專(zhuān)利名稱(chēng)：蛇毒細(xì)胞毒素-ctx1在制備具有鎮(zhèn)痛作用藥中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛇毒細(xì)胞毒素-CTX1在制備具有鎮(zhèn)痛作用藥中的應(yīng)用，具體涉及蛇毒細(xì)胞毒素-CTX1在制備對(duì)傷害性刺激導(dǎo)致的軀體痛、內(nèi)臟痛以及對(duì)嗎啡成癮后疼痛具有鎮(zhèn)痛作用的藥中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：
蛇毒是一個(gè)巨大的生物資源寶庫(kù)。自1968年英國(guó)科學(xué)家首先研制成功了治療血管閉塞性疾病的蛇毒制劑-ARIN，投放市場(chǎng)后不久即獲得了巨大的經(jīng)濟(jì)回報(bào)。近十年來(lái)，隨著多達(dá)數(shù)十種蛇毒藥品的面世，并且取得了不俗的臨床療效和銷(xiāo)售業(yè)績(jī)，從蛇毒中開(kāi)發(fā)出價(jià)廉、物美的特效藥正在成為各國(guó)生物學(xué)家、藥學(xué)家及制藥企業(yè)爭(zhēng)相追逐的新熱點(diǎn)。
舟山眼鏡蛇(Naja atra Cantor)，以頸部背面有白色眼鏡架狀斑紋為其最明顯的特征，體長(zhǎng)可達(dá)2米，主要分布于我國(guó)長(zhǎng)江以南諸省及臺(tái)灣等地。舟山眼鏡蛇所分泌的蛇毒液中含有多種神經(jīng)毒素(neurotoxin，NT)及細(xì)胞毒素(Cytotoxin，CTX)，由于CTX對(duì)多種組織細(xì)胞膜均有較強(qiáng)的破壞共性，尤其對(duì)心肌細(xì)胞更為顯著，故又稱(chēng)為膜毒素(Membrane toxin)或心臟毒素(cardiotoxin)。從我國(guó)大陸及臺(tái)灣產(chǎn)舟山眼鏡蛇毒中至少已分離出了5～7種不同的CTX，均由60～63個(gè)氨基酸殘基組成，相對(duì)分子質(zhì)量為6000～7000kDa。
二十世紀(jì)70年代以來(lái)，蛇毒中有效單體-NT在鎮(zhèn)痛的基礎(chǔ)研究方面已有較多報(bào)道，其鎮(zhèn)痛機(jī)制可能與膽堿能、內(nèi)源性阿片肽等多種系統(tǒng)有關(guān)。與傳統(tǒng)鎮(zhèn)痛藥物嗎啡相比，NT的鎮(zhèn)痛具有用量少、止痛時(shí)間長(zhǎng)、無(wú)成癮性等特點(diǎn)，對(duì)頑固性疼痛、神經(jīng)性疼痛和惡性腫瘤痛均有效。但鑒于NT的神經(jīng)毒性較大，致死活性較強(qiáng)，其的安全性一直有較大爭(zhēng)議。
1975年，Hayashi首次報(bào)道了從臺(tái)灣眼鏡蛇毒Naja naja atra中純化出一種CTX，是一種強(qiáng)堿性多肽毒素pI 9.0，相對(duì)分子質(zhì)量為6693kDa，有60個(gè)氨基酸殘基LKCNKLIPIA SKTCPAGKNL CYKMFMMSDL TIPVKRGCIDVCPKNSLLVK YVCCNTDRCN，并命名為CTX1；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)泰國(guó)眼鏡蛇(Naja naja siamensis)毒中亦含此毒素。目前CTX1是否有鎮(zhèn)痛的功能，至今未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供蛇毒細(xì)胞毒素-CTX1在制備具有鎮(zhèn)痛作用藥中的應(yīng)用，該細(xì)胞毒素-CTX1對(duì)傷害性刺激導(dǎo)致的軀體痛、內(nèi)臟痛及嗎啡成癮后疼痛均有較好的鎮(zhèn)痛作用，將其開(kāi)發(fā)為新的鎮(zhèn)痛藥具有較好的應(yīng)用前景。
實(shí)際上，本發(fā)明蛇毒細(xì)胞毒素-CTX1在制備具有鎮(zhèn)痛作用藥中的應(yīng)用。
優(yōu)選的，本發(fā)明所述的應(yīng)用是指在制備對(duì)傷害性刺激導(dǎo)致的軀體痛具有鎮(zhèn)痛作用藥的應(yīng)用。
優(yōu)選的，本發(fā)明所述的應(yīng)用是指在制備對(duì)傷害性刺激導(dǎo)致的內(nèi)臟痛具有鎮(zhèn)痛作用藥的應(yīng)用。
