專利名稱：：黃病毒ns1亞單位疫苗的制作方法黃病毒NS1亞單位疫苗此案是申請日為2002年11月20日、中國申請?zhí)枮?28243072、發(fā)明名稱為"黃病毒NS1亞單位疫苗，，的發(fā)明申請的分案申請。本發(fā)明涉及黃病毒(特別是登革熱病毒)的NS1蛋白或其部分，其可用于接種以抵抗所述黃病毒和抵抗一種或多種其它黃病毒。本發(fā)明進(jìn)一步涉及通過接種能用于抵抗登革熱病毒所有血清型的來自一種登革熱病毒血清型，特別是血清型2的NS1蛋白或其部分。本發(fā)明進(jìn)一步涉及含有編碼黃病毒NS1或其部分的表達(dá)盒的DNA，含有所述DNA的載體和含有或表達(dá)黃病毒NS1的疫苗。
背景技術(shù)：
：登革熱的致病因素是登革熱病毒，其屬于黃病毒科的黃病毒屬(BurkeandMonath，2001)。黃病毒中一個非常重要的亞群是稱做蚊媒(mosquito-bome)黃病毒的群體，即由蚊子傳播的黃病毒的群。這個群除了上述登革熱病毒外，還包括其它重要病毒，如西尼羅病毒(Westnilevirus)、日本月S炎病毒(Japaneseencephalitisvirus)和黃熱病病毒(FieldsVirology,ed.byFieldsB.N.,Lippincott-RavenPublishers,3rdedition1996,ISBN:0-7817-0253-4,pages931-1034)。由這些病毒傳播的典型疾病是由西尼羅病毒引起的西尼羅熱和西尼羅腦炎，由日本腦炎病毒引起的腦炎，由黃熱病病毒和登革熱病毒引起的黃熱病，由登革熱病毒引起的登革出血熱(DHF;見下面)和登革休克綜合征(DSS)。黃病毒為包膜單鏈正鏈RNA病毒，其由三種結(jié)構(gòu)蛋白組成與病毒基因組結(jié)合形成核衣殼的衣殼蛋白(C)，所述核衣殼由錨定有M(膜)和E(包膜)蛋白的脂質(zhì)雙層包圍?；蚪M大約為llkb，且包含編碼約3400個氨基酸殘基的多蛋白前體的單一開放閱讀框。每種病毒蛋白都通過細(xì)胞蛋白酶和病毒蛋白酶的作用由此前體產(chǎn)生。三種結(jié)構(gòu)蛋白(C，M和E)衍生自多蛋白的N末端部分，它們之后是七種非結(jié)構(gòu)蛋白NS1,NS2A,NS2B，NS3，NS4A,NS4B和NS5(LindenbachandRice,2001)。存在于所有黃病毒中的糖蛋白NS1傾向于對病毒活力是必需的。登革熱病毒NS1從哺乳動物感染細(xì)胞中以可溶六聚體形式分泌出來(Flamand等，1999)。此非共價結(jié)合六聚復(fù)合物由3個二聚亞基形成，具有310kDa的分子量。二聚化是NS1蛋白輸出到質(zhì)膜的先決條件，在質(zhì)膜上，它作為被感染的細(xì)胞表面唯一的病毒駐留蛋白。在哺乳動物細(xì)胞中，所轉(zhuǎn)運的部分NS1被釋放到細(xì)胞外環(huán)境中，而在利于登革熱感染的昆蟲細(xì)胞系中卻不會如此。細(xì)胞外NS1以可溶蛋白的形式分泌，其中可溶蛋白以較高級六聚寡聚形式存在，或者以與微粒結(jié)合而不與病毒粒子結(jié)合的形式分泌。此外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)NS1在感染登革熱病毒的患者的血清中循環(huán)，這表明NS1分泌可能是人宿主中黃病毒感染過程中的一個重要事件。在黃病毒感染的過程中，NS1蛋白引起很強的抗體反應(yīng)，這種反應(yīng)有助于從宿主中清除感染病毒，推測該清除是通過補體介導(dǎo)途徑(Schlesinger,J丄等，1987)和依賴抗體的細(xì)胞毒性(ADCC)(Schlesinger,J丄等,1993)。登革熱病毒有四種血清型登革熱病毒血清型l(Den-l)到登革熱病毒血清型4(Den-4)，該病毒是黃病毒屬中與感染人類有關(guān)的最重要成員，它引起的疾病從感冒樣癥狀到嚴(yán)重的或致命的疾病，登革出血熱及休克綜合征。登革熱爆發(fā)一直是熱帶和亞熱帶密集居住地區(qū)的一個主要公眾衛(wèi)生問題，在這些地區(qū)蚊媒豐富。世界許多地區(qū)都十分關(guān)注由蚊i某黃病毒引起的登革熱感染和其它疾病的傳播，因此大力開發(fā)可以預(yù)防登革熱(DF)和登革出血熱(DHF)的登革熱疫苗，并獲得了對保護接種個體抵抗由某些或所有蚊媒黃病毒引起的感染有用的疫苗。用四種血清型中任意一種首次感染后大多數(shù)DF病例都有癥狀，大部分DHF病例卻發(fā)生在第二次用與首次感染的登革熱病毒血清型不同的血清型感染的受檢者中。這些觀察結(jié)果產(chǎn)生了一種假設(shè)間隔適當(dāng)時期后，對已有抵抗一種登革熱血清型的抗體的個體用另一種病毒血清型繼續(xù)感染可能會造成相當(dāng)數(shù)量的DHF病例。在體外已經(jīng)證實了登革熱病毒以及其它包膜病毒的依賴抗體的增強作用(ADE)，并且認(rèn)為它是DHF病因中的一個重要機理。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)DHF通常出現(xiàn)在多種(三或四種)病毒血清型共流-阡的地理區(qū)域內(nèi)。在具有地方性DHF的區(qū)域，如東南亞國家，年齡特異性發(fā)病率在兒童中較高，在較大年齡組中DHF病例數(shù)減少。這與不斷增加的登革熱血清陽性率大致相應(yīng)，表明自然感染可能引起了保護性免疫。這一現(xiàn)象不像觀察到的其它病毒感染，比如甲型肝炎病毒。才艮據(jù)無對照的個案病例描述的臨床觀察顯示，患者可能經(jīng)歷兩次DHF(Nimmannitya等，1990)，但這是很罕見的，而且正確地鑒定出引起第二次感染和后來感染的血清型是非常困難的。到現(xiàn)在為止，盡管所有四種登革熱病毒血清型在同一區(qū)域內(nèi)流行，但還沒有相同個體后期感染的報告。這表明在自然界中，相同個體中二種或三種登革熱病毒血清型的感染可能形成交叉反應(yīng)抗體，甚至交叉反應(yīng)性細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞應(yīng)答。這可能調(diào)節(jié)或保護機體抵抗自然界中繼續(xù)存在的登革熱病毒血清型的感染。目前還沒有已被批準(zhǔn)的登革熱疫苗?，F(xiàn)在，登革熱病毒感染的預(yù)防依賴于對主要蚊媒一埃及伊蚊04ecfesaeg^")的控制。對殺蟲劑的抗性、缺乏能使地方衛(wèi)生部門維持有效控蚊計劃的技術(shù)上和經(jīng)濟上的支持，以及作為媒介的蚊和登革熱病毒的持續(xù)的地區(qū)傳播使得通過現(xiàn)行控蚊計劃來抵抗登革熱的感染實際上是不可能的。因此，開發(fā)安全有效的抵抗登革熱病毒所有四種血清型的疫苗已經(jīng)纟皮世界衛(wèi)生組織(WHO)指定為重點預(yù)防登革熱病毒感染的最經(jīng)濟有效的方法。世界衛(wèi)生組織建i義抵抗登革熱和DHF的理想疫苗應(yīng)該是一種能預(yù)防所有血清型引起的感染的疫苗，從而使得連續(xù)感染不能發(fā)生。為達(dá)到該目的，WO98/13500提出利用一種表達(dá)來自登革熱病毒所有血清型的抗原的重組修飾的安卡拉痘苗病毒(MVA)，和利用四種重組MVA,其中每種重組MVA表達(dá)一種登革熱病毒血清型的至少一種抗原。這兩個策略都提供了非常有前景的抵抗登革熱病毒所有血清型的接種策略。但是，希望提供一種單一亞單位疫苗，它在施用后可引起抵抗多于一種黃病毒或多于一種登革熱病毒血清型，優(yōu)選抵抗登革熱病毒所有血清型的免疫反應(yīng)。WO98/13500還公開了一種編碼登革熱病毒NSl的重組MVA。WO98/13500未公開衍生自一種登革熱病毒血清型的抗原能引起的免疫反應(yīng)不但抵抗產(chǎn)生該抗原的登革熱病毒血清型，而且抵抗衍生自其它登革熱病毒血清型的抗原。W099/156927>開了一種重組MVA，它包含并能表達(dá)一種或多種編碼不？1起免疫增強作用或抗體依賴性增強作用的登革熱病毒抗原的DNA序列。W099/15692未公開衍生自一種登革熱病毒血清型的抗原引起的免疫反應(yīng)不但抵抗產(chǎn)生該抗原的登革熱病毒血清型，而且抵抗衍生自其它登革熱病毒血清型的抗原。發(fā)明目的本發(fā)明的目的是提供一種衍生自黃病毒或黃病毒血清型的疫苗，它穩(wěn)定，易于生產(chǎn)，并能引起保護接種個體不但抵抗衍生該疫苗的黃病毒或黃病毒血清型，而且抵抗其它黃病毒或黃病毒血清型的免疫反應(yīng)。本發(fā)明的一個具體目的是提供一種衍生自蚊媒黃病毒的疫苗，它保護接種個體不但抵抗衍生該疫苗的蚊媒黃病毒或黃病毒血清型，而且抵抗其它蚊媒黃病毒或黃病毒血清型。本發(fā)明的另一個目的是提供衍生自登革熱病毒一種血清型的疫苗，它保護接種個體抵抗至少兩種，優(yōu)選登革熱病毒所有血清型的感染。本發(fā)明涉及1.下述物質(zhì)在制備疫苗中的用途，(i)包含表達(dá)盒的核酸，所述表達(dá)盒含有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件以及至少編碼蚊媒黃病毒的NS1蛋白或其部分的序列，(ii)包含所述核酸的載體，和/或(iii)所述黃病毒的NS1蛋白或其部分，所述疫苗用于抵抗產(chǎn)生所述核酸或者產(chǎn)生所述NS1蛋白或其部分的蚊i某黃病毒，并抵抗至少一種其它蚊媒黃病毒。2.項l的用途，其中產(chǎn)生所述核酸或者產(chǎn)生所述NS1蛋白或其部分的蚊媒黃病毒是登革熱病毒。3.下述物質(zhì)在制備疫苗中的用途，(i)包含表達(dá)盒的核酸，所述表達(dá)盒含有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件以及至少編碼登革熱病毒血清型的NS1蛋白或其部分的序列，(ii)包含所述核酸的載體，和/或(iii)所述登革熱病毒血清型的NS1蛋白或其部分，所述疫苗用于抵抗登革熱病毒所有血清型，并可選擇抵抗至少一種其它蚊:樣黃病毒。4.項2或3的用途，其中產(chǎn)生所述核酸或者產(chǎn)生所述NS1蛋白或其部分的登革熱病毒是登革熱病毒血清型2。5.項l-4之一的用途，其中編碼蚊媒黃病毒或登革熱病毒血清型的NSl蛋白或其部分的序列，在前面接有ATG密碼子和編碼糖基化信號序列的序列，且其中編碼序列在翻譯終止密碼子處終止。6.項l-5之一的用途，其中所述其它墳々某黃病毒選自西尼羅病毒、黃熱病病毒和曰本腦炎病毒。7.項l-6之一的用途，其中所述載體是痘病毒載體。8.項7的用途，其中所述痘病毒載體為修飾的安卡拉痘苗病毒(MVA)林，特別是保藏在歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心、編號為V00083008的MVA-BN或其衍生物。9.項7或8的用途，其中所述痘病毒載體已經(jīng)凍干，并且可以于給藥前在藥學(xué)上可接受的稀釋劑中重構(gòu)。10.項l-9之一的用途，其中所述轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件是痘病毒啟動子。11.項l-10之一的用途，其中所述疫苗在首次接種("初次接種")和二次接種("加強接種")中以治療有效量給藥。12.—種治療或預(yù)防黃病毒感染的方法，其包括給有需要的動物，包括人，接種(i)包含表達(dá)盒的核酸，所述表達(dá)盒包含轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件以及至少編碼蚊媒黃病毒NS1蛋白或其部分的序列，(ii)包含所述核酸的載體，和/或(iii)所述黃病毒的NS1蛋白或其部分其中所述黃病毒感染是被產(chǎn)生所述核酸或者產(chǎn)生所述NS1蛋白或其部分的蚊媒黃病毒感染，和/或被另一種蚊媒黃病毒感染。