專利名稱：蛇毒l-氨基酸氧化酶在制備艾滋病治療藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛇毒L-氨基酸氧化酶在制備艾滋病治療藥物中的應(yīng)用，屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
艾滋病(Acquired Immunodeficiency Syndrome，AIDS)是由人類免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)感染引起的破壞機(jī)體免疫系統(tǒng)的致死疾病。這一被稱為“二十一世紀(jì)瘟疫”的病魔，已蔓延到世界的每個(gè)角落，眾多的發(fā)展中國(guó)家正在遭受它的危害。據(jù)WHO最新公布的材料，AIDS流行的國(guó)家和地區(qū)達(dá)170多個(gè)，全球HIV感染者已達(dá)4400多萬(wàn)人，已有1400萬(wàn)人死亡，據(jù)報(bào)道，目前我國(guó)實(shí)際HIV感染人數(shù)超過(guò)100萬(wàn)人。由于目前尚無(wú)可預(yù)防或治療的有效疫苗，抗HIV藥物的研究成為防治AIDS的主要途徑之一。另一方面，HIV病毒的易變異性及對(duì)許多藥物易產(chǎn)生的耐藥性，對(duì)治療造成巨大困難，從傳統(tǒng)藥物和天然資源中尋找新的抗AIDS藥物和先導(dǎo)化合物的研究，是當(dāng)前國(guó)內(nèi)外新藥研制中的重要研究方面和非常活躍的領(lǐng)域[1]。
L-氨基酸氧化酶(ECl.4.3.2)是一類黃素蛋白酶，其酶活性為立體特異性催化L-氨基酸的氧化脫氨，生成α-酮酸、氨和過(guò)氧化氫(H2O2)。這種酶廣泛分布于多種生物體種類中。蛇毒L-氨基酸氧化酶是該類酶中研究最為深入的一族。蛇毒L-氨基酸氧化酶廣泛分布于蛇毒的毒液中，如蝰科、響尾蛇科、眼鏡蛇科蛇毒，它們含量高、酶活性強(qiáng)。蛇毒L-氨基酸氧化酶通常是含黃素(FAD)輔基的糖蛋白同型二聚體，自然狀態(tài)下凝膠過(guò)濾其分子量通常為110-150KDa，還原和非還原SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，其分子量均為50-70KDa，表明蛇毒L-氨基酸氧化酶為非共價(jià)結(jié)合的同型二聚體。蛇毒L-氨基酸氧化酶的等電點(diǎn)pI值變化很廣，從4.0-8.5均有分布[2]。至今為止，至少有五種蛇毒L-氨基酸氧化酶的cDNAs已克隆出來(lái)，其推斷的氨基酸序列高度相似(80％以上)。另一方面，蛇毒L-氨基酸氧化酶與人的單胺氧化酶、細(xì)菌和真菌的L-氨基酸氧化酶僅在FAD結(jié)合區(qū)有序列相似性。另外，這種序列的相似性還發(fā)現(xiàn)在蛇毒L-氨基酸氧化酶和IL-4誘導(dǎo)的大鼠Fig-1蛋白之間[3]。由于其輔基FAD的原因，L-氨基酸氧化酶在465nm、380nm處有典型的特殊吸收峰[4]。當(dāng)蛇毒L-氨基酸氧化酶在反復(fù)凍融或pH極端時(shí)其光吸收峰會(huì)發(fā)生微微的變動(dòng)，表明輔基FAD周圍的微環(huán)境發(fā)生了變化，并導(dǎo)致其活性的喪失。蛇毒L-氨基酸氧化酶需要在4℃、中性pH條件下保存。Pawelek et al(2000)提供了從馬來(lái)西亞蝮蛇(Calloselasmarhodostoma)分離的L-氨基酸氧化酶的X-射線晶體衍射結(jié)構(gòu)[5]，表明其功能性結(jié)構(gòu)是雙體形式，每一單體包含三個(gè)結(jié)構(gòu)域一個(gè)FAD結(jié)合結(jié)構(gòu)域、底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域和一個(gè)螺旋結(jié)構(gòu)域，在底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域和一個(gè)螺旋結(jié)構(gòu)域形成一個(gè)底物進(jìn)入并與活性位點(diǎn)結(jié)合的通道。