述了本發(fā)明間接實(shí)施例所述的克隆載體pGNCA和用于表面表達(dá)的重組載體pGNCA-HB 168的基因圖譜。
圖11描述了采用本發(fā)明間接實(shí)施例所述的Western印跡和熒光激活細(xì)胞分揀法對(duì)乙型肝炎病毒的表面抗原蛋白的表面表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，其中所述表面抗原蛋白來(lái)自被重組載體(pGNCA-HB168A2，pGNA-HB168A3和pGNHB-AA4)轉(zhuǎn)化的戈蘭氏陰性細(xì)菌。
具體實(shí)施例方式
下屬實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)用、優(yōu)選的實(shí)施方案進(jìn)行了描述。
但是，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，可在不偏離本發(fā)明的精神以及本申請(qǐng)公開內(nèi)容所述范圍的情況下，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行修飾以及改良。
特別地，在下述實(shí)施例中采用HPV 16型的L1抗原蛋白，但是任何類型的抗原蛋白基因，諸如L1，L2等來(lái)源于任何類型的HPV菌株的HPV衣殼蛋白基因都可單獨(dú)或者結(jié)合使用。在下面的實(shí)施例里面，使用了與癌癥誘導(dǎo)相關(guān)的一種主要的抗原蛋白基因-HPV 16型的E7基因，但是也可單獨(dú)或者結(jié)合選擇其它HPV菌株的其它癌癥誘導(dǎo)抗原蛋白基因。
除下述實(shí)施例外，還從Bacillus subtilis var.chungkookjang(保藏號(hào)KCTC0697 BP)收集了參與poly-x-谷氨酸合成的細(xì)胞外膜蛋白基因pgsBCA，但是本發(fā)明的載體可包括所有種類的來(lái)源于制備poly-x-谷氨酸的菌株的pgsBCA基因以及利用所述載體的微生物轉(zhuǎn)化株等。更確切的說(shuō)，與Bacillissubtilis chungkookjang的pgsBCA序列具有高于80％同源性的其它pgs BCA基因以及來(lái)源于其它微生物的菌株可用于構(gòu)建疫苗用的載體，這也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之中。
如下述實(shí)施例以及間接實(shí)施例所述，可利用pgs BCA基因的全部或者部分來(lái)構(gòu)建疫苗用的載體，這也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之中。
進(jìn)一步地，在下述實(shí)施例中，對(duì)于上述載體，采用戈蘭氏陰性細(xì)菌傷寒沙門菌、戈蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌乳酸菌作為宿主細(xì)胞，但除這些細(xì)菌外，也可使用其它戈蘭氏陽(yáng)性或者戈蘭氏陰性細(xì)菌，并可得到相同的結(jié)果，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的。
在下述實(shí)施例中，僅公開了將微生物轉(zhuǎn)化株本身應(yīng)用于活體作為活疫苗，其中所述微生物被用于疫苗的載體所轉(zhuǎn)化。但是，即使將由上述微生物轉(zhuǎn)化株提取的粗產(chǎn)物或者純化蛋白施用至活體，根據(jù)疫苗相關(guān)技術(shù)領(lǐng)域的一般性知識(shí)可以很自然地得到相同或類似的結(jié)果。
實(shí)施例1 用于表面表達(dá)的重組載體pHCE2LBpgsAHPV L1的構(gòu)建使用來(lái)源于Bacillus sp.菌株并參與poly-x-谷氨酸合成的細(xì)胞外膜蛋白。在細(xì)胞外膜基因pgsBCA中，采用基因pgsA來(lái)制備重組載體pHCE2LBpgsA-HPV L1，該載體能夠使戈蘭氏陰性細(xì)菌和戈蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的宿主細(xì)胞在細(xì)胞表而表達(dá)人乳突淋瘤病毒16型(下文稱作“HPV”)的主要衣殼蛋白L1。
首先，將編碼HPV L1的基因引入表面表達(dá)載體pGNA中，所述表達(dá)載體采用戈蘭氏陰性細(xì)胞作為宿主細(xì)胞(來(lái)自韓國(guó)專利申請(qǐng)No.10-2001-48373的申請(qǐng)人)。更確切地說(shuō)，采用在PUC19中克隆的約1.5kb的人乳突淋瘤病毒基因作為模板，以及采用具有SEQID.NO.4或者SEQ ID.NO.5所示核苷酸序列的編碼HPV L1的寡聚核苷酸作為模板，進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)。結(jié)果，擴(kuò)增了1518bp大小的基因。
制備引物SEQ ID.NO.4和SEQID.NO.5使之包括限制性酶BamHI和Hind III的識(shí)別序列，其中所述限制性酶識(shí)別序列存在于表面表達(dá)所用的克隆載體pGNA中。上述擴(kuò)增的HIPA L1抗原基因用限制性酶Bam HI和Hind III消化，并連接，調(diào)節(jié)翻譯密碼子與細(xì)胞外膜蛋白基因pgsA的C-末端區(qū)域，其中所述基因pgsA參與poly-x-谷氨酸的合成并來(lái)源于克隆載體pGNA，從而制備重組載體pGNA-HPVL1。
為了獲得上述重組載體制備的含有HCE啟動(dòng)子的DNA片段、pgsA和HPVL1，將重組載體pGNA-HPV L1用限制性酶Nhe I和Sca I進(jìn)行消化，將所得片段插入到戈蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的一般克隆載體pAT19的多克隆位點(diǎn)中的限制性酶Xba I和Sma I位點(diǎn)，從而構(gòu)建重組載體pHCE2LBpgsA-HPV L1(參見圖1)。
