專(zhuān)利名稱(chēng)：一種長(zhǎng)白山白眉蝮蛇蛇毒磷脂酶a的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，涉及一種新的來(lái)自于長(zhǎng)白山白眉蝮蛇蛇毒的磷脂酶A2同源物及編碼這種磷脂酶A2同源物的多核苷酸序列，還涉及所述多核苷酸及其編碼的蛋白質(zhì)用途。
背景技術(shù)：
磷脂酶A2(phospholipaseA2，EC3.1.1.4)，簡(jiǎn)稱(chēng)PLA2，能催化甘油磷脂的第二位脂酰鍵的水解，生成溶血磷脂和脂肪酸。它廣泛存在于生物體內(nèi)，尤其富含于哺乳動(dòng)物胰臟的分泌液及蛇和昆蟲(chóng)的毒液中。
蛇毒PLA2由一類(lèi)結(jié)構(gòu)相似(通常含有7對(duì)二硫鍵)，分子量在14kD左右的蛋白質(zhì)家族組成。除了酶活性外，還具有多種生理活性，如神經(jīng)毒、心臟毒、肌肉毒、細(xì)胞毒、溶血作用、抗凝集作用等。這些活性或者與酶活性相關(guān)，或者完全獨(dú)立于酶活性之外。不同來(lái)源的蛇毒PLA2所具有上述生理活性不盡相同，每種PLA2通常只有一種或少數(shù)幾種生理作用。吳祥甫等從江浙蝮蛇的毒液中分離到3種PLA2(Wu XF等，Acta Biochem Biophys Sin，1984，16(6)664-671)，根據(jù)等電點(diǎn)的不同，分別命名為酸性PLA2(APLA2，pI4.5)，中性PLA2(NPLA2，pI6.9)及堿性PLA2(BPLA2，pI9.3)。它們的一級(jí)結(jié)構(gòu)同源性較高，空間結(jié)構(gòu)也比較保守，而藥理活性有相當(dāng)大的差異。其中，APLA2能抑制血小板聚集，NPLA2屬于突觸前神經(jīng)毒素，BPLA2則具有溶血活性。為了搞清楚PLA2結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系，人們對(duì)各種來(lái)源的蛇毒PLA2進(jìn)行了大量的研究，包括通過(guò)生化提取的方法對(duì)蛇毒進(jìn)行分離純化，然后對(duì)所得PLA2進(jìn)行氨基酸測(cè)序，通過(guò)進(jìn)一步的功能研究來(lái)探索不同結(jié)構(gòu)的PLA2結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的規(guī)律。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供了一種來(lái)自長(zhǎng)白山白眉蝮蛇(日本蝮蛇烏蘇里亞種，Agkistrodon blomhoffii ussurensis，俗名Manushi)的蛇毒磷脂酶A2同源物(Gln-49-PLA2)及其編碼基因的制備和用途。
本發(fā)明采用的技術(shù)方案是(1)分離純化出一種新的蛇毒磷脂酶A2同源物，并測(cè)定其部分氨基酸序列；(2)克隆編碼所述磷脂酶A2同源物的基因并測(cè)定其堿基序列；(3)將本發(fā)明提供的基因?qū)胨拗骷?xì)胞，使用本基因。(4)提供所述磷脂酶A2同源物性質(zhì)及用途。
一種長(zhǎng)白山白眉蝮蛇蛇毒磷脂酶A2同源物及其編碼基因，是來(lái)源于長(zhǎng)白山白眉蝮蛇(日本蝮蛇烏蘇里亞種，Agkistrodon blomhoffii ussurensis，俗名Manushi)，包含SEQ ID No.2所示氨基酸序列的多肽，或其保守性變異多肽，或其活性片段，或其活性衍生物，活性片段和活性衍生物是指具有全部或部分SEQID No.2氨基酸序列的多肽。
制備一種長(zhǎng)白山白眉蝮蛇蛇毒磷脂酶A2同源物及其編碼基因的方法是，分離純化出一種新的蛇毒磷脂酶A2同源物，克隆其編碼基因，插入重組表達(dá)載體，并導(dǎo)入宿主細(xì)胞，以使用該基因。
一種長(zhǎng)白山白眉蝮蛇蛇毒磷脂酶A2同源物及其編碼基因的制備方法是(a)適合表達(dá)蛇毒磷脂酶A2的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求3所述的宿主細(xì)胞；(b)從細(xì)胞培養(yǎng)物中分離出具有長(zhǎng)白山白眉蝮蛇蛇毒磷脂酶A2同源物活性的多肽；(c)從長(zhǎng)白山白眉蝮蛇蛇毒中分離磷脂酶A2同源物。
一種長(zhǎng)白山白眉蝮蛇蛇毒磷脂酶A2同源物及其編碼基因的制備方法，編碼基因是指一種分離的多核苷酸，其特征在于包含(a)或(b)中至少90％相同性的核苷酸序列(a)編碼具有SEQ ID No.2氨基酸序列多肽的多核苷酸；(b)與(a)中的多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸。
