A型口蹄疫基因工程復(fù)合表位蛋白及疫苗的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于口蹄疫免疫技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種A型口蹄疫基因工程復(fù)合表位蛋 白及疫苗。
【背景技術(shù)】
[0002] 口蹄疫（foot-and-mouth disease, FMD)是由口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus, FMDV)引起偶蹄動(dòng)物的一種急性、高度接觸性、發(fā)熱性傳染病，以傳播迅 速、感染率高而著稱。該病一旦暴發(fā)將會(huì)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。FMDV有七個(gè)血清型，分別為 0、A、C、Asia l、SATl、SAT2、SAT3〇
[0003] 我國(guó)口蹄疫流行由來已久，目前流行的血清型主要有0型和A型。Asia 1型處于 基本控制狀態(tài)（自2009年5月以后至今近6年時(shí)間內(nèi)亞洲I型在我國(guó)再未發(fā)生)。0型的流 行有所緩和，A型流行增加，豬發(fā)病病例增多。2009年A型東南亞拓?fù)湫停ˋ/SEA-97/G1)引 發(fā)?？谔阋?，2012年2月至2013年1月無臨床病例、但病原廣泛存在。2013年2月A型東 南亞拓?fù)湫筒《镜牧硪环种Вˋ/SEA-97/G2)引起廣東茂名豬發(fā)生FMD，截止同年8月A型在 全國(guó)發(fā)生16起，波及廣州、云南、青海、西藏和新疆5個(gè)?。ㄗ灾螀^(qū)）。同時(shí)，東南亞地區(qū)國(guó)家 還存在A/IRAN/05等較多譜系的A型口蹄疫病毒，疫情形勢(shì)復(fù)雜，時(shí)刻威脅著我國(guó)畜牧養(yǎng)殖 業(yè)的健康發(fā)展。不同譜系A(chǔ)型口蹄疫病毒的抗原性變異較大，交叉免疫保護(hù)作用較差，給疫 苗研究帶來了困難。研究抗原譜廣的疫苗產(chǎn)品，將為我國(guó)口蹄疫防控提供重要的技術(shù)支撐。
[0004] 在FMD流行的國(guó)家，疫情的控制仍然依賴于現(xiàn)有的傳統(tǒng)滅活疫苗以及當(dāng)?shù)孬F醫(yī)工 作者的辛勤勞動(dòng)，通過強(qiáng)制性高強(qiáng)度的免疫，逐步減少疫情的發(fā)生。但是由于口蹄疫病毒本 身免疫原性弱，以及滅活疫苗生產(chǎn)成本的限制等因素，造成疫苗的免疫持續(xù)期較短，保護(hù)水 平較低，而且個(gè)體差異較大，保護(hù)性抗體產(chǎn)生的水平不整齊；同時(shí)滅活疫苗的生產(chǎn)需要高級(jí) 別的防護(hù)措施以消除病毒逃逸等安全隱患；而且，非純化的滅活疫苗多次免疫會(huì)產(chǎn)生非結(jié) 構(gòu)蛋白抗體，給感染動(dòng)物與免疫動(dòng)物的鑒別診斷帶來困難。另外，接種全病毒滅活疫苗不能 阻斷病毒的持續(xù)感染狀態(tài)。由于這些因素，促使人們研制更加高效安全的新型FMD疫苗。隨 著國(guó)內(nèi)外免疫學(xué)研究的深入、以及抗原遞呈機(jī)理與方法的研究進(jìn)展，在疫苗分子設(shè)計(jì)、復(fù)合 表位疫苗與免疫佐劑等方面都取得了明顯進(jìn)展。
[0005] 與傳統(tǒng)滅活疫苗相比，口蹄疫復(fù)合表位蛋白疫苗具有以下的優(yōu)點(diǎn)：生產(chǎn)過程不涉 及感染性的FMDV，不存在散毒的危險(xiǎn)；在同一種表位蛋白中引入多個(gè)譜系的保護(hù)性抗原表 位，拓展表位蛋白的抗原譜，從而使表位蛋白疫苗所誘導(dǎo)產(chǎn)生的免疫應(yīng)答更具有廣譜性；通 過與通用的T細(xì)胞表位融合設(shè)計(jì)，形成復(fù)合表位蛋白，刺激產(chǎn)生更全面的體液免疫與細(xì)胞 免疫應(yīng)答；利用非疫苗用病毒蛋白建立的診斷方法可對(duì)疫苗免疫動(dòng)物和自然感染動(dòng)物進(jìn)行 有效區(qū)分，從而可準(zhǔn)確評(píng)估動(dòng)物的感染狀況，為疫病防控提供準(zhǔn)確的監(jiān)測(cè)技術(shù)支撐?？谔阋?表位蛋白疫苗彌補(bǔ)了目前傳統(tǒng)疫苗所存在的諸多不足，成為口蹄疫新型疫苗發(fā)展的主要趨 勢(shì)之一。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的疫苗缺陷，提供一種A型口蹄疫基因工程復(fù)合表 位蛋白和疫苗，利用該疫苗免疫動(dòng)物，能夠產(chǎn)生很好的保護(hù)性免疫效果，是一種安全、高效 的口蹄疫新型分子疫苗。