13.項12的方法，其中產(chǎn)生所述核酸或者產(chǎn)生所述NS1蛋白或其部分的蚊媒黃病毒是登革熱病毒。14.一種治療或預(yù)防黃病毒感染的方法，其包括給有需要的動物，包括人，接種(i)包含表達(dá)盒的核酸，所述表達(dá)盒包含轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件以及至少編碼登革熱病毒血清型NS1蛋白或其部分的序列，(ii)包含所述核酸的載體，和/或(iii)所述登革熱病毒血清型的NS1蛋白或其部分，其中所述黃病毒感染是被產(chǎn)生所述核酸或者產(chǎn)生所述NS1蛋白或其部分的登革熱病毒血清型感染，和/或被其它登革熱病毒血清型感染，和/或被其它蚊媒黃病毒感染。15.項12-14之一的方法，其中產(chǎn)生所述DNA或者產(chǎn)生所述蛋白或其部分的登革熱病毒是登革熱病毒血清型2。16.項12-15之一的方法，其中所述編碼蚊々某黃病毒或登革熱病毒血清型的NS1蛋白或其部分的序列，在其前面接有ATG密碼子和編碼糖基化信號序列的序列，且其中編碼序列在翻譯終止密碼子處終止。17.項12-16之一的方法，其中所述載體是痘病毒載體。18.項17的方法，其中所述痘病毒載體是修飾的安卡拉痘苗病毒(MVA)抹。19.項18的方法，其中所述MVA林是保藏在歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心、編號為V00083008的MVA-BN或其衍生物。20.項17-19之一的方法，其中所述痘病毒載體已經(jīng)凍干，并且可以于給藥前在藥學(xué)上可接受的稀釋劑中重構(gòu)。21.項12-20之一的方法，其中所述轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件是痘病毒啟動子。22.項17-21之一的方法，其中所述痘病毒載體或藥物組合物在首次接種("初次接種")和二次接種("加強接種，，)中以治療有效量給藥。23.—種痘病毒載體，它攜有包含表達(dá)盒的DNA,所述表達(dá)盒包含轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件以及至少編碼黃病毒NS1蛋白或其部分的序列，其中所述痘病毒是保藏在歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心、編號為V00083008的修飾的安卡拉痘苗病毒(MVA)BN抹或其衍生物。24.項23的痘病毒載體，其中所述黃病毒是蚊媒黃病毒，特別是登革熱病毒。25.項24的痘病毒載體，其中所述登革熱病毒是登革熱病毒血清型2。26.項23-25之一的痘病毒載體，其中所述編碼黃病毒NS1蛋白或其部分的序列，在其前面接有ATG密碼子和編碼糖基化信號序列的序列，且其中編碼序列在翻譯終止密碼子處終止。27.項23-26之一的痘病毒載體，其中所述轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件為痘病毒啟動子。28.項23-27之一的痘病毒載體，其中所述痘病毒載體是凍千的。29.作為疫苗的項23-28之一的痘病毒載體。30.—種藥物組合物，它包含項23-28之一的痘病毒載體和藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑和/或添加劑。31.用于治療和/或預(yù)防黃病毒感染的項23-29之一的痘病毒載體或項30的藥物組合物，其中所述痘病毒載體或藥物組合物在首次接種("初次接種")和二次接種("加強接種，，)中以治療有效量給藥。32.—種治療或預(yù)防黃病毒感染的方法，包括給有需要的動物，包括人，接種項23-29之一的載體或項30的藥物組合物。33.—種細(xì)胞，優(yōu)選人細(xì)胞，它含有項23-28之一的痘病毒載體。34.項23-28之一的痘病毒載體用于制備治療或預(yù)防黃病毒感染的疫苗的用途。35.—種用于初次免疫/加強免疫的試劑盒，它在第一個并sy容器中含有首次接種(初次接種)所用的項23-29之一的痘病毒載體或項30的藥物組合物，在第二個瓶/容器中含有二次接種(加強接種)所用的項23-29之一的痘病毒載體或項30的藥物組合物。發(fā)明詳述這些問題分別利用黃病毒NS1蛋白或其部分，以及包含編碼黃病毒NS1蛋白或其部分的表達(dá)盒的DNA序列得以解決。具體地，通過利用蚊媒黃病毒，尤其是登革熱病毒，優(yōu)選登革熱病毒血清型2的NS1蛋白或其部分，以及對應(yīng)的DNA序列，提供衍生自一種蚊媒黃病毒的疫苗，它保護個體抵抗衍生該疫苗的蚊媒黃病毒的感染，而且抵抗至少一種其它蚊媒黃病毒的感染。更特別地，通過利用登革熱病毒，尤其是登革熱病毒血清型2的NS1蛋白或其部分以及對應(yīng)的DNA序列，提供了衍生自一種登革熱病毒血清型的疫苗，它保護個體抵抗至少兩種，優(yōu)選至少三種，更優(yōu)選登革熱病毒所有血清型的感染，并優(yōu)選還抵抗其它黃病毒，特別是蚊々某黃病毒如日本腦炎病毒、黃熱病病毒和西尼羅病毒的感染。如在試驗部分更詳細(xì)顯示的，衍生自登革熱病毒一種血清型并在接種后重新表達(dá)的NS1蛋白能引起與登革熱病毒血清型1、2、3和4的NS1蛋白和來自黃病毒屬的其它成員，如日本腦炎病毒，黃熱病病毒和西尼羅病毒的NS1蛋白交叉反應(yīng)的抗體應(yīng)答。因此，來自一種登革熱病毒血清型的NS1蛋白是同時抵抗至少二種，更優(yōu)選三種，甚至更優(yōu)選所有四種登革熱病毒血清型，而且抵抗黃病毒屬一種或更多其它病毒的通用DHF亞單位疫苗。由于這種亞單位疫苗策略中不包括E蛋白，所以在隨后暴露在任何一種登革熱血清型時將不會有依賴抗體的增強作用(ADE)的風(fēng)險，而且在登革熱感染自然爆發(fā)時將不會引起疫苗相關(guān)的DHF。NS1蛋白可以從核酸，優(yōu)選包含編碼至少一種黃病毒NS1蛋白或其部分的表達(dá)盒的DNA表達(dá)。本文中的術(shù)語"至少，，解釋為表達(dá)盒可以另外編碼其它蛋白/肽，如下面更詳細(xì)定義的單獨的蛋白/肽或與NS1蛋白或其部分融合的蛋白/肽。本發(fā)明中的術(shù)語"DNA"指任何形式的DNA，如單鏈DNA、雙鏈DNA、線性或環(huán)狀DNA或質(zhì)粒形式或病毒基因組形式的DNA。由于黃病毒是RNA病毒，編碼黃病毒NS1蛋白的DNA是非天然DNA,比如cDNA或合成DNA。術(shù)語"編碼黃病毒NS1蛋白或其部分的表達(dá)盒(expressioncassette)"解釋為編碼黃病毒NS1蛋白或其部分的序列在其前面接有控制轉(zhuǎn)錄，特別是強子。優(yōu)選的真核啟動子/增強子是人巨細(xì)胞病毒立即早期啟動子/增強子和痘病毒啟動子，如7.5啟動子和痘病毒最小啟動子，參見實施例部分。痘病毒最小啟動子的序列如圖2和SEQ:IDNo.9所示。如果需要，表達(dá)盒可進(jìn)一步包含控制轉(zhuǎn)錄終止的元件，如原核終止元件或真核PolyA信號序列。表達(dá)盒(expressioncassette)可以只表達(dá)黃病毒NS1蛋白或其部分，或者表達(dá)與一種或多種其它黃病毒蛋白/肽一起的NS1蛋白或其部分，其中NS1蛋白或其部分和其它蛋白/肽作為單獨的蛋白/肽或者融合蛋白制出。如果不在說明書中另外定義，本發(fā)明中的術(shù)語"肽"指至少IO個氨基酸的連續(xù)氨基酸序列，更優(yōu)選至少20個氨基酸，最優(yōu)選至少25個氨基酸。所述其它黃病毒蛋白不是完整E蛋白，因為此蛋白好象不參與DHF的進(jìn)展。因此，如果所述其它黃病毒肽衍生自E蛋白，其將包含少于40個氨基酸，優(yōu)選少于35個氨基酸。如果衍生自E蛋白的氨基酸序列與NS1蛋白或其部分一起表達(dá)，應(yīng)證實此氨基酸鏈不包含參與ADE和DHF發(fā)生的表位。如果表達(dá)盒除了表達(dá)NS1蛋白或其部分外，還表達(dá)單獨的蛋白/肽形式的其它黃病毒蛋白/肽，表達(dá)盒可以在編碼NS1蛋白或其部分的序列和編碼所述其它黃病毒蛋白的序列間包含一個內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(IRES)。IRES元件為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。IRES元件的例子為小核糖核酸病毒IRES元件或丙型肝炎病毒的5'非編碼區(qū)。另外，編碼NS1蛋白或其部分的核酸序列可以與編碼其它黃病毒蛋白/肽的DNA序列融合，以便產(chǎn)生NS1蛋白或其部分和其它黃病毒蛋白/肽的融合蛋白。如果要將NS1蛋白或其部分與其它黃病毒蛋白/肽以融合蛋白/肽的形式產(chǎn)生，則將其相應(yīng)編碼序列融合在同一閱讀框內(nèi)。在一優(yōu)選實施方案中，編碼NS1蛋白或其部分的DNA序列在其前面接有編碼E蛋白糖基化信號的序列。按照此實施方案，制備出包含與NS1蛋白或其部分融合的E蛋白糖基化信號序列的融合蛋白。如上所指出的，E蛋白衍生的氨基酸鏈應(yīng)該盡可能短，而且它應(yīng)該不包括參與ADE和DHF發(fā)生的表位。E蛋白的糖基化信號序列滿足這些要求。在另一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明所述的表達(dá)盒包含編碼NS1蛋白或其部分的序列作為唯一的黃病毒序列。因此，在此優(yōu)選實施方案中，根據(jù)本發(fā)明所述的表達(dá)盒不表達(dá)黃病毒基因組其它部分的任何其他肽/蛋白，尤其不表達(dá)NS2A或E蛋白。在另一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明所述的DNA表達(dá)NS1蛋白或其部分與并非衍生自黃病毒的蛋白/肽的融合蛋白，所述并非衍生自黃病毒的蛋白/肽包含非黃病毒信號序列或可用于檢測或純化所表達(dá)的融合蛋白的序列，如標(biāo)記。為了理解本發(fā)明一優(yōu)選實施方案中使用的表達(dá)盒中的黃病毒序列的一般結(jié)構(gòu)，簡要地概括一下黃病毒基因組的結(jié)構(gòu)是有利的在天然黃病毒感染期間，該病毒產(chǎn)生一種多蛋白，它先被宿主細(xì)胞蛋白酶裂解然后被病毒編碼的蛋白酶裂解為下列蛋白C,PrM和M,E，NS1，NS2A，NS2B,NS3,NS4A，NS4B和NS5(在該多蛋白前體上的蛋白順序)。因此，編碼NS1蛋白或其部分的DNA序列，尤其是cDNA序列，必須需要添加"ATG"起始密碼子。在一優(yōu)選實施方案中，起始ATG后面接有編碼糖基化信號的序列，以使新合成的NS1蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中糖基化。所述信號序列為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。最后，蛋白編碼組件需要一個終止密碼子，其可以是加在編碼蛋白的cDNA序列3'末端的TAG。在本發(fā)明實施例中使用的"ATG+信號序列，，元件衍生自編碼E蛋白的疏水C末端的序列(最后28個氨基酸，在登革熱病毒NewGuinea林("NGC林，，，GeneBank登錄號AF038403)中始于氨基酸M(ATG))。本發(fā)明所述的典型表達(dá)盒如圖2，SEQ:IDNO9和SEQ:IDNOIO所示。