一種長(zhǎng)白山白眉蝮蛇蛇毒磷脂酶A2同源物及其編碼基因的制備方法，重組載體是能在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定復(fù)制并包含多核苷酸的任何質(zhì)粒和載體。
一種長(zhǎng)白山白眉蝮蛇蛇毒磷脂酶A2同源物及其編碼基因的制備方法，宿主細(xì)胞是一種遺傳工程化的宿主細(xì)胞，可選自下組的一種(a)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞；(b)多核苷酸轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞。
制備的一種長(zhǎng)白山白眉蝮蛇蛇毒磷脂酶A2同源物及其編碼基因的用途是，利用多肽細(xì)胞毒性、肌肉毒性、神經(jīng)毒性和抗凝血活性等特性，制備用于治療血栓、腫瘤、神經(jīng)等疾病以及止痛藥物組合物。
本發(fā)明提供的蛇毒磷脂酶A2同源物可通過(guò)離子交換層析、凝膠層析和高效液相層析(HPLC)的聯(lián)合應(yīng)用得到，SDA-PAGE顯示其為單一組份，質(zhì)譜確定其精確分子量為13881.83±0.33D，等電聚焦電泳測(cè)定其等電點(diǎn)為8.56。本發(fā)明提供的磷脂酶A2同源物具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。序列表明，該磷脂酶A2同源物是一種新的Gln49磷脂酶A2。Gln49磷脂酶A2是指磷脂酶A2氨基酸序列中的第49位氨基酸殘基是Gln，按照國(guó)際慣例，本發(fā)明中涉及的蛋白質(zhì)序列編號(hào)是以牛胰PLA2的序列編號(hào)作為參照。
本發(fā)明提供的磷脂酶A2同源物可通過(guò)常用的蛋白質(zhì)分離純化方法適當(dāng)組合分離純化得到，如離子交換層析、凝膠層析和高效液相層析(HPLC)等，但本發(fā)明可采用的方法不限于此。
本發(fā)明不局限于蛋白質(zhì)的來(lái)源，生產(chǎn)方法等，只要它具有說(shuō)明書(shū)中的特征即可。本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)可以是天然蛋白質(zhì)，利用基因工程技術(shù)由重組DNA表達(dá)的蛋白質(zhì)，或化學(xué)合成的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)不僅包括具有SEQ ID No.2所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)，還包括該蛋白質(zhì)的片段、衍生物和類(lèi)似物。本發(fā)明所用術(shù)語(yǔ)“片段”、“衍生物”和“類(lèi)似物”是指基本上保持本發(fā)明所述多肽相同的生物學(xué)功能或活性多肽。
本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)SEQ ID No.2的片段、衍生物或類(lèi)似物可以是(1)這樣一種多肽，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被保守或非保守氨基酸殘基(優(yōu)選的是保守氨基酸殘基)取代，并且取代的氨基酸可以是或不是由遺傳密碼子編碼的；或者(2)這樣一種多肽，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基包含取代基；或者(3)這樣一種多肽，其中成熟多肽與另一種化合物融合；或者(4)這樣一種多肽，其中附加氨基酸融合進(jìn)成熟多肽，其用來(lái)純化成熟多肽；或者(5)這樣一種多肽，一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被缺失，或者插入或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸。
本發(fā)明提供了分離的多核苷酸，其基本上是編碼SEQ ID No.2氨基酸序列多肽的多核苷酸。本發(fā)明提供的多核苷酸序列包括在SEQ ID No.1核苷酸序列中。本發(fā)明的多核苷酸是從長(zhǎng)白山白眉蝮蛇毒腺中分離得到的。它包含366個(gè)核苷酸，編碼122個(gè)氨基酸。