優(yōu)選的，本發(fā)明所述的應(yīng)用是指在制備對(duì)嗎啡成癮后疼痛具有鎮(zhèn)痛作用藥的應(yīng)用。
本發(fā)明所述的蛇毒細(xì)胞毒素-CTX1通過(guò)中國(guó)大陸舟山眼鏡蛇蛇毒的分離和純化獲得，其具體過(guò)程為 (1)凝膠過(guò)濾采用Sephacryl S-100HR填料，將舟山眼鏡蛇毒樣本通過(guò)AKTA explorer 100快速純化工藝開(kāi)拓系統(tǒng)進(jìn)行分子篩過(guò)濾，獲得I、II、III三個(gè)毒性組分，分別用G-50預(yù)裝柱HiPrep 26/10Desaltin脫鹽，凍干，備用； (2)離子交換將步驟(1)所得三個(gè)毒性組分根據(jù)毒性強(qiáng)弱初篩，選取毒性最強(qiáng)的組分III，采用CM Sepharose FF填料，通過(guò)AKTA explorer 100快速純化工藝開(kāi)拓系統(tǒng)進(jìn)行離子交換，獲得單一毒性的多肽CTX1，并用G-50預(yù)裝柱HiPrep 26/10Desaltin脫鹽，凍干即可。
本發(fā)明的有益效果是 (1)該蛇毒細(xì)胞毒素CTX1對(duì)各種急、慢性疼痛的具有良好的鎮(zhèn)痛作用，尤其是CTX1對(duì)傷害性刺激導(dǎo)致的軀體痛(somatalgia)、內(nèi)臟痛(visceral pain)及嗎啡成癮后疼痛(疼痛癥狀群)均有較強(qiáng)鎮(zhèn)痛作用。
(2)由于CTX1分子中并不存在類(lèi)似于內(nèi)源性阿片肽的氨基酸序列(TGGP)片斷，對(duì)嗎啡成癮的動(dòng)物不但能發(fā)揮較強(qiáng)的鎮(zhèn)痛效應(yīng)，并且連續(xù)用藥12天亦未見(jiàn)成癮、耐受現(xiàn)象，故將其開(kāi)發(fā)為新的鎮(zhèn)痛藥有較好的應(yīng)用前景。



圖1是CTX1在CM Sepharose FF離子交換色譜圖； 圖2是質(zhì)譜分析法(MALDI-TOF)測(cè)定CTX1的質(zhì)譜圖。

具體實(shí)施例方式 以下實(shí)施例僅用于闡述本發(fā)明，而本發(fā)明的保護(hù)范圍并非僅僅局限于以下實(shí)施例。所述技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員依據(jù)以上本發(fā)明公開(kāi)的內(nèi)容均可實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的。
第一部分蛇毒細(xì)胞毒素-CTX1的制備及其分子量和氨基酸序列的測(cè)定 1.1蛇毒細(xì)胞毒素-CTX1的制備 從大陸舟山眼鏡蛇自然野生分布優(yōu)勢(shì)區(qū)域之一的湛江地區(qū)野外采集舟山眼鏡蛇毒樣本，進(jìn)行以下分離和純化得到CTX1 (1)凝膠過(guò)濾采用Sephacryl S-100HR填料，將舟山眼鏡蛇毒樣本通過(guò)AKTA explorer 100快速純化工藝開(kāi)拓系統(tǒng)(制備型高效液相色譜儀)進(jìn)行分子篩過(guò)濾，獲得I、II、III三個(gè)毒性組分，分別用G-50預(yù)裝柱HiPrep 26/10 Desaltin脫鹽，凍干，備用； 其中柱規(guī)格為26×100mm，先用0.05M pH6.4磷酸緩沖液兩個(gè)柱體積平衡凝膠柱，蛇毒樣品溶液通過(guò)AKTA explorer-100色譜儀的上樣泵上樣，泵速為0.6ml/min，洗脫泵速0.6ml/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)280nm，每管收集量6ml/min。
(2)離子交換將步驟(1)所得三個(gè)毒性組分通過(guò)初篩，選取毒性最強(qiáng)的組分III，采用CM Sepharose FF填料，通過(guò)AKTA explorer 100快速純化工藝開(kāi)拓系統(tǒng)進(jìn)行離子交換，獲得單一毒性的多肽CTX1，并用G-50預(yù)裝柱HiPrep 26/10Desaltin脫鹽，凍干即可。