[0007] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種A型口蹄疫基因工程復(fù)合表位蛋白，所述復(fù)合表 位蛋白的氨基酸序列為序列表中SEQ ID No. 2。
[0008] 本發(fā)明的A型口蹄疫基因工程復(fù)合表位蛋白包含由A/SEA/97，A/IRA/05，A22三 個(gè)譜系中不同流行毒株的主要中和性抗原表位區(qū)、通用T細(xì)胞表位以及表位間的間隔序列 串聯(lián)組成，表位間的間隔序列有助于蛋白形成穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)，提高蛋白的免疫原性；并在 重組蛋白末端融合的6個(gè)組氨酸標(biāo)簽，以便于表位蛋白的分離純化。
[0009] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種核苷酸序列，編碼權(quán)利要求1所述的A型口蹄疫 基因工程復(fù)合表位蛋白； 作為優(yōu)選，所述核苷酸序列為序列表中SEQ ID No. 1。
[0010] 本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種A型口蹄疫基因工程復(fù)合表位蛋白疫苗，所述疫 苗包含權(quán)利要求1所述的A型口蹄疫基因工程復(fù)合表位蛋白，和藥學(xué)上可接受的媒介物； 作為優(yōu)選，所述疫苗包括權(quán)利要求1所述的A型口蹄疫基因工程復(fù)合表位蛋白和Toll 樣受體9的配體CpG。
[0011] 作為優(yōu)選，所述疫苗由水相和油相按比例混合后制備而成；所述水相的溶質(zhì)為權(quán) 利要求1所述的A型口蹄疫基因工程復(fù)合表位蛋白和Toll樣受體9的配體CpG ;所述油相 為 Montanide ISA-201 油佐劑。
[0012] 作為優(yōu)選，所述的A型口蹄疫基因工程復(fù)合表位蛋白與Toll樣受體9的配體CpG 的重量比為5: (2-4)。
[0013] 作為優(yōu)選，所述水相和油相的體積比為1: (0.95-1.05)。
[0014] 作為優(yōu)選，所述疫苗的主要組分含量為復(fù)合表位蛋白250 μ g/mL，CpG佐劑150 μ g/mL ; 作為優(yōu)選，免疫有效量為成年動(dòng)物每頭份2 mL，幼年動(dòng)物每頭份I mL。
[0015] 本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供上述疫苗的制備方法，將權(quán)利要求1所述的A型口蹄 疫基因工程復(fù)合表位蛋白和Toll樣受體9的配體CpG溶于磷酸鹽緩沖液中，得到水相；將 水相與油相等溫度充分混合，乳化，得疫苗。
[0016] 本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供上述疫苗在制備預(yù)防和/或控制A型口蹄疫病毒的藥 物中的應(yīng)用。
[0017] 作為優(yōu)選，所述疫苗在制備預(yù)防和/或控制豬、?；蜓駻型口蹄疫的藥物中的應(yīng) 用。
[0018] 經(jīng)實(shí)驗(yàn)，應(yīng)用本發(fā)明的疫苗免疫動(dòng)物，一周后就可檢測(cè)到A型FMDV特異性抗體，抗 體效價(jià)不斷升高，免疫四周時(shí)抗體效價(jià)最高。用A型口蹄疫流行毒攻毒后，疫苗免疫組豬均 可完全抵抗強(qiáng)毒攻擊。疫苗效力試驗(yàn)結(jié)果表明，該疫苗每頭份的效力為10. 81 PD50,能夠作 為一種新型A型口蹄疫基因工程疫苗使用。
【附圖說明】
[0019] 附圖用來提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，并且構(gòu)成說明書的一部分，與本發(fā)明的實(shí) 施例一起用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。在附圖中： 圖1為重組菌A8抗原表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE ;其中，M為蛋白分子量Marker ;1為未誘導(dǎo) 的重組菌pET28a-A8對(duì)照；2為重組菌pET28a-A8誘導(dǎo)3小時(shí)產(chǎn)物；3為重組菌pET28a-A8 誘導(dǎo)5小時(shí)產(chǎn)物； 圖2為重組菌A8抗原Western Blotting檢測(cè)結(jié)果圖；其中，M為預(yù)染的蛋白分子量 Marker ;1為未誘導(dǎo)的重組菌pET28a-A8對(duì)照；2為誘導(dǎo)的pET28a載體對(duì)照；4, 5為重組菌 pET28a-A8誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物； 圖3為A8抗原表達(dá)純化后SDS-PAGE分析圖。M蛋白分子量Marker ; 1為pH值為5. 9 的洗脫緩沖液洗脫的目的蛋白；2為pH值為4. 5的洗脫緩沖液洗脫的目的蛋白。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn) 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為市 售。