本發(fā)明所用術(shù)語(yǔ)“分離”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(lái)(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細(xì)胞內(nèi)天然狀態(tài)下的多核苷酸和多肽是沒(méi)有分離純化的，但同樣的多核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開(kāi)，則為分離純化。
本發(fā)明提供的多核苷酸可以是DNA形式或是RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQ ID No.1所示的編碼區(qū)序列相同或是簡(jiǎn)并性變異體。本發(fā)明所用術(shù)語(yǔ)“簡(jiǎn)并性變異體”是指編碼具有SEQ ID No.2蛋白質(zhì)或多肽的核酸序列，但由于密碼子的簡(jiǎn)并性，編碼與SEQ ID No.1所示的編碼區(qū)序列可能不同。
編碼SEQ ID No.2成熟多肽的多核苷酸包括僅有天然多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列以及非編碼序列。術(shù)語(yǔ)“編碼多肽的多核苷酸”是指包括編碼多肽的多核苷酸和編碼和(或)非編碼序列的多核苷酸。
本發(fā)明還涉及上述描述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽片段、類(lèi)似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失或插入，但基本上不會(huì)改變其編碼的多肽功能。
本發(fā)明還涉及能與以上所述序列雜交的多核苷酸(兩個(gè)序列之間具有至少90％，更優(yōu)選的具有95％的相同性)。本發(fā)明涉及在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發(fā)明中，“嚴(yán)格條件”是指(1)在較低離子強(qiáng)度和較高濕度下的雜交和洗脫，如60℃，0.2×SSC，0.1％SDS；或(2)雜交時(shí)加變性劑，如42℃，50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清或0.1％Ficoll等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在95％以上，更好是97％以上時(shí)才發(fā)生雜交。并且，可雜交的多核苷酸編碼多肽與SEQ ID NO.2所示的成熟多肽有相同的生物學(xué)功能和活性。
本發(fā)明還涉及以上所描述的雜交的核酸片段。如本發(fā)明所用，“核酸片段”的長(zhǎng)度至少含15個(gè)核苷酸，較好是20-30個(gè)核苷酸，更好是50-60個(gè)核苷酸，最好是100個(gè)核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的擴(kuò)增技術(shù)(如PCR)以確定和(或)分離編碼所述蛇毒磷脂酶A2的多核苷酸。
本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明多核苷酸序列的載體和用本發(fā)明的載體經(jīng)基因工種方法產(chǎn)生的宿主細(xì)胞，以及經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明所述多肽的方法。
本發(fā)明提供的DNA序列能用幾種方法獲得，例如用本領(lǐng)域熟知的雜交技術(shù)分離DNA。這些技術(shù)包括但不局限于(1)用探針與基因組cDNA文庫(kù)雜交以檢出同源性核苷酸序列；(2)表達(dá)文庫(kù)的抗體篩選以檢出其具有同源結(jié)構(gòu)特征的克隆DNA片段。
編碼所述的磷脂酶A2同源物特異DNA片段序列產(chǎn)生也能用下列方法獲得(1)從基因組DNA分離雙鏈DNA序列；(2)化學(xué)合成DNA序列以獲得所需多肽編碼的雙鏈DNA。