因此，概括的講，此實施方案涉及含有編碼黃病毒NSl蛋白或其部分的表達(dá)盒的DNA的用途，其中編碼序列前面接有起始密碼子("ATG")和編碼糖基化信號序列的序列，優(yōu)選如上定義的衍生自E蛋白的序列，且編碼序列止于翻譯終止密碼子(圖1A,IC和2，SEQ:ID5-10)。本發(fā)明所述的DNA序列編碼黃病毒NS1蛋白或其部分。術(shù)語"黃病毒"指任何黃病毒。更優(yōu)選術(shù)語"黃病毒，，指蚊媒黃病毒，如西尼羅病毒，日本腦炎病毒，黃熱病病毒和登革熱病毒。由本發(fā)明所述DNA編碼的衍生自一種蚊媒病毒的NSl蛋白或其部分，應(yīng)該保護接種個體不但抵抗衍生該疫苗的病毒或病毒血清型的感染，而且抵抗其它蚊i某病毒或衍生該疫苗的病毒其它血清型的感染。NSl蛋白優(yōu)選為任何登革熱病毒血清型。更優(yōu)選地NSl蛋白編碼序列衍生自登革熱病毒血清型2,如登革熱病毒NewGuinea抹("NGC抹，，,GeneBank登錄號AF038403)。術(shù)語"亞型"和"血清型"在說明書中交替使用。本文術(shù)語"NS1蛋白或其部分"中的術(shù)語"其部分"指NSl蛋白的一段氨基酸鏈，它的長度足以誘導(dǎo)特異性免疫反應(yīng)以抵抗作為"其部分"的來源的NS1蛋白。如果黃病毒為登革熱病毒，此氨基酸鏈應(yīng)該能在接種動物(包括人)體內(nèi)引起抵抗登革熱病毒所有血清型的NSl蛋白的免疫反應(yīng)。在實施例部分，顯示了本領(lǐng)域技術(shù)人員如何測定是否NSl蛋白或其部分引起了對登革熱病毒所有血清型的特異性免疫反應(yīng)。根據(jù)一優(yōu)選的實施方案，黃病毒DNA序列編碼整個NS1蛋白。因此，術(shù)語"NS1蛋白或其部分"指天然NS1蛋白的整個序列，以及仍能引起免疫反應(yīng)的更短的表位鏈。14而且術(shù)語"NS1蛋白"也指天然NS1蛋白的衍生物。所述衍生物可以是在天然NS1蛋白中取代、缺失和/或插入一個或更多氨基酸所得的蛋白。作為實施例，所述衍生物是氨基酸序列同源性至少50%,優(yōu)選至少75%,更優(yōu)選至少90%的蛋白。因此，術(shù)語"其部分"也指所述NS1蛋白衍生物的部分。概括的講，本發(fā)明的一個最優(yōu)選的實施方案是含有編碼蚊媒黃病毒NS1或其部分的表達(dá)盒的DNA的用途，其中黃病毒優(yōu)選為登革熱病毒，尤其是登革熱病毒血清型2,其中NS1蛋白或其部分的表達(dá)由轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件控制。更優(yōu)選的，本發(fā)明所述DNA編碼以與糖基化信號序列的融合蛋白形式的NS1蛋白或其部分。本發(fā)明進(jìn)一步涉及含有如上所述DNA的載體，以及所述載體按照本發(fā)明所述誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的用途。術(shù)語"載體"指本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的任何載體。載體可以是質(zhì)粒載體如pBR322，或pUC系列載體。更優(yōu)選地，載體為病毒載體。在本發(fā)明正文中，術(shù)語"病毒的載體"或"病毒載體，，指含有病毒基因組的感染性病毒。在這種情況下，將本發(fā)明DNA克隆入相應(yīng)病毒載體的病毒基因組中。然后包裝重組病毒基因組，從而獲得的重組載體可以用于感染細(xì)胞和細(xì)胞系，特別是感染有生命動物(包括人)。根據(jù)本發(fā)明所述可以使用的典型的病毒載體是腺病毒載體、逆病毒載體，或以腺伴隨病毒2(AAV2)為基礎(chǔ)的載體。最優(yōu)選的是痘病毒載體。痘病毒優(yōu)選為金絲雀痘(canarypox)病毒、禽痘病毒或者痘苗病毒。更優(yōu)選為〗務(wù)飾的安卡拉痘苗病毒(MVA)(Sutter，G.等，1994，Vaccine12:1032-40)。典型的MVA抹是MVA575,它已經(jīng)保藏在歐洲動物細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(EuropeanCollectionofAnimalCellCultures),保藏編號為ECACCV00120707。最優(yōu)選為MVA-BN或在PCT申請WO02/42480中描述的其衍生物(PCT/EP01/13628)。上述申請的內(nèi)容包括在本申請中作為參考文獻(xiàn)。MVA-BN已經(jīng)保藏在歐洲動物細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為ECACCV00083008。由于MVA-BN病毒載體為高度減毒的病毒，故通過利用MVA-BN或其衍生物，附加的技術(shù)問題得到了解決，從而提供了一種抵抗黃病毒的特別安全的病毒疫苗。特別地，MVA-BN經(jīng)證實比現(xiàn)有技術(shù)已知的MVA株毒力更弱。MVA-BN衍生自修飾的安卡拉痘苗病毒，并且具有在人細(xì)胞系中喪失其復(fù)制能力的特性。由于在人體中不能復(fù)制，MVA-BN比任何其它已知的痘苗病株都更加安全。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及一種包含如上所述MVA-BN和MVA-BN衍生物的DNA的病毒載體。MVA-BN的特性，評價MVA林是否為MVA-BN或其衍生物的生物學(xué)4企測和獲得MVA-BN或其衍生物的方法在WO02/42480中公開。本申請中使用的保藏號為ECACCV00083008的病毒的"衍生物"，即MVA-BN的衍生物，如WO02/42480中所定義。下面，對MVA-BN衍生物的特性進(jìn)行簡單地描述。關(guān)于MVA-BN衍生物的定義的更加詳細(xì)的信息，特別是關(guān)于用來測定MVA病毒是否為提及的MVA-BN衍生物的生物學(xué)檢測的詳細(xì)信息參見WO02/42480。因此，所述術(shù)語指表現(xiàn)MVA-BN保藏抹的至少一種下述特性，但在其基因組中有一或多處不同的痘苗病毒。優(yōu)選的衍生物有至少二種，更優(yōu)選有至少三種，最優(yōu)選所有下述四種MVA-BN特性-在雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)以及在幼倉鼠腎細(xì)胞系BHK(ECACC85011433)中有繁殖性復(fù)制(reproducetivereplication)能力，但是在人細(xì)胞系HaCat中無繁殖性復(fù)制能力(Boukamp等1988,JCellBiol.106(3):761-71),-不能進(jìn)行體內(nèi)復(fù)制，畫與已知抹MVA575(ECACCV00120707)相比，在致死性攻擊才莫型中誘導(dǎo)更高的免疫原性，和/或-與DNA初次免疫(prime)/痘苗病毒增加強免疫(boost)的方案相比，在痘苗病毒初次免疫/痘苗病毒加強免疫的方案中誘導(dǎo)至少實質(zhì)上相同的免疫力水平。具體地，MVA-BN的衍生物具有與MVA-BN實質(zhì)上相同的復(fù)制特性。與保藏的病毒具有相同"復(fù)制特性"的病毒是，在CEF細(xì)胞和細(xì)胞系BHK，HeLa，HaCat以及143B細(xì)胞系中以相似的擴增比進(jìn)行復(fù)制、并且在轉(zhuǎn)基因小鼠模型AGR129中經(jīng)測定具有相似的復(fù)制的那些病毒。在本申請中使用的術(shù)語"不能進(jìn)行繁殖性復(fù)制"如WO02/42480中所定義。因此，"不能進(jìn)行繁殖性復(fù)制"的病毒是指在人細(xì)胞系HaCat中擴增比小于1的病毒(Boukamp等1988,JCellBiol.106(3):761-71)。優(yōu)選地，作為本發(fā)明載體使用的病毒在人細(xì)胞系HaCat中的擴增比為0.8或更少。病毒的"擴增比"是指，感染細(xì)胞所產(chǎn)生的病毒量(輸出量)與最初用于感染細(xì)胞的病毒量(輸入量)的比例("擴增比")。輸出量與輸入量的比例為"1"表示，感染細(xì)胞產(chǎn)生的病毒量與最初用于感染細(xì)胞的病毒量相等的擴增狀態(tài)。。在定義MVA-BN及其衍生物的上下文中，本申請所用術(shù)語"不能進(jìn)行體內(nèi)復(fù)制"與WO02/42480中定義相同。因此，所述術(shù)語如WO02/42480所述，是指那些不能在人體和小鼠模型中復(fù)制的病毒。WO02/42480使用的小鼠不能產(chǎn)生成熟B細(xì)胞和T細(xì)胞(AGR129小鼠)。具體地，MVA-BN和其衍生物，在對AGR129小鼠腹腔注射1(TpfU個病毒進(jìn)行感染后，至少45天內(nèi)不殺死小鼠，優(yōu)選至少60天內(nèi)，最優(yōu)選至少卯天內(nèi)。優(yōu)選地，"不能在體內(nèi)進(jìn)行復(fù)制"的病毒的另一特征是，在對AGR129小鼠腹腔注射107pfli個病毒進(jìn)行感染后，至少45天不能從該小鼠的器官或組織中收獲到任何病毒，優(yōu)選至少60天，最優(yōu)選至少90天。MVA-BN及其衍生物優(yōu)選在WO02/42480所述的致死攻擊小鼠模型中測得，致免疫性高于已知病林MVA575。在這樣的模型中，未接種的小鼠被具有復(fù)制能力的痘苗病抹如WesternReserve抹L929TK+或IHD-J感染后死亡。在描述致死攻擊模型的上下文中，被具有復(fù)制能力的痘苗病毒感染，該過程稱為"攻擊"。受攻擊4天后，小鼠通常被殺死，卵巢中的病毒滴度用VERO細(xì)胞經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)空斑試驗進(jìn)行測定。對未接種的小鼠，以及接種了本發(fā)明的痘苗病毒的小鼠，測定它們的病毒滴度。更具體地，MVA-BN及其衍生物在上述檢驗中，接種1(^TCID5o/ml的病毒比不接種病毒，小鼠卵巢病毒滴度減少至少70%,優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少90%。MVA-BN或其^f汙生物優(yōu)選具有以下特性在痘苗病毒初次免疫/痘苗病毒加強免疫方案中誘導(dǎo)出與DNA初次免疫/痘苗病毒加強免疫方案相比，至少實質(zhì)上相同水平的免疫力。當(dāng)在WO02/42480所述"試驗1"和"試驗2"(優(yōu)選全部兩種試驗)中測定，CTL應(yīng)答在疽苗病毒初次免疫/痘苗病毒加強免疫方案中與在DNA-初次免疫/痘苗病毒加強免疫方案中相比，至少實質(zhì)上相同，則認(rèn)為痘苗病毒可以在痘苗病毒初次免疫/痘苗病毒加強免疫方案中誘導(dǎo)出與在DNA初次免疫/痘苗病毒加強免疫方案中至少實質(zhì)上相同水平的免疫力。更優(yōu)選，在至少一種上述試^r中，痘苗病毒初次免疫/痘苗病毒加強免疫后的CTL應(yīng)答比DNA-初次免疫/痘苗病毒加強免疫后的高。最優(yōu)選CTL應(yīng)答在兩種試驗中都更高。WO02/42480公開了如何獲得具有MVA-BN及其衍生物的上述特性的癥苗病毒。將上述定義的DNA插入到痘病毒DNA中的方法，以及獲得重組痘病毒的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。