對(duì)馬來(lái)西亞蝮蛇(C.rhodostoma)中分離的L-氨基酸氧化酶結(jié)構(gòu)的研究提供的信息表明有兩個(gè)糖基化位點(diǎn)，一個(gè)在Asn172，一個(gè)在Asn361位，糖殘基是由以巖澡糖為中心、雙分支、雙唾液酸化的十二個(gè)糖殘基組成。用抑制劑衣酶素抑制蛋白質(zhì)的N-糖基化可阻遏酵母表達(dá)的響尾蛇(Crotalusatrox)L-氨基酸氧化酶apoxin-I向培養(yǎng)基的分泌及其L-氨基酸氧化酶的活性。說(shuō)明糖基化對(duì)L-氨基酸氧化酶活性的重要性[2]。
在許多蛇毒中，L-氨基酸氧化酶是一種主要的組分，并因其容易分離純化而成為研究L-氨基酸氧化酶的酶學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)和藥物學(xué)的有趣的客體。近年來(lái)越來(lái)越多的具有不同的分子量、不同的底物選擇性的蛇毒L-氨基酸氧化酶被分離純化。國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道了它們具有與血小板相互作用、抗細(xì)菌和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的特性。許多研究表明蛇毒L-氨基酸氧化酶產(chǎn)生的過(guò)氧化氫(H2O2)在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和蛇毒引起的出血中起直接作用，因?yàn)檫^(guò)氧化氫酶可消除H2O2進(jìn)而抑制蛇毒L-氨基酸氧化酶引起的細(xì)胞凋亡[2]。
綜合國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)，專利報(bào)道，L-氨基酸氧化酶已開(kāi)始用于細(xì)胞凋亡，血小板功能，抗菌的研究；及染料工業(yè)，食品制作的應(yīng)用，但未見(jiàn)蛇毒L-氨基酸氧化酶具有抗艾滋病病毒，和用于制備艾滋病治療藥物的應(yīng)用的文獻(xiàn)和專利報(bào)道。
參考文獻(xiàn)[1]抗艾滋病病毒活性化合物。羅士德，陳紀(jì)軍主編，2002，云南科技出版社。
Du XY，Clemetson KJ，(2002)Snake venom L-amino acid oxidases.Toxicon40.659-665. Raibekas AA，Massey V，(1998)Primary structure of the SV-LAAO shows highhomology with the mouse B cell interleukin 4-induced Fig 1protein.Biochem.Biophys.Res.Commun.248，476-478. Massey V，Curti B，(1967)On the reaction mechanism of Crotalusadamanteus L-amino-acid oxidase.J Biol.Chem.242，1259-1264. Pawelek PD，et al.，(2000)The structure of L-amino-acid oxidasereveals the substrate trajectory into an enantiomerically conserved activesite.EMBO J.19，4204-4215.

