專利名稱：一種新的重組蛇毒金屬蛋白酶的表達(dá)、復(fù)性及其生物學(xué)活性的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種重組蛇毒金屬蛋白酶基因的構(gòu)建、表達(dá)以及該重組蛇 毒金屬蛋白酶的體外復(fù)性和活性測定。
背景技術(shù)：
蛇毒中含有很多具有生物學(xué)活性和醫(yī)藥及工業(yè)應(yīng)用價值的蛋白酶類。其 中，蛇毒金屬蛋白酶是主要組份之一。它常常是蝮蛇蛇毒的主要毒素，引起 被咬機(jī)體的局部或系統(tǒng)出血。由于蛇毒金屬蛋白酶是一種蛋白酶，所以，與 其他工業(yè)用蛋白酶一樣，它也具有潛在的和現(xiàn)實的醫(yī)藥和工業(yè)用價值。如蛇 毒降纖酶就是從蛇毒中分離得到的一種蛋白酶，目前已應(yīng)用于人體血栓的臨 床治療中。此外，國外科學(xué)家試驗表明，蛇毒蛋白酶還可去除衣物污漬。但 是，由于天然蛇毒的來源有限，品種資源的日益減少以及分離純化的繁瑣和 困難，因此，通過基因工程或蛋白質(zhì)工程技術(shù)創(chuàng)造新的蛋白酶品種，以及通 過發(fā)酵大規(guī)模生產(chǎn)重組蛋白酶就具有特別重要的意義。目前，通過基因工程技術(shù)在大腸桿菌中表達(dá)重組蛋白已成為分子生物學(xué) 中的常規(guī)技術(shù)。但是，很多蛋白酶，尤其是含有多個二硫鍵的蛋白酶在大腸 桿菌中表達(dá)后往往形成沒有生物學(xué)活性的不溶性的包涵體；經(jīng)體外復(fù)性后， 很多蛋白酶還是沒有生物學(xué)活性。為了繞過沒有生物學(xué)活性的包涵體這個難 關(guān)，人們常常利用酵母和動物細(xì)胞來生產(chǎn)或表達(dá)真核蛋白。但是，利用酵母 和動物細(xì)胞生產(chǎn)重組蛋白的成本很高，表達(dá)量相對較低，生產(chǎn)周期較長，分 離純化的難度相對較大，操作技術(shù)也更復(fù)雜，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。另外，有 些毒性蛋白不適合于在動物細(xì)胞中生產(chǎn)，而更易于在大腸桿菌中以包涵體的 形式大量表達(dá)。因此，若能使在大腸桿菌中以包涵體形式表達(dá)的重組蛋白酶 復(fù)性后仍具有較強(qiáng)的生物學(xué)活性，那么，在大腸桿菌中生產(chǎn)重組蛋白酶就具 有極大的成本優(yōu)勢和大規(guī)模工業(yè)應(yīng)用價值。 本發(fā)明利用已公開發(fā)表的巴西非出血蛇毒金屬蛋白酶成熟酶區(qū)cDNA序 列和中國皖南尖吻蝮蛇出血蛇毒金屬蛋白酶acutolysin A (該酶的名稱)的 成熟酶區(qū)cDNA序列為材料，構(gòu)建了一種自然界不存在的重組金屬蛋白酶基 因，并在大腸桿菌中高效表達(dá)了該蛋白酶。經(jīng)體外復(fù)性后，該蛋白酶具有明 顯的蛋白水解活性。巴西蛇毒金屬蛋白酶基因序列的參考文獻(xiàn)1 ， Selistre de Araujo H.S. & Ownby C.L. (1995) Molecular cloning and sequence analysis of cDNAs for metalloproteinases from broad-banded copperhead々^/raticw cow/orzWx to/awd 爿rcA. 320, 141-148.2， Selistre de Araujo H.S.， de Souza E丄.，Bdtramini, L.M,, Ownby, C丄.