將本發(fā)明中用于表面表達(dá)的重組載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，包括pHCE2LBpgsA-HPV L1的細(xì)菌株轉(zhuǎn)化被保藏于韓國(guó)生命科學(xué)和生物技術(shù)研究院的基因庫(kù)(KCTC，Taejon-si，Eusung-gu，Eoun-dong 52)中，保藏號(hào)為KCTC 10349 BP。
實(shí)施例2與pgsA融合的HPV L1的表面表達(dá)以上述用于表面表達(dá)的重組載體pHCE21LBpgsA-HPV L1轉(zhuǎn)化戈蘭氏陰性細(xì)菌傷寒沙門菌Ty21a，然后檢測(cè)傷寒沙門菌Ty21a中與pgsA融合的HPVL1抗原的蛋白表達(dá)。然后，轉(zhuǎn)化戈蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌乳酸菌，在乳酸菌菌株中鑒別重組載體pHCE21LBpgsA-HPV L1的存在，然后檢測(cè)與pgsA融合的HPVL1抗原的蛋白表達(dá)(參見圖2)。利用針對(duì)HPV L1的特定抗體通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳和Western印跡來(lái)檢測(cè)與參與poly-x-谷氨酸合成的pgsA基因的C-末端相連的HPV L1抗原的細(xì)菌表達(dá)。
具體地說(shuō)，將以重組載體pHCE2LBpgsA-HPV L1轉(zhuǎn)化的傷寒沙門菌Ty21a在500ml的培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)表面表達(dá)，其中所述培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)包括含有100mg/L抗生素的50ml的LB培養(yǎng)基(酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，鹽5g/L，pH 7.0)。此外，用重組載體pHCE2LBpgsA-HPVL1轉(zhuǎn)化干酪乳酸桿菌(Lactobacillus casei)，在37℃靜態(tài)環(huán)境于MRS培養(yǎng)基(Lactobacillus MRS，Becton Dickinson and Company Sparks，USA)中進(jìn)行培養(yǎng)，進(jìn)行增殖并誘導(dǎo)表面表達(dá)。
隨后，對(duì)傷寒沙門菌和Lactobacillus casei誘導(dǎo)表面表達(dá)，在同樣細(xì)胞密度下獲得蛋白，變性用作樣品。然后利用SDS聚內(nèi)烯酰胺凝膠電泳對(duì)蛋白進(jìn)行分析，轉(zhuǎn)移至PVDF薄膜上(聚偏氟乙烯薄膜Bio-Rad)。所得PVDF薄膜浸于封閉液(50mM Tris-HCL，5％脫脂奶，pH 8.0)，振搖1小時(shí)進(jìn)行封閉，然后與單克隆第一抗體反應(yīng)12小時(shí)，其中所述第一抗體為鼠源的HPV L1蛋白抗體，并用封閉液1000倍稀釋。然后，將所得薄膜用緩沖液洗滌，與第二抗體共同孵育4小時(shí)，其中所述第二抗體為與生物素偶聯(lián)的小鼠第二抗體，并用封閉液1000倍稀釋。將反應(yīng)薄膜用緩沖液洗滌，與將所得薄膜用緩沖液洗滌，與抗生物素蛋白一生物素試劑反應(yīng)1小時(shí)，然后再次洗滌。通過加入H2O2和DAB，洗滌后的薄膜具有發(fā)色團(tuán)，鑒別出在針對(duì)HPV L1的特異性抗體和上述融合蛋白之間具有特異性結(jié)合(參見圖2)。
在圖2A中，泳道1是未轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞傷寒沙門菌Ty21a，泳道2、3是以重組載體pHCE2LBpgsA-HPVL1轉(zhuǎn)化的傷寒沙門菌Ty21a。在圖2B中，泳道1是未轉(zhuǎn)化的Lactobacillus casei，泳道2是以重組載體pHCE2LBpgsA-HPVL1轉(zhuǎn)化的Lactobacillus casei。如圖所示，在97.4Kda條帶鑒別到由重組載體pHCE21LBpgsA-HPV L1表達(dá)的融合蛋白。由于pgsA約為41.8KDa，L1蛋白約為55.6Kda，因此說(shuō)明具有約97.4Kda的條帶為pgsA和L1蛋白的融合蛋白。
實(shí)施例3用細(xì)胞表面表達(dá)HPV L1抗原的乳酸菌誘導(dǎo)免疫反應(yīng)將用于表面表達(dá)的重組載體pHCE2LBpgsA-HPV L1轉(zhuǎn)化至戈蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌Lactobacillus casei，如實(shí)施例2所述，在Lactobacillus casei細(xì)胞表面誘導(dǎo)抗原的表達(dá)，接下來(lái)在抗原性檢測(cè)中檢測(cè)到參與poly-x-谷氨酸合成的細(xì)胞外膜蛋白pgsA以及與L1抗原融合的HPV16。
具體地說(shuō)，將本發(fā)明的重組載體pHCE2LBpgsA-HPV L1轉(zhuǎn)化至Lactobacillus casei進(jìn)行表面表達(dá)，收集并調(diào)整每孔具有相同濃度，并用PBS緩沖液(pH7.4)洗滌幾次。然后，對(duì)4-6周齡的BALB/c小鼠以5×1010細(xì)菌的濃度通過口腔給予在細(xì)胞表面表達(dá)HPV16 L1抗原的乳酸菌以及未轉(zhuǎn)化的乳酸菌，在第一周和第二周隔天給予三次，兩周以后再注射，隔天給予三次。在標(biāo)準(zhǔn)組，對(duì)小鼠隔天施用兩次由酵母表達(dá)的HPV16 L1病毒樣顆粒(VLP)。