上述提到的方法中，分離基因組DNA最為常用。當(dāng)需要的多肽產(chǎn)物的整個(gè)氨基酸序列已知時(shí)，DNA序列的直接化學(xué)合成也是可選的方法。如果所需多肽氨基酸的整個(gè)序列不清楚時(shí)，DNA序列的直接化學(xué)合成是不可能的，選用的方法是cDNA序列的分離。分離目的cDNA的標(biāo)準(zhǔn)方法是從高表達(dá)該基因的供體細(xì)胞分離mRNA并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，形成質(zhì)?；蚴删wcDNA文庫(kù)。提取mRNA的方法已有多種成熟的技術(shù)，試劑盒也可從商業(yè)途徑獲得(Qingene)。而構(gòu)建cDNA文庫(kù)也是通常的方法(Sambrook等，Molecular Cloning，a Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York，1989)。還可得到商業(yè)供應(yīng)的cDNA文庫(kù)，如Clontech公司的不同cDNA文庫(kù)。當(dāng)結(jié)合使用聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)時(shí)，即使極少的表達(dá)基因也能克隆。
可用常規(guī)方法從這些cDNA文庫(kù)中篩選本發(fā)明的基因。這些方法包括(但不限于)(1)DNA-DNA或DNA-RNA雜交；(2)標(biāo)志基因的功能出現(xiàn)或喪失；(3)測(cè)定編碼所述長(zhǎng)白山白眉蝮蛇磷脂酶A2同源物轉(zhuǎn)錄本的水平；(4)應(yīng)用免疫學(xué)技術(shù)或測(cè)定生物學(xué)活性檢測(cè)基因表達(dá)的蛋白產(chǎn)物。上述方法可單用，也可多種方法聯(lián)合應(yīng)用。
在第(1)種方法中，雜交所用的探針是與本發(fā)明的多核苷酸的任何一部分同源的核苷酸序列，其長(zhǎng)度至少15個(gè)核苷酸，較好是20-30個(gè)核苷酸，更好是50-60個(gè)核苷酸，最好是100個(gè)核苷酸以上。此處所用的探針通常是在本發(fā)明提供的基因DNA序列信息的基礎(chǔ)上化學(xué)合成的DNA序列。本發(fā)明提供的基因本身或者片段當(dāng)然可以用做探針。DNA探針的標(biāo)記可用放射性同位素，熒光素或酶(如堿性磷酸酶)等。
在第(4)種方法中，檢測(cè)所述新蛋白質(zhì)基因表達(dá)的蛋白產(chǎn)物可用免疫學(xué)技術(shù)如Western印跡，放射免疫沉淀法，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)等。
應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA/RNA的方法(Saiki等，Science，1985；230；1350-1354)可被優(yōu)先用于獲得本發(fā)明提供的基因。特別是很難從文庫(kù)中得到全長(zhǎng)的cDNA時(shí)，可優(yōu)選使用RACE法(RACEcDNA末端快速擴(kuò)增法)，在上述PCR方面所用的引物可根據(jù)本發(fā)明提供的序列信息適當(dāng)?shù)剡x擇，并可用常規(guī)方法合成?？捎贸Ｒ?guī)方法如通過(guò)凝膠電泳分離和純化擴(kuò)增的DNA/RNA片段。
本發(fā)明提供的基因，各種DNA片段等核苷酸序列可用常規(guī)方法如雙脫氧鏈終止法測(cè)定(Sanger等，PNAS，1977，745463-5467)。這類(lèi)核苷酸序列測(cè)定也可用商業(yè)測(cè)序試劑盒等。為了獲得全長(zhǎng)的cDNA序列，測(cè)序需反復(fù)進(jìn)行。有時(shí)需要測(cè)定多個(gè)克隆的cDNA序列，才能拼接成全長(zhǎng)的cDNA序列。
本發(fā)明提供的長(zhǎng)白山白眉蝮蛇磷脂酶A2同源物的多核苷酸序列可插入到重組表達(dá)載體中。術(shù)語(yǔ)“重組表達(dá)載體”是指涉及本領(lǐng)域熟知的細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒、哺乳動(dòng)物細(xì)胞病毒如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或其他載體。在本發(fā)明中適用的載體包括但不局限于在細(xì)菌中表達(dá)的基于T7的表達(dá)載體(Maeda M.等，J. Biochem，109(4)632-637，1991，)以及在酵母細(xì)胞中表達(dá)的基于AOX1的表達(dá)載體；在哺乳動(dòng)物小鼠的表皮細(xì)胞中表達(dá)的基于MT的表達(dá)載體(Geyer H.等，Eur.J.Biochem.