其中，柱規(guī)格26×100mm，先用0.05M pH6.4磷酸緩沖液兩個(gè)柱體積平衡凝膠柱，組分III100mg樣品溶液通過(guò)AKTA explorer-100色譜儀的上樣泵上樣，泵速為0.8ml/min，用1000mL含0.5mol/L NaCl的0.02mol/L pH為8.0的PBS和1000mL0.02mol/L pH為8.0的PBS進(jìn)行梯度洗脫，洗脫泵速0.8ml/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)280nm，每管收集量8ml/min，獲得CTX1的色譜圖如附圖1所示。
1.2蛇毒細(xì)胞毒素-CTX1的分子量及氨基酸序列的測(cè)定 用質(zhì)譜分析法(MALDI-TOF)測(cè)定CTX1的分子量為6697.915kDa，其質(zhì)譜圖如附圖2所示； 用埃德曼降解法(Edman degradation)測(cè)定CTX1的氨基酸序列為L(zhǎng)KCNKLIPIA SKTCPAGKNL CYKMFMMSDL TIPVKRGCID VCPKNSLLVKYVCCNTDRCN。
與從臺(tái)灣舟山眼鏡蛇毒中純化出的CTX1相比，來(lái)源于大陸湛江地區(qū)舟山眼鏡蛇毒CTX1的分子質(zhì)量有約3kDa的差異，二者的氨基酸序列一致。
第二部分蛇毒細(xì)胞毒素-CTX1的鎮(zhèn)痛作用 實(shí)施例1 本實(shí)施例通過(guò)醋酸扭體法測(cè)試CTX1對(duì)小鼠的因傷害性刺激導(dǎo)致的內(nèi)臟痛的鎮(zhèn)痛作用。
動(dòng)物經(jīng)腹腔注射醋酸溶液后，可以模擬腹腔炎癥引起的腹腔內(nèi)臟痛癥狀，常用于新鎮(zhèn)痛藥物的篩選。通過(guò)觀察藥物處理組與對(duì)照組扭體癥狀的差別，可以確定該藥物是否具有鎮(zhèn)痛效應(yīng)以及其劑量-效應(yīng)曲線。
取小鼠(體重20-25g，雌雄均可)經(jīng)腹腔注射不同劑量CTX1(實(shí)驗(yàn)組)、嗎啡(陽(yáng)性對(duì)照組)或生理鹽水(陰性對(duì)照組)，30min后，各組動(dòng)物再經(jīng)腹腔注射0.1ml 0.6％的醋酸(acetic acid)溶液。醋酸溶液處理后，小鼠分別置于玻璃燒杯內(nèi)使其適用5min，然后觀察10min，記錄該時(shí)段出現(xiàn)典型扭體癥狀的次數(shù)，為了便于記錄，腹部和后肢因刺激而伸展一次定義為一次扭體反應(yīng)。
表1醋酸扭體法測(cè)試CTX1對(duì)小鼠的鎮(zhèn)痛作用
備注*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，與控制組相比較。
如上表1所示的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明提前30min應(yīng)用CTX1，高(0.4mg/kg)、中(0.2mg/kg)、低(0.1mg/kg)3個(gè)劑量組對(duì)醋酸所致小鼠扭體次數(shù)與生理鹽水對(duì)照組比較明顯減少，具有顯著差異(p＜0.01～0.001)，劑量-效應(yīng)關(guān)系明顯，該結(jié)果提示CTX1對(duì)醋酸所致小鼠內(nèi)臟疼痛有明顯抑制作用。
以上藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)研究表明，CTX1對(duì)傷害性刺激導(dǎo)致的內(nèi)臟痛(visceral pain)有較強(qiáng)鎮(zhèn)痛作用，在治療疼痛方面有新用途。
實(shí)施例2 本實(shí)施例通過(guò)熱板法測(cè)試CTX1對(duì)大鼠的因傷害性刺激導(dǎo)致的軀體痛及嗎啡成癮后疼痛(疼痛癥狀群)的鎮(zhèn)痛作用。
熱板法是鎮(zhèn)痛藥物篩選，檢測(cè)中常用的一種方法，也是一種能確定區(qū)分中樞神經(jīng)和末梢神經(jīng)鎮(zhèn)痛機(jī)理的方法，有較寬的使用范圍，小鼠受熱刺激后可出現(xiàn)舔后足或縮爪等典型軀體痛覺(jué)反應(yīng)。測(cè)定熱痛反應(yīng)潛伏期的長(zhǎng)短(s)，與動(dòng)物的痛閾變化相一致。