口服施用和靜脈注射間隔2周后，處死小鼠，收集每組小鼠的血清，利用ELISA方法(酶聯(lián)免疫吸附法)測(cè)量血清以及內(nèi)臟、支氣管、肺和陰道漂洗懸液中針對(duì)HPV16 L1抗原的IgG抗體滴度(參見圖3a、3b)。在利用ELISA計(jì)算針對(duì)HPV16 L1抗原的IgG和IgA抗體滴度的方法中，利用酵母表達(dá)的HPV16 L1病毒樣顆粒(VLP)作為抗原。更確切地說(shuō)，為測(cè)定IgG抗體滴度，采用辣根過氧化物酶偶聯(lián)的抗小鼠IgG，為測(cè)定IgG抗體滴度，采用辣根過氧化物酶偶聯(lián)的抗小鼠IgA。
在圖3a中，()為未轉(zhuǎn)化組，口服給予Lactobacillus casei；()為靜脈注射HPV16(VLP)的L1病毒樣顆粒組；()為口服給予經(jīng)pHCE2LBpgsAHPV載體轉(zhuǎn)化的Lactobacillus casei組。在圖3b中， 為未轉(zhuǎn)化組，口服給予Lactobacillus casei； 為靜脈注射HPV16(VLP)的L1病毒樣顆粒組； 為口服給予經(jīng)pHCE2LBpgsAHPV載體轉(zhuǎn)化的Lactobacillus casei組。
因而如圖3a所示，由給予了經(jīng)pHCE2LBpgsA-HPV L1載體轉(zhuǎn)化的Lactobacillus casei的BALB/c小鼠組中獲得的血清溶液及其稀釋液證實(shí)了其比標(biāo)準(zhǔn)BALB/c小鼠組具有更高的針對(duì)人HPV L1抗原的IgG抗體滴度，與靜脈注射HPV16 L1病毒樣顆粒(VLP)組相比，其抗體滴度增加。
如圖3b所示，由給予了經(jīng)pHCE2LBpgsA-HPV L1載體轉(zhuǎn)化的Lactobacillus casei的BALB/c小鼠組內(nèi)臟、支氣管、肺和陰道內(nèi)部等的漂洗懸液以及稀釋液證實(shí)了其比靜脈注射HPV16 L1病毒樣顆粒(VLP)的標(biāo)準(zhǔn)組具有更高的針對(duì)人HPV L1抗原的IgG抗體滴度。特別地，內(nèi)臟器官懸液具有更顯著的針對(duì)HPV L1抗原的IgA抗體滴度。
相應(yīng)地，證實(shí)了本發(fā)明的微生物轉(zhuǎn)化株能夠產(chǎn)生針對(duì)HPV的IgG抗體，該抗體為整個(gè)機(jī)體的免疫誘導(dǎo)的標(biāo)志；同時(shí)能夠產(chǎn)生針對(duì)HPV的IgA抗體，該抗體為局部免疫，粘膜免疫誘導(dǎo)的標(biāo)志。因此，可將微生物轉(zhuǎn)化株用作活的疫苗。
實(shí)施例4用細(xì)胞表面表達(dá)HPV L1抗原的乳酸菌免疫后的試驗(yàn)動(dòng)物中提取脾細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞毒活性分析為了觀察采用同樣過程的免疫反應(yīng)是否也誘導(dǎo)了細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，用細(xì)胞表面表達(dá)HPV L1的乳酸菌免疫試驗(yàn)小鼠，分離小鼠脾細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞(CTL)的活性。
具體地說(shuō)，取未免疫的Balb/c小鼠的脾細(xì)胞和10ug合成的HPV16 L1肽一起在37℃孵育3小時(shí)，然后以4000rad進(jìn)行照射，以制備刺激細(xì)胞。
如實(shí)施例3所述，分離在細(xì)胞表面表達(dá)HPV L1抗原的乳酸菌免疫的Balb/c小鼠的脾細(xì)胞，與加載合成肽的刺激細(xì)胞相混合，并培養(yǎng)6天，制備效應(yīng)細(xì)胞。此時(shí)，調(diào)整刺激細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞的細(xì)胞比率為2∶1，然后再刺激6天。檢測(cè)前1大，在用作靶細(xì)胞的細(xì)胞中加入10ug的合成HPV16 L1肽進(jìn)行孵育。在檢測(cè)當(dāng)天，向加載了肽的靶細(xì)胞中加入51CrO4，加入濃度為100uCi/106細(xì)胞，孵育2小時(shí)，然后進(jìn)行洗滌。將制得的效應(yīng)細(xì)胞等分至96孔板中，加入的5000細(xì)胞/孔的靶細(xì)胞的范圍為1∶100-1∶25?；旌习屑?xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞，在37℃孵育4小時(shí)。4小時(shí)后，收集上清，檢測(cè)51CrO4的釋放。最大釋放是通過1％TritonX-100與靶細(xì)胞混合所得到的，白發(fā)釋放通過培養(yǎng)基和靶細(xì)胞混合所得到，根據(jù)下式計(jì)算特異性裂解。
特異性裂解＝100*(實(shí)驗(yàn)cpm-自發(fā)cpm)/最大cpm-自發(fā)cpm細(xì)胞毒活性的轉(zhuǎn)化結(jié)果如圖4所示。
結(jié)果如圖4所示，可以看出，與僅施用了未轉(zhuǎn)化的乳酸菌的Balb/c小鼠的脾細(xì)胞相比，施用了以重組載體pHCE2LBpgsA-HPV L1轉(zhuǎn)化的Lactobacilluscasei的Balb/c小鼠脾細(xì)胞的特異性細(xì)胞毒性的比率更高。
因此鑒別出，由本發(fā)明的表達(dá)HPV16 L1抗原的乳酸菌所誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)為細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，其活化細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞作為口服疫苗的主要效應(yīng)。
