專利名稱：蛇毒細胞毒素及其制備方法與應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種蛇毒細胞毒素及其制備方法與應用。
技術背景目前，臨床上使用的抗癌藥物主要以化學藥為主，即常說的化療藥。這類藥物 共同缺點是副作用嚴重，普遍能引起患者嚴重的嘔吐和脫發(fā)等。因此，副作用較小 的生物抗癌藥近年成為研究的熱門，主要集中在蛇毒、蜈蚣毒素等的研究。某些蛇種的蛇毒中含有能夠破壞腫瘤細胞結構的細胞毒素，此前有過相關的報 導，例如在美國銅斑蛇蛇毒、我國皖南的尖吻蝮蛇蛇毒中都發(fā)現(xiàn)了具有抗癌作用的 細胞毒素，這些發(fā)現(xiàn)目前還處在學術研究階段，沒有進行藥用開發(fā)。但是在鋸鱗蝰 蛇蛇毒中提取得到具有抗癌作用的細胞毒素此前未見報導。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個目的是提供一種制備蛇毒細胞毒素的方法。本發(fā)明所提供的制備蛇毒細胞毒素(蛇毒提取物)的方法，包括如下步驟(1) 將蛇毒溶液進行離子交換層析，所述離子交換層析中所用的離子交換基 團為二乙基氨基乙基，以含有氯化鈉的、PH值為8. 2、濃度為0. 05mol/L的Tris-HCl 緩沖液為流動相進行氯化鈉線性梯度洗脫，氯化鈉濃度梯度為0—0. 5mol/L，收集 洗脫液中280nm檢測波長的吸光度曲線上的第一吸收峰和第二吸收峰之間的流 出液；(2) 將步驟(1)得到的流出液進行排阻層析，以水作為流動相，所用的層析 介質(zhì)為聚丙烯酰胺凝膠Bio-Gel-P-60，所用的層析柱子的直徑為4.5cm、柱床高度 為120cm，收集洗脫液中280nm檢測波長的吸光度曲線上第二吸收峰，得到蛇毒 細胞毒素。在所述離子交換層析中，所用的層析介質(zhì)可以為DEAE-S印hadexA-50;所述流 動相的流速可以為0. 8-1. Oml/min。在所述排阻層析中，所述流動相的流速可以為40ml/h。所述蛇毒溶液在進行離子交換層析前，還可以進行如下處理先用飽和硫酸銨 沉淀，收集上清液，再對所述上清液進行透析。所述蛇毒具體可以為鋸鱗蝰蛇的蛇毒。上述任一所述方法制備的蛇毒細胞毒素也屬于本發(fā)明的保護范圍。 以上述蛇毒細胞毒素為活性成分的預防和/或治療癌癥的藥物也屬于本發(fā)明的 保護范圍。上述蛇毒細胞毒素在制備抗癌癥藥物中的應用。 其中，所述癌癥具體可為喉癌。本發(fā)明通過生化手段從巨鱗蝰蛇蛇毒中得到細胞毒素，該細胞毒素能通過破壞 細胞的基本結構殺死細胞，對某些癌細胞的親和性遠遠高于正常細胞。實驗結果表明，本發(fā)明的鋸鱗蝰蛇蛇毒細胞毒素能夠明顯誘導人喉癌細胞H印-2凋亡，當蛇毒 細胞毒素濃度為0. 01mg/ml時，其誘導H印-2細胞凋亡的能力強于濃度為10(^g/ml 的平陽霉素；而且異常毒性實驗證明該物質(zhì)對小白鼠沒有毒性即該細胞毒素的副作 用輕。本發(fā)明的鋸鱗蝰蛇蛇毒細胞毒素可以作為一種抗癌癥藥物，使生物抗癌藥成 為現(xiàn)實。


圖1為離子交換層析結果圖譜，其中，縱坐標為吸光度值，橫坐標為管號。 圖2為排阻層析結果圖譜，其中，縱坐標為吸光度值，橫坐標為管號。
具體實施方式
下述實施例中所使用的實驗方法，如無特殊說明均為常規(guī)方法。 實施例1、蛇毒細胞毒素的制備本實施例中以鋸鱗蝰蛇蛇毒凍干粉(購于荊市開泰藥業(yè)有限公司)為原料。提取的實驗步驟如下1、 蛇毒溶解將8g鋸鱗蝰蛇蛇毒凍干粉溶于100ml Tris-HCl緩沖液(pH8. 2， 0. 05mol/L)中。2、 除雜蛋白向步驟l獲得的蛇毒溶液中加入6ml飽和硫酸銨溶液，混合后 在室溫條件下放置l小時，3000 rpm離心10分鐘，棄去沉淀，保留上清溶液。3、 透析除鹽將步驟2獲得的全部上清液封閉在截留14000D分子量的透析袋 中，然后將透析袋放入蒸餾水中透析15小時，每3小時換水一次，蒸餾水的體積 1200ml。透析后所得到的透析液大約180 ml。4、 離子交換層析用pH 8. 2、0. 