& Souza, D.H. (2000) Expression^ refolding and activity of a recombinant nonhemorrhagic snake venom metalloprotease.尸ro/Ww Ex/^. &尸wn/ 19， 41-47.中國皖南尖吻蝮蛇出血毒金屬蛋白酶acutolysin A (該酶的名稱)的 成熟酶區(qū)cDNA序列參考文獻(xiàn)1 ， Liu, Q., Xu, W.， Cheng, X., Jin， G.， Shen, X., Lou, H. & Liu, J. (1999) Molecular cloning and sequence analysis of cDNA encoding hemorrhagic toxin acutolysin A from爿沐Wz-ocitow 7bx/co 37, 1539-1548.發(fā)明內(nèi)容為了克服上述不足之處和開發(fā)新的工業(yè)用或醫(yī)藥用蛋白酶，本發(fā)明構(gòu)建 了一種新的重組或嵌合蛇毒金屬蛋白酶基因，并在大腸桿菌中以包涵體的形 式表達(dá)了該重組金屬蛋白酶，經(jīng)體外復(fù)性后，該重組蛋白酶具有對多種蛋白 底物的水解活性。這種新的重組或嵌合蛇毒金屬蛋白酶基因，是具有序列1所示的核苷酸 或堿基序列；該重組蛇毒金屬蛋白酶基因由巴西蛇毒金屬蛋白酶基因的部分 序列和中國皖南尖吻蝮蛇毒金屬蛋白酶基因的部分序列組成，全長共有615 個核苷酸或堿基，編碼205個氨基酸。該嵌合基因序列前面330個堿基來自 巴西蛇毒金屬蛋白酶cDNA的5，端序列，后面285個堿基來自中國皖南尖吻 蝮蛇毒金屬蛋白酶cDNA的3'端序列
該重組蛇毒金屬蛋白酶用表達(dá)載體pET-15b在大腸桿菌中以包涵體的形 式表達(dá)出來；經(jīng)體外復(fù)性后具有對多種蛋白底物的水解活性。所述重組蛇毒金屬蛋白酶基因在大腸桿菌中的表達(dá)、復(fù)性及其活性測定 方法，包括以下步驟(a) 以巴西蛇毒金屬蛋白酶基因與皖南尖吻蝮蛇毒金屬蛋白酶基因為 模板或材料，通過PCR (聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))技術(shù)構(gòu)建重組或嵌合蛇毒金屬蛋 白酶基因。(b) 在大腸桿菌中以包涵體的形式表達(dá)該重組蛇毒金屬蛋白酶，以及 包涵體的純化過程。(c )重組蛇毒金屬蛋白酶包涵體的溶解和重組蛇毒金屬蛋白酶的體外 復(fù)性過程。(d)重組蛇毒金屬蛋白酶的蛋白水解活性測定。該重組蛇毒金屬蛋白酶具有蛋白水解活性，能降解纖維蛋白原，明膠， 纖粘連蛋白，層粘連蛋白和酪蛋白。所以，該重組蛇毒金屬蛋白酶具有潛在的應(yīng)用價值。如該酶可用于制備水解明膠或多肽。隨著國內(nèi)對多肽研究不 斷深入，從酪蛋磷酸肽、白蛋白多肽、大豆多肽、玉米多肽到水解明膠，越 來越多的功能性多肽產(chǎn)品及添加有多肽的產(chǎn)品被推向市場。因此，該發(fā)明具 有極大的市場應(yīng)用潛力。說明書附1是用PCR技術(shù)構(gòu)建重組蛇毒金屬蛋白酶基因的原理示意圖；圖2為用12%的還原SDS-PAGE檢測重組金屬蛋白酶的表達(dá)試驗結(jié)果圖；圖3為8%的還原SDS-PAGE檢測復(fù)性后的重組蛇毒金屬蛋白酶對明膠的降解 試驗l結(jié)果圖4為8%的還原SDS-PAGE檢測復(fù)性后的重組蛇毒金屬蛋白酶對明膠的降解 試驗2結(jié)果圖；圖5為10%的還原SDS-PAGE檢測復(fù)性后的重組蛇毒金屬蛋白酶對纖維蛋白原 的降解試驗結(jié)果圖；圖6為8%的還原SDS-PAGE檢測復(fù)性后的重組蛇毒金屬蛋白酶對纖粘連蛋白 的降解試驗結(jié)果圖；圖7為8%的還原SDS-PAGE檢測復(fù)性后的重組蛇毒金屬蛋白酶對層粘連蛋白 的降解試驗結(jié)果圖。