實(shí)施例5用于表面表達(dá)的重組載體pHCE2LBpgsBCAHPV E7的構(gòu)建研究了來(lái)源于Bacillus sp.菌株并參與poly-x-谷氨酸合成的細(xì)胞外膜蛋白。在細(xì)胞外膜基因中，利用pgs BCA基因來(lái)制備重組載體pHCE2LBpgsA-HPV-E7，該載體能夠以戈蘭氏陰性細(xì)菌和戈蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌作為宿主細(xì)胞，在細(xì)胞表面表達(dá)與癌癥誘導(dǎo)相關(guān)的主要抗原蛋白HPV 16的E7。
首先，將編碼HPV16 E7的基因引入使用戈蘭氏陰性細(xì)菌作為宿主細(xì)胞的表面表達(dá)載體pGNBCA中(由韓國(guó)專利申請(qǐng)No.10-2001-48373的專利人處性得)。更確切地說(shuō)，利用在pUC19中克隆的大約324bp的人乳突淋瘤病毒基因作為模板，以及利用含有SEQID.NO.6或者SEQ ID.NO.7序列的編碼HPV16 E7的寡核苷酸作為模板，然后進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)。結(jié)果擴(kuò)增得到324bp大小的基因。
制備引物SEQID.NO.6和SEQ ID.NO.7，使之包含限制性酶Bam H1和Hind III的識(shí)別位點(diǎn)，其中所述限制性酶存在于用于表面表達(dá)的克隆載體pGNBCA中。利用限制性酶Bam H1和Hind III對(duì)上述擴(kuò)增的HPV L1抗原基因進(jìn)行消化，并連接，調(diào)節(jié)細(xì)胞外膜蛋白基因pgsA的C-末端區(qū)域的翻譯密碼子，其中所述pgsA基因參與poly-x-谷氨酸的合成并來(lái)源于克隆載體pGNBCA，從而制備重組載體pGNBCA-HPV E7。
為了獲得含有HCE啟動(dòng)子的DNA片段、上述制備的重組載體pGNBCA-HPV E7的pgsBCA和HPV L1，將重組載體用限制性酶Nhe I和ScaI進(jìn)行消化，將所得片段插入到戈蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的一般克隆載體pAT19的多克隆位點(diǎn)中的限制性酶Xba I和Sma I位點(diǎn)，從而構(gòu)建重組載體pHCE2LBpgsBCA-HPV E7(參見圖5)。
將本發(fā)明用于表面表達(dá)的重組載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，包括pHCE2LBpgsA-HPV L1的細(xì)菌轉(zhuǎn)化株被保藏于韓國(guó)生命科學(xué)和生物技術(shù)研究院的基因庫(kù)(KCTC，Taejon-si，Eusung-gu，Eoun-dong 52)中，保藏號(hào)為KCTC 10520 BP。
實(shí)施例6與pgsA融合的HPV E7的表面表達(dá)以上述用于表面表達(dá)的重組載體pHCE21LBpgsA-HPV E7轉(zhuǎn)化戈蘭氏陰性細(xì)菌乳酸菌，然后鑒別乳酸菌中重組載體pHCE21LBpgsBCA-HPV E7是否存在，并檢測(cè)與pgsA融合的HPV E7抗原的蛋白表達(dá)(參見圖6)。
為了完成這一目的，采用與實(shí)施例2同樣的步驟將表面表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至乳酸菌中并進(jìn)行誘導(dǎo)。然后，采用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳以及針對(duì)pgsA(參見圖6A)和HPV E7(參見圖6B)的特異性抗體的Western印跡，來(lái)檢測(cè)與參與了poly-x-谷氨酸合成的pgsA基因的C-末端相融合的HPV E7抗原蛋白的表達(dá)(參見圖6)。在圖6中，泳道1是未轉(zhuǎn)化的Lactobacillus casei，泳道2、3是以重組載體pHCE2LBpgsBCA-HPV E7轉(zhuǎn)化的Lactobacillus casei。
如圖所示，由重組載體pHCE2LBpgsBCA-HPV E7鑒別到約60.8Kda的融合蛋白的條帶。由于pgsA約為41.8KDa，HPV16 E7抗原蛋白通常約為19Kda，因此說(shuō)明具有約60.8Kda的條帶為pgsA和HPV16 E7抗原蛋白的融合蛋白。
實(shí)施例7以細(xì)胞表面表達(dá)HPV E7抗原的乳酸菌免疫后的試驗(yàn)動(dòng)物施用腫瘤細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)將用于表面表達(dá)的重組載體pHCE21LBpgsBCA-HPV E7轉(zhuǎn)化至戈蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌Lactobacillus casei中，按照與實(shí)施例2同樣的方法在Lactobacilluscasei細(xì)胞表面誘導(dǎo)上述抗原的表達(dá)，然后通過用HPV16 E7抗原免疫來(lái)檢測(cè)對(duì)腫瘤增殖的抑制作用，其中所述抗原與細(xì)胞外膜蛋白pgsA相融合，該蛋白參與poly-x-谷氨酸的合成。
具體地說(shuō)，按照實(shí)施例3的方法對(duì)用表面表達(dá)的重組載體pHCE2LBpgsBCA-HPV E7轉(zhuǎn)化的Lactobacillus casei和未轉(zhuǎn)化的乳酸菌進(jìn)行處理，對(duì)4-6周齡的BALB/c小鼠以5×1010細(xì)菌的濃度通過口腔給予轉(zhuǎn)化株，在第一周和第二周隔天給予三次，兩周以后再注射，隔天給予三次。
末次注射后，將表達(dá)HPV E7的腫瘤細(xì)胞系TC-1(1×104/50ul)通過皮下注射到待測(cè)小鼠的左側(cè)。