在重組痘苗病毒中，本發(fā)明所述DNA的表達(dá)優(yōu)選但并不僅僅在痘病毒啟動子(更優(yōu)選痘苗病毒啟動子)的轉(zhuǎn)錄控制下進(jìn)行。本發(fā)明所述的DNA優(yōu)選'插入到病毒基因組非必要區(qū)域內(nèi)。在本發(fā)明另一優(yōu)選實施方案中，異源核酸序列插入到MVA基因組的天然缺失位點處(PCT/EP96/02926中公開)。概括的講，本發(fā)明一最優(yōu)選的實施方案是提供一種含有如上定義的DNA的載體，其中所述載體是MVA-BN或其衍生物，所述DNA含有編碼黃病毒NS1蛋白或其部分的表達(dá)盒，黃病毒優(yōu)選為登革熱病毒，更優(yōu)選為登革熱病毒血清型2。在一優(yōu)選實施方案中，發(fā)明涉及由本發(fā)明所述DNA編碼，或本發(fā)明所述載體編碼的NS1蛋白或其部分用于通過接種來抵抗多種黃病毒或黃病毒血清型的用途。對于本發(fā)明所述NS1蛋白或其部分的定義參見上面描述的部分，其中編碼NS1的DNA已經(jīng)定義為由所述DNA表達(dá)的產(chǎn)物。因此下面關(guān)于本發(fā)明所述蛋白的概述，不能看作是對本發(fā)明的限制。概括的講，NS1蛋白可以是由任意黃病毒編碼的分離的NS1蛋白或其部分。NS1蛋白或其部分優(yōu)選衍生自登革熱病毒，最優(yōu)選登革熱病毒血清型2。所述蛋白可以只包含病毒NS1蛋白或其部分的氨基酸序列。在一優(yōu)選實施方案中，NS1蛋白還可以包含對有效表達(dá)該蛋白必需的附加氨基酸。所述氨基酸/氨基酸序列的例子如上所示，且其包括在蛋白N末端、由附加的ATG密碼子編碼的蛋氨酸和衍生自E蛋白C末端、用于使NS1蛋白或其部分糖基化所需的信號序列的氨基酸序列。其它的信號序列也在本發(fā)明范圍之內(nèi)。在另一實施方案中，NS1氨基酸序列或其部分可以與其它蛋白/肽融合。融合伴侶的例子為允許識別該蛋白的序列，如標(biāo)記或其它黃病毒蛋白或其部分。在一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及作為疫苗，尤其作為抵抗多種黃病毒或黃病毒血清型的疫苗的本發(fā)明DNA，載體或NS1蛋白或其部分。"疫苗"是誘導(dǎo)特異性免疫反應(yīng)的化合物，即DNA、蛋白、載體或病毒。根據(jù)此實施方案的一個替代方案，本發(fā)明所述"疫苗"是基于一種登革熱病毒NS1蛋白或其部分，該蛋白或其部分能誘導(dǎo)抗登革熱病毒所有血清型的NS1蛋白的免疫反應(yīng)。特別地，已證實一種登革熱病毒血清型，尤其是血清型2的NS1蛋白誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)能抵抗至少兩種，優(yōu)選至少三種，最優(yōu)選登革熱病毒所有血清型的NS1蛋白，優(yōu)選還抵抗至少一種其它蚊媒黃病毒。如上所述，本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)本發(fā)明所述來自一種黃病毒的NSl蛋白或其部分能誘導(dǎo)抗其它黃病毒NS1蛋白的免疫反應(yīng)。如上所指出的，"黃病毒"優(yōu)選是蚊媒黃病毒。換句話說，本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在另一實施方案中，本發(fā)明所述來自一種蚊媒黃病毒的NS1蛋白或其部分誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答能抵抗衍生疫苗的蚊媒黃病毒的NS1蛋白，還能抵抗其它蚊媒黃病毒的NS1蛋白。因此，衍生自蚊々某黃病毒的疫苗可以作為抵抗一種或多種蚊媒黃病毒的疫苗。術(shù)語"衍生自黃病毒的載體，，或本說明書正文中的相似術(shù)語是指，包含上述DNA的上述載體(如痘病毒載體或質(zhì)粒)。因此，此術(shù)語涉及載體插入物而不是載體主鏈。一個"衍生自黃病毒的載體"的例子是包含含有痘病毒啟動子、編碼黃病毒NS1蛋白或其部分的序列的表達(dá)盒的痘病毒載體，如MVA，其中所述編碼黃病毒NS1蛋白或其部分的序列前面接有ATG密碼子和編碼糖基化信號序列的序列，并且所述編碼序列止于翻譯終止密碼子。因此，用所述DNA、載體或NS1蛋白或其部分進(jìn)行的接種可以作為抵抗較寬范圍的黃病毒或至少黃病毒血清型的單一亞單位疫苗。編碼來自一種黃病毒或黃病毒血清型的NS1蛋白或其部分的DNA或載體，或者來自所述黃病毒或血清型的NS1蛋白或其部分，因此可以用作通過接種來抵抗其它黃病毒和黃病毒血清型的疫苗。例如，衍生自登革熱病毒血清型2的疫苗可以用作抵抗血清型1，3和4中一種、二種或所有的疫苗，以及抵抗血清型2的疫苗。它可以進(jìn)一步用于保護個體抵抗其它黃病毒，如西尼羅病毒、日本腦炎病毒和黃熱病病毒。在一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明所述DNA用作疫苗。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，用本發(fā)明中的含有真核表達(dá)盒的棵露DNA，尤其是DNA進(jìn)行肌內(nèi)注射，將引起由該表達(dá)盒編碼的蛋白的表達(dá)。該蛋白暴露于免疫系統(tǒng)，并引起特異性免疫反應(yīng)。在另一實施方案中，通過施用本發(fā)明所述載體，特別是病毒載體，更優(yōu)選痘病毒載體，最優(yōu)選痘苗病毒載體，如MVA載體來進(jìn)行接種。為了制備基于痘苗病毒的疫苗，可將本發(fā)明所述病毒，尤其是MVA-BN和其衍生物轉(zhuǎn)變?yōu)樯韺W(xué)上可接受的形式。這可以依據(jù)用于天花預(yù)防性接種的痘病毒疫苗的制備經(jīng)驗來進(jìn)行(參見Stickl，11等[1974]Dtsch.med.Wschr.99,2386-2392)。例如，將純化的病毒以5xl08TCID5Q/ml的濃度配制在約10mMTris，140mMNaClpH7.4中，-80°。保存。為了制備疫苗針劑(vaccineshot)，例如，將102-109的病毒顆粒，在有2%蛋白胨和1%人白蛋白存在的情況下，凍干在安瓿(優(yōu)選玻璃安瓿)內(nèi)的100ml磷酸鹽緩沖液(PBS)中。特別優(yōu)選用于接種的基于痘苗病毒的疫苗，特別是基于MVA-BN的疫苗以凍干狀態(tài)儲存。在實施例部分顯示，如果用作接種的病毒以凍干病毒形式儲存，由一種黃病毒NS1蛋白誘導(dǎo)的分別對不同黃病毒NS1和黃病毒血清型NS1蛋白的免疫反應(yīng)和免疫反應(yīng)的交叉反應(yīng)百分比會非常地高。因此，疫苗針劑優(yōu)選通過將病毒在配制劑中逐步凍干的方式產(chǎn)生。這種配制劑可包含適于體內(nèi)給藥的額外添加劑，如甘露醇，葡聚糖，糖，甘氨酸，乳糖，或聚乙烯吡咯烷酮，或其它添加劑，如抗氧化劑或惰性氣體，穩(wěn)定劑或重組蛋白(如人血清白蛋白)。適于凍干的包含病毒的典型配制劑含有10mMTris-緩沖液，140mMNaCl,18.9g/l葡聚糖(MW36000-40000)，45g/l蔗糖，0.108g/l—水合L-谷氨酸單鉀鹽，pH7.4。然后將玻璃安瓿密封，在介于4。C和室溫之間的溫度中保存數(shù)月。但是，只要不必使用，優(yōu)選將安瓿保存在-20。C以下。為了進(jìn)行接種，可將凍干品溶于0.1-0.5ml水溶液中，如，水，生理鹽水或Tris緩沖液，經(jīng)過系統(tǒng)途徑或局部途徑給藥，即通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的胃腸道外途徑、肌肉途徑或任何其它給藥途徑來給藥。給藥方式、給藥劑量以及給藥次數(shù)可由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過已知的方式最優(yōu)化。痘病毒載體最優(yōu)選皮下或肌肉給藥。最優(yōu)選所述接種通過間隔例如3-5周的兩次疫苗注射來進(jìn)行。如果疫苗是含有本發(fā)明所述DNA的MVA-BN載體或其衍生物，本發(fā)明的一個具體實施方案涉及一種接種試劑盒，它在第一個瓶/容器中含有首次接種(初次免疫)所用的本發(fā)明MVA-BN病毒載體，在第二個弁fL/容器中含有二次接種(力D強免疫)所用的本發(fā)明MVA-BN病毒載體。如果疫苗為含有上述DNA的MVA-BN載體或其衍生物，本發(fā)明的一個具體實施方案涉及在首次接種("初次接種")和二次接種("加強接種")中以治療有效量給予疫苗。初次接種和加強接種的時間間隔為，例如2至12周，優(yōu)選3到6周，更優(yōu)選約3周。用于接種注射的病毒量至少為lx102TCID50，優(yōu)選如1x1()7tCID5o到lxl09TCID50。此外，本發(fā)明的一個具體實施方案涉及一種接種試劑盒，它在第一個瓶/容器中含有首次接種(初次免疫)所用的上述MVA-BN病毒載體，在第二個瓶/容器中含有二次接種(加強免疫)所用的上述MVA-BN病毒載體。因此，在疫苗實施方案中，本發(fā)明涉及一種含有如上所述DNA、載體或NS1蛋白或其部分的疫苗，以及所述DNA、載體或蛋白制備疫苗的用途。按照一優(yōu)選的實施方案，本發(fā)明涉及所述DNA、載體或蛋白制備疫苗的用途，其中NS1蛋白或其部分、由DNA或載體編碼的NS1蛋白或部分來自一種登革熱病毒血清型，且其中DNA、載體或NS1蛋白或其部分作為抵抗二種、三種或登革熱病毒所有血清型的疫苗。最優(yōu)選地，登革熱病毒血清型是血清型2。本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種治療或預(yù)防黃病毒感染的方法，包括在有需要的動物(包括人)體內(nèi)接種上述DNA、上述載體、或上述NS1蛋白或其部分。具體地，本發(fā)明涉及上述方法，其中所述NS1蛋白或其部分、或由DNA或載體編碼的NS1蛋白或其部分來自登革熱病毒血清型，其中DNA、載體或NS1蛋白或其部分作為抵抗二種、三種或登革熱病毒所有血清型的疫苗。發(fā)明概述具體地，本發(fā)明單獨或聯(lián)合涉及下列各項下述物質(zhì)在制備疫苗中的用途，-包含表達(dá)盒的核酸，所述表達(dá)盒含有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件以及至少編碼蚊媒黃病毒的NS1蛋白或其部分的序列，-包含所述核酸的載體，和/或-所述黃病毒的NS1蛋白或其部分，所述疫苗用于抵抗產(chǎn)生所述核酸或者產(chǎn)生所述NS1蛋白或其部分的蚊i某黃病毒，并4氏抗至少一種其它蚊:樣黃病毒。上述用途，其中產(chǎn)生所述核酸或者產(chǎn)生所述NS1蛋白或其部分的蚊々某黃病毒是登革熱病毒。下述物質(zhì)在制備疫苗中的用途，-包含表達(dá)盒的核酸，所述表達(dá)盒含有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件以及至少編碼登21革熱病毒血清型的NS1蛋白或其部分的序列，-包含所述核酸的載體，和/或-所述登革熱病毒血清型的NS1蛋白或其部分，所述疫苗用于抵抗登革熱病毒所有血清型，并可選擇抵抗至少一種其它蚊i某黃病毒。上述用途，其中產(chǎn)生所述核酸或者產(chǎn)生所述NS1蛋白或其部分的登革熱病毒是登革熱病毒血清型2。上述用途，其中編碼蚊媒黃病毒或登革熱病毒血清型的NS1蛋白或其部分的序列，在前面接有ATG密碼子和編碼糖基化信號序列的序列，且其中編碼序列在翻譯終止密碼子處終止。