，237113-127，1996)和在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)的來(lái)源于桿狀病毒的載體。總之，只要能在宿主細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定復(fù)制，任何質(zhì)粒和載體都可以用。表達(dá)載體的一個(gè)重要特征是通常含有復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子、標(biāo)記基因和翻譯控制元件。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含所述長(zhǎng)白山白眉蝮蛇磷脂酶A2同源物的編碼DNA序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信息的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等(Sambroook等，Molecular Cloning，a laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York，1998)。所述的DNA序列可有效連接到表達(dá)載體中的適當(dāng)啟動(dòng)子上，以指導(dǎo)mRNA合成。這些啟動(dòng)子中代表性的例子有大腸桿菌的Lac或Trp啟動(dòng)子；λ噬菌體PL啟動(dòng)子；真核啟動(dòng)子包括CMV早期啟動(dòng)子、HSV胸苷激酶啟動(dòng)子、早期和晚期SV40啟動(dòng)子、反轉(zhuǎn)錄病毒的LTR啟動(dòng)子和其他一些已知的可控制基因在原核、真核細(xì)胞或其病毒中表達(dá)的啟動(dòng)子。表達(dá)載體還包括有翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子。
此外，表達(dá)載體優(yōu)選包含一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的表型性狀，如用于真核細(xì)胞培養(yǎng)的二氫葉酸還原酶、新霉毒抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉毒抗性。
包含以上所述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)?shù)膯?dòng)子或者控制序列的載體可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。
宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞。有代表性的例子有大腸桿菌，鏈霉菌，鼠傷寒沙門(mén)氏菌的細(xì)菌細(xì)胞；諸如酵母的真菌細(xì)胞；植物細(xì)胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲(chóng)細(xì)胞；CHO、COS或Bowes黑素瘤動(dòng)物細(xì)胞等。
本發(fā)明提供的多核苷酸在高等真核細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，如果在載體中插入一個(gè)增強(qiáng)子序列時(shí)將會(huì)使轉(zhuǎn)錄得到增強(qiáng)。增強(qiáng)子是DNA的順式作用因子，通常大約有10到300個(gè)堿基對(duì)，作用于啟動(dòng)子以增強(qiáng)基因的轉(zhuǎn)錄。可舉的例子包括在復(fù)制起始點(diǎn)晚期一側(cè)的100到270個(gè)堿基對(duì)SV40增強(qiáng)子、在復(fù)制起始點(diǎn)晚期一側(cè)的多瘤增強(qiáng)子以及腺病毒增強(qiáng)子等。
用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行，當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時(shí)，制備能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞一般從指數(shù)生長(zhǎng)期后收獲細(xì)胞，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知?？晒┻x擇的是用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀，顯微注射，電穿孔，脂質(zhì)體包裝等方法。
獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達(dá)本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)細(xì)胞可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基，在適于宿主細(xì)胞生長(zhǎng)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細(xì)胞生長(zhǎng)到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法(溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動(dòng)子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時(shí)間。
在上面的方法中所需的重組多肽可表達(dá)于細(xì)胞內(nèi)、或在細(xì)胞膜上表達(dá)或分泌到細(xì)胞外。如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過(guò)各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法多為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。更具體地說(shuō)，有常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破碎細(xì)胞、超濾處理、超離心、分子篩層析(凝膠過(guò)濾)，吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。
本發(fā)明還提供了所述磷脂酶A2同源物的生物學(xué)活性。實(shí)驗(yàn)表明所述蛇毒磷脂酶A2同源物沒(méi)有明顯的磷脂酶A2活性，但具有抗凝血、抗腫瘤等生物學(xué)活性，但基于本研究還在繼續(xù)，所述磷脂酶A2同源物的生物學(xué)活性不限于此。所述新的磷脂酶A2同源物有多方面的用途。這些用途包括(但不限于)抗腫瘤、抗血拴、止痛。
綜上所述，鑒于蛇毒PLA2結(jié)構(gòu)的多樣性和功能的復(fù)雜性，本發(fā)明首次提供的磷脂酶A2同源物氨基酸序列及其編碼基因，對(duì)弄清不同來(lái)源的PLA2結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系具有重要的理論意義。本發(fā)明提供的磷脂酶A2同源物，具有多種生物學(xué)活性，使得天然或重組PLA2在臨床血栓治療、腫瘤治療或臨床止痛方面具有潛在的應(yīng)用前景。
具體實(shí)施例方式
下面的具體實(shí)施方式
結(jié)合實(shí)例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說(shuō)明。
實(shí)施例1長(zhǎng)白山白眉蝮蛇蛇毒磷脂酶A2同源物的分離純化長(zhǎng)白山白眉蝮蛇粗蛇毒購(gòu)自吉林輝南縣，使用前用10mmol Tris-HCl(pH8.0)溶解，離心去沉淀，用10kD的超濾膜超濾兩次。
取上述粗蛇毒樣品進(jìn)行陽(yáng)離子交換層析，離子交換柱為Hitrap sp，緩沖液A為10mmol HAc-NaAc(pH 5.0)，緩沖液B為10mmol HAc-NaAc+1molKCl(pH5.0)，流速為2ml/min。收集離子交換柱上洗脫下的各組分，超濾濃縮后進(jìn)行凝膠過(guò)濾層析凝膠柱為superdex75，緩沖液C為10mmol Tris-HCl+1molKCl，流速為1ml/min。收集凝膠過(guò)濾層析組分，超濾濃縮脫鹽后，進(jìn)行陰離子交換層析離子交換柱為source Q，緩沖液D為10mmol Tris-HCl(pH 8.0)，緩沖液E為10mmol Tris-HCl+1molKCl(pH 8.0)，流速為2ml/min。HPLC進(jìn)一步純化方法為收集陰離子交換層析組分，超濾濃縮后進(jìn)行HPLC制備，色譜柱為反相C18制備柱(250×15)；流動(dòng)相F為乙腈+0.1％三氟乙酸；G為水+0.1％三氟乙酸；流速為2ml/min。