具體實施方式
一種新的重組蛇毒金屬蛋白酶基因，由巴西蛇毒金屬蛋白酶基因的部分 序列和中國皖南尖吻蝮蛇毒金屬蛋白酶基因的部分序列組成，全長共有615 個核苷酸或堿基，編碼205個氨基酸。該基因序列前面330個堿基來自巴西 蛇毒金屬蛋白酶cDNA的5'端序列，后面285個堿基來自中國皖南尖吻蝮蛇 毒金屬蛋白酶cDNA的3，端序列。在大腸桿菌中表達(dá)的該重組蛇毒金屬蛋白 酶經(jīng)體外復(fù)性后，具有對多種蛋白底物的水解活性。所述重組蛇毒金屬蛋白酶基因在大腸桿菌中的表達(dá)、體外復(fù)性及其活性 測定方法，包括以下步驟(a)以已公開發(fā)表的巴西非出血蛇毒金屬蛋白酶的基因與皖南尖吻蝮蛇 毒出血金屬蛋白酶的基因為模板或材料，通過PCR (聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))技術(shù) 構(gòu)建了一種新的重組(或嵌合)蛇毒金屬蛋白酶基因。用PCR技術(shù)構(gòu)建蛇毒金屬蛋白酶的原理圖如

圖1所示，以巴西蛇毒金屬 蛋白酶基因為模板，Pl和P2作引物，將巴西蛇毒蛋白酶基因靠近5'端的 編碼區(qū)擴(kuò)增出來，即得到巴西蛇毒基因的5'端片段。同理，以中國皖南蝮 蛇毒蛋白酶基因為模板，P3和P4作引物，將皖南蝮蛇毒蛋白酶基因的3'
端編碼區(qū)片段擴(kuò)增出來。由于引物P2和P3的5'端有部分序列互補(bǔ)，所 以，當(dāng)把擴(kuò)增出來的兩個基因片段混合后，巴西蛇毒基因片段的其中一條鏈 的3'端將和皖南蝮蛇毒基因片段中一條鏈的3'端互補(bǔ)，形成可延伸的部 分互補(bǔ)的嵌合雙鏈基因。然后，再以引物Pl和P4進(jìn)行PCR，就能將全長嵌 合基因擴(kuò)增出來。圖中空白框為巴西蛇毒金屬蛋白酶基因，黑色框為中國皖 南蝮蛇毒金屬蛋白酶基因。50 ul PCR反應(yīng)體系(反應(yīng)管)中含有引物 P1/P2或P3/P4;模板為巴西蛇毒蛋白酶基因或皖南蝮蛇毒蛋白酶基因；4種 dNTP(即4種脫氧核糖核苷酸，每種2. 5畫1/L,各1 u 1); 5 u 1的10X DNA聚合酶緩沖液；3 — 5u高保真Taq DNA聚合酶。擴(kuò)增程序如下94。C預(yù) 變性5分鐘后進(jìn)行以下循環(huán)93°C 1分鐘，55°C 1分鐘，72°C 1分鐘。28 個循環(huán)后，72t:再延伸5分鐘。4條引物(Pl， P2， P3和P4)的堿基序列分別是Pl: 5'-cgc cat atg gaa caa caa gga ttc cc-3' ; P2: 5'-tac agt gtc tcc atc aaa-3'; P3: 5，-ttt gat gga gac act gta gga ttg get tac gtg-3， ； P4: 5，-ccc gga tec tea ggg ttt att gag aat gca agg-3' 。 cat atg為甜e I的酶切 位點，gga tcc為^a威I的酶切位點。(b)將重組蛇毒金屬蛋白酶在大腸桿菌中以包涵體的形式表達(dá)出來，以 及包涵體的純化過程。按常規(guī)的分子克隆技術(shù)，將上述重組金屬蛋白酶基因定向克隆在PET-15b載體的Abfe I和^rfl位點之間，將得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌 5Zi7(DE3)中。其中pET-15b為商業(yè)化的質(zhì)粒DNA載體，用于在大腸桿菌中表達(dá)外源基因，載體上含有多克隆位點，可供外源基因插入。載體上的多克 隆位點其實就是特定的一小段DNA順序或核苷酸順序。為了將外源基因插 入，通常需先用限制性內(nèi)切酶(如^/e I和Aa/^I等)將載體切開，然后