取正常及嗎啡成癮后大鼠(雄性，體重180～220g)放置于UGO痛覺(jué)測(cè)試儀的金屬熱板(表面溫度為55±0.5℃)上，開(kāi)始記時(shí)，直至大鼠舔后足或縮爪，停止記時(shí)，這段時(shí)間為該只大鼠的潛伏期。實(shí)驗(yàn)中，給藥前先測(cè)定大鼠基礎(chǔ)潛伏期，潛伏期大于30s則淘汰。各組大鼠在實(shí)驗(yàn)中不同階段測(cè)定給藥后潛伏期，為了避免大鼠后足被燙傷，確定55s為中斷時(shí)。
表2熱板法測(cè)試CTX1對(duì)大鼠的鎮(zhèn)痛作用(x±s)
備注*p＜0.05，**p＜0.01，與控制組相比較。
如上表2所示的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明強(qiáng)效鎮(zhèn)痛藥嗎啡及CTX1(0.2mg/kg)均可顯著提高痛閾，延長(zhǎng)熱痛反應(yīng)時(shí)間，該結(jié)果提示CTX1對(duì)傷害性熱刺激所致的軀體痛有明顯的抑制作用。
以上藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)研究表明，CTX1對(duì)傷害性刺激導(dǎo)致的軀體痛(omatalgia)及嗎啡成癮后疼痛(疼痛癥狀群)均有較強(qiáng)鎮(zhèn)痛作用，在治療疼痛方面有新用途。
由于CTX1分子中并不存在類(lèi)似于內(nèi)源性阿片肽的氨基酸序列(TGGP)片斷，對(duì)嗎啡成癮的動(dòng)物不但能發(fā)揮較強(qiáng)的鎮(zhèn)痛效應(yīng)，并且連續(xù)用藥12天亦未見(jiàn)成癮、耐受現(xiàn)象，故將其開(kāi)發(fā)為新的鎮(zhèn)痛藥有較好的應(yīng)用前景。
實(shí)施例3 本實(shí)施例通過(guò)機(jī)械刺激法測(cè)試CTX1因大鼠對(duì)嗎啡成癮引起疼痛的鎮(zhèn)痛作用。
機(jī)械刺激機(jī)械縮腿閾值(paw withdrawal threshold，PWT)測(cè)定參照文獻(xiàn)報(bào)道的“Up-Down”法，將大鼠置于金屬網(wǎng)上，蓋以透明的有機(jī)玻璃罩。首先讓大鼠適應(yīng)環(huán)境15min，待大鼠梳理和探究活動(dòng)基本消失后，用一系列標(biāo)準(zhǔn)化的vonFrey測(cè)試探針刺激大鼠神經(jīng)損傷側(cè)后肢足底中部，使其彎曲成S形，持續(xù)6～8S，觀察縮足反應(yīng)，大鼠在刺激時(shí)間內(nèi)或在移開(kāi)vonFrey針時(shí)立即出現(xiàn)快速的縮足反應(yīng)，記為陽(yáng)性反應(yīng)，而身體活動(dòng)引起的縮足反應(yīng)不記做陽(yáng)性反應(yīng)。直至找到該鼠出現(xiàn)50％測(cè)量10次至少有連續(xù)5次縮足)縮足反應(yīng)的探針，記錄其壓力值(g)，此值即為該鼠損傷側(cè)的縮腿閾值。
表3CTX1不同劑量對(duì)嗎啡成癮大鼠痛域的影響(％)(x±s)
備注*p＜0.05，**p＜0.01，與嗎啡成癮前相比較 如上表3所示的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明各組大鼠給藥前痛域無(wú)明顯差異(P＞0.05)，嗎啡組與CTX1各劑量組在連續(xù)8天嗎啡位置偏愛(ài)訓(xùn)練后，大鼠對(duì)嗎啡成癮后第10～18天，嗎啡組大鼠在痛覺(jué)測(cè)試儀上抬腳時(shí)間縮短，痛覺(jué)敏化，對(duì)痛覺(jué)反應(yīng)強(qiáng)；而CTX1各組對(duì)嗎啡成癮大鼠痛覺(jué)敏化有較強(qiáng)的鎮(zhèn)痛作用，有一定的劑量依賴性，連續(xù)8天給藥后鎮(zhèn)痛作用顯著，CTX1(0.4mg/kg)增長(zhǎng)到244.8±17.5％，CTX1(0.2mg/kg)也增長(zhǎng)到249.5±37.1％，CTX1(0.1mg/kg)增加到168.9±15.5％，與N.S組比較明顯增加(P＜0.05)與大鼠成癮給CTX1處理前相比有顯著性差異(P＜0.01)，以嗎啡成癮后第一天痛域值為100觀察其余各天痛域的增加百分值。