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是基于上述現(xiàn)有技術(shù)基礎(chǔ)，提供蛇毒L-氨基酸氧化酶在制備艾滋病治療藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明將從蝰科、響尾蛇科、眼鏡蛇科蛇毒中用現(xiàn)有方法分離得到蛇毒L-氨基酸氧化酶，或由蛇毒L-氨基酸氧化酶編碼基因經(jīng)基因工程人工表達(dá)產(chǎn)物，或突變體(蛇毒L-氨基酸氧化酶突變體)作為制備艾滋病治療藥物的應(yīng)用。
本發(fā)明亦可將蛇毒L-氨基酸氧化酶與過(guò)氧化氫酶混合，作為制備艾滋病治療藥物的應(yīng)用。
本發(fā)明的有益效果在于蛇毒L-氨基酸氧化酶具有顯著的抗艾滋病病毒活性，蛇毒L-氨基酸氧化酶可強(qiáng)烈抑制病毒誘導(dǎo)細(xì)胞形成合胞體，抑制病毒復(fù)制。蛇毒L-氨基酸氧化酶具有活力高(1-3納摩爾濃度下即可有效抑制HIV病毒)，抗HIV病毒的機(jī)制不同于目前所用的逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑藥物(如AZT)、融合阻斷藥物(如Dextran Sulfate，DS)。另一方面，蛇毒L-氨基酸氧化酶與過(guò)氧化氫酶聯(lián)合應(yīng)用，可降低L-氨基酸氧化酶的細(xì)胞毒性16倍，提高治療指數(shù)3.3倍。
具體實(shí)施例方式下面用實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步詳述本發(fā)明，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。
實(shí)施例一
所用蛇毒L-氨基酸氧化酶為從中國(guó)產(chǎn)竹葉青(Trimeresurus stejnegeri)蛇毒中分離得到，或?yàn)橛缮叨綥-氨基酸氧化酶編碼基因經(jīng)基因工程人工表達(dá)的突變體(蛇毒L-氨基酸氧化酶)。
1，蛇毒L-氨基酸氧化酶對(duì)HIV-1誘導(dǎo)C8166細(xì)胞形成合胞體的抑制作用蛇毒L-氨基酸氧化酶細(xì)胞毒活性測(cè)定在96孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板上，將待測(cè)化合物用完全培養(yǎng)基進(jìn)行5倍倍比稀釋，共5個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度設(shè)3個(gè)重復(fù)孔，每孔100μl，同時(shí)設(shè)置正常細(xì)胞對(duì)照。每孔滴加3×105/ml的C8166細(xì)胞100μl。置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。72小時(shí)后用MTT方法測(cè)定待測(cè)化合物對(duì)細(xì)胞的毒性作用。CC50是對(duì)50％宿主細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒作用時(shí)的藥物濃度。
蛇毒L-氨基酸氧化酶對(duì)HIV-1IIIB誘導(dǎo)C8166細(xì)胞形成合胞體的抑制作用測(cè)定在96孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板上，將待測(cè)化合物用完全培養(yǎng)基進(jìn)行5倍倍比稀釋，共5個(gè)稀釋度，每孔100μl，同時(shí)設(shè)置正常細(xì)胞對(duì)照，HIV感染細(xì)胞對(duì)照。每實(shí)驗(yàn)孔滴加3×104個(gè)C8166細(xì)胞和200 TCID50的HIV-1IIIB，即感染復(fù)數(shù)為0.007，每孔的總體積為200μl。置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。感染后第3天觀察待測(cè)化合物對(duì)合胞體形成的影響。在100倍的倒置顯微鏡下，選取5個(gè)不重疊的視野，計(jì)數(shù)HIV-1IIIB誘導(dǎo)C8166細(xì)胞形成的合胞體數(shù)。EC50為抑制合胞體形成達(dá)50％時(shí)的藥物濃度。
治療指數(shù)(TI)為CC50/EC50的比值。
