專(zhuān)利名稱(chēng)：黃病毒ns1亞單位疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及黃病毒(特別是登革熱病毒)的NS1蛋白或其部分，其可用于接種以抵抗所述黃病毒和抵抗一種或多種其它黃病毒。本發(fā)明進(jìn)一步涉及通過(guò)接種能用于抵抗登革熱病毒所有血清型的來(lái)自一種登革熱病毒血清型，特別是血清型2的NS1蛋白或其部分。本發(fā)明進(jìn)一步涉及含有編碼黃病毒NS1或其部分的表達(dá)組件的DNA，含有所述DNA的載體和含有或表達(dá)黃病毒NS1的疫苗。
背景技術(shù)：
登革熱的致病因素是登革熱病毒，其屬于黃病毒科的黃病毒屬(Burkeand Monath，2001)。黃病毒中一個(gè)非常重要的亞群是稱(chēng)做蚊媒(mosquito-bome)黃病毒的群體，即由蚊子傳播的黃病毒的群。這個(gè)群除了上述登革熱病毒外，還包括其它重要病毒，如西尼羅病毒(West nile virus)、日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus)和黃熱病病毒(Fields Virology，ed.byFields B.N.，Lippincott-Raven Publishers，3rd edition 1996，ISBN0-7817-0253-4，pages 931-1034)。由這些病毒傳播的典型疾病是由西尼羅病毒引起的西尼羅熱和西尼羅腦炎，由日本腦炎病毒引起的腦炎，由黃熱病病毒和登革熱病毒引起的黃熱病，由登革熱病毒引起的登革出血熱(DHF；見(jiàn)下面)和登革休克綜合征(DSS)。
黃病毒為包膜單鏈正鏈RNA病毒，其由三種結(jié)構(gòu)蛋白組成與病毒基因組結(jié)合形成核衣殼的衣殼蛋白(C)，所述核衣殼由錨定有M(膜)和E(包膜)蛋白的脂質(zhì)雙層包圍?；蚪M大約為11kb，且包含編碼約3400個(gè)氨基酸殘基的多蛋白前體的單一開(kāi)放閱讀框。每種病毒蛋白都通過(guò)細(xì)胞蛋白酶和病毒蛋白酶的作用由此前體產(chǎn)生。三種結(jié)構(gòu)蛋白(C，M和E)衍生自多蛋白的N末端部分，它們之后是七種非結(jié)構(gòu)蛋白NS1，NS2A，NS2B，NS3，NS4A，NS4B和NS5(Lindenbach and Rice，2001)。
存在于所有黃病毒中的糖蛋白NS1傾向于對(duì)病毒活力是必需的。登革熱病毒NS1從哺乳動(dòng)物感染細(xì)胞中以可溶六聚體形式分泌出來(lái)(Flamand等，1999)。此非共價(jià)結(jié)合六聚復(fù)合物由3個(gè)二聚亞基形成，具有310kDa的分子量。二聚化是NS1蛋白輸出到質(zhì)膜的先決條件，在質(zhì)膜上，它作為被感染的細(xì)胞表面唯一的病毒駐留蛋白。
在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，所轉(zhuǎn)運(yùn)的部分NS1被釋放到細(xì)胞外環(huán)境中，而在利于登革熱感染的昆蟲(chóng)細(xì)胞系中卻不會(huì)如此。細(xì)胞外NS1以可溶蛋白的形式分泌，其中可溶蛋白以較高級(jí)六聚寡聚形式存在，或者以與微粒結(jié)合而不與病毒粒子結(jié)合的形式分泌。此外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)NS1在感染登革熱病毒的患者的血清中循環(huán)，這表明NS1分泌可能是人宿主中黃病毒感染過(guò)程中的一個(gè)重要事件。在黃病毒感染的過(guò)程中，NS1蛋白引起很強(qiáng)的抗體反應(yīng)，這種反應(yīng)有助于從宿主中清除感染病毒，推測(cè)該清除是通過(guò)補(bǔ)體介導(dǎo)途徑(Schlesinger，J.J.等，1987)和依賴(lài)抗體的細(xì)胞毒性(ADCC)(Schlesinger，J.J.等，1993)。
登革熱病毒有四種血清型登革熱病毒血清型1(Den-1)到登革熱病毒血清型4(Den-4)，該病毒是黃病毒屬中與感染人類(lèi)有關(guān)的最重要成員，它引起的疾病從感冒樣癥狀到嚴(yán)重的或致命的疾病，登革出血熱及休克綜合征。登革熱爆發(fā)一直是熱帶和亞熱帶密集居住地區(qū)的一個(gè)主要公眾衛(wèi)生問(wèn)題，在這些地區(qū)蚊媒豐富。
世界許多地區(qū)都十分關(guān)注由蚊媒黃病毒引起的登革熱感染和其它疾病的傳播，因此大力開(kāi)發(fā)可以預(yù)防登革熱(DF)和登革出血熱(DHF)的登革熱疫苗，并獲得了對(duì)保護(hù)接種個(gè)體抵抗由某些或所有蚊媒黃病毒引起的感染有用的疫苗。
用四種血清型中任意一種首次感染后大多數(shù)DF病例都有癥狀，大部分DHF病例卻發(fā)生在第二次用與首次感染的登革熱病毒血清型不同的血清型感染的受檢者中。這些觀察結(jié)果產(chǎn)生了一種假設(shè)間隔適當(dāng)時(shí)期后，對(duì)已有抵抗一種登革熱血清型的抗體的個(gè)體用另一種病毒血清型繼續(xù)感染可能會(huì)造成相當(dāng)數(shù)量的DHF病例。在體外已經(jīng)證實(shí)了登革熱病毒以及其它包膜病毒的依賴(lài)抗體的增強(qiáng)作用(ADE)，并且認(rèn)為它是DHF病因中的一個(gè)重要機(jī)理。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)DHF通常出現(xiàn)在多種(三或四種)病毒血清型共流行的地理區(qū)域內(nèi)。在具有地方性DHF的區(qū)域，如東南亞國(guó)家，年齡特異性發(fā)病率在兒童中較高，在較大年齡組中DHF病例數(shù)減少。這與不斷增加的登革熱血清陽(yáng)性率大致相應(yīng)，表明自然感染可能引起了保護(hù)性免疫。這一現(xiàn)象不像觀察到的其它病毒感染，比如甲型肝炎病毒。根據(jù)無(wú)對(duì)照的個(gè)案病例描述的臨床觀察顯示，患者可能經(jīng)歷兩次DHF(Nimmannitya等，1990)，但這是很罕見(jiàn)的，而且正確地鑒定出引起第二次感染和后來(lái)感染的血清型是非常困難的。到現(xiàn)在為止，盡管所有四種登革熱病毒血清型在同一區(qū)域內(nèi)流行，但還沒(méi)有相同個(gè)體后期感染的報(bào)告。這表明在自然界中，相同個(gè)體中二種或三種登革熱病毒血清型的感染可能形成交叉反應(yīng)抗體，甚至交叉反應(yīng)性細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞應(yīng)答。這可能調(diào)節(jié)或保護(hù)機(jī)體抵抗自然界中繼續(xù)存在的登革熱病毒血清型的感染。
目前還沒(méi)有已被批準(zhǔn)的登革熱疫苗?，F(xiàn)在，登革熱病毒感染的預(yù)防依賴(lài)于對(duì)主要蚊媒—埃及伊蚊(Aedes aegypti)的控制。對(duì)殺蟲(chóng)劑的抗性、缺乏能使地方衛(wèi)生部門(mén)維持有效控蚊計(jì)劃的技術(shù)上和經(jīng)濟(jì)上的支持，以及作為媒介的蚊和登革熱病毒的持續(xù)的地區(qū)傳播使得通過(guò)現(xiàn)行控蚊計(jì)劃來(lái)抵抗登革熱的感染實(shí)際上是不可能的。因此，開(kāi)發(fā)安全有效的抵抗登革熱病毒所有四種血清型的疫苗已經(jīng)被世界衛(wèi)生組織(WHO)指定為重點(diǎn)預(yù)防登革熱病毒感染的最經(jīng)濟(jì)有效的方法。世界衛(wèi)生組織建議抵抗登革熱和DHF的理想疫苗應(yīng)該是一種能預(yù)防所有血清型引起的感染的疫苗，從而使得連續(xù)感染不能發(fā)生。
為達(dá)到該目的，WO98/13500提出利用一種表達(dá)來(lái)自登革熱病毒所有血清型的抗原的重組修飾的安卡拉痘苗病毒(MVA)，和利用四種重組MVA，其中每種重組MVA表達(dá)一種登革熱病毒血清型的至少一種抗原。這兩個(gè)策略都提供了非常有前景的抵抗登革熱病毒所有血清型的接種策略。但是，希望提供一種單一亞單位疫苗，它在施用后可引起抵抗多于一種黃病毒或多于一種登革熱病毒血清型，優(yōu)選抵抗登革熱病毒所有血清型的免疫反應(yīng)。WO98/13500還公開(kāi)了一種編碼登革熱病毒NS1的重組MVA。WO98/13500未公開(kāi)衍生自一種登革熱病毒血清型的抗原能引起的免疫反應(yīng)不但抵抗產(chǎn)生該抗原的登革熱病毒血清型，而且抵抗衍生自其它登革熱病毒血清型的抗原。
WO99/15692公開(kāi)了一種重組MVA，它包含并能表達(dá)一種或多種編碼不引起免疫增強(qiáng)作用或抗體依賴(lài)性增強(qiáng)作用的登革熱病毒抗原的DNA序列。WO99/15692未公開(kāi)衍生自一種登革熱病毒血清型的抗原引起的免疫反應(yīng)不但抵抗產(chǎn)生該抗原的登革熱病毒血清型，而且抵抗衍生自其它登革熱病毒血清型的抗原。
發(fā)明目的本發(fā)明的目的是提供一種衍生自黃病毒或黃病毒血清型的疫苗，它穩(wěn)定，易于生產(chǎn)，并能引起保護(hù)接種個(gè)體不但抵抗衍生該疫苗的黃病毒或黃病毒血清型，而且抵抗其它黃病毒或黃病毒血清型的免疫反應(yīng)。本發(fā)明的一個(gè)具體目的是提供一種衍生自蚊媒黃病毒的疫苗，它保護(hù)接種個(gè)體不但抵抗衍生該疫苗的蚊媒黃病毒或黃病毒血清型，而且抵抗其它蚊媒黃病毒或黃病毒血清型。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供衍生自登革熱病毒一種血清型的疫苗，它保護(hù)接種個(gè)體抵抗至少兩種，優(yōu)選登革熱病毒所有血清型的感染。
發(fā)明詳述這些問(wèn)題分別利用黃病毒NS1蛋白或其部分，以及包含編碼黃病毒NS1蛋白或其部分的表達(dá)組件的DNA序列得以解決。具體地，通過(guò)利用蚊媒黃病毒，尤其是登革熱病毒，優(yōu)選登革熱病毒血清型2的NS1蛋白或其部分，以及對(duì)應(yīng)的DNA序列，提供衍生自一種蚊媒黃病毒的疫苗，它保護(hù)個(gè)體抵抗衍生該疫苗的蚊媒黃病毒的感染，而且抵抗至少一種其它蚊媒黃病毒的感染。更特別地，通過(guò)利用登革熱病毒，尤其是登革熱病毒血清型2的NS1蛋白或其部分以及對(duì)應(yīng)的DNA序列，提供了衍生自一種登革熱病毒血清型的疫苗，它保護(hù)個(gè)體抵抗至少兩種，優(yōu)選至少三種，更優(yōu)選登革熱病毒所有血清型的感染，并優(yōu)選還抵抗其它黃病毒，特別是蚊媒黃病毒如日本腦炎病毒、黃熱病病毒和西尼羅病毒的感染。
如在試驗(yàn)部分更詳細(xì)顯示的，衍生自登革熱病毒一種血清型并在接種后重新表達(dá)的NS1蛋白能引起與登革熱病毒血清型1、2、3和4的NS1蛋白和來(lái)自黃病毒屬的其它成員，如日本腦炎病毒，黃熱病病毒和西尼羅病毒的NS1蛋白交叉反應(yīng)的抗體應(yīng)答。因此，來(lái)自一種登革熱病毒血清型的NS1蛋白是同時(shí)抵抗至少二種，更優(yōu)選三種，甚至更優(yōu)選所有四種登革熱病毒血清型，而且抵抗黃病毒屬一種或更多其它病毒的通用DHF亞單位疫苗。由于這種亞單位疫苗策略中不包括E蛋白，所以在隨后暴露在任何一種登革熱血清型時(shí)將不會(huì)有依賴(lài)抗體的增強(qiáng)作用(ADE)的風(fēng)險(xiǎn)，而且在登革熱感染自然爆發(fā)時(shí)將不會(huì)引起疫苗相關(guān)的DHF。
NS1蛋白可以從核酸，優(yōu)選包含編碼至少一種黃病毒NS1蛋白或其部分的表達(dá)組件的DNA表達(dá)。本文中的術(shù)語(yǔ)“至少”解釋為表達(dá)組件可以另外編碼其它蛋白/肽，如下面更詳細(xì)定義的單獨(dú)的蛋白/肽或與NS1蛋白或其部分融合的蛋白/肽。本發(fā)明中的術(shù)語(yǔ)“DNA”指任何形式的DNA，如單鏈DNA、雙鏈DNA、線(xiàn)性或環(huán)狀DNA或質(zhì)粒形式或病毒基因組形式的DNA。由于黃病毒是RNA病毒，編碼黃病毒NS1蛋白的DNA是非天然DNA，比如cDNA或合成DNA。
術(shù)語(yǔ)“編碼黃病毒NS1蛋白或其部分的表達(dá)組件”解釋為編碼黃病毒NS1蛋白或其部分的序列在其前面接有控制轉(zhuǎn)錄，特別是轉(zhuǎn)錄起始的元件。所述轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件的例子為原核啟動(dòng)子和真核啟動(dòng)子/增強(qiáng)子。優(yōu)選的真核啟動(dòng)子/增強(qiáng)子是人巨細(xì)胞病毒立即早期啟動(dòng)子/增強(qiáng)子和痘病毒啟動(dòng)子，如7.5啟動(dòng)子和痘病毒最小啟動(dòng)子，參見(jiàn)實(shí)施例部分。痘病毒最小啟動(dòng)子的序列如圖2和SEQID No.9所示。如果需要，表達(dá)組件可進(jìn)一步包含控制轉(zhuǎn)錄終止的元件，如原核終止元件或真核PolyA信號(hào)序列。
表達(dá)組件可以只表達(dá)黃病毒NS1蛋白或其部分，或者表達(dá)與一種或多種其它黃病毒蛋白/肽一起的NS1蛋白或其部分，其中NS1蛋白或其部分和其它蛋白/肽作為單獨(dú)的蛋白/肽或者融合蛋白制出。如果不在說(shuō)明書(shū)中另外定義，本發(fā)明中的術(shù)語(yǔ)“肽”指至少10個(gè)氨基酸的連續(xù)氨基酸序列，更優(yōu)選至少20個(gè)氨基酸，最優(yōu)選至少25個(gè)氨基酸。
所述其它黃病毒蛋白不是完整E蛋白，因?yàn)榇说鞍缀孟蟛粎⑴cDHF的進(jìn)展。因此，如果所述其它黃病毒肽衍生自E蛋白，其將包含少于40個(gè)氨基酸，優(yōu)選少于35個(gè)氨基酸。如果衍生自E蛋白的氨基酸序列與NS1蛋白或其部分一起表達(dá)，應(yīng)證實(shí)此氨基酸鏈不包含參與ADE和DHF發(fā)生的表位。
如果表達(dá)組件除了表達(dá)NS1蛋白或其部分外，還表達(dá)單獨(dú)的蛋白/肽形式的其它黃病毒蛋白/肽，表達(dá)組件可以在編碼NS1蛋白或其部分的序列和編碼所述其它黃病毒蛋白的序列間包含一個(gè)內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)。IRES元件為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。IRES元件的例子為小核糖核酸病毒IRES元件或丙型肝炎病毒的5’非編碼區(qū)。
另外，編碼NS1蛋白或其部分的核酸序列可以與編碼其它黃病毒蛋白/肽的DNA序列融合，以便產(chǎn)生NS1蛋白或其部分和其它黃病毒蛋白/肽的融合蛋白。如果要將NS1蛋白或其部分與其它黃病毒蛋白/肽以融合蛋白/肽的形式產(chǎn)生，則將其相應(yīng)編碼序列融合在同一閱讀框內(nèi)。
在一優(yōu)選實(shí)施方案中，編碼NS1蛋白或其部分的DNA序列在其前面接有編碼E蛋白糖基化信號(hào)的序列。
按照此實(shí)施方案，制備出包含與NS1蛋白或其部分融合的E蛋白糖基化信號(hào)序列的融合蛋白。如上所指出的，E蛋白衍生的氨基酸鏈應(yīng)該盡可能短，而且它應(yīng)該不包括參與ADE和DHF發(fā)生的表位。E蛋白的糖基化信號(hào)序列滿(mǎn)足這些要求。
在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的表達(dá)組件包含編碼NS1蛋白或其部分的序列作為唯一的黃病毒序列。因此，在此優(yōu)選實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明所述的表達(dá)組件不表達(dá)黃病毒基因組其它部分的任何其他肽/蛋白，尤其不表達(dá)NS2A或E蛋白。