發(fā)現(xiàn)CTX1(0.2mg/kg)和CTX1(0.4mg/kg)組嗎啡成癮后痛敏的鎮(zhèn)痛作用比CTX1(0.1mg/kg)強(qiáng)(p＜0.05)，但二者鎮(zhèn)痛作用組間差異性不大.在停止給CTX1后，CTX1鎮(zhèn)痛作用降低。但CTX1(0.4mg/kg)降低幅度較小說(shuō)明劑量較大時(shí)鎮(zhèn)痛維持效果好。結(jié)果表明CTX1對(duì)于嗎啡成癮后痛覺(jué)過(guò)敏有良好的鎮(zhèn)痛作用，對(duì)于長(zhǎng)期吸毒的患者在剛戒毒時(shí)出現(xiàn)痛覺(jué)過(guò)敏較強(qiáng)不能自持而去尋藥有良好的控制作用。
以上實(shí)施例表明蛇毒細(xì)胞毒素-CTX1具有鎮(zhèn)痛作用，即該細(xì)胞毒素-CTX1對(duì)傷害性刺激導(dǎo)致的軀體痛、內(nèi)臟痛及嗎啡成癮后疼痛均有較強(qiáng)的鎮(zhèn)痛作用，且連續(xù)用藥12天未見(jiàn)成癮、耐受現(xiàn)象，將其開(kāi)發(fā)為新的鎮(zhèn)痛藥具有較好的應(yīng)用前景。
權(quán)利要求
1.蛇毒細(xì)胞毒素-CTX1在制備具有鎮(zhèn)痛作用藥中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的應(yīng)用是指在制備對(duì)傷害性刺激導(dǎo)致的軀體痛具有鎮(zhèn)痛作用藥中的應(yīng)用。
3.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的應(yīng)用是指在制備對(duì)傷害性刺激導(dǎo)致的內(nèi)臟痛具有鎮(zhèn)痛作用藥中的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的應(yīng)用是指在制備對(duì)嗎啡成癮后疼痛具有鎮(zhèn)痛作用藥中的應(yīng)用。
5.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的蛇毒細(xì)胞毒素-CTX1通過(guò)中國(guó)大陸舟山眼鏡蛇蛇毒的分離和純化獲得，其具體過(guò)程為
(1)凝膠過(guò)濾采用Sephacryl S-100HR填料，將舟山眼鏡蛇毒樣本通過(guò)AKTA explorer 100快速純化工藝開(kāi)拓系統(tǒng)進(jìn)行分子篩過(guò)濾，獲得I、II、III三個(gè)毒性組分，分別用G-50預(yù)裝柱HiPrep 26/10 Desaltin脫鹽，凍干，備用；
(2)離子交換將步驟(1)所得三個(gè)毒性組分根據(jù)毒性強(qiáng)弱初篩，選取毒性最強(qiáng)的組分III，采用CM Sepharose FF填料，通過(guò)AKTA explorer 100快速純化工藝開(kāi)拓系統(tǒng)進(jìn)行離子交換，獲得單一毒性的多肽CTX1，并用G-50預(yù)裝柱HiPrep 26/10 Desaltin脫鹽，凍干即可。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了蛇毒細(xì)胞毒素-CTX1在制備具有鎮(zhèn)痛作用藥中的應(yīng)用，尤其是蛇毒細(xì)胞毒素-CTX1在制備對(duì)傷害性刺激導(dǎo)致的軀體痛、內(nèi)臟痛以及對(duì)嗎啡成癮后疼痛具有鎮(zhèn)痛作用的藥中的應(yīng)用，該細(xì)胞毒素-CTX1對(duì)傷害性刺激導(dǎo)致的軀體痛、內(nèi)臟痛及嗎啡成癮后疼痛均有較好的鎮(zhèn)痛作用，且連續(xù)用藥12天未見(jiàn)成癮、耐受現(xiàn)象，將其開(kāi)發(fā)為新的鎮(zhèn)痛藥具有較好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C07K1/36GK101757610SQ200910215379
公開(kāi)日2010年6月30日 申請(qǐng)日期2009年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月29日
發(fā)明者劉先國(guó), 孔天翰, 信文君, 仲維高, 崔躍, 董偉華, 黃紹, 崔超偉, 唐婭 申請(qǐng)人:中山大學(xué)