上述用途，其中所述其它蚊^某黃病毒選自西尼羅病毒、黃熱病病毒和日本腦炎病毒。上述用途，其中所述載體是痘病毒載體。上述用途，其中所述痘病毒載體為修飾的安卡拉痘苗病毒(MVA)林，特別是保藏在歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心、編號為V00083008的MVA-BN或其書亍生物。上述用途，其中所述痘病毒載體已經(jīng)凍干，并且可以于給藥前在藥學(xué)上可接受的稀釋劑中重構(gòu)。上述用途，其中轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件是痘病毒啟動子。上述用途，其中疫苗在首次接種("初次接種")和二次接種("加強接種")中以治療有效量給藥。一種治療或預(yù)防黃病毒感染的方法，其包括給有需要的動物(包括人)接種-包含表達(dá)盒的核酸，所述表達(dá)盒包含轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件以及至少編碼蚊媒黃病毒NS1蛋白或其部分的序列，-包含所述核酸的載體，和/或-所述黃病毒的NS1蛋白或其部分其中所述黃病毒感染是被產(chǎn)生所述核酸或者產(chǎn)生所述NS1蛋白或其部分的蚊媒黃病毒感染，和/或被另一種蚊媒黃病毒感染。上述方法，其中產(chǎn)生所述核酸或者產(chǎn)生所述NS1蛋白或其部分的蚊媒黃病毒是登革熱病毒。一種治療或預(yù)防黃病毒感染的方法，其包括給有需要的動物(包括人)接種-包含表達(dá)盒的核酸，所述表達(dá)盒包含轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件以及至少編碼登革熱病毒血清型NS1蛋白或其部分的序列，-包含所述核酸的載體，和/或-所述登革熱病毒血清型的NS1蛋白或其部分，其中所述黃病毒感染是被產(chǎn)生所述核酸或者產(chǎn)生所述NS1蛋白或其部分的登革熱病毒血清型感染，和/或被其它登革熱病毒血清型感染，和/或被其它蚊媒黃病毒感染。上述方法，其中產(chǎn)生所述核酸或者產(chǎn)生所述NS1蛋白或其部分的登革熱病毒是登革熱病毒血清型2。上述方法，其中所述編碼蚊媒黃病毒或登革熱病毒血清型的NS1蛋白或其部分的序列，在其前面接有ATG密碼子和編碼糖基化信號序列的序列，且其中編碼序列在翻譯終止密碼子處終止。上述方法，其中所述載體是痘病毒載體。上述方法，其中所述痘病毒載體是修飾的安卡拉痘苗病毒(MVA)抹。上述方法，所述MVA抹是保藏在歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心、編號為V00083008的MVA-BN或其衍生物。上述方法，其中所述痘病毒載體已經(jīng)凍干，并且可以于給藥前在藥學(xué)上可接受的稀釋劑中重構(gòu)。上述方法，其中所述轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件是痘病毒啟動子。上述方法，其中所述痘病毒載體或藥物組合物在首次接種("初次接種")和二次接種("加強接種，，)中以治療有效量給藥。一種痘病毒載體，它攜有包含表達(dá)盒的DNA,所述表達(dá)盒包含轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件以及至少編碼黃病毒NS1蛋白或其部分的序列，其中所述痘病毒是保藏在歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心、編號為V00083008的修飾的安卡拉痘苗病毒(MVA)林BN或其衍生物。上述痘病毒載體，其中所述黃病毒是蚊媒黃病毒，特別是登革熱病毒。上述痘病毒載體，其中所述登革熱病毒是登革熱病毒血清型2。上述痘病毒載體，其中所述編碼黃病毒NS1蛋白或其部分的序列，在其前面接有ATG密碼子和編碼糖基化信號序列的序列，且其中編碼序列在翻譯終止密碼子處終止。上述痘病毒載體，其中所述轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件為痘病毒啟動子。上述痘病毒載體，其中所述痘病毒載體是凍千的。作為疫苗的上述痘病毒載體。一種藥物組合物，它包含上述痘病毒載體和藥學(xué)上可4妄受的載體(carrier)、稀釋劑和/或添力口劑。用于治療和/或預(yù)防黃病毒感染的上述痘病毒載體或上述藥物組合物，其中所述痘病毒載體或藥物組合物在首次接種("初次接種")和二次接種("加強接種")中以治療有效量給藥。一種治療和/或預(yù)防黃病毒感染的方法，包括給需要的動物(包括人)接種上述載體或上述藥物組合物。一種細(xì)胞，優(yōu)選人細(xì)胞，它含有上述痘病毒載體。上述痘病毒用于制備治療或預(yù)防黃病毒感染的疫苗的用途。一種用于初次免疫/加強免疫的試劑盒，它在第一個并57容器中含有首次接種(初次免疫)所用的上述痘病毒載體或上述藥物組合物，在第二個瓶/容器中含有二次接種(加強免疫)所用的上述痘病毒載體或上述藥物組合物。圖1A:作為本發(fā)明一個例子的構(gòu)建體的登革熱NGC株"信號序列+NS1"cDNA蛋白編碼序列。NS1基因的天然起始位點用箭頭指出。重要特征是添加了ATG起始密碼子和終止密碼子(在此例中為，，TAG，，)。核苷酸序列數(shù)字是指在NGC株基因組(Genbank登錄號AF038403)中的位置。圖1A中的核苦酸序列和氨基酸序列對應(yīng)于SEQ:IDNo.5。氨基酸單獨示于SEQ:IDNo.6。圖IB:含登革熱NGC抹"信號序列+NSl"蛋白編碼序列的質(zhì)粒pAF7NSl的圖譜。圖1C:在質(zhì)粒pAF7中的NS1組件的核香酸序列，顯示了用oBN345和oBN338進(jìn)行PCR擴增時位于此組件上的引物結(jié)合位點。圖1C中的核普酸和氨基酸序列對應(yīng)于SEQ:IDNo.7。氨基酸單獨示于SEQ:IDNo.8。圖ID:上圖:登革熱NGC株NS1的氨基酸序列(登革熱NCG多蛋白Genbank登錄號AF038403的氨基酸776-1127)的Kyte-Doolittle親水性圖譜。零以上的值=疏水。EM:含有衍生自E蛋白C末端最后28個氨基酸(氨基酸748-775)的信號序列的登革熱NGC抹NS1氨基酸序列的Kyte-Doolittle親水性圖譜。完整氨基酸序列代表登革熱NGC多蛋白(Genbank登錄號AF038403)的氨基酸748-1127，它對此病毒4朱而言始于"ATG"起始密碼子但缺少終止密碼子。Sig—言號序列。零以上的值=疏水。圖2:"痘病毒啟動子+信號序列+NSl"表達(dá)盒的核苷酸序列。圖2中的核苦酸和氨基酸序列對應(yīng)于SEQ:IDNo.9。氨基酸單獨示于SEQ:IDNo.lO。簡要地講，痘病毒的最小早期/晚期啟動子元件控制登革熱病毒血清型2的NS1蛋白表達(dá)，其中NS1蛋白的N末端與E蛋白的28個C末端氨基酸融合。翻譯在插入該核酸序列中的TAG終止密碼子處終止。圖3A:將NS1表達(dá)盒克隆入pBNX07平末端的Xhol位點(平端克隆化)，產(chǎn)生克隆pBN41。PP產(chǎn)痘病毒啟動子，D2F卜缺失位點2的旁側(cè)1，NPTII=新霉素抗性基因，IRES-內(nèi)部核糖體結(jié)合位點，EGFP^曾強的綠色熒光蛋白，NSl(pBN41中)H言號序列+NS1，D2F2二缺失位點2的旁側(cè)2,Sig—言號序列。AmpR-氨千青霉素抗性基因。圖3B:MVA(GenbankU94848)的HindIII圖譜，顯示了MVA六個缺失位點的位置(-J-=缺失位點的接頭)。將"PPr+NPTn+IRES+EGFP+PPr+NSl"組件插入MVA的缺失位點2。PPF痘病毒啟動子，NPTIP新霉素抗性基因(蛋白編碼序列)，IRES=內(nèi)部核糖體結(jié)合位點，NS1=信號序列+登革熱2NGC林的NS1蛋白編碼序列。圖4:ELISA吸光度圖譜，示出全部三只兔子免疫后的血清滴定。圖5:ELISA交叉反應(yīng)性研究。在ELISA-分析中，第38天(上部)和第66天(下部)的兔子血清與已被DENV-1、DENV-3、DENV-4、JEV和WNV感染的細(xì)胞的裂解液的交叉反應(yīng)性。實施例下面的實施例進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明。本領(lǐng)域4支術(shù)人員應(yīng)當(dāng)4艮理解下'「八郎實施例1:mBN07的構(gòu)建1.NS1抗原詳述(圖1)本實施例涉及衍生自NewGuineaC4朱-NGC沖朱(例如Genbank序列AF038403)的血清型2的NS1。由于黃病毒的NSl蛋白作為多蛋白前體的一部分而產(chǎn)生，因此在相應(yīng)DNA中的NSl基因前面不接有，，ATG"起始密碼子。因此，編碼NS1蛋白的cDNA序列必須需要添加一個"ATG"起始密碼子。接著添加信號序列使得新合成的NS1蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)糖基化。最后，蛋白編碼組件需要一個終止密碼子，在這個實施例中是將TAG加到蛋白編碼cDNA序列的3'末端。在本發(fā)明使用的實施例中，"ATG+信號序列"元件源自E蛋白疏水性C末端(最后28個氨基酸，其中NGC抹以氨基酸M(ATG沐始)。圖1A顯示作為本發(fā)明實例使用的確切的信號序列加上NSl序列(見SEQ:ID5和6)。"信號序列+NSl"核苷酸編石馬序列通過RT-PCR擴增從登革熱NGC基因組RNA中獲得，其使用下述引物D2NS1陽1上游5'-ACA^a47U7UGAATGAATTCACGTAGCACCTCA-3'(SEQ:IDNO4)斜體字為BglII限制性核酸內(nèi)切酶識別位點。下劃線為起始密碼子。D2NS1-2下游5'-AAL404rC7lCTACTAGGCTGTGACCAAGGAGTT-3'(SEQ:IDNO3)斜體字為BglII限制性核酸內(nèi)切酶識別位點。下劃線為終止密碼子。使用購自RocheMolecularBiochemical(CatalogNo,1-939-823)的TitanOneTubeRT-PCR試劑盒，按照制造商的推薦進(jìn)行RT-PCR擴增。但是，實際上可以使用任何商業(yè)的或非商業(yè)的RT-PCR試劑盒。RT-PCR產(chǎn)物可以接著克隆到許多可商購的細(xì)菌克隆質(zhì)粒中任何多克隆位點的BamHI位點，但是在此實施例中它凈皮克隆入pAF7，得到克隆pAF7D2NSl-其序列詳見圖1B和1C。圖ID顯示NSl氨基酸序列和添加了E蛋白C末端氨基酸編碼序列中信號序列的NSl的疏水性圖語。2.NSl表達(dá)盒詳述(圖2)為了表達(dá)來自痘病毒載體，如金絲雀痘、禽痘、牛痘或MVA的"信號序列+NSI",需要將痘病毒啟動子加到此cDNA的5'末端。聚腺苷酸化信號序列不是必需的，因為所有痘病毒合成性RNA被病毒編碼的酶聚腺芬酸化，這種酶在實現(xiàn)此功能時不需要polyA附加信號序列。任何痘病毒啟動子都可以用于此組件的表達(dá)。圖2和SEQ:IDNo.9和10顯示作為本發(fā)明實例的"痘病毒啟動子+信號序列+NSl"組件的核苷酸序列。作為本發(fā)明使用的實例，"信號序列+NSl"進(jìn)一步用引物oBN338和oBN345從NS1質(zhì)?？寺∵M(jìn)行PCR擴增。oBN345引物包含該克隆質(zhì)粒中靶序列5'側(cè)的痘病毒最小啟動子元件的核酸序列。oBN345引物結(jié)合所需的質(zhì)粒靶序列在信號序列起始密碼子上游約40個核苷酸處。