在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的DNA表達(dá)NS1蛋白或其部分與并非衍生自黃病毒的蛋白/肽的融合蛋白，所述并非衍生自黃病毒的蛋白/肽包含非黃病毒信號(hào)序列或可用于檢測(cè)或純化所表達(dá)的融合蛋白的序列，如標(biāo)記。
為了理解本發(fā)明一優(yōu)選實(shí)施方案中使用的表達(dá)組件中的黃病毒序列的一般結(jié)構(gòu)，簡(jiǎn)要地概括一下黃病毒基因組的結(jié)構(gòu)是有利的在天然黃病毒感染期間，該病毒產(chǎn)生一種多蛋白，它先被宿主細(xì)胞蛋白酶裂解然后被病毒編碼的蛋白酶裂解為下列蛋白C，PrM和M，E，NS1，NS2A，NS2B，NS3，NS4A，NS4B和NS5(在該多蛋白前體上的蛋白順序)。因此，編碼NS1蛋白或其部分的DNA序列，尤其是cDNA序列，必須需要添加“ATG”起始密碼子。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，起始ATG后面接有編碼糖基化信號(hào)的序列，以使新合成的NS1蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中糖基化。所述信號(hào)序列為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。最后，蛋白編碼組件需要一個(gè)終止密碼子，其可以是加在編碼蛋白的cDNA序列3’末端的TAG。在本發(fā)明實(shí)施例中使用的“ATG+信號(hào)序列”元件衍生自編碼E蛋白的疏水C末端的序列(最后28個(gè)氨基酸，在登革熱病毒New Guinea株(“NGC株”，GeneBank登錄號(hào)AF038403)中始于氨基酸M(ATG))。本發(fā)明所述的典型表達(dá)組件如圖2，SEQID NO 9和SEQID NO 10所示。
因此，概括的講，此實(shí)施方案涉及含有編碼黃病毒NS1蛋白或其部分的表達(dá)組件的DNA的用途，其中編碼序列前面接有起始密碼子(″ATG″)和編碼糖基化信號(hào)序列的序列，優(yōu)選如上定義的衍生自E蛋白的序列，且編碼序列止于翻譯終止密碼子(圖1A，1C和2，SEQID 5-10)。
本發(fā)明所述的DNA序列編碼黃病毒NS1蛋白或其部分。術(shù)語(yǔ)“黃病毒”指任何黃病毒。更優(yōu)選術(shù)語(yǔ)“黃病毒”指蚊媒黃病毒，如西尼羅病毒，日本腦炎病毒，黃熱病病毒和登革熱病毒。由本發(fā)明所述DNA編碼的衍生自一種蚊媒病毒的NS1蛋白或其部分，應(yīng)該保護(hù)接種個(gè)體不但抵抗衍生該疫苗的病毒或病毒血清型的感染，而且抵抗其它蚊媒病毒或衍生該疫苗的病毒其它血清型的感染。NS1蛋白優(yōu)選為任何登革熱病毒血清型。更優(yōu)選地NS1蛋白編碼序列衍生自登革熱病毒血清型2，如登革熱病毒New Guinea株(“NGC株”，GeneBank登錄號(hào)AF038403)。術(shù)語(yǔ)“亞型”和“血清型”在說(shuō)明書(shū)中交替使用。
本文術(shù)語(yǔ)“NS1蛋白或其部分”中的術(shù)語(yǔ)“其部分”指NS1蛋白的一段氨基酸鏈，它的長(zhǎng)度足以誘導(dǎo)特異性免疫反應(yīng)以抵抗作為“其部分”的來(lái)源的NS1蛋白。如果黃病毒為登革熱病毒，此氨基酸鏈應(yīng)該能在接種動(dòng)物(包括人)體內(nèi)引起抵抗登革熱病毒所有血清型的NS1蛋白的免疫反應(yīng)。在實(shí)施例部分，顯示了本領(lǐng)域技術(shù)人員如何測(cè)定是否NS1蛋白或其部分引起了對(duì)登革熱病毒所有血清型的特異性免疫反應(yīng)。根據(jù)一優(yōu)選的實(shí)施方案，黃病毒DNA序列編碼整個(gè)NS1蛋白。因此，術(shù)語(yǔ)“NS1蛋白或其部分”指天然NS1蛋白的整個(gè)序列，以及仍能引起免疫反應(yīng)的更短的表位鏈。
而且術(shù)語(yǔ)“NS1蛋白”也指天然NS1蛋白的衍生物。所述衍生物可以是在天然NS1蛋白中取代、缺失和/或插入一個(gè)或更多氨基酸所得的蛋白。作為實(shí)施例，所述衍生物是氨基酸序列同源性至少50％，優(yōu)選至少75％，更優(yōu)選至少90％的蛋白。因此，術(shù)語(yǔ)“其部分”也指所述NS1蛋白衍生物的部分。
概括的講，本發(fā)明的一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案是含有編碼蚊媒黃病毒NS1或其部分的表達(dá)組件的DNA的用途，其中黃病毒優(yōu)選為登革熱病毒，尤其是登革熱病毒血清型2，其中NS1蛋白或其部分的表達(dá)由轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件控制。更優(yōu)選的，本發(fā)明所述DNA編碼以與糖基化信號(hào)序列的融合蛋白形式的NS1蛋白或其部分。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及含有如上所述DNA的載體，以及所述載體按照本發(fā)明所述誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的用途。術(shù)語(yǔ)“載體”指本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的任何載體。載體可以是質(zhì)粒載體如pBR322，或pUC系列載體。更優(yōu)選地，載體為病毒載體。在本發(fā)明正文中，術(shù)語(yǔ)“病毒的載體”或“病毒載體”指含有病毒基因組的感染性病毒。在這種情況下，將本發(fā)明DNA克隆入相應(yīng)病毒載體的病毒基因組中。然后包裝重組病毒基因組，從而獲得的重組載體可以用于感染細(xì)胞和細(xì)胞系，特別是感染有生命動(dòng)物(包括人)。根據(jù)本發(fā)明所述可以使用的典型的病毒載體是腺病毒載體、逆病毒載體，或以腺伴隨病毒2(AAV2)為基礎(chǔ)的載體。最優(yōu)選的是痘病毒載體。痘病毒優(yōu)選為金絲雀痘(canarypox)病毒、禽痘病毒或者痘苗病毒。更優(yōu)選為修飾的安卡拉痘苗病毒(MVA)(Sutter，G.等，1994，Vaccine 121032-40)。典型的MVA株是MVA 575，它已經(jīng)保藏在歐洲動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(European Collectionof Animal Cell Cultures)，保藏編號(hào)為ECACC V00120707。最優(yōu)選為MVA-BN或在PCT申請(qǐng)WO02/42480中描述的其衍生物(PCT/EP01/13628)。上述申請(qǐng)的內(nèi)容包括在本申請(qǐng)中作為參考文獻(xiàn)。MVA-BN已經(jīng)保藏在歐洲動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為ECACC V00083008。由于MVA-BN病毒載體為高度減毒的病毒，故通過(guò)利用MVA-BN或其衍生物，附加的技術(shù)問(wèn)題得到了解決，從而提供了一種抵抗黃病毒的特別安全的病毒疫苗。特別地，MVA-BN經(jīng)證實(shí)比現(xiàn)有技術(shù)已知的MVA株毒力更弱。MVA-BN衍生自修飾的安卡拉痘苗病毒，并且具有在人細(xì)胞系中喪失其復(fù)制能力的特性。由于在人體中不能復(fù)制，MVA-BN比任何其它已知的痘苗病株都更加安全。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種包含如上所述MVA-BN和MVA-BN衍生物的DNA的病毒載體。MVA-BN的特性，評(píng)價(jià)MVA株是否為MVA-BN或其衍生物的生物學(xué)檢測(cè)和獲得MVA-BN或其衍生物的方法在WO02/42480中公開(kāi)。
本申請(qǐng)中使用的保藏號(hào)為ECACC V00083008的病毒的“衍生物”，即MVA-BN的衍生物，如WO02/42480中所定義。下面，對(duì)MVA-BN衍生物的特性進(jìn)行簡(jiǎn)單地描述。關(guān)于MVA-BN衍生物的定義的更加詳細(xì)的信息，特別是關(guān)于用來(lái)測(cè)定MVA病毒是否為提及的MVA-BN衍生物的生物學(xué)檢測(cè)的詳細(xì)信息參見(jiàn)WO02/42480。因此，所述術(shù)語(yǔ)指表現(xiàn)MVA-BN保藏株的至少一種下述特性，但在其基因組中有一或多處不同的痘苗病毒。優(yōu)選的衍生物有至少二種，更優(yōu)選有至少三種，最優(yōu)選所有下述四種MVA-BN特性
-在雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)以及在幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞系BHK(ECACC85011433)中有繁殖性復(fù)制(reproducetive replication)能力，但是在人細(xì)胞系HaCat中無(wú)繁殖性復(fù)制能力(Boukamp等1988，J Cell Biol.106(3)761-71)，-不能進(jìn)行體內(nèi)復(fù)制，-與已知株MVA 575(ECACC V00120707)相比，在致死性攻擊模型中誘導(dǎo)更高的免疫原性，和/或-與DNA初次免疫(prime)/痘苗病毒增加強(qiáng)免疫(boost)的方案相比，在痘苗病毒初次免疫/痘苗病毒加強(qiáng)免疫的方案中誘導(dǎo)至少實(shí)質(zhì)上相同的免疫力水平。
具體地，MVA-BN的衍生物具有與MVA-BN實(shí)質(zhì)上相同的復(fù)制特性。與保藏的病毒具有相同“復(fù)制特性”的病毒是，在CEF細(xì)胞和細(xì)胞系BHK，HeLa，HaCat以及143B細(xì)胞系中以相似的擴(kuò)增比進(jìn)行復(fù)制、并且在轉(zhuǎn)基因小鼠模型AGR129中經(jīng)測(cè)定具有相似的復(fù)制的那些病毒。
在本申請(qǐng)中使用的術(shù)語(yǔ)“不能進(jìn)行繁殖性復(fù)制”如WO02/42480中所定義。因此，“不能進(jìn)行繁殖性復(fù)制”的病毒是指在人細(xì)胞系HaCat中擴(kuò)增比小于1的病毒(Boukamp等1988，J Cell Biol.106(3)761-71)。優(yōu)選地，作為本發(fā)明載體使用的病毒在人細(xì)胞系HaCat中的擴(kuò)增比為0.8或更少。病毒的“擴(kuò)增比”是指，感染細(xì)胞所產(chǎn)生的病毒量(輸出量)與最初用于感染細(xì)胞的病毒量(輸入量)的比例(“擴(kuò)增比”)。輸出量與輸入量的比例為“1”表示，感染細(xì)胞產(chǎn)生的病毒量與最初用于感染細(xì)胞的病毒量相等的擴(kuò)增狀態(tài)。。
在定義MVA-BN及其衍生物的上下文中，本申請(qǐng)所用術(shù)語(yǔ)“不能進(jìn)行體內(nèi)復(fù)制”與WO02/42480中定義相同。因此，所述術(shù)語(yǔ)如WO02/42480所述，是指那些不能在人體和小鼠模型中復(fù)制的病毒。WO02/42480使用的小鼠不能產(chǎn)生成熟B細(xì)胞和T細(xì)胞(AGR 129小鼠)。具體地，MVA-BN和其衍生物，在對(duì)AGR129小鼠腹腔注射107pfu個(gè)病毒進(jìn)行感染后，至少45天內(nèi)不殺死小鼠，優(yōu)選至少60天內(nèi)，最優(yōu)選至少90天內(nèi)。優(yōu)選地，“不能在體內(nèi)進(jìn)行復(fù)制”的病毒的另一特征是，在對(duì)AGR129小鼠腹腔注射107pfu個(gè)病毒進(jìn)行感染后，至少45天不能從該小鼠的器官或組織中收獲到任何病毒，優(yōu)選至少60天，最優(yōu)選至少90天。
MVA-BN及其衍生物優(yōu)選在WO02/42480所述的致死攻擊小鼠模型中測(cè)得，致免疫性高于已知病株MVA 575。在這樣的模型中，未接種的小鼠被具有復(fù)制能力的痘苗病株如Western Reserve株L929 TK+或IHD-J感染后死亡。在描述致死攻擊模型的上下文中，被具有復(fù)制能力的痘苗病毒感染，該過(guò)程稱(chēng)為“攻擊”。受攻擊4天后，小鼠通常被殺死，卵巢中的病毒滴度用VERO細(xì)胞經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)空斑試驗(yàn)進(jìn)行測(cè)定。對(duì)未接種的小鼠，以及接種了本發(fā)明的痘苗病毒的小鼠，測(cè)定它們的病毒滴度。更具體地，MVA-BN及其衍生物在上述檢驗(yàn)中，接種102TCID50/ml的病毒比不接種病毒，小鼠卵巢病毒滴度減少至少70％，優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選至少90％。
MVA-BN或其衍生物優(yōu)選具有以下特性在痘苗病毒初次免疫/痘苗病毒加強(qiáng)免疫方案中誘導(dǎo)出與DNA初次免疫/痘苗病毒加強(qiáng)免疫方案相比，至少實(shí)質(zhì)上相同水平的免疫力。當(dāng)在WO02/42480所述“試驗(yàn)1”和“試驗(yàn)2”(優(yōu)選全部?jī)煞N試驗(yàn))中測(cè)定，CTL應(yīng)答在痘苗病毒初次免疫/痘苗病毒加強(qiáng)免疫方案中與在DNA-初次免疫/痘苗病毒加強(qiáng)免疫方案中相比，至少實(shí)質(zhì)上相同，則認(rèn)為痘苗病毒可以在痘苗病毒初次免疫/痘苗病毒加強(qiáng)免疫方案中誘導(dǎo)出與在DNA初次免疫/痘苗病毒加強(qiáng)免疫方案中至少實(shí)質(zhì)上相同水平的免疫力。更優(yōu)選，在至少一種上述試驗(yàn)中，痘苗病毒初次免疫/痘苗病毒加強(qiáng)免疫后的CTL應(yīng)答比DNA-初次免疫/痘苗病毒加強(qiáng)免疫后的高。最優(yōu)選CTL應(yīng)答在兩種試驗(yàn)中都更高。
WO02/42480公開(kāi)了如何獲得具有MVA-BN及其衍生物的上述特性的痘苗病毒。
將上述定義的DNA插入到痘病毒DNA中的方法，以及獲得重組痘病毒的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。在重組痘苗病毒中，本發(fā)明所述DNA的表達(dá)優(yōu)選但并不僅僅在痘病毒啟動(dòng)子(更優(yōu)選痘苗病毒啟動(dòng)子)的轉(zhuǎn)錄控制下進(jìn)行。本發(fā)明所述的DNA優(yōu)選插入到病毒基因組非必要區(qū)域內(nèi)。在本發(fā)明另一優(yōu)選實(shí)施方案中，異源核酸序列插入到MVA基因組的天然缺失位點(diǎn)處(PCT/EP96/02926中公開(kāi))。
概括的講，本發(fā)明一最優(yōu)選的實(shí)施方案是提供一種含有如上定義的DNA的載體，其中所述載體是MVA-BN或其衍生物，所述DNA含有編碼黃病毒NS1蛋白或其部分的表達(dá)組件，黃病毒優(yōu)選為登革熱病毒，更優(yōu)選為登革熱病毒血清型2。