表達(dá)HPV E7蛋白的腫瘤細(xì)胞系TC-1在C57/BL/6小鼠的原代肺細(xì)胞中被誘導(dǎo)，該細(xì)胞系被HPV16 E6和E7基因所免疫和轉(zhuǎn)化，并采用現(xiàn)有技術(shù)來(lái)活化人c-Ha-ras基因[Lin etal.，Cancer Res.5621-26，1996]。
腫瘤刺激2周后，測(cè)定腫瘤的尺寸。每周隔天3次，計(jì)算并指出增大一倍的最長(zhǎng)以及最短長(zhǎng)度。用腫瘤刺激后腫瘤尺寸測(cè)量的數(shù)據(jù)如圖7所示。
如圖7所示，與采用了未轉(zhuǎn)化的乳酸菌的C57/BL/6小鼠中獲得的結(jié)果相比，在以載體pHCE2LBpgsBCA-E7轉(zhuǎn)化的Lactobacillus casei的C57/BL/6小鼠中，腫瘤細(xì)胞的增殖被顯著抑制。
因此，可以證實(shí)，由在細(xì)胞表面表達(dá)本發(fā)明的HPV16 E7抗原的乳酸菌誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。
間接實(shí)施例用于聯(lián)合pgs B，pgs C和pgs A疫苗的重組載體的構(gòu)建以及采用該系統(tǒng)在細(xì)胞表面表達(dá)外源蛋白的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)，構(gòu)建的表面表達(dá)載體可包含任意一個(gè)或兩個(gè)以上的pgs B、pgsC和pgs A基因用于編碼poly-x-谷氨酸合成酶復(fù)合物，以及包含編碼外源蛋白的基因，將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到微生物中，從而所述基因表達(dá)至微生物表面。
相應(yīng)地，還間接證實(shí)，能夠制備包括編碼poly-x-谷氨酸合成酶復(fù)合物的任意一個(gè)或兩個(gè)以上的pgs B、pgs C和pgs A基因以及編碼外源蛋白的基因的載體，用在疫苗上。
在間接實(shí)施例中，所述質(zhì)粒pGNBCA和pGNCA分別與本發(fā)明的質(zhì)粒載體pGNpgsBCA和pGNpgsCA相同。
間接實(shí)施例1重組載體pGNBCA-HB168的構(gòu)建以及形成S抗原的中和抗體的抗原決定簇的表面表達(dá)利用來(lái)源于Bacillus sp.菌株的參與poly-x-谷氨酸合成酶的細(xì)胞外膜基因pgs BCA來(lái)構(gòu)建重組載體pGNBCA-HB168，該重組載體以戈蘭氏陰性細(xì)菌為宿主細(xì)胞，在細(xì)胞表面表達(dá)能產(chǎn)生乙型肝炎病毒S抗原中和抗體的抗原決定簇。
為了將乙型肝炎病毒S抗原引入到戈蘭氏陰性細(xì)菌作為宿主細(xì)胞的表面表達(dá)載體pGNBCA中，采用在一般克隆載體pUC8中克隆的大約1.4kb的乙型肝炎病毒基因作為模板，以包括SEQ ID NO.8和SEQID NO.9核苷酸序列的寡核苷酸作為引物。通過聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增S抗原的基因。此時(shí)，擴(kuò)增得到的基因?yàn)?68bp大小。
上述制得的引物SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9包含限制性酶Bam HI和Hind III的識(shí)別位點(diǎn)，這些位點(diǎn)也存在于表面表達(dá)載體pGNBCA上。利用限制性酶Bam HI和HindIII消化上述擴(kuò)增的乙型肝炎病毒S抗原基因，連接至參與poly-x-谷氨酸合成的細(xì)胞外膜基因的C末端，進(jìn)行預(yù)先制備，并調(diào)節(jié)翻譯密碼子。結(jié)果，如上所述制備了重組載體pGNBCA-HB168(參見圖8)。
采用表面表達(dá)所用的重組載體pGNBCA-HB168在大腸桿菌中表達(dá)抗原決定簇，該抗原決定簇能形成乙型肝炎病毒S抗原的中和抗體，并對(duì)表面表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。
將實(shí)施例2中構(gòu)建的表面表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，并以50ml含有100mg/L抗生素的LB培養(yǎng)基(酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，鹽5g/L，pH7.0)進(jìn)行培養(yǎng)，然后誘導(dǎo)表面表達(dá)。
在細(xì)菌中表達(dá)了與poly-x-谷氨酸合成酶基因的C末端融合的能形成S抗原中和抗體的抗原決定簇，通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳以及針對(duì)S抗原特異性抗體的Western印跡來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。具體地說(shuō)，將在相同細(xì)胞濃度中得到的蛋白質(zhì)進(jìn)行滅活以制備樣品，并利用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分析，然后，將分離的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF薄膜上。將完成蛋白轉(zhuǎn)移的PVDF薄膜采用封閉液(50mM Tris-HCL，5％脫脂奶，pH8.0)進(jìn)行振搖并封閉1小時(shí)。然后與多克隆第一抗體反應(yīng)12小時(shí)，其中所述第一抗體為針對(duì)S抗原的來(lái)源于羊的的多克隆第一抗體，并用封閉液稀釋1000倍。然后，將所得薄膜用緩沖液洗滌，與第二抗體共同孵育4小時(shí)，其中所述第二抗體是與生物素偶聯(lián)的針對(duì)羊的第二抗體，并用封閉液稀釋1000倍。將反應(yīng)薄膜用緩沖液洗滌，與抗生物素蛋白一生物素試劑反應(yīng)1小時(shí)，然后再次洗滌。向洗滌后的薄膜加入H2O2和DAB作為底物以及生色試劑，結(jié)果其顯色，從而鑒別出在針對(duì)S抗原的特異性抗體和上述融合蛋白之間具有特異性結(jié)合(參見圖A)。在圖9中，泳道1為未轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞JM109，泳道2為轉(zhuǎn)化株pGNBCA-HB168/JM 109。如圖所示，通過質(zhì)粒pGNBCA-HB168證實(shí)了融合蛋白的約48KDa的條帶。