05mol/L的Tris-HCl緩沖液平衡DEAE-S印hadex A-50層析柱15小時，流速為1. 0 ml/min;將步驟3獲得的透析得到的透析液移到平衡后的DEAE-S印hadex A-50層析柱，待上清液完全移動到膠面以下后，在膠面 上方加Tris-HC1緩沖液(PH8. 2， 0. 05mol/l) 50ml;以Tris-HC1緩沖液(pH8. 2， 0. 05mol/l)為起始液、以含0. 5mol/L氯化鈉的Tris-HCl緩沖液(pH8. 2， 0. 05mol/l) 為終止液進行氯化鈉線性梯度洗脫。所用的洗脫液共為4000ml;洗脫液的流速為 0. 8-1. Oml/min (即氯化鈉的濃度的變化速度為1 X 10—4mol/L/min -1.25X 10—4mol/L/min)。用自動餾分收集器收集，每管15ml，通過紫外分光光度計檢測層析液吸光度， 檢測波長為280nm，制作點一吸光度曲線，如圖1所示。收集第一吸收峰和第二吸 收峰之間的部分(第16—29管流出液)，收集的流出液約210 ml。5、 排阻層析將步驟4獲得的210ral流出液進行排阻層析。用BI0-GEL-P-60 凝膠層析分離(按照凝膠說明書處理并灌柱)，層析柱長150cm，直徑4.5cm，膠 床高度不低于120cm，以純化水作為流動相，流速40ml/h;用自動餾分收集器收集 層析液，15ral/管，通過紫外分光光度計監(jiān)測層析液吸光度，檢測波長為280nm; 制作點一吸光度曲線，如圖2所示。收集吸光度曲線上的第二吸收峰(第26—34 管流出液)，收集的流出液約135 ml。6、 用Folin-酚試劑法(lowry法)測得收集液蛋白質(zhì)濃度為0. 08mg/ml。 將收集液稀釋成蛋白含量為0. 01mg/ml的溶液，即得鋸鱗蝰蛇蛇毒細胞毒素原液1080 ml。通過SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測蛇毒細胞毒素的分子量，檢測結果表明， 所得細胞毒素呈現(xiàn)一條帶，分子量為31000D。實施例2、鋸鱗蝰蛇蛇毒細胞毒素的功能驗證 一、鋸鱗蝰蛇蛇毒細胞毒素的抗癌癥功能驗證以人喉癌細胞Hep-2細胞株(遼寧醫(yī)學院頭頸外科研究所提供)為靶細胞，觀 察本發(fā)明蛇毒細胞毒素和平陽霉素誘導癌細胞調(diào)亡的效率對比。實驗方法參照文獻 (邰雋王雪峰平陽霉素誘導人喉癌Hep-2細胞調(diào)亡的實驗研究《遼寧醫(yī)學 院學報》2004 Aug. 25(4) 5—7頁)，具體如下人喉癌細胞系H印-2細胞株的培養(yǎng):將細胞接種于RPMI-1640的完全培養(yǎng)液(胎 牛血清10%、青霉素100u/ml、鏈霉素100ug / ml)，置于37。C、含5%0)2培養(yǎng)箱 內(nèi)培養(yǎng)。取實施例1制備的鋸鱗蝰蛇蛇毒細胞毒素原液20 ml冷凍干燥后，用20mlRPMI-1640培養(yǎng)液復溶備用，細胞毒素(蛋白質(zhì))的濃度為0.01mg/ml。實驗分為三個處理含有濃度為0. Olmg/ml上述蛇毒細胞毒素的RPMI-1640培 養(yǎng)液中作為實驗組，含有濃度為lOO^g/ml的平陽霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液作為陽 性對照組，RPMI-1640培養(yǎng)基作為空白對照組。上述三個處理分別接種上述H印-2 細胞，接種濃度均相同，然后置于37。C、含5%0)2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24小時。每個處 理均重復10次。采用PI單染法，進行流式細胞儀檢測，從而計算出細胞凋亡率(細胞凋亡率二 凋亡細胞數(shù)目/活細胞數(shù)目+凋亡細胞數(shù)目)。結果如表l所示，表l中的數(shù)值為平均值士標準差。