在一優(yōu)選實(shí)施方案中，發(fā)明涉及由本發(fā)明所述DNA編碼，或本發(fā)明所述載體編碼的NS1蛋白或其部分用于通過(guò)接種來(lái)抵抗多種黃病毒或黃病毒血清型的用途。對(duì)于本發(fā)明所述NS1蛋白或其部分的定義參見(jiàn)上面描述的部分，其中編碼NS1的DNA已經(jīng)定義為由所述DNA表達(dá)的產(chǎn)物。因此下面關(guān)于本發(fā)明所述蛋白的概述，不能看作是對(duì)本發(fā)明的限制。概括的講，NS1蛋白可以是由任意黃病毒編碼的分離的NS1蛋白或其部分。NS1蛋白或其部分優(yōu)選衍生自登革熱病毒，最優(yōu)選登革熱病毒血清型2。所述蛋白可以只包含病毒NS1蛋白或其部分的氨基酸序列。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，NS1蛋白還可以包含對(duì)有效表達(dá)該蛋白必需的附加氨基酸。所述氨基酸/氨基酸序列的例子如上所示，且其包括在蛋白N末端、由附加的ATG密碼子編碼的蛋氨酸和衍生自E蛋白C末端、用于使NS1蛋白或其部分糖基化所需的信號(hào)序列的氨基酸序列。其它的信號(hào)序列也在本發(fā)明范圍之內(nèi)。在另一實(shí)施方案中，NS1氨基酸序列或其部分可以與其它蛋白/肽融合。融合伴侶的例子為允許識(shí)別該蛋白的序列，如標(biāo)記或其它黃病毒蛋白或其部分。
在一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及作為疫苗，尤其作為抵抗多種黃病毒或黃病毒血清型的疫苗的本發(fā)明DNA，載體或NS1蛋白或其部分?！耙呙纭? 是誘導(dǎo)特異性免疫反應(yīng)的化合物，即DNA、蛋白、載體或病毒。
根據(jù)此實(shí)施方案的一個(gè)替代方案，本發(fā)明所述“疫苗”是基于一種登革熱病毒NS1蛋白或其部分，該蛋白或其部分能誘導(dǎo)抗登革熱病毒所有血清型的NS1蛋白的免疫反應(yīng)。特別地，已證實(shí)一種登革熱病毒血清型，尤其是血清型2的NS1蛋白誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)能抵抗至少兩種，優(yōu)選至少三種，最優(yōu)選登革熱病毒所有血清型的NS1蛋白，優(yōu)選還抵抗至少一種其它蚊媒黃病毒。
如上所述，本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)本發(fā)明所述來(lái)自一種黃病毒的NS1蛋白或其部分能誘導(dǎo)抗其它黃病毒NS1蛋白的免疫反應(yīng)。如上所指出的，“黃病毒” 優(yōu)選是蚊媒黃病毒。換句話(huà)說(shuō)，本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明所述來(lái)自一種蚊媒黃病毒的NS1蛋白或其部分誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答能抵抗衍生疫苗的蚊媒黃病毒的NS1蛋白，還能抵抗其它蚊媒黃病毒的NS1蛋白。因此，衍生自蚊媒黃病毒的疫苗可以作為抵抗一種或多種蚊媒黃病毒的疫苗。術(shù)語(yǔ)“衍生自黃病毒的載體”或本說(shuō)明書(shū)正文中的相似術(shù)語(yǔ)是指，包含上述DNA的上述載體(如痘病毒載體或質(zhì)粒)。因此，此術(shù)語(yǔ)涉及載體插入物而不是載體主鏈。一個(gè)“衍生自黃病毒的載體”的例子是包含含有痘病毒啟動(dòng)子、編碼黃病毒NS1蛋白或其部分的序列的表達(dá)組件的痘病毒載體，如MVA，其中所述編碼黃病毒NS1蛋白或其部分的序列前面接有ATG密碼子和編碼糖基化信號(hào)序列的序列，并且所述編碼序列止于翻譯終止密碼子。
因此，用所述DNA、載體或NS1蛋白或其部分進(jìn)行的接種可以作為抵抗較寬范圍的黃病毒或至少黃病毒血清型的單一亞單位疫苗。編碼來(lái)自一種黃病毒或黃病毒血清型的NS1蛋白或其部分的DNA或載體，或者來(lái)自所述黃病毒或血清型的NS1蛋白或其部分，因此可以用作通過(guò)接種來(lái)抵抗其它黃病毒和黃病毒血清型的疫苗。例如，衍生自登革熱病毒血清型2的疫苗可以用作抵抗血清型1，3和4中一種、二種或所有的疫苗，以及抵抗血清型2的疫苗。它可以進(jìn)一步用于保護(hù)個(gè)體抵抗其它黃病毒，如西尼羅病毒、日本腦炎病毒和黃熱病病毒。
在一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明所述DNA用作疫苗。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，用本發(fā)明中的含有真核表達(dá)組件的裸露DNA，尤其是DNA進(jìn)行肌內(nèi)注射，將引起由該表達(dá)組件編碼的蛋白的表達(dá)。該蛋白暴露于免疫系統(tǒng)，并引起特異性免疫反應(yīng)。
在另一實(shí)施方案中，通過(guò)施用本發(fā)明所述載體，特別是病毒載體，更優(yōu)選痘病毒載體，最優(yōu)選痘苗病毒載體，如MVA載體來(lái)進(jìn)行接種。
為了制備基于痘苗病毒的疫苗，可將本發(fā)明所述病毒，尤其是MVA-BN和其衍生物轉(zhuǎn)變?yōu)樯韺W(xué)上可接受的形式。這可以依據(jù)用于天花預(yù)防性接種的痘病毒疫苗的制備經(jīng)驗(yàn)來(lái)進(jìn)行(參見(jiàn)Stickl，H.等 Dtsch.med.Wschr.99，2386-2392)。例如，將純化的病毒以5×108TCID50/ml的濃度配制在約10mM Tris，140 mM NaCl pH7.4中，-80℃保存。為了制備疫苗針劑(vaccine shot)，例如，將102-109的病毒顆粒，在有2％蛋白胨和1％人白蛋白存在的情況下，凍干在安瓿(優(yōu)選玻璃安瓿)內(nèi)的100ml磷酸鹽緩沖液(PBS)中。
特別優(yōu)選用于接種的基于痘苗病毒的疫苗，特別是基于MVA-BN的疫苗以?xún)龈蔂顟B(tài)儲(chǔ)存。在實(shí)施例部分顯示，如果用作接種的病毒以?xún)龈刹《拘问絻?chǔ)存，由一種黃病毒NS1蛋白誘導(dǎo)的分別對(duì)不同黃病毒NS1和黃病毒血清型NS1蛋白的免疫反應(yīng)和免疫反應(yīng)的交叉反應(yīng)百分比會(huì)非常地高。因此，疫苗針劑優(yōu)選通過(guò)將病毒在配制劑中逐步凍干的方式產(chǎn)生。這種配制劑可包含適于體內(nèi)給藥的額外添加劑，如甘露醇，葡聚糖，糖，甘氨酸，乳糖，或聚乙烯吡咯烷酮，或其它添加劑，如抗氧化劑或惰性氣體，穩(wěn)定劑或重組蛋白(如人血清白蛋白)。適于凍干的包含病毒的典型配制劑含有10mM Tris-緩沖液，140mM NaCl，18.9g/l葡聚糖(MW 36000-40000)，45g/l蔗糖，0.108g/l一水合L-谷氨酸單鉀鹽，pH7.4。然后將玻璃安瓿密封，在介于4℃和室溫之間的溫度中保存數(shù)月。但是，只要不必使用，優(yōu)選將安瓿保存在-20℃以下。為了進(jìn)行接種，可將凍干品溶于0.1-0.5ml水溶液中，如，水，生理鹽水或Tris緩沖液，經(jīng)過(guò)系統(tǒng)途徑或局部途徑給藥，即通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的胃腸道外途徑、肌肉途徑或任何其它給藥途徑來(lái)給藥。給藥方式、給藥劑量以及給藥次數(shù)可由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)已知的方式最優(yōu)化。痘病毒載體最優(yōu)選皮下或肌肉給藥。最優(yōu)選所述接種通過(guò)間隔例如3-5周的兩次疫苗注射來(lái)進(jìn)行。
如果疫苗是含有本發(fā)明所述DNA的MVA-BN載體或其衍生物，本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案涉及一種接種試劑盒，它在第一個(gè)瓶/容器中含有首次接種(初次免疫)所用的本發(fā)明MVA-BN病毒載體，在第二個(gè)瓶/容器中含有二次接種(加強(qiáng)免疫)所用的本發(fā)明MVA-BN病毒載體。
如果疫苗為含有上述DNA的MVA-BN載體或其衍生物，本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案涉及在首次接種(“初次接種”)和二次接種(“加強(qiáng)接種”)中以治療有效量給予疫苗。初次接種和加強(qiáng)接種的時(shí)間間隔為，例如2至12周，優(yōu)選3到6周，更優(yōu)選約3周。用于接種注射的病毒量至少為1×102TCID50，優(yōu)選如1×107TCID50到1×109TCID50。此外，本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案涉及一種接種試劑盒，它在第一個(gè)瓶/容器中含有首次接種(初次免疫)所用的上述MVA-BN病毒載體，在第二個(gè)瓶/容器中含有二次接種(加強(qiáng)免疫)所用的上述MVA-BN病毒載體。
因此，在疫苗實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種含有如上所述DNA、載體或NS 1蛋白或其部分的疫苗，以及所述DNA、載體或蛋白制備疫苗的用途。按照一優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明涉及所述DNA、載體或蛋白制備疫苗的用途，其中NS1蛋白或其部分、由DNA或載體編碼的NS1蛋白或部分來(lái)自一種登革熱病毒血清型，且其中DNA、載體或NS1蛋白或其部分作為抵抗二種、三種或登革熱病毒所有血清型的疫苗。最優(yōu)選地，登革熱病毒血清型是血清型2。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種治療或預(yù)防黃病毒感染的方法，包括在有需要的動(dòng)物(包括人)體內(nèi)接種上述DNA、上述載體、或上述NS1蛋白或其部分。具體地，本發(fā)明涉及上述方法，其中所述NS1蛋白或其部分、或由DNA或載體編碼的NS1蛋白或其部分來(lái)自登革熱病毒血清型，其中DNA、載體或NS1蛋白或其部分作為抵抗二種、三種或登革熱病毒所有血清型的疫苗。
發(fā)明概述具體地，本發(fā)明單獨(dú)或聯(lián)合涉及下列各項(xiàng)下述物質(zhì)在制備疫苗中的用途，-包含表達(dá)組件的核酸，所述表達(dá)組件含有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件以及至少編碼蚊媒黃病毒的NS1蛋白或其部分的序列，-包含所述核酸的載體，和/或-所述黃病毒的NS1蛋白或其部分，所述疫苗用于抵抗產(chǎn)生所述核酸或者產(chǎn)生所述NS1蛋白或其部分的蚊媒黃病毒，并抵抗至少一種其它蚊媒黃病毒。
上述用途，其中產(chǎn)生所述核酸或者產(chǎn)生所述NS1蛋白或其部分的蚊媒黃病毒是登革熱病毒。
下述物質(zhì)在制備疫苗中的用途，-包含表達(dá)組件的核酸，所述表達(dá)組件含有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件以及至少編碼登革熱病毒血清型的NS1蛋白或其部分的序列，-包含所述核酸的載體，和/或-所述登革熱病毒血清型的NS1蛋白或其部分，所述疫苗用于抵抗登革熱病毒所有血清型，并可選擇抵抗至少一種其它蚊媒黃病毒。
上述用途，其中產(chǎn)生所述核酸或者產(chǎn)生所述NS1蛋白或其部分的登革熱病毒是登革熱病毒血清型2。
上述用途，其中編碼蚊媒黃病毒或登革熱病毒血清型的NS1蛋白或其部分的序列，在前面接有ATG密碼子和編碼糖基化信號(hào)序列的序列，且其中編碼序列在翻譯終止密碼子處終止。
上述用途，其中所述其它蚊媒黃病毒選自西尼羅病毒、黃熱病病毒和日本腦炎病毒。
上述用途，其中所述載體是痘病毒載體。
上述用途，其中所述痘病毒載體為修飾的安卡拉痘苗病毒(MVA)株，特別是保藏在歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心、編號(hào)為V00083008的MVA-BN或其衍生物。
上述用途，其中所述痘病毒載體已經(jīng)凍干，并且可以于給藥前在藥學(xué)上可接受的稀釋劑中重構(gòu)。
上述用途，其中轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件是痘病毒啟動(dòng)子。
上述用途，其中疫苗在首次接種(“初次接種”)和二次接種(“加強(qiáng)接種”)中以治療有效量給藥。
一種治療或預(yù)防黃病毒感染的方法，其包括給有需要的動(dòng)物(包括人)接種-包含表達(dá)組件的核酸，所述表達(dá)組件包含轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件以及至少編碼蚊媒黃病毒NS1蛋白或其部分的序列，-包含所述核酸的載體，和/或-所述黃病毒的NS1蛋白或其部分其中所述黃病毒感染是被產(chǎn)生所述核酸或者產(chǎn)生所述NS1蛋白或其部分的蚊媒黃病毒感染，和/或被另一種蚊媒黃病毒感染。
上述方法，其中產(chǎn)生所述核酸或者產(chǎn)生所述NS1蛋白或其部分的蚊媒黃病毒是登革熱病毒。
一種治療或預(yù)防黃病毒感染的方法，其包括給有需要的動(dòng)物(包括人)接種-包含表達(dá)組件的核酸，所述表達(dá)組件包含轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件以及至少編碼登革熱病毒血清型NS1蛋白或其部分的序列，-包含所述核酸的載體，和/或-所述登革熱病毒血清型的NS1蛋白或其部分，其中所述黃病毒感染是被產(chǎn)生所述核酸或者產(chǎn)生所述NS1蛋白或其部分的登革熱病毒血清型感染，和/或被其它登革熱病毒血清型感染，和/或被其它蚊媒黃病毒感染。
上述方法，其中產(chǎn)生所述核酸或者產(chǎn)生所述NS1蛋白或其部分的登革熱病毒是登革熱病毒血清型2。
上述方法，其中所述編碼蚊媒黃病毒或登革熱病毒血清型的NS1蛋白或其部分的序列，在其前面接有ATG密碼子和編碼糖基化信號(hào)序列的序列，且其中編碼序列在翻譯終止密碼子處終止。
上述方法，其中所述載體是痘病毒載體。
上述方法，其中所述痘病毒載體是修飾的安卡拉痘苗病毒(MVA)株。
上述方法，所述MVA株是保藏在歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心、編號(hào)為V00083008的MVA-BN或其衍生物。
上述方法，其中所述痘病毒載體已經(jīng)凍干，并且可以于給藥前在藥學(xué)上可接受的稀釋劑中重構(gòu)。
上述方法，其中所述轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件是痘病毒啟動(dòng)子。
上述方法，其中所述痘病毒載體或藥物組合物在首次接種(“初次接種”)和二次接種(“加強(qiáng)接種”)中以治療有效量給藥。
一種痘病毒載體，它攜有包含表達(dá)組件的DNA，所述表達(dá)組件包含轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件以及至少編碼黃病毒NS1蛋白或其部分的序列，其中所述痘病毒是保藏在歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心、編號(hào)為V00083008的修飾的安卡拉痘苗病毒(MVA)株BN或其衍生物。
上述痘病毒載體，其中所述黃病毒是蚊媒黃病毒，特別是登革熱病毒。
上述痘病毒載體，其中所述登革熱病毒是登革熱病毒血清型2。