這樣就保證了RNA轉(zhuǎn)錄物在信號序列ATG起始密碼子前包含一段非蛋白編碼序列。PCR引物與Ps啟動子oBN338:5'-TTGTTAGCAGCCGGATCGTAGACTTAATTA(30mer)(SEQ:IDNo.1)oBN345:5'-CAAAAAATTGAAATTTTATTTTTTTTTTTTGGAATATAAATAAAAACACGATAATACCATGG-3'(SEQ:IDNo.2)(下劃線核苦酸代表痘病毒最小啟動子序列。)PCR擴增反應(yīng)前5個循環(huán)的退火溫度，從與oBN34克隆載體中同源序列結(jié)合的核苷酸序列計算出。3.NS1表達(dá)盒整合入MVA(圖3)將PCR擴增產(chǎn)物平端化，再克隆入質(zhì)粒pBNX07的切口和平端Xhol位點(見圖3a)，而形成質(zhì)粒pBN41(見圖3a)。pBN41是通過同源重^BL將"pox啟動子+信號序列+NSl"組件整合入MVA的缺失位點2的載體。pBN41(圖3a)的基本特4正如下畫質(zhì)粒骨架是來自Stratagene的pBluescriptSK+(GenbankVB0078)-D2F1:缺失位點2旁側(cè)1同源重組臂。它代表MVAGenbank序歹'JU94848的20117到20717的核普酸序列。-PPr:痘病毒啟動子。-NPTII:新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶蛋白編碼序列(GenbankV00618的蛋白編碼序列)。國IRES:來自腦心肌炎病毒的內(nèi)部核糖體進(jìn)入序列(Jang等，1989,GenbankM16802)。畫EGFP:增強綠色熒光蛋白的編碼序歹'K蛋白編碼序列-Genbank序列U57609的核苦酸675到核苷酸1394)-NS1:來自登革熱NGC抹的"信號序列+NSr蛋白編碼序列。-D2F2:缺失優(yōu)點2旁側(cè)2同源重組臂。它代表MVAGenbank序列U94848的20719到21343的核苷酸序列。-AmpR:pBluescript的氨千青霉素抗性基因3.1通過同源重組將登革熱"pox啟動子+信號序列+NSl"插入MVA的缺失位點遞^/^源,逾整合迷M^差^*上述整合載體pBN41通過pBN41旁側(cè)1和旁側(cè)2臂與MVA基因組中的同源靶序列之間的同源重組，將登革熱NS1表達(dá)盒加報告組件(pox啟動子+NPTII-IRES-EGFP)整合到MVA基因組。它通過將線性整合載體轉(zhuǎn)染到已用低感染復(fù)數(shù)(MOI，例如0.01個感染單位/每個細(xì)胞)的MVA感染的雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)中來完成。在感染后48小時或當(dāng)感染達(dá)到匯合時，制備病毒提取物并保存在-20。C，以準(zhǔn)備用于需要的重組MVA(rMVA)的篩選和克隆純化。H2rME4的謬這和義鏖遂化非重組MVA(空載體病毒)的消除和rMVA的擴增，在存在G418(G418的量必須優(yōu)化以便確定不殺死CEF細(xì)胞的最高劑量)的條件下，在低MOI時感染匯合的雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)來完成。在細(xì)胞維持培養(yǎng)基中添加了G418時，不包含或整合NPT2基因的任何病毒將不能復(fù)制。G418抑制DNA的復(fù)制，但是由于CEF細(xì)胞將會處于穩(wěn)定的非復(fù)制階段，CEF細(xì)月包將不會受G418作用的影響。由于增強熒光綠色蛋白的表達(dá)，rMVA感染的CEF細(xì)胞可以在焚光顯微鏡下觀察到。來自同源重組步驟的病毒提取物必須連續(xù)稀釋，并且在存在G418的條件下用來感染新鮮CEF細(xì)胞，并用低熔點瓊脂糖覆蓋。在感染2天后，在熒光顯微鏡下觀察瓊脂糖感染平板，這種觀察只能發(fā)現(xiàn)綠色的感染細(xì)胞。這些細(xì)胞是有標(biāo)記的，可以將包含細(xì)胞感染灶的瓊脂糖取出并》文入含有無菌細(xì)胞維持培養(yǎng)基的1.5ml小離心管內(nèi)。通過在-20。C將小離心管凍融三次，使病毒從瓊脂糖塞中釋放出來。在瓊脂糖下進(jìn)一步克隆純化最好的克隆，直到通過PCR分析不存在空載體污染的跡象(3至30個克隆純化循環(huán))。然后通過RT-PCR擴增這些克隆，以進(jìn)一步嚴(yán)格測定是否獲得正確的插入構(gòu)型，確認(rèn)啟動子-外源基因組件的序列和分析表達(dá)。在這些分析后，只有一個克隆進(jìn)一步在G418選擇條件下擴增，以便制備出母液用于進(jìn)一步鑒定和免疫原性研究。插入本發(fā)明所述登革熱NS1表達(dá)盒的重組MVA命名為mBN07。圖3b顯示mBN07中插入的外源序列的構(gòu)型。4.真正NS1的MVA表達(dá)來自重組MVA，mBN07，的NS1蛋白表達(dá)在非變性條件下通過標(biāo)準(zhǔn)western印跡分析證實。更具體地，用MOI為1.0感染單位/細(xì)胞的純化mBN07來感染哺乳動物組織培養(yǎng)細(xì)胞，例如BHK-21細(xì)胞，分析NS1表達(dá)。從那些感染24-30小時后的感染細(xì)胞制備出粗蛋白提取物，其中一部分用含2巰基乙醇(2-ME)或不含2-ME的SDS-PAGE凝膠加樣緩沖液混合。這些樣品加上來自感染登革熱NGC林的細(xì)胞(蚊細(xì)胞系)的蛋白提取物作為陽性對照，在SDS-PAGE凝膠中電泳分離，然后印跡到硝酸纖維素膜上。膜用抗登革熱NS1單克隆抗體探測。結(jié)果顯示，mBN07表達(dá)的NS1被抗登革熱NS1單克隆抗體識別，并形成與來自登革熱感染細(xì)胞(與不含2-ME的未煮沸mBN07泳道以及不含2-ME的未煮沸DEN2泳道相比)的NS1類似的正確二聚體形式。另外顯示，在變性條件下二聚體形式分解為單體形式(見含2-ME的煮沸的mBN07泳道)。在western印跡分析中，用mBN07感染的細(xì)胞中表達(dá)的NS1也被混合的康復(fù)病人血清和能與所有四種登革熱血清型的NS1交叉反應(yīng)的單克隆抗體識別。這表明mBN07表達(dá)的NS1具有免疫原性。在整個實施例部分，mBN07(有時也稱為BN07)是以液態(tài)Cf壬選冷凍)，或是凍干狀態(tài)保存。為了獲得凍干病毒，制備了含有病毒的溶液，它包含lOmMTris-緩沖液，140mMNaCl，18.9g/l葡聚糖(分子量36000-40000)，45g/l蔗糖，0.108g/l—水合L-谷氨酸單鉀pH7.4。然后將所述配制劑凍干。為了重組，在凍干制劑中加入水。實施例2:mBN07表達(dá)的NS1對除了血清型2以外的登革熱病毒NS1和曰本腦炎病毒(JEV)NS1和西尼羅病毒(WNV)NS1的交叉免疫原性1.從mBN07表達(dá)的NS1:對病人康復(fù)期血清的反應(yīng)性檢測mBN07表達(dá)的NSl被有早先登革熱病毒感染的個體的康復(fù)期病人血清識別的可能性。選取具有抗登革熱病毒包膜蛋白的抗體(通過免疫印跡證實其抵抗登革熱血清型1至4的真正抗原)的68例個體的血清，檢測由mBN07感染細(xì)胞提取物制備的免疫印跡條帶，將MVA-GFP感染細(xì)胞的提且不加熱。檢測的68份個體血清中，62份(91.2%)與免疫印跡中由mBN07表達(dá)的BN07NS1反應(yīng)。進(jìn)一步分析這些血清對所有4種登革熱病毒血清型和日本腦炎病毒(JEV)的NS1的反應(yīng)性。結(jié)果示于表l。54份血清與登革熱病毒所有血清型和日本腦炎病毒(JEV)的NS1反應(yīng)，而且這54份血清中的53份(98.2%)也與mBN07表達(dá)的NS1反應(yīng)。7份血清對至少一種登革熱病毒血清型的NS1是特異的，而且不與JEV的NS1反應(yīng)。所有這7份血清也與mBN07表達(dá)的NS1反應(yīng)。另外的7份血清只與JEV的NS1反應(yīng)，而不與任何登革熱病毒血清型的NS1反應(yīng)，然而這些JEV-特異性血清中的2份(28.6%)也與mBN07表達(dá)的NS1反應(yīng)。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>真正NS1和mBN07表達(dá)的NS1的抗血清反應(yīng)比較。括弧中檢測樣品陽性數(shù)/檢測樣品總數(shù)。DEN-登革熱，JEV:日本腦炎病毒。對相同的68份血清也進(jìn)行了抵抗前膜蛋白的反應(yīng)性的分析。在發(fā)明人的經(jīng)驗中，抵抗前膜的抗體比抵抗NS1或E的抗體更具特異性。這樣，已感染登革熱的患者將會產(chǎn)生識別登革熱病毒前膜而非JEV前膜的抗體，反之亦然。沿著這條線的分析將會提供更好的個體感染歷史的預(yù)測。表2顯示了來自22名患者的血清僅與真正登革熱前膜蛋白反應(yīng)，提示這22名患者只暴露于登革熱病毒而非JEV。所有這22份血清與mBN07表達(dá)的NS1反應(yīng)。另外的22名患者有先前感染登革熱和JEV的證據(jù)，它們也全都與mBN07表達(dá)的NS1反應(yīng)。在這個組中也有21名有先前只感染JEV證據(jù)的患者(盡管這些血清有抵抗登革熱E的交叉反應(yīng)抗體)。有趣地是，這21名JEV反應(yīng)者中的17名(82°/。)與mBN07表達(dá)的NS1反應(yīng)。在整個組中，只有3份血清不與登革熱或JEV的前膜蛋白反應(yīng)，其中只有1份與mBN07表達(dá)的NS1反應(yīng)。這種情況的最可能理由是抗體滴度太低而無法用免疫印跡檢出。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>抵抗真正前膜和BN07NS1的抗血清反應(yīng)比較。括弧中檢測樣品陽性數(shù)/檢測樣品總數(shù)。DEN:登革熱，JEV:日本腦炎病毒。表2中的數(shù)據(jù)也清楚地顯示了在6份不與mBN07表達(dá)的NS1反應(yīng)的血清中，4份來自先前感染了JEV而非登革熱的個體，剩余的2份無可檢出的對登革熱或JEV前膜蛋白的抗體，可能是由于低滴度。2.給兔接種mBN07并用免疫印跡和ELISA分析檢測抗登革熱病毒和日本腦炎病毒的免疫后血清三只無特異性病原體的兔子按照如下所示疫苗接種程序采用皮下途徑免疫。每只兔子用使用無菌水重構(gòu)到lml的一瓶凍干疫苗(lxl0e8TCID50BN07凍千疫苗)在第0天和第28天接種。在第一次接種前(預(yù)取血)和第二次4妾種的10天后采取血樣。第0天=預(yù)取血后第一次接種第28天-第二次接種第38天=取血第56天-第三次接種第66天=取血第112天=從每只兔中抽取50ml血2.1抵抗登革熱血清型2免疫印跡的前期取血和免疫后血清檢測登革熱2病毒抗原和未感染的C6/36細(xì)胞的抗原通過在非變性條件下的SDSPAGE分離。為了免疫印跡分析，使用第38天的血清(稀釋1:200)。結(jié)果清楚地顯示，接種mBN07使所有三只兔子產(chǎn)生高滴度的抗NS1抗體，且該抗體能與組織培養(yǎng)蚊細(xì)胞被登革熱血清型2感染后產(chǎn)生的真正NS1交叉反應(yīng)。在接種前采集的血清不與免疫印跡上的任何登革熱蛋白反應(yīng)。第38天的免疫后血清在1:1000，1:2000，1:4000,1:10'4,1:10-5，1:1(T6下滴定，并在非變性條件下通過SDSPAGE分離的登革熱2病毒抗原免疫印跡條和未感染的C6/36細(xì)胞的對照條上檢測。