結果表明，本發(fā)明所得的 鋸鱗蝰蛇蛇毒細胞毒素能夠明顯誘導H印-2細胞凋亡，當蛇毒細胞毒素濃度為 0. Olmg/ml時，其誘導H印-2細胞凋亡的能力強于濃度為lOOPg/ml的平陽霉素。表1、細胞凋亡情況組別凋亡率空白對照組3. 03±0. 14陽性對照組12. 69±0. 24*實驗組17. 31 ±0. 27*A*尸< 0. 01同空白對照組比較；A尸〈0. 01同陽性對照組比較二、鋸鱗蝰蛇蛇毒細胞毒素異常毒性考察選擇健康的昆明種一級小白鼠5只，體重18 22g，雌雄不限。將實施例l所 得的鋸鱗蝰蛇蛇毒細胞毒素原液經(jīng)過0. 2微米孔徑的微孔濾膜過濾后，無菌操作給 小白鼠尾靜脈注射，每只小白鼠注射lml，正常飲食飼養(yǎng)觀察48小時。結果48小 時后5只小白鼠未見任何異常。上述給小白鼠的用量大約是人治療量的75倍以上， 小白鼠無異常，因此鋸鱗蝰蛇蛇毒細胞毒素異常毒性合格，安全性可靠。
權利要求
1、一種制備蛇毒細胞毒素的方法，包括如下步驟(1)將蛇毒溶液進行離子交換層析，所述離子交換層析中所用的離子交換基團為二乙基氨基乙基，以含有氯化鈉的、pH值為8.2、濃度為0.05mol/L的Tris-HCl緩沖液為流動相進行氯化鈉線性梯度洗脫，氯化鈉濃度梯度為0-0.5mol/L，收集洗脫液中280nm檢測波長的吸光度曲線上的第一吸收峰和第二吸收峰之間的流出液；(2)將步驟(1)得到的流出液進行排阻層析，以水作為流動相，所用的層析介質(zhì)為聚丙烯酰胺凝膠Bio-Gel-P-60，所用的層析柱子的直徑為4.5cm、柱床高度為120cm，收集洗脫液中280nm檢測波長的吸光度曲線上第二吸收峰，得到蛇毒細胞毒素。
2、 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于所述離子交換層析中，所用的 層析介質(zhì)是DEAE-S印hadex A-50。
3、 根據(jù)權利要求1或2所述的方法，其特征在于所述離子交換層析中，流 動相的流速為0. 8-1. Oml/min。
4、 根據(jù)權利要求l、 2或3所述的方法，其特征在于所述排阻層析中，所述 流動相的流速為40ml/h。
5、 根據(jù)權利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述蛇毒溶液在進行 離子交換層析前，還進行如下處理先用飽和硫酸銨沉淀，收集上清液，再對所述 上清液進行透析。
6、 根據(jù)權利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于所述蛇毒為鋸鱗蝰蛇的蛇毒。
7、 用權利要求l-6中任一所述方法制備的蛇毒細胞毒素。
8、 一種預防和/或治療癌癥的藥物，它的活性成分為權利要求7中所述蛇毒細 胞毒素。
9、 權利要求7所述蛇毒細胞毒素在制備抗癌癥藥物中的應用。
10、 根據(jù)權利要求8所述的藥物或權利要求9所述的應用，其特征在于所述 癌癥為喉癌。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種蛇毒細胞毒素及其制備方法與應用。本發(fā)明所公開的制備蛇毒細胞毒素的方法包括如下步驟(1)將蛇毒溶液進行離子交換層析，收集洗脫液中280nm檢測波長的吸光度曲線上的第一吸收峰和第二吸收峰之間的流出液；(2)將步驟(1)得到的流出液進行排阻層析，以水作為流動相，收集洗脫液中280nm檢測波長的吸光度曲線上第二吸收峰，得到蛇毒細胞毒素。本發(fā)明的鋸鱗蝰蛇蛇毒細胞毒素能夠明顯誘導人喉癌細胞Hep-2凋亡，當蛇毒細胞毒素濃度為0.01mg/ml時，其誘導Hep-2細胞凋亡的能力強于濃度為100μg/ml的平陽霉素；而且異常毒性實驗證明該細胞毒素的副作用輕。本發(fā)明的鋸鱗蝰蛇蛇毒細胞毒素可以作為一種抗癌癥藥物，使生物抗癌藥成為現(xiàn)實。
文檔編號A61K35/58GK101269092SQ20081010625
公開日2008年9月24日 申請日期2008年5月9日 優(yōu)先權日2008年5月9日
發(fā)明者于洪儒 申請人:于洪儒