為了證實(shí)形成S抗原中和抗體的抗原決定簇的直接表達(dá)，將誘導(dǎo)的大腸桿菌利用外膜分離方法分別分成可溶性、內(nèi)膜、以及外膜組分，然后通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳和針對(duì)S抗原的抗體進(jìn)行的Western印跡來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。具體地說(shuō)，收集在細(xì)胞表面誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白的大腸桿菌轉(zhuǎn)化株以及并未轉(zhuǎn)化的大腸桿菌，將其調(diào)整到相同的細(xì)胞濃度，用緩沖溶液(10mM HEPES緩沖液，pH7.4)洗滌幾次，重懸于包括10ug/ml裂解酶、1mM PMSF和1mM EDTA的緩沖溶液中，反應(yīng)4-10分鐘。隨后，加入DNase(0.5mg/pl)口RNase(0.5mg/ml)，將細(xì)胞用超聲破碎，于10,000×g離心4、20分鐘分離大腸桿菌細(xì)胞碎片，收集包括大腸桿菌外周胞質(zhì)和細(xì)胞質(zhì)的部分。然后，將收集的沉淀用含有1％Sarcosyl(N-肌氨酸月桂酯，鈉鹽)的PBS緩沖液(pH7.4)進(jìn)行重懸，在15,000×g離心4，2小時(shí)分離上清中的大腸桿菌內(nèi)膜蛋白以及細(xì)胞沉淀中的外膜蛋白，從而獲得各組分。通過聚丙烯酰胺凝膠電泳以及針對(duì)S抗原的抗體的Western印跡法對(duì)各組分進(jìn)行鑒別，證實(shí)在大腸桿菌各組分中，形成S抗原中和抗體的抗原決定簇的部分存在于外膜組分(參見圖9A；大腸桿菌膜組分的Western印跡的結(jié)果)。在圖9中，泳道1為未轉(zhuǎn)化的JM109菌株；泳道2為轉(zhuǎn)化株pGNBCA-HB168/JM 109的全細(xì)胞；泳道3為轉(zhuǎn)化株pGNBCA-HB168/JM 109的可溶性組分；泳道4為轉(zhuǎn)化株pGNBCA-HB168/JM 109的外膜組分；泳道5為轉(zhuǎn)化株pGNBCA-HB168/JM 109的外膜組分。
已經(jīng)通過熒光激活細(xì)胞分揀(FACS)流式法證實(shí)了形成S抗原中和抗體的抗原決定簇在大腸桿菌細(xì)胞表面表達(dá)。對(duì)于免疫熒光染色來(lái)說(shuō)，收集被誘導(dǎo)的大腸桿菌，將細(xì)胞濃度調(diào)節(jié)至相同水平，以PBS緩沖液(pH7.4)洗滌幾次，重懸于1ml含有1％小牛血清白蛋白的緩沖液中，與多克隆第一抗體反應(yīng)4～12小時(shí)，其中所述第一抗體為針對(duì)S抗原的來(lái)源于羊的多克隆第一抗體，并1000倍稀釋。將完成反應(yīng)的細(xì)胞用緩沖液洗滌幾次，重懸于1ml含有1％小牛血清白蛋白的緩沖液中，并與稀釋的生物素偶聯(lián)的第二抗體反應(yīng)3～4小時(shí)。然后再次將完成反應(yīng)的細(xì)胞用緩沖液洗滌幾次，重懸于0.1ml含有1％小牛血清白蛋白的緩沖液中，與1000倍稀釋的染色劑生物素特異性的鏈霉親和素-R-藻紅蛋白進(jìn)行反應(yīng)。
將反應(yīng)的大腸桿菌洗滌幾次，通過熒光激活細(xì)胞分揀流式法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與未轉(zhuǎn)化的大腸桿菌相比，形成S抗原中和抗體的抗原決定簇蛋白在細(xì)胞表面表達(dá)(參見圖9B)。在圖9B中，白色來(lái)源于未轉(zhuǎn)化的JM109，黑色來(lái)源于轉(zhuǎn)化株pGNBCA-HB168/JM109。如圖9所示，在未轉(zhuǎn)化的大腸桿菌中并未表達(dá)形成S抗原中和抗體的抗原決定簇，但是在以表面表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌轉(zhuǎn)化株中可清楚看出形成S抗原中和抗體的抗原決定簇的表達(dá)。
間接實(shí)施例2重組載體pGNCA-HB168的構(gòu)建以及形成乙型肝炎S抗原中和抗體的抗原決定簇的表面表達(dá)利用來(lái)源于Bacillus sp.菌株的參與poly-x-谷氨酸合成酶的細(xì)胞外膜基因pgs BCA中的pgs C和pgs A來(lái)構(gòu)建以戈蘭氏陰性細(xì)菌作為宿主細(xì)胞的用于表面表達(dá)的重組載體。
為了從參與poly-x-谷氨酸合成酶的細(xì)胞外膜蛋白中獲得編碼pgs C和pgsA的N末端和C末端的基因，以全染色體作為模板，以包括核苷酸序列SEQ IDNO.10和SEQ ID NO.11的寡核苷酸作為引物，進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)。
制備與N末端相應(yīng)的引物，該引物包含存在于表達(dá)載體pHCE 19T(II)中的限制性酶Nde I的識(shí)別位點(diǎn)。此時(shí)，擴(kuò)增區(qū)域從pgsC的N末端至pgsA的C末端區(qū)域具有約1.6kb的大小，其中pgsA是參與poly-x-谷氨酸合成的細(xì)胞外膜基因。
將聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增得到的基因用限制性酶Nde I和Bam HI消化，并插入至已經(jīng)用Nde I和Bam HI消化的組成性高表達(dá)載體pHCE19T(II)中。結(jié)果，制備了約5.3kb大小的新的載體，并命名為pGNCA，其中參與poly-x-谷氨酸合成的細(xì)胞外膜蛋白基因不具有翻譯終止密碼子，并且加入了限制性酶的新的識(shí)別位點(diǎn)。
利用參與poly-x-谷氨酸合成的細(xì)胞外膜基因pgs BCA中的pgs C和pgs A，并如實(shí)施例2所述，以戈蘭氏陰性細(xì)菌作為宿主細(xì)胞來(lái)構(gòu)建重組載體pGNCA-HB168，該載體能在細(xì)胞表面表達(dá)形成乙型肝炎病毒S抗原中和抗體的抗原決定簇。，上述制備的重組載體pGNCA-HB168如圖10所示。
利用重組載體pGNCA-HB168在大腸桿菌中制備形成乙型肝炎病毒S抗原中和抗體的抗原決定簇，并檢測(cè)表面表達(dá)。
為了這一目的，將重組載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，按照實(shí)施例3同樣的方法誘導(dǎo)表達(dá)，然后，利用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳以及采用針對(duì)S抗原的抗體的Western印跡法來(lái)驗(yàn)證能與細(xì)胞外膜蛋白pgsCA融合的形成乙型肝炎病毒S抗原中和抗體的抗原決定簇的表達(dá)。
在圖11中，泳道1為未轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞JM109；泳道2為轉(zhuǎn)化的pGNCA-HB168/JM109。如圖11所示，證實(shí)了來(lái)自質(zhì)粒pGNCA-HB168的與蛋白融合的約48KDa的條帶。
工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明人開發(fā)出了一種利用poly-x-谷氨酸合成酶基因以及來(lái)源于Bacillussp.菌株的pgsBCA基因在微生物表面，尤其是在用作疫苗菌株的口服施用的乳酸菌的微生物表面、以及沙門氏菌的細(xì)胞表面有效表達(dá)人乳突淋瘤病毒的衣殼L1蛋白的方法。此外，該重組菌株可用作治療以及預(yù)防用疫苗等。由于對(duì)于HPV來(lái)說(shuō)，并不能大規(guī)模誘導(dǎo)性制備抗體，因此，本發(fā)明的表達(dá)HPV抗原的重組菌株在大規(guī)模且非常經(jīng)濟(jì)地增殖后，可作為經(jīng)濟(jì)實(shí)用的疫苗，例如，可作為口服疫苗或者對(duì)陰道損傷直接有效的疫苗。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以看出，可以前述說(shuō)明書中公開的概念以及特定實(shí)施方式為基礎(chǔ)來(lái)修飾或者設(shè)計(jì)可完成本發(fā)明目的的其它實(shí)施方案。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以明白，這種等價(jià)的實(shí)施方案并未偏離所附權(quán)利要求所闡明的本發(fā)明的精神和范圍。
序列表SEQUENCE LISTING<110>生物領(lǐng)先公司韓國(guó)生命工學(xué)研究院<120>抗HPV疫苗的載體以及該載體轉(zhuǎn)化的微生物<130>PCF050560C<140>PCT/KR2003/002163<141>2003-10-17<150>10-2002-0063378<151>2002-1017<160>11<170>PatentIn version 32<210>1<211>1182<212>DNA<213>Bacillus subtilis<400>1atgggctggt tactcattat agcctgtgct gtcatactgg tcatcggaat attagaaaaa 60cgacgacatc agaaaaacat tgatgccctc cctgttcggg tgaatattaa cggcatccgc 120ggaaaatcga ctgtgacaag gctgacaacc ggaatattaa tagaagccgg ttacaagact 180gttggaaaaa caacaggaac agatgcaaga atgatttact gggacacacc ggaggaaaag 240ccgattaaac ggaaacctca ggggccgaat atcggagagc aaaaagaagt catgagagaa 300acagtagaaa gaggggctaa cgcgattgtc agtgaatgca tggctgttaa cccagattat 360caaatcatct ttcaggaaga acttctgcag gccaatatcg gcgtcattgt gaatgtttta 420gaagaccata tggatgtcat ggggccgacg cttgatgaaa ttgcagaagc gtttaccgct 480acaattcctt ataatggcca tcttgtcatt acagatagtg aatataccga gttctttaaa 540caaaaagcaa aagaacgaaa cacaaaagtc atcattgctg ataactcaaa aattacagat 600gagtatttac gtaattttga atacatggta ttccctgata acgcttctct ggcgctgggt 660gtggctcaag cactcggcat tgacgaagaa acagcattta agggaatgct gaatgcgccg 720ccagatccgg gagcaatgag aattcttccg ctgatcagtc cgagcgagcc tgggcacttt 780gttaatgggt ttgccgcaaa cgacgcttct tctactttga atatatggaa acgtgtaaaa 840gaaatcggtt acccgaccga tgatccgatc