把經(jīng)同樣內(nèi)切酶處理的外源基因與載體連接，即將外源基因克隆進(jìn)去了。連 接后得到的含有外源基因的載體，又常稱為重組載體。在37"C， 220轉(zhuǎn)/分鐘的條件下培養(yǎng)含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌，用IPTG (異丙基硫代半乳糖苷)誘導(dǎo)重組蛋白酶表達(dá)。經(jīng)SDS-PAGE (聚丙烯酰胺凝 膠電泳)，確定重組蛇毒金屬蛋白酶主要以包涵體的形式在大腸桿菌中得到 高效表達(dá)，表達(dá)量占菌體總蛋白的15-25%。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離蛋白的原理是根據(jù)大多數(shù)蛋白都能與陰 離子表面活性劑十二烷基硫酸鈉(SDS)按重量比結(jié)合成復(fù)合物，使蛋白分子所 帶的負(fù)電荷遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過天然蛋白分子的本身的凈電荷，消除了不同蛋白分子的 電荷效應(yīng)，使蛋白在電場中按分子大小(分子量)分離。如果某一蛋白底物 被重組蛋白酶降解或水解，那么，該蛋白底物就會被水解成若干個小分子量 片段，通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳就能分辨出新產(chǎn)生的蛋白片段和底物分 子量的變化。包涵體的純化過程通過3000-5000 g低速離心細(xì)菌培養(yǎng)液，棄上清， 收取細(xì)菌沉淀，用原菌液體積的1/20的緩沖液A溶解并混勻細(xì)菌沉淀，再 用超聲波破碎細(xì)菌。破碎完全后，以8000-10000 g離心10-15分鐘，棄上 清，收取重組蛋白包涵體沉淀，用緩沖液B洗滌包涵體2次，以8000 g離 心后再收取包涵體沉淀。(c )重組蛇毒金屬蛋白酶包涵體的溶解和重組蛇毒金屬蛋白酶的體外 復(fù)性過程用緩沖液C溶解包涵體沉淀，以8000 g離心15分鐘后收取重組 蛋白上清。用緩沖液D稀釋重組蛋白上清，SP:每隔5分鐘往緩沖液D中加 入1/10的重組蛋白，須使稀釋完成后重組蛋白的終濃度不高于0.5 mg/ml，并使稀釋完成后，重組蛋白溶液中尿素或鹽酸胍的終濃度維持在 0.5-1.5 mol/L之間。稀釋完成后，用超濾法對蛋白質(zhì)進(jìn)行濃縮，使蛋白濃 度維持在0.5-2 mg/ml之間。最后，用緩沖液E透析重組蛋白溶液，以使重 組蛋白溶液中尿素的濃度低于20隱ol/L，于4。C或-2(TC保存。
以上實驗步驟所用緩沖液配方如下-超聲波破碎大腸桿菌時所用的緩沖液A: 50腿ol/L Tris-HCI (pH 8. 5) 1% TritonX-100，溶菌酶0.1 mg/ml， 50 mmol/L氯化鈉，1 mmol/L DTT(二 硫蘇糖醇)。洗滌包涵體的緩沖液B: 50 mmol/L Tris-HCI (pH 8.5)， 2mol/L尿 素，0.5% TritonX-100， 100 mmol/L氯化鈉，1 mmol/L DTT。裂解(溶解)包涵體所用的緩沖液C: 50 mmol/L Tris-HCI (pH 8.5)， 8 mol/L尿素(或6 mol/L鹽酸胍)，100 mmol/L氯化鈉，1腿ol/L DTT。