[0021] 試劑 1、IX IB Wash Buffer :EDTA 10mmol/L，Tris-HCl 20mmol/L，pH 7. 5，Triton X-100 l%〇
[0022] 實(shí)施例1 I、A8免疫原的設(shè)計(jì)與表達(dá) 本申請(qǐng)人根據(jù)國(guó)內(nèi)外A型口蹄疫流行病學(xué)信息，設(shè)計(jì)并合成了免疫原基因 A8。其中AS 包含A/SEA/97, A/IRA/05, A22三個(gè)譜系中不同流行毒株的主要中和性抗原表位區(qū)以及通 用T細(xì)胞表位，各表位之間以甘氨酸-甘氨酸（GG)、甘氨酸-甘氨酸-半胱氨酸（GGC)或甘 氨酸-脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸-甘氨酸-半胱氨酸（GPGPGC)的間隔氨基酸序列相連，以 形成穩(wěn)定的蛋白空間結(jié)構(gòu)，最后加6組氨酸標(biāo)簽序列，以有利于表達(dá)蛋白的純化。設(shè)計(jì)好的 序列交由南京GenScript公司進(jìn)行編碼序列的優(yōu)化與合成，兩端分別加入Nco I酶切位點(diǎn)/ 啟始密碼子與終止密碼子Hind III酶切位點(diǎn)，合成序列經(jīng)Nco I/Hind III酶切位點(diǎn)插入 pET28a載體中，用于復(fù)合表位蛋白A8的表達(dá)。編碼復(fù)合表位蛋白的核苷酸序列如下，為序 列表中SEQ ID No. 1，其蛋白序列為序列表中SEQ ID No. 2。
[0023] ATGGCTAAGT TCGTGGCTGC ATGGACGCTG AAAGCAGCAG CCGGTGGTTG CGTGTACAGC GGTACATCCA AATATTCTGC CCCTCAAAAT CGTCGCGGCG ATAGCGGACC ACTGGCAGCA CGTCTGGCAG CTCAGCTGCC GGCATCCTTC AACTTTGGTG GTGCCGTGGA AGTCAGCTCC CAGGACCGCC ACAAACAAAA GATCATTGCA CCAGCCAAAC AAGGCGGAGT GTACTCAGGT ACTAGTAAGT ATAGTGCGTC GCAGAATCGT CGCGGCGATC TGGGCCCTCT GGCTGCTCGC CTGGCTGCTC AGCTGCCAGC TAGCTTCAAC TTTGGACCTG GTCCCGGCTG CGTCTACAAT GGCGTTTCGA AGTATAGCAC CACTGGAAAT GGTCGTCGCG GAGATCTGGG TTCTCTGGCA GCACGTGTCG CAGCTCAGCT GCCTTCTTCA TTCAACTTTG GTGGCGCAGT TGAGGTGCTG TCACAGGACC GCCATAAACA AAAGATCATT GCCCCCACCA AACAGGGTGG TGTGTACTCC GGTACTTCTA AGTATTCAGC ACCACAGAAC CGTCGCGGCG ACCTGGGTCC GCTGGCTGCT CGCCTGGCCG CTCAGCTGCC TGCGTCCTTC AACTTTGGCC CGGGACCAGG TTGCGTTTAC AATGGCACGA CAAAATATTC TACGGGTAAC GCAGGACGTC GCGGCGATTT AGGCTCACTG GCAGCACGTG TGGCAGCTCA ACTGCCAGCG AGCTTCAATT TTGGCGGAGC TGTCAAGGTT ACCAGCCAGG ACCGTCACAA ACAACGCATC ATTGCGCCGG CTAAGCAGGG TGGCGTGTAC AACGGCACGA GTAAGTATTC GGCACCAGCA ACACGTCGCG GCGATCTTGG CAGTCTGGCT GCTCGTCTGG CTGCCCAGCT GCCAGCATCG TTCAACTATT GCGGTGGCAC CGCCAAATCT AAAAAGTTCC CATCCTACAC CGCCACCTAT CAGTTCCACC ACCACCATCA CCACTAA 上述序列中各段核苷酸編碼氨基酸序列的來源與功能如下表1所示。
[0024] 表1. A8復(fù)合表位蛋白編碼序列中各段氨基酸來源與功能
各表位間的間隔氨基酸序列不同時(shí)