實(shí)施例2長(zhǎng)白山白眉蝮蛇蛇毒磷脂酶A2同源物基因的獲得長(zhǎng)白山白眉蝮蛇排毒后4天，取出毒腺，迅速投入TRIZOL中，按照試劑盒生產(chǎn)廠商提供的操作指南進(jìn)行總RNA提取(TRIZOL試劑盒，美國(guó)GIBICOL公司)。根據(jù)已知氨基酸序列，結(jié)合同源序列比較設(shè)計(jì)特異引物P-F1，采用3’-FullRACE法得到長(zhǎng)白山白眉蝮蛇蛇毒磷脂酶A2同源物基因3’端序列。進(jìn)而設(shè)計(jì)引物P-F2、P-R2，采用RT-PCR法得到長(zhǎng)白山白眉蝮蛇蛇毒磷脂酶A2同源物的編碼基因。3’-Full RACE、RT-PCR均采用試劑盒(TAKARA公司，日本)，3’-FullRACE反轉(zhuǎn)錄引物為Oligo dT-3 sites Adaptor Primer，由TAKARA公司提供，所有操作均按照試劑盒生產(chǎn)廠商提供的操作指南進(jìn)行。其中有關(guān)PCR反應(yīng)的條件是這樣的引物為P-F15’-TATCGTCTGTGGAGGGGACGACCC-3’3 sites Adaptor Primer5’-CTGATCTAGAGGTACCGGATCC-3’P-F25’-AGCCTGCTGCAATTCAGGAAGATGAT-3’P-R25’-TCCCGGCCTGCAGAGACTTAGC-3’PCR具體反應(yīng)條件均為 72℃ 7min4℃5m所得PCR產(chǎn)物克隆到pMD18-T中，測(cè)序獲得編碼長(zhǎng)白山白眉蝮蛇蛇毒磷脂酶A2同源物基因序列。將該序列與已有的DNA序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該多核苷酸序列未有過(guò)報(bào)道，我們將該基因編碼的蛋白質(zhì)命名為長(zhǎng)白山白眉蝮蛇蛇毒磷脂酶A2同源物，英文名為manushi phospholipaseA2homologue，縮寫(xiě)為Gln49-MPLA2。
實(shí)施例3長(zhǎng)白山白眉蝮蛇蛇毒磷脂酶A2同源物基因在大腸桿菌中的表達(dá)根據(jù)該新蛋白質(zhì)相應(yīng)的基因序列，設(shè)計(jì)出一對(duì)特異性擴(kuò)增引物，序列如下
F1 primer5’-CCGAATTCATTGAGGGACGCAGCCTGCT GCAATTCAG-3’R1 primer5’-CCGGATCCTCATTAGCATTTCTCTGACTT-3’F-primer序列含有EcoRI酶切位點(diǎn)和Factor Xa切割的識(shí)別序列。R-primer序列含有BamH I酶切位點(diǎn)和翻譯終止子序列，其后面分別為目的基因5’端和3’端的編碼序列，以含有目的基因的pMD118-T質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)。
根據(jù)已知的大腸桿菌表達(dá)載體pET-32(a)+的全序列，設(shè)計(jì)出一對(duì)特異性擴(kuò)增引物，以改建質(zhì)粒，得到滿意的表達(dá)效果，引物序列如下F2 primer 5’-CCGGATCCCAAAGCCCGAAAGGAAGC-3’R2 primer 5’-GGGAATTCACCAGAAGAATGATGATGATG-3’F primer含有BamH I酶切位點(diǎn)和部分T7終止子序列。R primer含有EcoRI酶切位點(diǎn)、柔鏈區(qū)和部分His Tag序列。以大腸桿菌表達(dá)載體pET-32(a)+為模板，進(jìn)行反向PCR。
用BmH I和EcoRI分別對(duì)擴(kuò)增的目的基因序列和大腸桿菌表達(dá)載體pET-32(a)+序列進(jìn)行酶切并連接。將重組質(zhì)粒電脈沖轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)中，37℃，IPTG誘導(dǎo)4小時(shí)后收獲菌體。所的菌體超聲破碎，SDS-PAGE顯示重組蛋白質(zhì)獲得了表達(dá)。
實(shí)施例4長(zhǎng)白山白眉蝮蛇蛇毒磷脂酶A2同源物抗凝血活性的測(cè)定取新鮮的枸櫞酸鈉抗凝豬血，1000g離心10min，得富含血小板血漿(PRP)，取PRP 0.5ml，與0.1ml含不同濃度的磷脂酶A2同源物(0.1，0.2，0.4或0.6g/L)的PBS溶液37℃孵育10min，加入0.1ml 0.25mol/L CaCl2，記錄凝血時(shí)間。實(shí)驗(yàn)表明，長(zhǎng)白山白眉蝮蛇PLA2同源物在較低濃度(0.1mg/ml)時(shí)，對(duì)復(fù)鈣時(shí)間略有降低，但當(dāng)濃度高于0.2mg/ml時(shí)，隨PLA2濃度的增加，復(fù)鈣時(shí)間延長(zhǎng)。