atcatcatga actgccgcgc agaccgtgtc 900gatcggacac agcaattcgc aaatgacgta ttgccttata ttgaagcaag tgaactgatc 960ttaatcggtg aaacaacaga accgatcgta aaagcctatg aagaaggcaa aattcctgca1020gacaaactgc atgacctaga gtataagtca acagatgaaa ttatggaatt gttaaagaaa1080agaatgcaca accgtgtcat atatggcgtc ggcaatattc atggtgccgc agagccttta1140attgaaaaaa tccacgaata caaggtaaag cagctcgtaa gc 1182<210>2<211>447<212>DNA<213>Bacillus stbtilis<400>2atgttcggat cagatttata catcgcacta attttaggtg tactactcag tttaattttt 60gcggaaaaaa cagggatcgt gccggcagga cttgttgtac cgggatattt aggacttgtg 120
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權(quán)利要求
1.用于制備疫苗的載體，其包括編碼poly-x-谷氨酸合成酶復(fù)合物的一種或兩種以上選自pgs B，pgs C和pgs A的基因，以及人乳突淋瘤病毒抗原蛋白基因。
2.權(quán)利要求1的用于制備疫苗的載體，其中所述的抗原蛋白基因選自人乳突淋瘤病毒衣殼HPV L1和HPV L2基因中的一種或兩種以上。
3.權(quán)利要求1的用于制備疫苗的載體，其中所述抗原蛋白基因選自與腫瘤誘導(dǎo)相關(guān)的HPV E6和HPV E7抗原蛋白基因中的一種或兩種以上。
4.權(quán)利要求1的用于制備疫苗的載體，其中包括編碼所述poly-x-谷氨酸合成酶復(fù)合物的pgsA基因。
5.一種戈蘭氏陰性微生物，其被權(quán)利要求1的用于制備疫苗的載體所轉(zhuǎn)化。
6.權(quán)利要求5的微生物，其中所述微生物選自大腸桿菌、傷寒沙門菌、鼠傷寒沙門氏菌、牛分枝桿菌、以及志賀氏痢疾桿菌。
7.一種戈蘭氏陽(yáng)性微生物，其被權(quán)利要求1的用于制備疫苗的載體所轉(zhuǎn)化。
8.權(quán)利要求7的微生物，其中所述微生物選自桿狀菌、乳酸菌、乳球菌、葡萄球菌、單核細(xì)胞增生利斯特菌以及鏈球菌。
9.用于治療或預(yù)防粘膜腫瘤的疫苗，其包含在細(xì)胞表面表達(dá)抗原蛋白的權(quán)利要求5和7所述的微生物、從所述微生物上提取的粗抗原蛋白提取物、或者從所述微生物上純化的抗原蛋白作為有效成分。
10.權(quán)利要求9的用于治療或預(yù)防粘膜腫瘤的疫苗，其可口服施用或可食用。
11.權(quán)利要求9的用于治療或預(yù)防粘膜腫瘤的疫苗，其可通過皮下或腹腔注射。
12.權(quán)利要求9的用于治療或預(yù)防粘膜腫瘤的疫苗，其可向鼻腔噴霧。
13.權(quán)利要求1的用于制備疫苗的載體，其具有圖1所示的基因圖譜并且被命名為pHCE2LBpgsA-HPV L1。
14.權(quán)利要求1的用于制備疫苗的載體，其具有圖5所示的基因圖譜并且被命名為pHCE2LBpgsBCA-HPV E7。
15.一種微生物，其被權(quán)利要求13或14所述的用于制備疫苗的載體所轉(zhuǎn)化。
16.權(quán)利要求15的微生物，其使用乳酸菌或者沙門氏菌作為宿主細(xì)胞。
17.一種用權(quán)利要求13的載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌轉(zhuǎn)化株(保藏號(hào)KCTC10349 BP)。
18.一種用權(quán)利要求13的載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌轉(zhuǎn)化株(保藏號(hào)KCTC10520 BP)。
19.一種用于治療或預(yù)防粘膜腫瘤的疫苗，其包含在細(xì)胞表面表達(dá)抗原蛋白的權(quán)利要求16所述的微生物、從所述微生物中提取的粗抗原蛋白提取物、或者從所述微生物中純化的抗原蛋白作為有效成分。
20.權(quán)利要求19的用于治療或預(yù)防粘膜腫瘤的疫苗，其可口服施用或可食用。
21.權(quán)利要求19的用于治療或預(yù)防粘膜腫瘤的疫苗，其可通過皮下或腹腔注射。
22.權(quán)利要求19的用于治療或預(yù)防粘膜腫瘤的疫苗，其可向鼻腔噴霧。
23.一種生殖器用洗液，其包括能在細(xì)胞表面表達(dá)抗原蛋白的權(quán)利要求16所述的微生物、從所述微生物中提取的粗抗原蛋白提取物、或者從所述微生物中純化的抗原蛋白作為有效成分。
全文摘要
本發(fā)明涉及在微生物表面能夠有效生成病毒顆粒衣殼蛋白以及人乳突淋瘤病毒腫瘤相關(guān)蛋白的表達(dá)載體，以及能夠載荷該表面展示載體的菌株和所述菌株或其提取物、純化產(chǎn)物作為復(fù)合疫苗的應(yīng)用。更特異地，本發(fā)明涉及的表面展示載體包括一種或兩種以上的選自pgsB，pgsC，pgsA的基因，來(lái)編碼Bacillus sp.菌株的poly－x－谷氨酸合成酶復(fù)合物(pgsBCA)，以及編碼病毒顆粒衣殼蛋白、人乳突淋瘤病毒的腫瘤相關(guān)蛋白基因，本發(fā)明還涉及上述物質(zhì)的制備方法。
文檔編號(hào)A61K31/00GK1705747SQ200380101373
公開日2005年12月7日 申請(qǐng)日期2003年10月17日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月17日
發(fā)明者成文喜, 夫夏玲, 李宗洙, 鄭昌敏, 洪承杓, 金哲仲, 樸順姬, 表賢美 申請(qǐng)人:生物領(lǐng)先公司, 韓國(guó)生命工學(xué)研究院