上述痘病毒載體，其中所述編碼黃病毒NS1蛋白或其部分的序列，在其前面接有ATG密碼子和編碼糖基化信號(hào)序列的序列，且其中編碼序列在翻譯終止密碼子處終止。
上述痘病毒載體，其中所述轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件為痘病毒啟動(dòng)子。
上述痘病毒載體，其中所述痘病毒載體是凍干的。
作為疫苗的上述痘病毒載體。
一種藥物組合物，它包含上述痘病毒載體和藥學(xué)上可接受的載體(carrier)、稀釋劑和/或添加劑。
用于治療和/或預(yù)防黃病毒感染的上述痘病毒載體或上述藥物組合物，其中所述痘病毒載體或藥物組合物在首次接種(“初次接種”)和二次接種(“加強(qiáng)接種”)中以治療有效量給藥。
一種治療和/或預(yù)防黃病毒感染的方法，包括給需要的動(dòng)物(包括人)接種上述載體或上述藥物組合物。
一種細(xì)胞，優(yōu)選人細(xì)胞，它含有上述痘病毒載體。
上述痘病毒用于制備治療或預(yù)防黃病毒感染的疫苗的用途。
一種用于初次免疫/加強(qiáng)免疫的試劑盒，它在第一個(gè)瓶/容器中含有首次接種(初次免疫)所用的上述痘病毒載體或上述藥物組合物，在第二個(gè)瓶/容器中含有二次接種(加強(qiáng)免疫)所用的上述痘病毒載體或上述藥物組合物。


圖1A作為本發(fā)明一個(gè)例子的構(gòu)建體的登革熱NGC株“信號(hào)序列+NS1”cDNA蛋白編碼序列。NS1基因的天然起始位點(diǎn)用箭頭指出。重要特征是添加了ATG起始密碼子和終止密碼子(在此例中為”TAG”)。核苷酸序列數(shù)字是指在NGC株基因組(Genbank登錄號(hào)AF038403)中的位置。圖1A中的核苷酸序列和氨基酸序列對(duì)應(yīng)于SEQID No.5。氨基酸單獨(dú)示于SEQID No.6。
圖1B含登革熱NGC株“信號(hào)序列+NS1”蛋白編碼序列的質(zhì)粒pAF7NS1的圖譜。
圖1C在質(zhì)粒pAF7中的NS1組件的核苷酸序列，顯示了用oBN345和oBN338進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)位于此組件上的引物結(jié)合位點(diǎn)。圖1C中的核苷酸和氨基酸序列對(duì)應(yīng)于SEQID No.7。氨基酸單獨(dú)示于SEQID No.8。
圖1D上圖登革熱NGC株NS1的氨基酸序列(登革熱NCG多蛋白Genbank登錄號(hào)AF038403的氨基酸776-1127)的Kyte-Doolittle親水性圖譜。零以上的值＝疏水。下圖含有衍生自E蛋白C末端最后28個(gè)氨基酸(氨基酸748-775)的信號(hào)序列的登革熱NGC株NS1氨基酸序列的Kyte-Doolittle親水性圖譜。完整氨基酸序列代表登革熱NGC多蛋白(Genbank登錄號(hào)AF038403)的氨基酸748-1127，它對(duì)此病毒株而言始于“ATG”起始密碼子但缺少終止密碼子。Sig＝信號(hào)序列。零以上的值＝疏水。
圖2“痘病毒啟動(dòng)子+信號(hào)序列+NS1”表達(dá)組件的核苷酸序列。圖2中的核苷酸和氨基酸序列對(duì)應(yīng)于SEQID No.9。氨基酸單獨(dú)示于SEQIDNo.10。簡(jiǎn)要地講，痘病毒的最小早期/晚期啟動(dòng)子元件控制登革熱病毒血清型2的NS1蛋白表達(dá)，其中NS1蛋白的N末端與E蛋白的28個(gè)C末端氨基酸融合。翻譯在插入該核酸序列中的TAG終止密碼子處終止。
圖3A將NS1表達(dá)組件克隆入pBNX07平末端的XhoI位點(diǎn)(平端克隆化)，產(chǎn)生克隆pBN41。PPr＝痘病毒啟動(dòng)子，D2F1＝缺失位點(diǎn)2的旁側(cè)1，NPT II＝新霉素抗性基因，IRES＝內(nèi)部核糖體結(jié)合位點(diǎn)，EGFP＝增強(qiáng)的綠色熒光蛋白，NS1(pBN41中)＝信號(hào)序列+NS1，D2F2＝缺失位點(diǎn)2的旁側(cè)2，Sig＝信號(hào)序列。AmpR＝氨芐青霉素抗性基因。
圖3BMVA(Genbank U94848)的HindIII圖譜，顯示了MVA六個(gè)缺失位點(diǎn)的位置(-J-＝缺失位點(diǎn)的接頭)。將″PPr+NPT II+IRES+EGFP+PPr+NS1″組件插入MVA的缺失位點(diǎn)2。PPr＝痘病毒啟動(dòng)子，NPT II＝新霉素抗性基因(蛋白編碼序列)，IRES＝內(nèi)部核糖體結(jié)合位點(diǎn)，NS1＝信號(hào)序列+登革熱2NGC株的NS1蛋白編碼序列。
圖4ELISA吸光度圖譜，示出全部三只兔子免疫后的血清滴定。
圖5ELISA交叉反應(yīng)性研究。在ELISA-分析中，第38天(上部)和第66天(下部)的兔子血清與已被DENV-1、DENV-3、DENV-4、JEV和WNV感染的細(xì)胞的裂解液的交叉反應(yīng)性。
實(shí)施例下面的實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)很理解下述實(shí)施例不在任何方面解釋為將本發(fā)明技術(shù)的應(yīng)用限制于這些實(shí)施例。
實(shí)施例1mBN07的構(gòu)建1.NS1抗原詳述(圖1)本實(shí)施例涉及衍生自New Guinea C株-NGC株(例如Genbank序列AF038403)的血清型2的NS1。由于黃病毒的NS1蛋白作為多蛋白前體的一部分而產(chǎn)生，因此在相應(yīng)DNA中的NS1基因前面不接有”ATG”起始密碼子。
因此，編碼NS1蛋白的cDNA序列必須需要添加一個(gè)”ATG”起始密碼子。接著添加信號(hào)序列使得新合成的NS1蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)糖基化。最后，蛋白編碼組件需要一個(gè)終止密碼子，在這個(gè)實(shí)施例中是將TAG加到蛋白編碼cDNA序列的3′末端。在本發(fā)明使用的實(shí)施例中，“ATG+信號(hào)序列”元件源自E蛋白疏水性C末端(最后28個(gè)氨基酸，其中NGC株以氨基酸M(ATG)起始)。
圖1A顯示作為本發(fā)明實(shí)例使用的確切的信號(hào)序列加上NS1序列(見(jiàn)SEQID 5和6)?！靶盘?hào)序列+NS1”核苷酸編碼序列通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增從登革熱NGC基因組RNA中獲得，其使用下述引物D2NS1-1上游5′-ACAAGATCTGGAATGAATTCACGTAGCACCTCA-3′(SEQID NO 4)
斜體字為Bgl II限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)。
下劃線(xiàn)為起始密碼子。
D2NS1-2下游5′-AATAGATCTCTACTAGGCTGTGACCAAGGAGTT-3′(SEQID NO 3)斜體字為BglII限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)。
下劃線(xiàn)為終止密碼子。
使用購(gòu)自Roche Molecular Biochemical(Catalog No.1-939-823)的TitanOne Tube RT-PCR試劑盒，按照制造商的推薦進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。但是，實(shí)際上可以使用任何商業(yè)的或非商業(yè)的RT-PCR試劑盒。
RT-PCR產(chǎn)物可以接著克隆到許多可商購(gòu)的細(xì)菌克隆質(zhì)粒中任何多克隆位點(diǎn)的BamHI位點(diǎn)，但是在此實(shí)施例中它被克隆入pAF7，得到克隆pAF7D2NS1-其序列詳見(jiàn)圖1B和1C。圖1D顯示NS1氨基酸序列和添加了E蛋白C末端氨基酸編碼序列中信號(hào)序列的NS1的疏水性圖譜。
2.NS1表達(dá)組件詳述(圖2)為了表達(dá)來(lái)自痘病毒載體，如金絲雀痘、禽痘、牛痘或MVA的“信號(hào)序列+NSI”，需要將痘病毒啟動(dòng)子加到此cDNA的5′末端。聚腺苷酸化信號(hào)序列不是必需的，因?yàn)樗卸徊《竞铣尚訰NA被病毒編碼的酶聚腺苷酸化，這種酶在實(shí)現(xiàn)此功能時(shí)不需要polyA附加信號(hào)序列。任何痘病毒啟動(dòng)子都可以用于此組件的表達(dá)。圖2和SEQID No.9和10顯示作為本發(fā)明實(shí)例的“痘病毒啟動(dòng)子+信號(hào)序列+NS1”組件的核苷酸序列。
作為本發(fā)明使用的實(shí)例，“信號(hào)序列+NS1”進(jìn)一步用引物oBN338和oBN345從NS1質(zhì)?？寺∵M(jìn)行PCR擴(kuò)增。oBN345引物包含該克隆質(zhì)粒中靶序列5′側(cè)的痘病毒最小啟動(dòng)子元件的核酸序列。oBN345引物結(jié)合所需的質(zhì)粒靶序列在信號(hào)序列起始密碼子上游約40個(gè)核苷酸處。這樣就保證了RNA轉(zhuǎn)錄物在信號(hào)序列ATG起始密碼子前包含一段非蛋白編碼序列。
PCR引物與Ps啟動(dòng)子oBN3385′-TTGTTAGCAGCCGGATCGTAGACTTAATTA(30mer)(SEQID No.1)oBN3455′-CAAAAAATTGAAATTTTATTTTTTTTTTTTGGAATATAAATAAAAACACGATAATACCATGG-3′
(SEQID No.2)(下劃線(xiàn)核苷酸代表痘病毒最小啟動(dòng)子序列。)PCR擴(kuò)增反應(yīng)前5個(gè)循環(huán)的退火溫度，從與oBN34克隆載體中同源序列結(jié)合的核苷酸序列計(jì)算出。
3.NS1表達(dá)組件整合入MVA(圖3)將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物平端化，再克隆入質(zhì)粒pBNX07的切口和平端XhoI位點(diǎn)(見(jiàn)圖3a)，而形成質(zhì)粒pBN41(見(jiàn)圖3a)。pBN41是通過(guò)同源重組將“pox啟動(dòng)子+信號(hào)序列+NS1”組件整合入MVA的缺失位點(diǎn)2的載體。
pBN41(圖3a)的基本特征如下-質(zhì)粒骨架是來(lái)自Stratagene的pBluescript SK+(Genbank VB0078)-D2F1缺失位點(diǎn)2旁側(cè)1同源重組臂。它代表MVA Genbank序列U94848的20117到20717的核苷酸序列。
-PPr痘病毒啟動(dòng)子。
-NPT II新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶蛋白編碼序列(Genbank V00618的蛋白編碼序列)。
-IRES來(lái)自腦心肌炎病毒的內(nèi)部核糖體進(jìn)入序列(Jang等，1989，Genbank M16802)。
-EGFP增強(qiáng)綠色熒光蛋白的編碼序列(蛋白編碼序列-Genbank序列U57609的核苷酸675到核苷酸1394)-NS1來(lái)自登革熱NGC株的“信號(hào)序列+NS1”蛋白編碼序列。
-D2F2缺失優(yōu)點(diǎn)2旁側(cè)2同源重組臂。它代表MVA Genbank序列U94848的20719到21343的核苷酸序列。
-AmpRpBluescript的氨芐青霉素抗性基因3.1通過(guò)同源重組將登革熱″pox啟動(dòng)子+信號(hào)序列+NS1″插入MVA的缺失位點(diǎn)3.1.1通過(guò)同源重組整合進(jìn)MVA基因組上述整合載體pBN41通過(guò)pBN41旁側(cè)1和旁側(cè)2臂與MVA基因組中的同源靶序列之間的同源重組，將登革熱NS1表達(dá)組件加報(bào)告組件(pox啟動(dòng)子+NPT II-IRES-EGFP)整合到MVA基因組。它通過(guò)將線(xiàn)性整合載體轉(zhuǎn)染到已用低感染復(fù)數(shù)(MOI，例如0.01個(gè)感染單位/每個(gè)細(xì)胞)的MVA感染的雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)中來(lái)完成。在感染后48小時(shí)或當(dāng)感染達(dá)到匯合時(shí)，制備病毒提取物并保存在-20℃，以準(zhǔn)備用于需要的重組MVA(rMVA)的篩選和克隆純化。
3.1.2rMVA的篩選和克隆純化非重組MVA(空載體病毒)的消除和rMVA的擴(kuò)增，在存在G418(G418的量必須優(yōu)化以便確定不殺死CEF細(xì)胞的最高劑量)的條件下，在低MOI時(shí)感染匯合的雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)來(lái)完成。在細(xì)胞維持培養(yǎng)基中添加了G418時(shí)，不包含或整合NPT2基因的任何病毒將不能復(fù)制。G418抑制DNA的復(fù)制，但是由于CEF細(xì)胞將會(huì)處于穩(wěn)定的非復(fù)制階段，CEF細(xì)胞將不會(huì)受G418作用的影響。由于增強(qiáng)熒光綠色蛋白的表達(dá)，rMVA感染的CEF細(xì)胞可以在熒光顯微鏡下觀察到。
來(lái)自同源重組步驟的病毒提取物必須連續(xù)稀釋?zhuān)⑶以诖嬖贕418的條件下用來(lái)感染新鮮CEF細(xì)胞，并用低熔點(diǎn)瓊脂糖覆蓋。在感染2天后，在熒光顯微鏡下觀察瓊脂糖感染平板，這種觀察只能發(fā)現(xiàn)綠色的感染細(xì)胞。這些細(xì)胞是有標(biāo)記的，可以將包含細(xì)胞感染灶的瓊脂糖取出并放入含有無(wú)菌細(xì)胞維持培養(yǎng)基的1.5ml小離心管內(nèi)。通過(guò)在-20℃將小離心管凍融三次，使病毒從瓊脂糖塞中釋放出來(lái)。
在瓊脂糖下進(jìn)一步克隆純化最好的克隆，直到通過(guò)PCR分析不存在空載體污染的跡象(3至30個(gè)克隆純化循環(huán))。然后通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增這些克隆，以進(jìn)一步嚴(yán)格測(cè)定是否獲得正確的插入構(gòu)型，確認(rèn)啟動(dòng)子-外源基因組件的序列和分析表達(dá)。在這些分析后，只有一個(gè)克隆進(jìn)一步在G418選擇條件下擴(kuò)增，以便制備出母液用于進(jìn)一步鑒定和免疫原性研究。
插入本發(fā)明所述登革熱NS1表達(dá)組件的重組MVA命名為mBN07。圖3b顯示mBN07中插入的外源序列的構(gòu)型。
4.真正NS1的MVA表達(dá)來(lái)自重組MVA，mBN07，的NS1蛋白表達(dá)在非變性條件下通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)western印跡分析證實(shí)。更具體地，用MOI為1.0感染單位/細(xì)胞的純化mBN07來(lái)感染哺乳動(dòng)物組織培養(yǎng)細(xì)胞，例如BHK-21細(xì)胞，分析NS1表達(dá)。從那些感染24-30小時(shí)后的感染細(xì)胞制備出粗蛋白提取物，其中一部分用含2巰基乙醇(2-ME)或不含2-ME的SDS-PAGE凝膠加樣緩沖液混合。這些樣品加上來(lái)自感染登革熱NGC株的細(xì)胞(蚊細(xì)胞系)的蛋白提取物作為陽(yáng)性對(duì)照，在SDS-PAGE凝膠中電泳分離，然后印跡到硝酸纖維素膜上。膜用抗登革熱NS1單克隆抗體探測(cè)。