表1，蛇毒L-氨基酸氧化酶對(duì)HIV-1IIIB誘導(dǎo)C8166細(xì)胞形成合胞體的抑制作用和治療指數(shù)(TI)化合物 EC50 CC50 TI(μg/ml) (μg/ml)L-氨基酸氧化酶(批號(hào)1)0.132.64 20L-氨基酸氧化酶(批號(hào)2)0.182.88 16L-氨基酸氧化酶(批號(hào)3)0.165.10 31從表1可見(jiàn)，不同批號(hào)的蛇毒L-氨基酸氧化酶均有顯著的體外抑制HIV-1IIIB誘導(dǎo)C8166細(xì)胞形成合胞體的作用，而且治療指數(shù)(TI)達(dá)20以上。
2，蛇毒L-氨基酸氧化酶降低HIV P24抗原的作用ELISA檢測(cè)HIV P24抗原方法 1，用包被緩沖液稀釋抗HIV-1 P24單克隆抗體包被于96孔微量反應(yīng)板上，每孔100μl，4℃過(guò)夜。2，洗滌二次后，每孔加入200μl封板液，37℃溫育2小時(shí)。3，洗滌三次后，每孔加入待測(cè)樣品100μl，37℃溫育2小時(shí)。4，洗滌三次后，加入1∶500稀釋的艾滋病人血清(APS)，每孔100μl，37℃溫育1小時(shí)。5，洗滌后，每孔加入1∶2000稀釋的HPR標(biāo)記羊抗人IgG抗體100μl，37℃溫育1小時(shí)。6，充分洗滌后，加入OPD底物使用液100μl，室溫反應(yīng)5-15分鐘后，用反應(yīng)中止液50μl中止反應(yīng)。7，Bio-Rad全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定結(jié)果，測(cè)定波長(zhǎng)為490nm，參考波長(zhǎng)為630nm。此試驗(yàn)重復(fù)四次，取平均值，結(jié)果如表2。
表2，蛇毒L-氨基酸氧化酶抑制HIV P24抗原的作用化合物EC50(μg/ml)L-氨基酸氧化酶(批號(hào)1) 0.67L-氨基酸氧化酶(批號(hào)2) 0.32L-氨基酸氧化酶(批號(hào)3) 0.22由表2可見(jiàn)，不同批號(hào)的蛇毒L-氨基酸氧化酶均有顯著的抑制HIV病毒復(fù)制的作用。
3，蛇毒L-氨基酸氧化酶HIV感染細(xì)胞融合(Fusion)的阻斷實(shí)驗(yàn)在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，將待測(cè)化合物按5倍倍比稀釋，共四個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度設(shè)3個(gè)重復(fù)孔，每孔100μl。同時(shí)設(shè)置不含待測(cè)化合物的對(duì)照孔。每孔滴加6×105/ml的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期C8166細(xì)胞50μl和2×105/ml的HIV-1IIIB慢性感染的H9細(xì)胞50μl，即HIV-1IIIB感染細(xì)胞與未感染的C8166細(xì)胞數(shù)之比為1∶3。置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24小時(shí)后，在倒置顯微鏡下通過(guò)觀察細(xì)胞融合形成的合胞體數(shù)量來(lái)推斷化合物是否阻斷病毒與細(xì)胞的結(jié)合過(guò)程?！?”表示化合物未阻斷細(xì)胞融合的形成；“+”表示化合物完全阻斷了細(xì)胞融合的形成。此試驗(yàn)重復(fù)三次，取平均值，結(jié)果如表3。
表3，蛇毒L-氨基酸氧化酶對(duì)HIV感染細(xì)胞融合(Fusion)的影響化合物 濃度(μg/ml) 融合抑制L-氨基酸氧化酶(批號(hào)1) 100-20 -4 -感染細(xì)胞表面的gp120與未感染細(xì)胞表面的CD4受體結(jié)合后，可導(dǎo)致細(xì)胞融合形成合胞體。作用于該靶點(diǎn)的藥物將阻斷融合的發(fā)生，如Dextran Sulfate(DS)。從表3可見(jiàn)，與DS不同，蛇毒L-氨基酸氧化酶不能阻斷感染細(xì)胞的融合，表明其抗HIV病毒的機(jī)制與目前所用的融合阻斷藥物不同。
4，蛇毒L-氨基酸氧化酶對(duì)HIV的逆轉(zhuǎn)錄酶活性抑制實(shí)驗(yàn)HIV Reverse Transcriptase Assay，non-radioactive試劑盒購(gòu)自Roche公司。取出試劑盒中反應(yīng)條，每孔滴加20μl HIV-1 RT溶液，20μl樣品，20μl含模板和核苷酸的反應(yīng)緩沖液。使化合物的終濃度為33μg/ml。設(shè)置Foscarnet陽(yáng)性對(duì)照孔和不含化合物的陰性對(duì)照孔。置37℃ 1小時(shí)。洗滌5次后，每孔加入200μl抗DIG-POD抗體工作液。37℃溫育1小時(shí)，洗滌5次。每孔滴加200μl ABTS底物反應(yīng)液。室溫反應(yīng)15-30分鐘，Bio-Tek Elx800酶標(biāo)儀測(cè)定OD值(405/490nm)。以抑制RT活性＞50％的化合物判定為初篩陽(yáng)性。