在稀釋復(fù)性過程中所使用的緩沖液D: 50 mmol/L Tris-HCI (pH 8.0)， 5%甘油，0. 5 mmol/L還原型谷胱苷肽，0. 2 ramol/L氧化型谷胱苷肽，1-10 umol/L氯化鋅，100 mmol/L氯化鈉，10腿ol/L氯化鉀。透析時所用緩沖液E: 50 mraol/L Tris-HCI (pH 8.0)， 5%甘油，100 mmol/L氯化鈉，10mmol/L氯化鉀，1-10umol/L氯化鋅。 (d)重組蛇毒金屬蛋白酶的蛋白水解活性測定。體外復(fù)性后重組蛋白酶的蛋白水解活性測定方法如下100 nlTris-HCI緩沖液(50 mmol/L， pH 8.0)的反應(yīng)體系中含有蛋白底物和重組蛋白酶 的混合物。測定的蛋白底物分別是明膠，纖維蛋白原，纖粘連蛋白，層粘 連蛋白。反應(yīng)體系中重組酶的濃度為0.05 ug/ul，明膠濃度為10 ug/u 1，其他蛋白底物的濃度為0.5 ug/ul。反應(yīng)溫度為37'C，反應(yīng)時間為8 小時。陰性對照為在大腸桿菌中表達(dá)的沒有酶活性的其他重組蛋白與上述蛋 白底物的混合物。SDS-PAGE (聚丙烯酰胺凝膠電泳)檢測底物是否被降解。 實驗結(jié)果表明，所有這些底物均能被重組的蛇毒金屬蛋白酶降解或水解。 實驗結(jié)果圖解釋如下-圖2中12%的還原SDS-PAGE檢測重組金屬蛋白酶的表達(dá)，第1泳道為 蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，從上到下的條帶分子量大小分別為97.4 kD， 66.2kD， 43 kD， 31 kD， 20.1 kD， 14.4 kD。第2泳道為表達(dá)重組蛋白酶的菌體樣 品，在分子量為26 kD處明顯有重組金屬蛋白酶的表達(dá)，即最粗最濃的那條 帶。第3泳道為包含體純化后重組蛋白酶樣品。圖3中8%的還原SDS-PAGE檢測復(fù)性后的重組蛋白酶對明膠的降解，第 1， 2和7泳道為陰性對照，第3， 4， 5和6泳道為明膠被重組蛇毒金屬蛋白 酶降解后的情況。由于明膠的上樣量太大，所以染色后陰性對照呈現(xiàn)一片藍(lán) 色(黑白照片表現(xiàn)為黑色)。圖4中8%的還原SDS-PAGE檢測復(fù)性后的重組蛋白酶對明膠的降解，第 1， 2， 6， 7， 8和9泳道為明膠陰性對照，第3， 4， 5泳道為明膠被重組蛇 毒金屬蛋白酶降解后的情況。由于明膠的上樣量太大，所以染色后陰性對照 呈現(xiàn)一片藍(lán)色(黑白照片表現(xiàn)為黑色)。圖5中10%的還原SDS-PAGE檢測復(fù)性后的重組蛋白酶對纖維蛋白原的 降解，第1泳道為纖維蛋白原陰性對照，第2泳道為纖維蛋白原被重組蛇毒 金屬蛋白酶降解的情況，第3泳道為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)。圖6中8%的還原SDS-PAGE檢測復(fù)性后的重組蛇毒金屬蛋白酶對纖粘 連蛋白的降解，第4泳道為天然蛇毒金屬蛋白酶對纖粘連蛋白的降解，第5 和6泳道為不同時間重組蛇毒金屬蛋白酶對纖粘連蛋白的降解，其余泳道為 纖粘連蛋白的陰性對照。圖7中8%的還原SDS-PAGE檢測復(fù)性后的重組蛇毒金屬蛋白酶對層粘連 蛋白的降解，第4泳道為層粘連蛋白被重組金屬蛋白酶降解的情況，第5泳 道為天然蛇毒金屬蛋白酶對層粘連蛋白的降解，其余泳道為層粘連蛋白的陰 性對照。