結(jié)果顯示，mBN07表達(dá)的NS1被抗登革熱NS1單克隆抗體識(shí)別，并形成與來(lái)自登革熱感染細(xì)胞(與不含2-ME的未煮沸mBN07泳道以及不含2-ME的未煮沸DEN2泳道相比)的NS1類(lèi)似的正確二聚體形式。另外顯示，在變性條件下二聚體形式分解為單體形式(見(jiàn)含2-ME的煮沸的mBN07泳道)。
在western印跡分析中，用mBN07感染的細(xì)胞中表達(dá)的NS1也被混合的康復(fù)病人血清和能與所有四種登革熱血清型的NS1交叉反應(yīng)的單克隆抗體識(shí)別。這表明mBN07表達(dá)的NS1具有免疫原性。
在整個(gè)實(shí)施例部分，mBN07(有時(shí)也稱(chēng)為BN07)是以液態(tài)(任選冷凍)，或是凍干狀態(tài)保存。為了獲得凍干病毒，制備了含有病毒的溶液，它包含10mM Tris-緩沖液，140mM NaCl，18.9g/l葡聚糖(分子量36000-40000)，45g/l蔗糖，0.108g/l一水合L-谷氨酸單鉀pH7.4。然后將所述配制劑凍干。為了重組，在凍干制劑中加入水。
實(shí)施例2mBN07表達(dá)的NS1對(duì)除了血清型2以外的登革熱病毒NS1和日本腦炎病毒(JEV)NS1和西尼羅病毒(WNV)NS1的交叉免疫原性1.從mBN07表達(dá)的NS1對(duì)病人康復(fù)期血清的反應(yīng)性檢測(cè)mBN07表達(dá)的NS1被有早先登革熱病毒感染的個(gè)體的康復(fù)期病人血清識(shí)別的可能性。選取具有抗登革熱病毒包膜蛋白的抗體(通過(guò)免疫印跡證實(shí)其抵抗登革熱血清型1至4的真正抗原)的68例個(gè)體的血清，檢測(cè)由mBN07感染細(xì)胞提取物制備的免疫印跡條帶，將MVA-GFP感染細(xì)胞的提取物作為對(duì)照。含抗原的細(xì)胞裂解物用不含2-巰基乙醇的上樣緩沖液處理，且不加熱。檢測(cè)的68份個(gè)體血清中，62份(91.2％)與免疫印跡中由mBN07表達(dá)的BN07 NS1反應(yīng)。進(jìn)一步分析這些血清對(duì)所有4種登革熱病毒血清型和日本腦炎病毒(JEV)的NS1的反應(yīng)性。結(jié)果示于表1。54份血清與登革熱病毒所有血清型和日本腦炎病毒(JEV)的NS1反應(yīng)，而且這54份血清中的53份(98.2％)也與mBN07表達(dá)的NS1反應(yīng)。7份血清對(duì)至少一種登革熱病毒血清型的NS1是特異的，而且不與JEV的NS1反應(yīng)。所有這7份血清也與mBN07表達(dá)的NS1反應(yīng)。另外的7份血清只與JEV的NS1反應(yīng)，而不與任何登革熱病毒血清型的NS1反應(yīng)，然而這些JEV-特異性血清中的2份(28.6％)也與mBN07表達(dá)的NS1反應(yīng)。
表1

真正NS1和mBN07表達(dá)的NS1的抗血清反應(yīng)比較。括弧中檢測(cè)樣品陽(yáng)性數(shù)/檢測(cè)樣品總數(shù)。DEN＝登革熱，JEV＝日本腦炎病毒。
對(duì)相同的68份血清也進(jìn)行了抵抗前膜蛋白的反應(yīng)性的分析。在發(fā)明人的經(jīng)驗(yàn)中，抵抗前膜的抗體比抵抗NS1或E的抗體更具特異性。這樣，已感染登革熱的患者將會(huì)產(chǎn)生識(shí)別登革熱病毒前膜而非JEV前膜的抗體，反之亦然。沿著這條線(xiàn)的分析將會(huì)提供更好的個(gè)體感染歷史的預(yù)測(cè)。表2顯示了來(lái)自22名患者的血清僅與真正登革熱前膜蛋白反應(yīng)，提示這22名患者只暴露于登革熱病毒而非JEV。所有這22份血清與mBN07表達(dá)的NS1反應(yīng)。另外的22名患者有先前感染登革熱和JEV的證據(jù)，它們也全都與mBN07表達(dá)的NS1反應(yīng)。在這個(gè)組中也有21名有先前只感染JEV證據(jù)的患者(盡管這些血清有抵抗登革熱E的交叉反應(yīng)抗體)。有趣地是，這21名JEV反應(yīng)者中的17名(82％)與mBN07表達(dá)的NS1反應(yīng)。在整個(gè)組中，只有3份血清不與登革熱或JEV的前膜蛋白反應(yīng)，其中只有1份與mBN07表達(dá)的NS1反應(yīng)。這種情況的最可能理由是抗體滴度太低而無(wú)法用免疫印跡檢出。
表2

抵抗真正前膜和BN07 NS1的抗血清反應(yīng)比較。括弧中檢測(cè)樣品陽(yáng)性數(shù)/檢測(cè)樣品總數(shù)。DEN＝登革熱，JEV＝日本腦炎病毒。
表2中的數(shù)據(jù)也清楚地顯示了在6份不與mBN07表達(dá)的NS1反應(yīng)的血清中，4份來(lái)自先前感染了JEV而非登革熱的個(gè)體，剩余的2份無(wú)可檢出的對(duì)登革熱或JEV前膜蛋白的抗體，可能是由于低滴度。
2.給兔接種mBN07并用免疫印跡和ELISA分析檢測(cè)抗登革熱病毒和日本腦炎病毒的免疫后血清三只無(wú)特異性病原體的兔子按照如下所示疫苗接種程序采用皮下途徑免疫。每只兔子用使用無(wú)菌水重構(gòu)到1ml的一瓶?jī)龈梢呙?1x10e8 TCID50BN07凍干疫苗)在第0天和第28天接種。在第一次接種前(預(yù)取血)和第二次接種的10天后采取血樣。
第0天＝預(yù)取血后第一次接種第28天＝第二次接種第38天＝取血第56天＝第三次接種第66天＝取血第112天＝從每只兔中抽取50ml血2.1抵抗登革熱血清型2免疫印跡的前期取血和免疫后血清檢測(cè)登革熱2病毒抗原和未感染的C6/36細(xì)胞的抗原通過(guò)在非變性條件下的SDS PAGE分離。為了免疫印跡分析，使用第38天的血清(稀釋1∶200)。
結(jié)果清楚地顯示，接種mBN07使所有三只兔子產(chǎn)生高滴度的抗NS1抗體，且該抗體能與組織培養(yǎng)蚊細(xì)胞被登革熱血清型2感染后產(chǎn)生的真正NS1交叉反應(yīng)。在接種前采集的血清不與免疫印跡上的任何登革熱蛋白反應(yīng)。
第38天的免疫后血清在1∶1000，1∶2000，1∶4000，1∶10-4，1∶10-5，1∶10-6下滴定，并在非變性條件下通過(guò)SDS PAGE分離的登革熱2病毒抗原免疫印跡條和未感染的C6/36細(xì)胞的對(duì)照條上檢測(cè)。第38天的三份兔子血清終點(diǎn)滴度計(jì)算為1∶10,000。第66天的血清終點(diǎn)滴度在免疫印跡和ELISA分析中都計(jì)算為1×105(數(shù)據(jù)未顯示)。
免疫前和免疫后的血清都在1∶10-2，1∶10-3，1∶10-4，1∶10-5，1∶10-6，1∶10-7時(shí)滴定，而且在間接IgG ELISA中檢測(cè)?？子?∶250稀釋度的登革熱2和未被感染的C6/36的裂解液包被。
表3

示出每只兔子的免疫前和免疫后血清在不同稀釋度下的ELISA吸光度(Pre＝免疫前血清，Post＝免疫后血清)每只兔子的免疫后血清滴定示于圖4中。每只兔子的免疫后血清估計(jì)終點(diǎn)稀釋度為1∶1000。
2.2抵抗登革熱血清型1、3、4和日本腦炎病毒和西尼羅病毒免疫印跡的前期取血和免疫后血清檢測(cè)第38天的每份兔子血清在1∶1000稀釋度下，在非變性條件下通過(guò)SDSPAGE分離的登革熱1、2、3、4和JE病毒抗原的免疫印跡條加未感染的C6/36細(xì)胞的對(duì)照條上檢測(cè)。顯示每份兔免疫后血清與來(lái)自登革熱血清型1、3和4的NS1以及與在日本腦炎免疫印跡上的NS1反應(yīng)。
第66天的每份兔子血清在1∶1000稀釋度下，在非變性條件下通過(guò)SDSPAGE分離的登革熱1、3、4、WNV和JE病毒抗原的免疫印跡條加未感染的C6/36細(xì)胞的對(duì)照條上檢測(cè)。顯示每份兔免疫后血清與來(lái)自登革熱血清型1、3和4的NS1以及與在日本腦炎病毒和西尼羅病毒免疫印跡上的NS1反應(yīng)。
為了證實(shí)免疫印跡分析，進(jìn)行了Elisa交叉反應(yīng)分析。微滴定板上的孔用1∶250稀釋度的DENV-1、DENV-3、DENV-4、JEV、WNV和未感染的細(xì)胞的裂解液包被。血清為第38天(圖5A)和第66天(圖5B)的血清。
從免疫印跡分析和ELISA試驗(yàn)中可以得出結(jié)論由登革熱病毒NS1誘導(dǎo)的抗體與所有其它登革熱血清型、JEV和WNV交叉反應(yīng)。
2.3.結(jié)論
-用mBN07疫苗免疫的兔子誘導(dǎo)能識(shí)別真正登革熱病毒血清型2 NS1的抗體。
-當(dāng)免疫印跡分析和ELISA中的終點(diǎn)分別在1∶10-4和1∶10-3時(shí)觀察到非常高的免疫反應(yīng)。
-在兔子中誘導(dǎo)的抗體與所有其它登革熱血清型(1，3和4)交叉反應(yīng)。
-所述抗體也與來(lái)自異源病毒，如JEV和WNV的NS1交叉反應(yīng)。
3.小鼠中的免疫原性研究雌性遠(yuǎn)系小鼠通過(guò)腹膜內(nèi)途徑用表達(dá)登革熱病毒NS1的mBN07以不同量和方案免疫，如下所示。mBN08(一種與mBN07相應(yīng)但不表達(dá)NS1的MVA)和PBS作為對(duì)照。小鼠血清用來(lái)檢驗(yàn)小鼠中產(chǎn)生的抗體是否能夠在Western印跡上分別與來(lái)自不同黃病毒血清型和日本腦炎病毒的NS1蛋白反應(yīng)。來(lái)自對(duì)照小鼠的血清在所有試驗(yàn)中都是陰性的。
分析下列各組

在免疫印跡試驗(yàn)中，得到下列結(jié)果表7

用Balb/c小鼠獲得了非常相似的試驗(yàn)在第0天和第2 1天給小鼠兩次接種1×108TCID50BN07(凍干并用水重構(gòu))。在第42天采集血清。100％的血清與登革熱病毒2NS1反應(yīng)，100％的血清與來(lái)自所有四種登革熱病毒血清型的NS1蛋白反應(yīng)，75％的血清與JEV的NS1蛋白反應(yīng)。用1×108TCID50非凍干BN07接種的結(jié)果如下100％的血清與來(lái)自所有四種登革熱病毒血清型的NS1蛋白反應(yīng)。識(shí)別來(lái)自JEV的NS1的血清比用凍干BN07接種小鼠獲得的血清差。
結(jié)論-用BN07免疫的小鼠100％具有對(duì)DENV-2 NS1的非常強(qiáng)反應(yīng)的抗體。
-用1x10e7TCID50 BN07免疫小鼠的免疫反應(yīng)與用1x10e8TCID50BN07免疫小鼠的免疫反應(yīng)一樣強(qiáng)(數(shù)據(jù)未示出)。
-在間隔4周和取血前4周免疫的小鼠上觀察到最好的交叉反應(yīng)性百分比。
-與用非凍干疫苗免疫的小鼠相比，用BN07凍干疫苗免疫的小鼠對(duì)NS1具有更強(qiáng)的反應(yīng)。
參考文獻(xiàn)Nimmannitya S，Kalayanaroo S，Nisalak A，andInnes B.1990.Secondattack of dengue hemorrhagic fever.Southeast Asian Journal of TropicalMedicine and Public Health，21699Burke DS and Monath TP.，2001，F(xiàn)laviviruses.In Fields Virology，F(xiàn)ourthEdition，Edited by David M Knipe and Peter M Howley.Published by LippincottWilliams and Wilkins，Philadelphia.Pages 1043-1125.
Flamand M，Megret F，Mathieu M，LePault，ReyFA and Deubel V.，1999.Dengue Virus Type 1Nonstructural Glycoprotein NS1 is Secreted frommammalian cells as a soluble hexamer in a glycsylation-dependent fashion.J.Virol.，736104-6110.
Jang SK，Davies MV，Kaufman RJ and Wimmer E.，1989.Initiation ofprotein synthesis by internal entry of ribosomes into the5′nontransfated region ofencephalomycarditis virus RNA in vivo.J.Virol.，631651-60.
Lindenbach BD and Rice CM.，2001，F(xiàn)laviviruses and their replication.InFields Virology，F(xiàn)ourth Edition.Edited by David M Knipe and Peter M Howley.Published by Lippincott Williams and Wilkins，Philadelphia.Pages 991-1041.
Schlesinger JJ，Brandriss MW and Walsh EE.，1987.Protection of miceagainst dengue 2 virus encephalitis by immunization with the dengue 2 virusnon-structural protein NS 1.J.Gen.Virol.，68853-7Schesinger JJ，F(xiàn)oltzer M and Chapman S.，1993.The Fc portion ofantibody to yellow fever virus NS1 is a determinant of protection against yellowfever encephalitis in mice.Virology.192132-41本說(shuō)明書(shū)中描述的技術(shù)和步驟是分子生物學(xué)和病毒學(xué)，特別是黃病毒病毒學(xué)和痘病毒基因工程領(lǐng)域的專(zhuān)業(yè)人員所熟悉的。所述技術(shù)和步驟可以在下述文獻(xiàn)中找到更詳細(xì)的描述Molecular Cloning，A laboratory Manual.Second Edition.By J.Sambrook，E.F.Fritsch and T.Maniatis.Cold Spring Harbor Laboratory Press.1989.
Virology Methods Manual.Edited by Brian WJ Mahy and Hillar OKangro.Academic Press.1996.
Molecular VirologyA Practical Approach.Edited by AJ Davison and RMElliott.The Practical Approach Series.IRL Press at Oxford University Press.Oxford 1993.Chapter 9Expression of genes by vaccinia virus vectors.
Current Protocols in Molecular Biology.PublisherJohn Wiley andSonInc.1998.Chapter 16，sectionIVExpression of proteins in mammalian cellsusing vaccinia viral vector.