實(shí)施例5長(zhǎng)白山白眉蝮蛇蛇毒磷脂酶A2同源物細(xì)胞毒性的測(cè)定將凍存的Hela、K562細(xì)胞經(jīng)復(fù)蘇、傳代后取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞記數(shù)，以1×105/ml細(xì)胞加入24孔培養(yǎng)板，每孔500μl，5％ CO2孵箱中培養(yǎng)24h，加入不同濃度的PLA2同源物，培養(yǎng)3h。采用MTT法測(cè)定Hela、K562的活細(xì)胞數(shù)，計(jì)算半數(shù)致死量(LD50)。實(shí)驗(yàn)表明，PLA2同源物對(duì)Hela細(xì)胞有明顯的毒性作用，但對(duì)K562細(xì)胞不明顯，其LD50分別為1.3μmol/ml和28.6μmol/l。
權(quán)利要求
1.一種長(zhǎng)白山白眉蝮蛇蛇毒磷脂酶A2同源物及其編碼基因，其特征在于，來(lái)源于長(zhǎng)白山白眉蝮蛇，包含SEQ ID No.2所示氨基酸序列的多肽，或其保守性變異多肽，或其活性片段，或其活性衍生物，活性片段和活性衍生物是指具有全部或部分SEQ ID No.2氨基酸序列的多肽。
2.制備根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種長(zhǎng)白山白眉蝮蛇蛇毒磷脂酶A2同源物及其編碼基因的方法，其特征在于，分離純化出一種新的蛇毒磷脂酶A2同源物，克隆其編碼基因，插入重組表達(dá)載體，并導(dǎo)入宿主細(xì)胞，以使用該基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種長(zhǎng)白山白眉蝮蛇蛇毒磷脂酶A2同源物及其編碼基因的制備方法，其特征在于，(a)適合表達(dá)蛇毒磷脂酶A2的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求2所述的宿主細(xì)胞；(b)從細(xì)胞培養(yǎng)物中分離出具有長(zhǎng)白山白眉蝮蛇蛇毒磷脂酶A2同源物活性的多肽；(c)從長(zhǎng)白山白眉蝮蛇蛇毒中分離磷脂酶A2同源物。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種長(zhǎng)白山白眉蝮蛇蛇毒磷脂酶A2同源物及其編碼基因的制備方法，其特征在于，編碼基因是指一種分離的多核苷酸，其特征在于包含(a)或(b)中至少90％相同性的核苷酸序列(a)編碼具有SEQ ID No.2氨基酸序列多肽的多核苷酸；(b)與(a)中的多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求2、4所述的一種長(zhǎng)白山白眉蝮蛇蛇毒磷脂酶A2同源物及其編碼基因的制備方法，其特征在于，重組載體是能在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定復(fù)制并包含多核苷酸的任何質(zhì)粒和載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求2、3或5所述的一種長(zhǎng)白山白眉蝮蛇蛇毒磷脂酶A2同源物及其編碼基因的制備方法，其特征在于，宿主細(xì)胞是一種遺傳工程化的宿主細(xì)胞，可選自下組的一種(a)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞；(b)多核苷酸轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞。
7.權(quán)利要求1、2所述的制備的一種長(zhǎng)白山白眉蝮蛇蛇毒磷脂酶A2同源物及其編碼基因的用途，其特征在于，利用多肽細(xì)胞毒性、肌肉毒性、神經(jīng)毒性和抗凝血活性等特性，制備用于治療血栓、腫瘤、神經(jīng)等疾病以及止痛藥物組合物。
全文摘要
一種長(zhǎng)白山白眉蝮蛇蛇毒磷脂酶A
文檔編號(hào)A61P25/00GK1542135SQ20031010504
公開(kāi)日2004年11月3日 申請(qǐng)日期2003年11月6日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月6日
發(fā)明者包永明, 安利佳, 金禮吉, 卜鵬成, 楊君 申請(qǐng)人:大連理工大學(xué)