第38天的三份兔子血清終點滴度計算為I:IO，OOO。第66天的血清終點滴度在免疫印跡和ELISA分析中都計算為lxl()S(數(shù)據(jù)未顯示)。免疫前和免疫后的血清都在1:10-2,1:10-3，1:1(T4，1:10-5，1:10-6，1:1(T7時滴定，而且在間接IgGELISA中檢測?？子胠:250稀釋度的登革熱2和未被感染的C6/36的裂解液包被。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>示出每只兔子的免疫前和免疫后血清在不同稀釋度下的ELISA吸光度(Pre二免疫前血清，Post-免疫后血清)每只兔子的免疫后血清滴定示于圖4中。每只兔子的免疫后血清估計終點稀釋度為1:1000。2.2抵抗登革熱血清型1、3、4和日本腦炎病毒和西尼羅病毒免疫印跡的前期取血和免疫后血清;險測第38天的每份兔子血清在1:1000稀釋度下，在非變性條件下通過SDSPAGE分離的登革熱1、2、3、4和JE病毒抗原的免疫印跡條加未感染的C6/36細(xì)胞的對照條上檢測。顯示每份兔免疫后血清與來自登革熱血清型1、3和4的NS1以及與在日本腦炎免疫印跡上的NS1反應(yīng)。第66天的每份兔子血清在1:1000稀釋度下，在非變性條件下通過SDSPAGE分離的登革熱1、3、4、WNV和JE病毒抗原的免疫印跡條加未感染的C6/36細(xì)胞的對照條上檢測。顯示每份兔免疫后血清與來自登革熱血清型1、3和4的NS1以及與在日本腦炎病毒和西尼羅病毒免疫印跡上的NS1反應(yīng)。為了證實免疫印跡分析，進(jìn)行了Elisa交叉反應(yīng)分析。微滴定板上的孔用l:250稀釋度的DENV-1、DENV-3、DENV-4、JEV、WNV和未感染的細(xì)胞的裂解液包被。血清為第38天(圖5A)和第66天(圖5B)的血清。從免疫印跡分析和ELISA試驗中可以得出結(jié)論由登革熱病毒NS1誘導(dǎo)的抗體與所有其它登革熱血清型、JEV和WNV交叉反應(yīng)。2.3.結(jié)論-用mBN07疫苗免疫的兔子誘導(dǎo)能識別真正登革熱病毒血清型2NS1的抗體。-當(dāng)免疫印跡分析和ELISA中的終點分別在1:1()4和1:1(^時觀察到非常高的免疫反應(yīng)。-在兔子中誘導(dǎo)的抗體與所有其它登革熱血清型(l,3和4)交叉反應(yīng)。-所述抗體也與來自異源病毒，如JEV和WNV的NS1交叉反應(yīng)。3.小鼠中的免疫原性研究雌性遠(yuǎn)系小鼠通過腹膜內(nèi)途徑用表達(dá)登革熱病毒NS1的mBN07以不同量和方案免疫，如下所示。mBN08(—種與mBN07相應(yīng)〗旦不表達(dá)NS1的MVA)和PBS作為對照。小鼠血清用來檢驗小鼠中產(chǎn)生的抗體是否能夠在Western印跡上分別與來自不同黃病毒血清型和日本腦炎病毒的NS1蛋白反應(yīng)。來自對照小鼠的血清在所有試驗中都是陰性的。分析下列各組:<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>在免疫印跡試驗中，得到下列結(jié)果:表7<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>用Balb/c小鼠獲得了非常相似的試驗在第0天和第21天給小鼠兩次接種lxl0STCIDs。BN07(凍干并用水重構(gòu))。在第42天采集血清。100%的血清與登革熱病毒2NS1反應(yīng)，100%的血清與來自所有四種登革熱病毒血清型的NS1蛋白反應(yīng)，75%的血清與JEV的NS1蛋白反應(yīng)。用lxl08TCID50非凍干BN07接種的結(jié)果如下100%的血清與來自所有四種登革熱病毒血清型的NS1蛋白反應(yīng)。識別來自JEV的NS1的血清比用凍干BN07接種小鼠獲得的血清差。結(jié)論-用BN07免疫的小鼠100。/。具有對DENV-2NS1的非常強反應(yīng)的抗體。-用lxl0e7TCID50BN07免疫小鼠的免疫反應(yīng)與用lxl0e8TCID50BN07免疫小鼠的免疫反應(yīng)一樣強(數(shù)據(jù)未示出)。-在間隔4周和取血前4周免疫的小鼠上觀察到最好的交叉反應(yīng)性百分比。-與用非凍干疫苗免疫的小鼠相比，用BN07凍干疫苗免疫的小鼠對NS1具有更強的反應(yīng)。參考文獻(xiàn)NimmannityaS,KalayanarooS，NisalakA，andlnnesB.1990.Secondattackofdenguehemorrhagicfever.SoutheastAsianJournalofTropicalMedicineandPublicHealth,21:699BurkeDSandMonathTR,2001，F(xiàn)lavivimses.InFieldsVirology,FourthWilliamsandWilkins,Philadelphia.Pages1043-1125.FlamandM，MegretF，MathieuM，LePault,ReyFAandDeubelV.,1999.DengueVirusType1NonstructuralGlycoproteinNS1isSecretedfrommammaliancellsasasolublehexamerinaglycsylation-dependentfashion.J.Virol"73:6104-6110.JangSK,DaviesMV,KaufmanRJandWimmerE.,1989.Initiationofproteinsynthesisbyinternalentryofribosomesintothe5'nontransfatedregionofencephalomycarditisvirusRNAinvivo.J.Virol"63:1651-60.LindenbachBDandRiceCM.，2001,Flavivimsesandtheirreplication.InFieldsVirology,FourthEdition.EditedbyDavidMKnipeandPeterMHowley.PublishedbyLippincottWilliamsandWilkins,Philadelphia.Pages991-1041.SchlesingerJJ,BrandrissMWandWalshEE.，1987.Protectionofmiceagainstdengue2virusencephalitisbyimmunizationwiththedengue2virusnon-structuralproteinNS1.J,Gen.Virol"68:853-7SchesingerJJ，F(xiàn)oltzerMandChapmanS.,1993.TheFcportionofantibodytoyellowfevervirusNS1isadeterminantofprotectionagainstyellowfeverencephalitisinmice.Virology.192:132-41本說明書中描述的技術(shù)和步驟是分子生物學(xué)和病毒學(xué)，特別是黃病毒病毒學(xué)和痘病毒基因工程領(lǐng)域的專業(yè)人員所熟悉的。所述技術(shù)和步驟可以在下述文獻(xiàn)中找到更詳細(xì)的描述MolecularCloning,AlaboratoryManual.SecondEdition.ByJ.Sambrook:E.F.FritschandT.Maniatis.ColdSpringHarborLaboratoryPress.1989.VirologyMethodsManual.EditedbyBrianWJMahyandHillarOKangro.AcademicPress.1996.MolecularVirology:APracticalApproach.EditedbyAJDavisonandRMElliott.ThePracticalApproachSeries.IRLPressatOxfordUniversityPress.Oxford1993.Chapter9:Expressionofgenesbyvacciniavirusvectors-CurrentProtocolsinMolecularBiology.Publisher:JohnWileyandSonlnc.1998.Chapter16，sectionlV:Expressionofproteinsinmammaliancellsusingvacciniaviralvector.Antibodies,ALaboratoryManual.ByEdHarlowandDavidLane.ColdSpringHarborLaboratoryPress.1988.關(guān)于微生物保藏的說明(細(xì)則13之二)<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>關(guān)于微生物保藏的說明(細(xì)則13之二)<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>PCT/RO/134表(1992年7月)序列表<110>巴法里安諾迪克有限公司(BavarianNordicA/S)文圖爾技術(shù)公司(VentureTechnologiesSdnBhd)<120〉黃病毒NS1亞單位疫苗<130>NS1-Dengue<140〉0000<141>2001—12—04<160>10<170>PatentlnVer.2.1<210>1<211〉30<212〉DM<213>人工序列<220><223〉人工序列的描述引物<400>1ttgttagcagccggatcgUgacttaatta30<210〉2<211〉62<212>腿<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>2caaaaaattgsaattttattttttttttttggjiatataaataaeiaacacgataataccat60gg62<210〉3<211>33<212〉DM<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>3aatagatctctactaggctgtgaccaaggagtt33<210>4<211>33<212〉DNA<213〉人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400〉4acaagatctggaatgaattcacgtagcacctea33<210>5<211〉1143<212>DNA<213>2型登革熱病毒<220〉<221〉CDS<222>(l)..