Antibodies，A Laboratory Manual.By Ed Harlow and David Lane.ColdSpring Harbor Laboratory Press.1988.
關(guān)于微生物保藏的說(shuō)明(細(xì)則13之二)



PCT/RO/134表(1992年7月)
關(guān)于微生物保藏的說(shuō)明(細(xì)則13之二)



PCT/RO/134表(1992年7月)
序列表<110>巴法里安諾迪克有限公司(Bavarian Nordic A/S)文圖爾技術(shù)公司(Venture Technologies Sdn Bhd)<120>黃病毒NS1亞單位疫苗<130>NS1-Dengue<140>0000<141>2001-12-04<160>10<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>1ttgttagcag ccggatcgta gacttaatta 30<210>2<211>62<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>2caaaaaattg aaattttatt tttttttttt ggaatataaa taaaaacacg ataataccat60gg 62<210>3<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物
<400>3aatagatctc tactaggctg tgaccaagga gtt33<210>4<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>4acaagatctg gaatgaattc acgtagcacc tca 33<210>5<211>1143<212>DNA<213>2型登革熱病毒<220>
<221>CDS<222>(1)..(1140)<223>E蛋白信號(hào)序列+NS1編碼序列<400>5atg aat tca cgc agc acc tca ctg tct gtg tca cta gta ttg gtg gga48Met Asn Ser Arg Ser Thr Ser Leu Ser Val Ser Leu Val Leu Val Gly1 5 10 15gtc gtg acg ctg tat ttg gga gtt atg gtg cag gcc gat agt ggt tgc96Val Val Thr Leu Tyr Leu Gly Val Met Val Gln Ala Asp Ser Gly Cys20 25 30gtt gtg agc tgg aaa aac aaa gaa ctg aag tgt ggc agt ggg att ttc144Val Val Ser Trp Lys Asn Lys Glu Leu Lys Cys Gly Ser Gly Ile Phe35 40 45atc aca gac aac gtg cac aca tgg aca gaa caa tac aag ttc caa cca192Ile Thr Asp Asn Val His Thr Trp Thr Glu Gln Tyr Lys Phe Gln Pro50 55 60gaa tcc cct tca aag cta gct tca gct atc cag aaa gct cat gaa gag240Glu Ser Pro Ser Lys Leu Ala Ser Ala Ile Gln Lys Ala His Glu Glu65 70 75 80
ggc att tgt gga atc cgc tca gta aca aga ctg gaa aat ctg atg tgg288Gly Ile Cys Gly Ile Arg Ser Val Thr Arg Leu Glu Asn Leu Met Trp85 90 95aaa caa ata aca cca gaa ttg aat cac att cta tca gaa aat gag gtg336Lys Gln Ile Thr Pro Glu Leu Asn His Ile Leu Ser Glu Asn Glu Val100 105 110aag ttg act att atg aca gga gac atc aaa gga atc atg cag gca gga384Lys Leu Thr Ile Met Thr Gly Asp Ile Lys Gly Ile Met Gln Ala Gly115 120 125aaa cga tct ctg cag ccc cag ccc act gag ctg aag tat tca tgg aaa432Lys Arg Ser Leu Gln Pro Gln Pro Thr Glu Leu Lys Tyr Ser Trp Lys130 135 140aca tgg ggc aaa gcg aaa atg ctc tct aca gag tct cat aac cag acc480Thr Trp Gly Lys Ala Lys Met Leu Ser Thr Glu Ser Hi s Asn Gln Thr145 150 155 160ttt ctc att gat ggc ccc gaa aca gca gaa tgc ccc aac aca aac aga528Phe Leu Ile Asp Gly Pro Glu Thr Ala Glu Cys Pro Asn Thr Asn Arg165 170 175gct tgg aat tcg ctg gaa gtt gaa gac tat ggc ttt gga gta ttc acc576Ala Trp Asn Ser Leu Glu Val Glu Asp Tyr Gly Phe Gly Val Phe Thr180 185 190acc aat ata tgg cta aag ttg aga gaa aag cag gat gta ttc tgc gac624Thr Asn Ile Trp Leu Lys Leu Arg Glu Lys Gln Asp Val Phe Cys Asp195 200 205tca aaa ctc atg tca gcg gcc ata aaa gac aac aga gcc gtc cat gcc672Ser Lys Leu Met Ser Ala Ala Ile Lys Asp Asn Arg Ala Val His Ala210 215 220gat atg ggt tat tgg ata gaa agt gca ctc aat gac aca tgg aag ata720Asp Met Gly Tyr Trp Ile Glu Ser Ala Leu Asn Asp Thr Trp Lys Ile225 230 235 240gag aaa gcc tct ttc atc gaa gtt aaa agc tgc cac tgg cca aag tca768Glu Lys Ala Ser Phe Ile Glu Val Lys Ser Cys His Trp Pro Lys Ser245 250 255cac acc ctc tgg agt aat gga gtg tta gaa agt gag atg ata att cca816His Thr Leu Trp Ser Asn Gly Val Leu Glu Ser Glu Met Ile Ile Pro260 265 270
aag aat ttc gct gga cca gtg tca caa cac aac tac aga cca ggc tac864Lys Asn Phe Ala Gly Pro Val Ser Gln His Asn Tyr Arg Pro Gly Tyr275 280 285cat aca caa aca gca gga cca tgg cat cta ggt aag ctt gag atg gac912His Thr Gln Thr Ala Gly Pro Trp Hi s Leu Gly Lys Leu Glu Met Asp290 295 300ttt gat ttc tgc gaa gga acc aca gtg gtg gtg act gag gac tgt gga960Phe Asp Phe Cys Glu Gly Thr Thr Val Val Val Thr Glu Asp Cys Gly305 310 315 320aat aga gga ccc tct tta aga aca act act gcc tct gga aaa ctc ata1008Asn Arg Gly Pro Ser Leu Arg Thr Thr Thr Ala Ser Gly Lys Leu Ile325 330 335aca gaa tgg tgc tgc cga tct tgc aca tta cea ccg cta aga tac aga1056Thr Glu Trp Cys Cys Arg Ser Cys Thr Leu Pro Pro Leu Arg Tyr Arg340 345 350ggt gag gac gga tgc tgg tac ggg atg gaa atc aga cca ttg aaa gag1104Gly Glu Asp Gly Cys Trp Tyr Gly Met Glu Ile Arg Pro Leu Lys Glu355 360 365aaa gaa gag aat ttg gtc aac tcc ttg gtc aca gcc tag1143Lys Glu Glu Asn Leu Val Asn Ser Leu Val Thr Ala370 375 380<210>6<211>380<212>PRT<213>2型登革熱病毒<400>6Met Asn Ser Arg Ser Thr Ser Leu Ser Val Ser Leu Val Leu Val Gly1 5 10 15Val Val Thr Leu Tyr Leu Gly Val Met Val Gln Ala Asp Ser Gly Cys20 25 30Val Val Ser Trp Lys Asn Lys Glu Leu Lys Cys Gly Ser Gly Ile Phe35 40 45Ile Thr Asp Asn Val His Thr Trp Thr Glu Gln Tyr Lys Phe Gln Pro50 55 60Glu Ser Pro Ser Lys Leu Ala Ser Ala Ile Gln Lys Ala His Glu Glu
65 70 75 80Gly Ile Cys Gly Ile Arg Ser Val Thr Arg Leu Glu Asn Leu Met Trp85 90 95Lys Gln Ile Thr Pro Glu Leu Asn His Ile Leu Ser Glu Asn Glu Val100 105 110Lys Leu Thr Ile Met Thr Gly Asp Ile Lys Gly Ile Met Gln Ala Gly115 120 125Lys Arg Ser Leu Gln Pro Gln Pro Thr Glu Leu Lys Tyr Ser Trp Lys130 135 140Thr Trp Gly Lys Ala Lys Met Leu Ser Thr Glu Ser His Asn Gln Thr145 150 155 160Phe Leu Ile Asp Gly Pro Glu Thr Ala Glu Cys Pro Asn Thr Asn Arg165 170 175Ala Trp Asn Ser Leu Glu Val Glu Asp Tyr Gly Phe Gly Val Phe Thr180 185 190Thr Asn Ile Trp Leu Lys Leu Arg Glu Lys Gln Asp Val Phe Cys Asp195 200 205Ser Lys Leu Met Ser Ala Ala Ile Lys Asp Asn Arg Ala Val His Ala210 215 220Asp Met Gly Tyr Trp Ile Glu Ser Ala Leu Asn Asp Thr Trp Lys Ile225 230 235 240Glu Lys Ala Ser Phe Ile Glu Val Lys Ser Cys His Trp Pro Lys Ser245 250 255His Thr Leu Trp Ser Asn Gly Val Leu Glu Ser Glu Met Ile Ile Pro260 265 270Lys Asn Phe Ala Gly Pro Val Ser Gln His Asn Tyr Arg Pro Gly Tyr275 280 285His Thr Gln Thr Ala Gly Pro Trp His Leu Gly Lys Leu Glu Met Asp290 295 300Phe Asp Phe Cys Glu Gly Thr Thr Val Val Val Thr Glu Asp Cys Gly305 310 315 320Asn Arg Gly Pro Ser Leu Arg Thr Thr Thr Ala Ser Gly Lys Leu Ile
325 330 335Thr Glu Trp Cys Cys Arg Ser Cys Thr Leu Pro Pro Leu Arg Tyr Arg340 345 350Gly Glu Asp Gly Cys Trp Tyr Gly Met Glu Ile Arg Pro Leu Lys Glu355 360 365Lys Glu Glu Asn Leu Val Asn Ser Leu Val Thr Ala370 375 380<210>7<211>1296<212>DNA<213>2型登革熱病毒<220>
<221>CDS<222>(50)..(1189)<220>
<221>引物_結(jié)合<222>(12)..(32)<220>
<221>引物_結(jié)合<222>(1243)..(1273)<400>7ttttcctttg aaaaacacga taataccatg ggaattcccc cgatctgga atg aat tca 58Met Asn Ser1cgc agc acc tca ctg tct gtg tca cta gta ttg gtg gga gtc gtg acg106Arg Ser Thr Ser Leu Ser Val Ser Leu Val Leu Val Gly Val Val Thr5 10 15ctg tat ttg gga gtt atg gtg cag gcc gat agt ggt tgc gtt gtg agc154Leu Tyr Leu Gly Val Met Val Gln Ala Asp Ser Gly Cys Val Val Ser20 25 30 35tgg aaa aac aaa gaa ctg aag tgt ggc agt ggg att ttc atc aca gac202Trp Lys Asn Lys Glu Leu Lys Cys Gly Ser Gly Ile Phe Ile Thr Asp40 45 50