序列表<110>向開軍<210> 1 <211〉 615 <212〉 DNA <213>人工序列<221> CDS<400〉 1gaacaacaaggattccccca aagatacgttgagcttgtcatagttgcgga tcacagaatg 60aacacgaaatacaatggtga ttcagataagataagacaatgggtacatca aattgtcaac120agatttacag acctttgaatattcgattcgcactggttgg cctagaaatt180tggtccaaccaagatttgat taccgtgacatcagtatcacatgatacttt ggcctcattt240ggaaactggagagagacaga cttgctaaggcgccaaagacatgataatgc ccagttactc300acggccattgactttgatgg agacactgtaggattggcttacgtggccag catgtgtgac360ccaaagcgttctgtaggagt tgttcaggatcatagctcagtaaatcattt ggttgccatt420accctggcccatgagattgc tcataatctgggcgttcgtcatgacgaagg ttcctgttct480tgtggtagtggttacacatg cattatgtctcctgtgataaactctgaagt tatcaaatat540ttcagcgattgtagttatat ccaatatcgggagta^tatcgaaggagaa cccaccttgc600attctcaata犯ccc61權(quán)利要求
1、一種新的重組蛇毒金屬蛋白酶基因，其特征在于是具有序列1的核苷酸或堿基序列；該序列前面330個堿基來自巴西蛇毒金屬蛋白酶cDNA的5’端編碼序列，后面285個堿基來自中國皖南尖吻蝮蛇毒金屬蛋白酶cDNA的3’端編碼序列。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的重組蛇毒金屬蛋白酶基因，其特征在 于用表達(dá)載體pET-15b在大腸桿菌中以包涵體的形式表達(dá)了該重組 蛇毒金屬蛋白酶；經(jīng)體外復(fù)性后，該重組蛋白酶具有明顯的蛋白水解 活性。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述重組蛇毒金屬蛋白酶基因在大腸桿 菌中的表達(dá)、復(fù)性及其活性測定方法，其特征在于包括以下步驟(a) 以巴西蛇毒金屬蛋白酶基因與皖南尖吻蝮蛇毒金屬蛋白酶 基因為模板或材料，通過PCR (聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))技術(shù)構(gòu) 建了由這兩種蛇毒金屬蛋白酶基因片段組成的重組(或嵌 合)蛇毒金屬蛋白酶基因；(b) 在大腸桿菌中以包涵體的形式表達(dá)了該重組蛇毒金屬蛋白 酶，以及包涵體的純化過程；(c) 重組蛇毒金屬蛋白酶包涵體的溶解和重組蛇毒金屬蛋白酶 的體外復(fù)性過程；(d) 重組蛇毒金屬蛋白酶的蛋白水解活性測定。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種新的重組或嵌合蛇毒金屬蛋白酶基因，并在大腸桿菌中以包涵體的形式表達(dá)了該重組金屬蛋白酶，經(jīng)體外復(fù)性后，該重組蛋白酶具有對多種蛋白底物的水解活性。本發(fā)明還公開了所述重組蛇毒金屬蛋白酶基因在大腸桿菌中的表達(dá)、復(fù)性和活性測定的實驗方法。該重組蛋白酶能降解纖維蛋白原，明膠，纖粘連蛋白，層粘連蛋白和酪蛋白等。
文檔編號C12N15/57GK101397567SQ200710030709
公開日2009年4月1日 申請日期2007年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月30日
發(fā)明者向開軍 申請人:向開軍