結(jié)果表明蛇毒L-氨基酸氧化酶不能抑制HIV的逆轉(zhuǎn)錄酶活性，表明其抗HIV病毒的機(jī)制與目前所用的逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑藥物，如AZT不同。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明蛇毒L-氨基酸氧化酶具有顯著的抗艾滋病病毒活性，蛇毒L-氨基酸氧化酶可強(qiáng)烈抑制病毒誘導(dǎo)細(xì)胞形成合胞體，抑制病毒復(fù)制。蛇毒L-氨基酸氧化酶具有活力高(1-3納摩爾濃度下即可有效抑制HIV病毒)，抗HIV病毒的機(jī)制與目前所用的逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑藥物，如AZT，融合阻斷藥物，如DS不同的特點(diǎn)。
實(shí)施例二過(guò)氧化氫酶存在下蛇毒L-氨基酸氧化酶抗HIV作用化合物抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，對(duì)HIV-1誘導(dǎo)C8166細(xì)胞形成合胞體的抑制作用，及抑制HIV病毒復(fù)制作用測(cè)定方法如實(shí)施例一所述。EC50為抑制合胞體形成達(dá)50％時(shí)的藥物濃度，P24抗原EC50為抑制病毒復(fù)制50％所需要的藥物濃度；CC50是對(duì)50％宿主細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒作用時(shí)的藥物濃度，治療指數(shù)(TI)為CC50/EC50的比值表4，過(guò)氧化氫酶存在下蛇毒L-氨基酸氧化酶抗HIV活性測(cè)定化合物合胞體抑制EC50CC50 TI P24抗原EC50(μg/ml) (μg/ml)(μg/ml)L-氨基酸氧化酶0.18 2.8 160.40L-氨基酸氧化酶0.9 46.8 521.27加過(guò)樣化氫酶(100μg/ml)過(guò)氧化氫酶具有清除L-氨基酸氧化酶所產(chǎn)生的過(guò)氧化氫(H2O2)的作用。從表4的結(jié)果可見(jiàn)，蛇毒L-氨基酸氧化酶與過(guò)氧化氫酶聯(lián)合應(yīng)用，可降低L-氨基酸氧化酶的細(xì)胞毒性16倍，提高治療指數(shù)3.3倍。
權(quán)利要求
1.蛇毒L-氨基酸氧化酶在制備艾滋病治療藥物中的應(yīng)用，其特征在于1.1將從蝰科、響尾蛇科、眼鏡蛇科蛇毒中分離得到的蛇毒L-氨基酸氧化酶，或由蛇毒L-氨基酸氧化酶編碼基因經(jīng)基因工程人工表達(dá)產(chǎn)物，或突變體作為制備艾滋病治療藥物中的應(yīng)用；1.2.將1.1所述的蛇毒L-氨基酸氧化酶與過(guò)氧化氫酶混合，作為制備艾滋病治療藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及蛇毒L－氨基酸氧化酶在制備艾滋病治療藥物中的應(yīng)用，屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。蛇毒L－氨基酸氧化酶可從蝰科或眼鏡蛇科毒腺分泌物中分離得到，也可用其編碼基因由基因工程表達(dá)得到。蛇毒L－氨基酸氧化酶具有顯著的抗艾滋病病毒活性，蛇毒L－氨基酸氧化酶可強(qiáng)烈抑制病毒誘導(dǎo)細(xì)胞形成合胞體，抑制病毒復(fù)制。蛇毒L－氨基酸氧化酶具有活力高(1－3納摩爾濃度下即可有效抑制HIV病毒)，抗HIV病毒的機(jī)制與目前所用的逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑藥物，如AZT，融合阻斷藥物，如DS不同的特點(diǎn)。另一方面，蛇毒L－氨基酸氧化酶與過(guò)氧化氫酶聯(lián)合應(yīng)用，可有效降低L－氨基酸氧化酶的細(xì)胞毒性，顯著提高治療指數(shù)。
文檔編號(hào)A61K38/43GK1526445SQ0311741
公開(kāi)日2004年9月8日 申請(qǐng)日期2003年3月4日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月4日
發(fā)明者張?jiān)? 鄭永唐, 張玉潔, 王建華, 李文輝, 王茜, 張 云 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所