aac gtg cac aca tgg aca gaa caa tac aag ttc caa cca gaa tcc cct250Asn Val His Thr Trp Thr Glu Gln Tyr Lys Phe Gln Pro Glu Ser Pro55 60 65tca aag cta gct tca gct atc cag aaa gct cat gaa gag ggc att tgt298Ser Lys Leu Ala Ser Ala Ile Gln Lys Ala His Glu Glu Gly Ile Cys70 75 80gga atc cgc tca gta aca aga ctg gaa aat ctg atg tgg aaa caa ata346Gly Ile Arg Ser Val Thr Arg Leu Glu Asn Leu Met Trp Lys Gln Ile85 90 95aca cca gaa ttg aat cac att cta tca gaa aat gag gtg aag ttg act394Thr Pro Glu Leu Asn His Ile Leu Ser Glu Asn Glu Val Lys Leu Thr100 105 110 115att atg aca gga gac atc aaa gga atc atg cag gca gga aaa cga tct442Ile Met Thr Gly Asp Ile Lys Gly Ile Met Gln Ala Gly Lys Arg Ser120 125 130ctg cag ccc cag ccc act gag ctg aag tat tca tgg aaa aca tgg ggc490Leu Gln Pro Gln Pro Thr Glu Leu Lys Tyr Ser Trp Lys Thr Trp Gly135 140 145aaa gcg aaa atg ctc tct aca gag tct cat aac cag acc ttt ctc att538Lys Ala Lys Met Leu Ser Thr Glu Ser His Asn Gln Thr Phe Leu Ile150 155 160gat ggc ccc gaa aca gca gaa tgc ccc aac aca aac aga gct tgg aat586Asp Gly Pro Glu Thr Ala Glu Cys Pro Asn Thr Asn Arg Ala Trp Asn165 170 175tcg ctg gaa gtt gaa gac tat ggc ttt gga gta ttc acc acc aat ata634Ser Leu Glu Val Glu Asp Tyr Gly Phe Gly Val Phe Thr Thr Asn Ile180185 190 195tgg cta aag ttg aga gaa aag cag gat gta ttc tgc gac tca aaa ctc682Trp Leu Lys Leu Arg Glu Lys Gln Asp Val Phe Cys Asp Ser Lys Leu200 205 210atg tca gcg gcc ata aaa gac aac aga gcc gtc cat gcc gat atg ggt730Met Ser Ala Ala Ile Lys Asp Asn Arg Ala Val His Ala Asp Met Gly215 220 225tat tgg ata gaa agt gca ctc aat gac aca tgg aag ata gag aaa gcc778Tyr Trp Ile Glu Ser Ala Leu Asn Asp Thr Trp Lys Ile Glu Lys Ala230 235 240
tct ttc atc gaa gtt aaa agc tgc cac tgg cca aag tca cac acc ctc826Ser Phe Ile Glu Val Lys Ser Cys His Trp Pro Lys Ser His Thr Leu245 250 255tgg agt aat gga gtg tta gaa agt gag atg ata att cca aag aat ttc874Trp Ser Asn Gly Val Leu Glu Ser Glu Met Ile Ile Pro Lys Asn Phe260 265 270 275gct gga cca gtg tca caa cac aac tac aga cca ggc tac cat aca caa922Ala Gly Pro Val Ser Gln His Asn Tyr Arg Pro Gly Tyr His Thr Gln280 285 290aca gca gga cca tgg cat cta ggt aag ctt gag atg gac ttt gat ttc970Thr Ala Gly Pro Trp His Leu Gly Lys Leu Glu Met Asp Phe Asp Phe295 300 305tgc gaa gga acc aca gtg gtg gtg act gag gac tgt gga aat aga gga1018Cys Glu Gly Thr Thr Val Val Val Thr Glu Asp Cys Gly Asn Arg Gly310 315 320ccc tct tta aga aca act act gcc tct gga aaa ctc ata aca gaa tgg1066Pro Ser Leu Arg Thr Thr Thr Ala Ser Gly Lys Leu Ile Thr Glu Trp325 330 335tgc tgc cga tct tgc aca tta cca ccg cta aga tac aga ggt gag gac1114Cys Cys Arg Ser Cys Thr Leu Pro Pro Leu Arg Tyr Arg Gly Glu Asp340 345 350 355gga tgc tgg tac ggg atg gaa atc aga cca ttg aaa gag aaa gaa gag1162Gly Cys Trp Tyr Gly Met Glu Ile Arg Pro Leu Lys Glu Lys Glu Glu360 365 370aat ttg gtc aac tcc ttg gtc aca gcc tagtagggat cgggggagct 1209Asn Leu Val Asn Ser Leu Val Thr Ala375 380cactagtgga tccctccagc tcgagaggnc taattaatta agtctacgat ccggctgcta 1269acaaagcccg aaaggaagct gagttgg 1296<210>8<211>380<212>PRT<213>2型登革熱病毒<400>8
Met Asn Ser Arg Ser Thr Ser Leu Ser Val Ser Leu Val Leu Val Gly1 5 10 15Val Val Thr Leu Tyr Leu Gly Val Met Val Gln Ala Asp Ser Gly Cys20 25 30Val Val Ser Trp Lys Asn Lys Glu Leu Lys Cys Gly Ser Gly Ile Phe35 40 45Ile Thr Asp Asn Val His Thr Trp Thr Glu Gln Tyr Lys Phe Gln Pro50 55 60Glu Ser Pro Ser Lys Leu Ala Ser Ala Ile Gln Lys Ala His Glu Glu65 70 75 80Gly Ile Cys Gly Ile Arg Ser Val Thr Arg Leu Glu Asn Leu Met Trp85 90 95Lys Gln Ile Thr Pro Glu Leu Asn His Ile Leu Ser Glu Asn Glu Val100 105 110Lys Leu Thr Ile Met Thr Gly Asp Ile Lys Gly Ile Met Gln Ala Gly115120 125Lys Arg Ser Leu Gln Pro Gln Pro Thr Glu Leu Lys Tyr Ser Trp Lys130 135 140Thr Trp Gly Lys Ala Lys Met Leu Ser Thr Glu Ser His Asn Gln Thr145 150 155 160Phe Leu Ile Asp Gly Pro Glu Thr Ala Glu Cys Pro Asn Thr Asn Arg165 170 175Ala Trp Asn Ser Leu Glu Val Glu Asp Tyr Gly Phe Gly Val Phe Thr180 185 190Thr Asn Ile Trp Leu Lys Leu Arg Glu Lys Gln Asp Val Phe Cys Asp195 200 205Ser Lys Leu Met Ser Ala Ala Ile Lys Asp Asn Arg Ala Val His Ala210 215 220Asp Met Gly Tyr Trp Ile Glu Ser Ala Leu Asn Asp Thr Trp Lys Ile225 230 235 240Glu Lys Ala Ser Phe Ile Glu Val Lys Ser Cys His Trp Pro Lys Ser245 250 255
His Thr Leu Trp Ser Asn Gly Val Leu Glu Ser Glu Met Ile Ile Pro260 265 270Lys Asn Phe Ala Gly Pro Val Ser Gln His Asn Tyr Arg Pro Gly Tyr275 280 285His Thr Gln Thr Ala Gly Pro Trp His Leu Gly Lys Leu Glu Met Asp290 295 300Phe Asp Phe Cys Glu Gly Thr Thr Val Val Val Thr Glu Asp Cys Gly305 310 315 320Asn Arg Gly Pro Ser Leu Arg Thr Thr Thr Ala Ser Gly Lys Leu Ile325 330 335Thr Glu Trp Cys Cys Arg Ser Cys Thr Leu Pro Pro Leu Arg Tyr Arg340 345 350Gly Glu Asp Gly Cys Trp Tyr Gly Met Glu Ile Arg Pro Leu Lys Glu355 360 365Lys Glu Glu Asn Leu Val Asn Ser Leu Val Thr Ala370 375 380<210>9<211>1227<212>DNA<213>2型登革熱病毒<220>
<221>啟動(dòng)子<222>(5)..(48)<223>最小痘病毒啟動(dòng)子元件<220>
<221>CDS<222>(85)..(1224)<223>NS1<400>9ctcgacaaaa aattgaaatt ttattttttt tttttggaat ataaataaaa acacgataat 60accatgggaa ttccccgatc tgga atg aat tca cgc agc acc tca ctg tct111Met Asn Ser Arg Ser Thr Ser Leu Ser1 5
gtg tca cta gta ttg gtg gga gtc gtg acg ctg tat ttg gga gtt atg159Val Ser Leu Val Leu Val Gly Val Val Thr Leu Tyr Leu Gly Val Met10 15 20 25gtg cag gcc gat agt ggt tgc gtt gtg agc tgg aaa aac aaa gaa ctg207Val Gln Ala Asp Ser Gly Cys Val Val Ser Trp Lys Asn Lys Glu Leu30 35 40aag tgt ggc agt ggg att ttc atc aca gac aac gtg cac aca tgg aca255Lys Cys Gly Ser Gly Ile Phe Ile Thr Asp Asn Val His Thr Trp Thr45 50 55gaa caa tac aag ttc caa cca gaa tcc cct tca aag cta gct tca gct303Glu Gln Tyr Lys Phe Gln Pro Glu Ser Pro Ser Lys Leu Ala Ser Ala60 65 70atc cag aaa gct cat gaa gag ggc att tgt gga atc cgc tca gta aca351Ile Gln Lys Ala His Glu Glu Gly Ile Cys Gly Ile Arg Ser Val Thr75 80 85aga ctg gaa aat ctg atg tgg aaa caa ata aca cca gaa ttg aat cac399Arg Leu Glu Asn Leu Met Trp Lys Gln Ile Thr Pro Glu Leu Asn His90 95 100 105att cta tca gaa aat gag gtg aag ttg act att atg aca gga gac atc447Ile Leu Ser Glu Asn Glu Val Lys Leu Thr Ile Met Thr Gly Asp Ile110 115 120aaa gga atc atg cag gca gga aaa cga tct ctg cag ccc cag ccc act495Lys Gly Ile Met Gln Ala Gly Lys Arg Ser Leu Gln Pro Gln Pro Thr125 130 135gag ctg aag tat tca tgg aaa aca tgg ggc aaa gcg aaa atg ctc tct543Glu Leu Lys Tyr Ser Trp Lys Thr Trp Gly Lys Ala Lys Met Leu Ser140 145 150aca gag tct cat aac cag acc ttt ctc att gat ggc ccc gaa aca gca591Thr Glu Ser His Asn Gln Thr Phe Leu Ile Asp Gly Pro Glu Thr Ala155 160 165gaa tgc ccc aac aca aac aga gct tgg aat tcg ctg gaa gtt gaa gac639Glu Cys Pro Asn Thr Asn Arg Ala Trp Asn Ser Leu Glu Val Glu Asp170 175 180 185tat ggc ttt gga gta ttc acc acc aat ata tgg cta aag ttg aga gaa687Tyr Gly Phe Gly Val Phe Thr Thr Asn Ile Trp Leu Lys Leu Arg Glu190 195 200