(1140)<223>E蛋白信號序列+NS1編碼序列<400〉5atgaatteacgcageaccteactgtctgtgteaetagtattggtggga48MetAsnSerArgSerThrSerLeuSerValSerLeuValLeuValGly151015gtcgtgaxgctgUtUgggagttatggtgcaggccgatagtggttgc96ValValThrLeuTyrLeuGlyValMetValGinAlaAspSerGlyCys202530gttgtgagetggaaaaacaaagaactgaagtgtggcagtgggattttc144ValValSerTrpLysAsnLysGluLeuLysCysGlySerGlyliePhe354045ateacagacaacgtgcacacatggacagaacaatacaagttccaacca192lieThrAspAsnValHisThrTrpThrGluGinTyrLysPheGinPro505560gaateccctteaaagetagetteaget3tccsgaaagetcatgaagag240GluSerProSerLysLeuAlaSerAlalieGinLysAlaHisGluGlu65707580ggcatttgtggaatecgcteagtaacaagactggaaaatctgatgtgg288GlylieCysGlylieArgSerValThrArgLeuGluAsnLeuMetTrp859095aaacaaataacaccagaaUgaatcacattetateagaaaatgaggtg336LysGinlieThrProGluLeuAsnHislieLeuSerGluAsnGluVal100105110aagUgactattatgacaggagacateaaaggaateatgcaggcagga384LysLeuThrlieMetThrGlyAsplieLysGlylieMetGinAlaGly115120125aaacgatctctgcagccccagcccactgagctgaagtatteatggaaa432LysArgSerLeuGinProGinProThrGluLeuLysTyrSerTrpLys130135140acatggggcaaagcgaaaatgetctctacagagtctcataaccagacc480ThrTrpGlyLysAlaLysMetLeuSerThrGluSerHisAsnGinThr145150155160Utetcattgatggccccgaaacagcagaatgccccaacacaaacaga528PheLeulieAspGlyProGluThrAlaGluCysProAsnThrAsnArg165170175gettggaattcgctggaagttgaagactatggcUtggagtattcacc"6AlaTrpAsnScrLeuGluValGluAspTyrGlyPtieGlyValPheThr180185190accaatatatggcUaagUgagagaaaagcaggatgtattctgcgac624ThrAsnlieTrpLeuLysLeuArgGluLysGinAspValPheCysAsp195200205teaaaaetcatgteagcggccataaaagacaacagagccgtccatgcc672SerLysLeuMetSerAlaAlalieLysAspAsnArgAlaValHisAla210215220gatatgggttattggatagaaagtgcaetcaatgacacatggaagata720AspMetGlyTyrTrplieGluSerAlaLeuAsnAspThrTrpLyslie225230235240gagaaagcctctttcategaagttaaaagetgccactggccaaagtea768GluLysAlaSerPhelieGluValLysSerCysHisTrpProLysSer245250255cacaccetctggagtaatggagtgUagaaagtgagatgataattcca816HisThrLeuTrpSerAsnGlyValLeuGluSerGluMetlieliePro260265270aagaatUcgetggaccagtgteacaacacaactacagaccaggctac864LysAsnPheAlaGlyProValSerGinHisAsnTyrArgProGlyTyr275280285catacacaaacagcaggaccatggcatetaggtaagcttgagatggac912HisThrGinThrAlaGlyProTrpHisLeuGlyl^sLeuGluMetAsp290295300tttg"Uctgcgaaggaaccacagtggt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AspPheCysGluGlyThrThrValValValThrGluAspCysGly305310315320AsnArgGlyProSerLeuArgThrThrThrAlaSerGlyLysLeulie325330335ThrGluTrpCysCysArgSerCysThrLeuProProLeuArgTyrArg340345350GlyGluAspGlyCysTrpTyrGlyMetGlulieArgProLeuLysGlu355360365LysGluGluAsnLeuValAsnSerLeuValThrAla370375380權(quán)利要求1.一種痘病毒載體，該痘病毒載體的痘病毒基因組中插入了包含表達(dá)盒的DNA，所述表達(dá)盒包含轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件和編碼完整的黃病毒NS1蛋白或其仍能引起免疫反應(yīng)的表位，其中所述痘病毒是具有保藏在歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心的MVABNV00083008的下述特征的病毒(i)在雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)中有繁殖性復(fù)制能力，但是在人類骨肉瘤細(xì)胞系143B、人類角質(zhì)細(xì)胞系HaCat和人類宮頸腺癌細(xì)胞系HeLa無繁殖性復(fù)制能力，和(ii)不能在不能產(chǎn)生成熟B和T細(xì)胞的小鼠模型體內(nèi)復(fù)制。2.權(quán)利要求1的痘病毒載體，其中所述表達(dá)盒還包含編碼其它黃病毒肽/蛋白的序列，如果該其它黃病毒肽/蛋白來源于E蛋白，那么其包含少于40個氨基酸，但至少包含糖基化信號序列。3.權(quán)利要求1或2的痘病毒載體，其中所述黃病毒是蚊媒黃病毒。4.權(quán)利要求3的痘病毒載體，其中所述蚊媒黃病毒是登革熱病毒。5.權(quán)利要求4的痘病毒載體，其中所述登革熱病毒是登革熱病毒血清型2。6.權(quán)利要求1至5之一的痘病毒載體，其中所述編碼黃病毒NS1蛋白或其仍能引起免疫反應(yīng)的表位的序列的前面接有ATG密碼子和編碼糖基化信號序列的序列，且其中編碼序列止于翻譯終止密碼子處。7.權(quán)利要求1至6之一的痘病毒載體，其中所述轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件為痘病毒啟動子。8.權(quán)利要求1至7之一的痘病毒載體，其中所述痘病毒載體是凍干的。9.一種藥物組合物，它包含權(quán)利要求1至8之一的痘病毒載體和藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑和/或添加劑。10.作為疫苗的權(quán)利要求1至8之一的痘病毒載體。11.權(quán)利要求10的痘病毒載體，其中所述疫苗用于進(jìn)行接種，以便抵抗產(chǎn)生所述核酸或者產(chǎn)生所述NS1蛋白或其表位的黃病毒或黃病毒血清型，和/或抵抗一種或多種其它黃病毒和/或黃病毒血清型。12.痘病毒載體在制備疫苗中的用途，其中所述痘病毒載體的痘病毒基因組中插入了包含表達(dá)盒的DNA,所述表達(dá)盒包含轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件和編碼完整的黃病毒NS1蛋白或其仍能引起免疫反應(yīng)的表位，所述疫苗是抵抗產(chǎn)生所述NS1蛋白或其表位的黃病毒或黃病毒血清型，和/或抵抗一種或多種其它黃病毒和/或黃病毒血清型的疫苗。13.權(quán)利要求12的用途，其中所述表達(dá)盒還包含編碼其它黃病毒肽/蛋白的序列，如果該其它黃病毒肽/蛋白來源于E蛋白，那么其包含少于40個氨基酸，但至少包含糖基化信號序列。14.痘病毒載體在制備治療或預(yù)防有需要的動物，包括人的黃病毒感染的藥物中的用途，其中所述痘病毒載體的痘病毒基因組中插入了包含表達(dá)盒的DNA，所述表達(dá)盒包含轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件和編碼完整的黃病毒NS1蛋白或其仍能引起免疫反應(yīng)的表位，其中所述黃病毒感染是產(chǎn)生所述核酸或者產(chǎn)生所述NS1蛋白或其表位的黃病毒或黃病毒血清型的感染，和/或其它黃病毒和/或黃病毒血清型的感染。15.權(quán)利要求14的用途，其中所述表達(dá)盒還包含編碼其它黃病毒狀/蛋白的序列，如果該其它黃病毒肽/蛋白來源于E蛋白，那么其包含少于40個氨基酸，但至少包含糖基化信號序列。16.痘病毒載體在制備預(yù)防有需要的動物，包括人的多種黃病毒或黃病毒血清的感染的藥物中的用途，其中所述痘病毒載體的痘病毒基因組中插入了包含表達(dá)盒的DNA，所述表達(dá)盒包含轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件和編碼完整的黃病毒NS1蛋白或其仍能引起免疫反應(yīng)的表位。17.權(quán)利要求16的用途，其中所述表達(dá)盒還包含編碼其它黃病毒肽/蛋白的序列，如果該其它黃病毒肽/蛋白來源于E蛋白，那么其包含少于40個氨基酸，但至少包含糖基化信號序列。18.權(quán)利要求12-17任一項的用途，其中所述痘病毒載體是權(quán)利要求1至8之一的痘病毒載體。19.權(quán)利要求11的痘病毒載體，權(quán)利要求12-17任一項的用途，其中所述NS1蛋白或其表位衍生自一種登革熱病毒血清型，且其中所述疫苗保護個體至少抵抗至少兩種登革熱病毒血清型的感染。20.權(quán)利要求19的痘病毒載體或用途，其中所述疫苗保護個體抵抗登革熱病毒所有血清型的感染。21.權(quán)利要求19或20的痘病毒載體或用途，其中產(chǎn)生所述NS1蛋白的登革熱病毒血清型和/或黃病毒是登革熱病毒血清型2。22.權(quán)利要求11-20任一項的痘病毒載體或用途，其中所述其它黃病毒選自西尼羅病毒、黃熱病病毒和日本腦炎病毒。23.—種細(xì)胞，優(yōu)選人細(xì)胞，含有權(quán)利要求1至8之一的痘病毒載體。24.—種用于初次免疫/加強免疫的試劑盒，它在第一個并瓦/容器中含有首次接種("初次接種")所用的權(quán)利要求1至8和10至11任一項的痘病毒載體或權(quán)利要求9的藥物組合物，在第二個瓶/容器中含有二次接種("加強接種")所用的權(quán)利要求1至8和10至11任一項的痘病毒載體或權(quán)利要求9的藥物組合物。25.—種疫苗，包含權(quán)利要求l-8任一項的痘病毒載體。全文摘要本發(fā)明涉及黃病毒特別是登革熱病毒的NS1蛋白或其部分，其可用于接種以抵抗所述黃病毒和抵抗一種或多種其它黃病毒。本發(fā)明進(jìn)一步涉及可用于接種以抵抗登革熱病毒所有血清型的一種登革熱病毒血清型，特別是血清型2的NS1蛋白或其部分。本發(fā)明進(jìn)一步涉及含有編碼黃病毒NS1或其部分的表達(dá)盒的DNA，含有所述DNA的載體和含有或表達(dá)黃病毒NS1的疫苗。文檔編號C07K14/18GK101397574SQ200810214238公開日2009年4月1日申請日期2002年11月20日優(yōu)先權(quán)日2001年12月4日發(fā)明者保羅·豪利,桑賈·萊勒,瑪麗·J·卡多薩,馬格迪林·S·亨利薩姆申請人:巴法里安諾迪克有限公司;文圖爾技術(shù)公司