aag cag gat gta ttc tgc gac tca aaa ctc atg tca gcg gcc ata aaa735Lys Gln Asp Val Phe Cys Asp Ser Lys Leu Met Ser Ala Ala Ile Lys205 210 215gac aac aga gcc gtc cat gcc gat atg ggt tat tgg ata gaa agt gca783Asp Asn Arg Ala Val His Ala Asp Met Gly Tyr Trp Ile Glu Ser Ala220 225 230ctc aat gac aca tgg aag ata gag aaa gcc tct ttc atc gaa gtt aaa831Leu Asn Asp Thr Trp Lys Ile Glu Lys Ala Ser Phe Ile Glu Val Lys235 240 245agc tgc cac tgg cca aag tca cac acc ctc tgg agt aat gga gtg tta879Ser Cys His Trp Pro Lys Ser His Thr Leu Trp Ser Asn Gly Val Leu250 255 260 265gaa agt gag atg ata att cca aag aat ttc gct gga cca gtg tca caa927Glu Ser Glu Met Ile Ile Pro Lys Asn Phe Ala Gly Pro Val Ser Gln270 275 280cac aac tac aga cca ggc tac cat aca caa aca gca gga cca tgg cat975His Asn Tyr Arg Pro Gly Tyr His Thr Gln Thr Ala Gly Pro Trp His285 290 295cta ggt aag ctt gag atg gac ttt gat ttc tgc gaa gga acc aca gtg1023Leu Gly Lys Leu Glu Met Asp Phe Asp Phe Cys Glu Gly Thr Thr Val300 305 310gtg gtg act gag gac tgt gga aat aga gga ccc tct tta aga aca act1071Val Val Thr Glu Asp Cys Gly Asn Arg Gly Pro Ser Leu Arg Thr Thr315 320 325act gcc tct gga aaa ctc ata aca gaa tgg tgc tgc cga tct tgc aca1119Thr Ala Ser Gly Lys Leu Ile Thr Glu Trp Cys Cys Arg Ser Cys Thr330 335 340 345tta cca ccg cta aga tac aga ggt gag gac gga tgc tgg tac ggg atg1167Leu Pro Pro Leu Arg Tyr Arg Gly Glu Asp Gly Cys Trp Tyr Gly Met350 355 360gaa atc aga cca ttg aaa gag aaa gaa gag aat ttg gtc aac tcc ttg1215Glu Ile Arg Pro Leu Lys Glu Lys Glu Glu Asn Leu Val Asn Ser Leu365 370 375gtc aca gcc tag1227Val Thr Ala380
<210>10<211>380<212>PRT<213>2型登革熱病毒<400>10Met Asn Ser Arg Ser Thr Ser Leu Ser Val Ser Leu Val Leu Val Gly15 10 15Val Val Thr Leu Tyr Leu Gly Val Met Val Gln Ala Asp Ser Gly Cys20 25 30Val Val Ser Trp Lys Asn Lys Glu Leu Lys Cys Gly Ser Gly Ile Phe35 40 45Ile Thr Asp Asn Val His Thr Trp Thr Glu Gln Tyr Lys Phe Gln Pro50 55 60Glu Ser Pro Ser Lys Leu Ala Ser Ala Ile Gln Lys Ala His Glu Glu65 70 75 80Gly Ile Cys Gly Ile Arg Ser Val Thr Arg Leu Glu Asn Leu Met Trp85 90 95Lys Gln Ile Thr Pro Glu Leu Asn His Ile Leu Ser Glu Asn Glu Val100 105 110Lys Leu Thr Ile Met Thr Gly Asp Ile Lys Gly Ile Met Gln Ala Gly115 120 125Lys Arg Ser Leu Gln Pro Gln Pro Thr Glu Leu Lys Tyr Ser Trp Lys130 135 140Thr Trp Gly Lys Ala Lys Met Leu Ser Thr Glu Ser His Asn Gln Thr145 150 155 160Phe Leu Ile Asp Gly Pro Glu Thr Ala Glu Cys Pro Asn Thr Asn Arg165 170 175Ala Trp Asn Ser Leu Glu Val Glu Asp Tyr Gly Phe Gly Val Phe Thr180 185 190Thr Asn Ile Trp Leu Lys Leu Arg Glu Lys Gln Asp Val Phe Cys Asp195 200 205Ser Lys Leu Met Ser Ala Ala Ile Lys Asp Asn Arg Ala Val His Ala
210 215 220Asp Met Gly Tyr Trp Ile Glu Ser Ala Leu Asn Asp Thr Trp Lys Ile225 230 235 240Glu Lys Ala Ser Phe Ile Glu Val Lys Ser Cys His Trp Pro Lys Ser245 250 255His Thr Leu Trp Ser Asn Gly Val Leu Glu Ser Glu Met Ile Ile Pro260 265 270Lys Asn Phe Ala Gly Pro Val Ser Gln His Asn Tyr Arg Pro Gly Tyr275 280 285His Thr Gln Thr Ala Gly Pro Trp His Leu Gly Lys Leu Glu Met Asp290 295 300Phe Asp Phe Cys Glu Gly Thr Thr Val Val Val Thr Glu Asp Cys Gly305 310 315 320Asn Arg Gly Pro Ser Leu Arg Thr Thr Thr Ala Ser Gly Lys Leu Ile325 330 335Thr Glu Trp Cys Cys Arg Ser Cys Thr Leu Pro Pro Leu Arg Tyr Arg340 345 350Gly Glu Asp Gly Cys Trp Tyr Gly Met Glu Ile Arg Pro Leu Lys Glu355 360 365Lys Glu Glu Asn Leu Val Asn Ser Leu Val Thr Ala370 375 380
權(quán)利要求
1.下述物質(zhì)在制備疫苗中的用途，(i)包含表達(dá)組件的核酸，所述表達(dá)組件含有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件以及至少編碼蚊媒黃病毒的NS1蛋白或其部分的序列，(ii)包含所述核酸的載體，和/或(iii)所述黃病毒的NS1蛋白或其部分，所述疫苗用于抵抗產(chǎn)生所述核酸或者產(chǎn)生所述NS1蛋白或其部分的蚊媒黃病毒，并抵抗至少一種其它蚊媒黃病毒。
2.權(quán)利要求1的用途，其中產(chǎn)生所述核酸或者產(chǎn)生所述NS1蛋白或其部分的蚊媒黃病毒是登革熱病毒。
3.下述物質(zhì)在制備疫苗中的用途，(i)包含表達(dá)組件的核酸，所述表達(dá)組件含有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件以及至少編碼登革熱病毒血清型的NS1蛋白或其部分的序列，(ii)包含所述核酸的載體，和/或(iii)所述登革熱病毒血清型的NS1蛋白或其部分，所述疫苗用于抵抗登革熱病毒所有血清型，并可選擇抵抗至少一種其它蚊媒黃病毒。
4.權(quán)利要求2或3的用途，其中產(chǎn)生所述核酸或者產(chǎn)生所述NS1蛋白或其部分的登革熱病毒是登革熱病毒血清型2。
5.權(quán)利要求1-4之一的用途，其中編碼蚊媒黃病毒或登革熱病毒血清型的NS1蛋白或其部分的序列，在前面接有ATG密碼子和編碼糖基化信號(hào)序列的序列，且其中編碼序列在翻譯終止密碼子處終止。
6.權(quán)利要求1-5之一的用途，其中所述其它蚊媒黃病毒選自西尼羅病毒、黃熱病病毒和日本腦炎病毒。
7.權(quán)利要求1-6之一的用途，其中所述載體是痘病毒載體。
8.權(quán)利要求7的用途，其中所述痘病毒載體為修飾的安卡拉痘苗病毒(MVA)株，特別是保藏在歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心、編號(hào)為V00083008的MVA-BN或其衍生物。
9.權(quán)利要求7或8的用途，其中所述痘病毒載體已經(jīng)凍干，并且可以于給藥前在藥學(xué)上可接受的稀釋劑中重構(gòu)。
10.權(quán)利要求1-9之一的用途，其中所述轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件是痘病毒啟動(dòng)子。
11.權(quán)利要求1-10之一的用途，其中所述疫苗在首次接種(“初次接種”)和二次接種(“加強(qiáng)接種”)中以治療有效量給藥。
12.一種治療或預(yù)防黃病毒感染的方法，其包括給有需要的動(dòng)物，包括人，接種(i)包含表達(dá)組件的核酸，所述表達(dá)組件包含轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件以及至少編碼蚊媒黃病毒NS1蛋白或其部分的序列，(ii)包含所述核酸的載體，和/或(iii)所述黃病毒的NS1蛋白或其部分其中所述黃病毒感染是被產(chǎn)生所述核酸或者產(chǎn)生所述NS1蛋白或其部分的蚊媒黃病毒感染，和/或被另一種蚊媒黃病毒感染。
13.權(quán)利要求12的方法，其中產(chǎn)生所述核酸或者產(chǎn)生所述NS1蛋白或其部分的蚊媒黃病毒是登革熱病毒。
14.一種治療或預(yù)防黃病毒感染的方法，其包括給有需要的動(dòng)物，包括人，接種(i)包含表達(dá)組件的核酸，所述表達(dá)組件包含轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件以及至少編碼登革熱病毒血清型NS1蛋白或其部分的序列，(ii)包含所述核酸的載體，和/或(iii)所述登革熱病毒血清型的NS1蛋白或其部分，其中所述黃病毒感染是被產(chǎn)生所述核酸或者產(chǎn)生所述NS1蛋白或其部分的登革熱病毒血清型感染，和/或被其它登革熱病毒血清型感染，和/或被其它蚊媒黃病毒感染。
15.權(quán)利要求12-14之一的方法，其中產(chǎn)生所述DNA或者產(chǎn)生所述蛋白或其部分的登革熱病毒是登革熱病毒血清型2。
16.權(quán)利要求12-15之一的方法，其中所述編碼蚊媒黃病毒或登革熱病毒血清型的NS1蛋白或其部分的序列，在其前面接有ATG密碼子和編碼糖基化信號(hào)序列的序列，且其中編碼序列在翻譯終止密碼子處終止。
17.權(quán)利要求12-16之一的方法，其中所述載體是痘病毒載體。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述痘病毒載體是修飾的安卡拉痘苗病毒(MVA)株。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述MVA株是保藏在歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心、編號(hào)為V00083008的MVA-BN或其衍生物。
20.權(quán)利要求17-19之一的方法，其中所述痘病毒載體已經(jīng)凍干，并且可以于給藥前在藥學(xué)上可接受的稀釋劑中重構(gòu)。
21.權(quán)利要求12-20之一的方法，其中所述轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件是痘病毒啟動(dòng)子。
22.權(quán)利要求17-21之一的方法，其中所述痘病毒載體或藥物組合物在首次接種(“初次接種”)和二次接種(“加強(qiáng)接種”)中以治療有效量給藥。
23.一種痘病毒載體，它攜有包含表達(dá)組件的DNA，所述表達(dá)組件包含轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件以及至少編碼黃病毒NS1蛋白或其部分的序列，其中所述痘病毒是保藏在歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心、編號(hào)為V00083008的修飾的安卡拉痘苗病毒(MVA)BN株或其衍生物。
24.權(quán)利要求23的痘病毒載體，其中所述黃病毒是蚊媒黃病毒，特別是登革熱病毒。
25.權(quán)利要求24的痘病毒載體，其中所述登革熱病毒是登革熱病毒血清型2。
26.權(quán)利要求23-25之一的痘病毒載體，其中所述編碼黃病毒NS1蛋白或其部分的序列，在其前面接有ATG密碼子和編碼糖基化信號(hào)序列的序列，且其中編碼序列在翻譯終止密碼子處終止。
27.權(quán)利要求23-26之一的痘病毒載體，其中所述轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件為痘病毒啟動(dòng)子。
28.權(quán)利要求23-27之一的痘病毒載體，其中所述痘病毒載體是凍干的。
29.作為疫苗的權(quán)利要求23-28之一的痘病毒載體。
30.一種藥物組合物，它包含權(quán)利要求23-28之一的痘病毒載體和藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑和/或添加劑。
31.用于治療和/或預(yù)防黃病毒感染的權(quán)利要求23-29之一的痘病毒載體或權(quán)利要求30的藥物組合物，其中所述痘病毒載體或藥物組合物在首次接種(“初次接種”)和二次接種(“加強(qiáng)接種”)中以治療有效量給藥。
32.一種治療或預(yù)防黃病毒感染的方法，包括給有需要的動(dòng)物，包括人，接種權(quán)利要求23-29之一的載體或權(quán)利要求30的藥物組合物。
33.一種細(xì)胞，優(yōu)選人細(xì)胞，它含有權(quán)利要求23-28之一的痘病毒載體。
34.權(quán)利要求23-28之一的痘病毒載體用于制備治療或預(yù)防黃病毒感染的疫苗的用途。
35.一種用于初次免疫/加強(qiáng)免疫的試劑盒，它在第一個(gè)瓶/容器中含有首次接種(初次接種)所用的權(quán)利要求23-29之一的痘病毒載體或權(quán)利要求30的藥物組合物，在第二個(gè)瓶/容器中含有二次接種(加強(qiáng)接種)所用的權(quán)利要求23-29之一的痘病毒載體或權(quán)利要求30的藥物組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及黃病毒特別是登革熱病毒的NS1蛋白或其部分，其可用于接種以抵抗所述黃病毒和抵抗一種或多種其它黃病毒。本發(fā)明進(jìn)一步涉及可用于接種以抵抗登革熱病毒所有血清型的一種登革熱病毒血清型，特別是血清型2的NS1蛋白或其部分。本發(fā)明進(jìn)一步涉及含有編碼黃病毒NS1或其部分的表達(dá)盒的DNA，含有所述DNA的載體和含有或表達(dá)黃病毒NS1的疫苗。
文檔編號(hào)C07KGK1602316SQ02824307
公開(kāi)日2005年3月30日 申請(qǐng)日期2002年11月20日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月4日
發(fā)明者保羅·豪利, 桑賈·萊勒, 瑪麗·J·卡多薩, 馬格迪林·S·亨利薩姆 申請(qǐng)人:巴法里安諾迪克有限公司, 文圖爾技術(shù)公司