專(zhuān)利名稱(chēng)：一種蛇毒類(lèi)凝血酶蛋白的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種蛇毒類(lèi)凝血酶蛋白的制備方法。
背景技術(shù)：
心腦血管疾病如腦中風(fēng)、冠心病以及外周血管血栓等嚴(yán)重影響人們生活質(zhì)量、并造成沉重經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。作為自然界的野生資源之一，毒蛇毒液中含有許多生物活性多肽和蛋白質(zhì)，包括對(duì)機(jī)體循環(huán)系統(tǒng)有重要影響的組分。利用蛇毒研制開(kāi)發(fā)新的治療血栓的藥物，成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)之一?；谔烊簧叨举Y源以及產(chǎn)品純度方面的限制，單純依靠改進(jìn)工藝已經(jīng)不能滿(mǎn)足需要，而通過(guò)現(xiàn)代基因工程技術(shù)可獲得大量的蛇毒重組蛋白，這也符合現(xiàn)代生物藥物的發(fā)展趨勢(shì)。同時(shí)隨著地區(qū)城市化及農(nóng)村經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，蛇類(lèi)棲息地受到越來(lái)越多的破壞，有些蛇類(lèi)也許在我們獲得其基因信息之前就滅絕了。利用寶貴的蛇毒資源造福人類(lèi)，是具有廣泛應(yīng)用前景。在蝰亞科、蝮亞科等蛇類(lèi)蛇毒中含有能直接溶解纖維蛋白或纖維蛋白原的酶，如纖維蛋白(原)溶酶(簡(jiǎn)稱(chēng)纖溶酶)(Fibrinolytic enzyme)、類(lèi)凝血酶(Thrombin-Iike enzyme)。纖溶酶可以作用于纖維蛋白和纖維蛋白原的A α和Ββ亞基，將纖維蛋白和纖維蛋白原水解成片段而可起到抗凝、溶栓作用。類(lèi)凝血酶可以水解纖維蛋白原的A鏈或 B鏈，且不激活XIII因子，因此產(chǎn)生了非交聯(lián)的可溶性纖維蛋白單體，使其不能形成血栓， 同時(shí)可以大量消耗纖維蛋白原而達(dá)到抗凝效果。臨床上已經(jīng)應(yīng)用的類(lèi)凝血酶有Ancrod、 Crotalase λ Batroxb in λ Flavoxob in λ Bothromb in 及 Defibrase 等。有的類(lèi)凝血酶除有抗凝血活性外還有其它活性如出血活性、神經(jīng)毒性等。研究表明蝮蛇纖溶酶和類(lèi)凝血酶是一組蛋白水解酶的混合體。由于各種抗凝組分的理化性質(zhì)比較接近，給分離提純工作帶來(lái)一定的困難。目前對(duì)蛇毒蛋白的分離純化方法是利用色譜技術(shù)獲得單一組分，然后通過(guò)不同的生化實(shí)驗(yàn)來(lái)確定所得蛋白組分的生物學(xué)特性。拋開(kāi)煩瑣的蛋白質(zhì)純化不言，就是確定所得蛋白的生化特性也頗為困難。因此有必要應(yīng)用基因工程方法，來(lái)獲得具有重要生物活性的蛇毒蛋白。

發(fā)明內(nèi)容
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種利用生物工程方法制備出具有活性的蛇毒類(lèi)凝血酶。本發(fā)明提供了上述方法制備的類(lèi)凝血酶蛋白在制備治療心血管疾病藥物中的應(yīng)用。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種蛇毒類(lèi)凝血酶蛋白的制備方法，包括如下步驟1)制備蛇毒類(lèi)凝血酶基因；所述的蛇毒類(lèi)凝血酶基因如SEQ ID NO=I所示；2)將蛇毒類(lèi)凝血酶基因克隆入質(zhì)粒載體中，構(gòu)建原核表達(dá)載體；3)用原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌；
4)挑取含表達(dá)載體的單克隆菌株在37°C下過(guò)夜振蕩培養(yǎng)至A600 = 0. 6-0. 8，加異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷至終濃度為0. 7mmol/L，18°C振蕩培養(yǎng)8小時(shí)，誘導(dǎo)表達(dá)蛇毒類(lèi)凝血酶蛋白；5)收集菌體，-80°c凍存；重新取出菌體，加入裂解液，攪勻，冰上超聲破菌；6)在4°C，SOOOg下離心10分鐘，收集上清，進(jìn)一步純化制備類(lèi)凝血酶蛋白。所述的蛇毒類(lèi)凝血酶基因是通過(guò)下述方法獲得的a)小心分離新鮮蛇毒毒腺，提取組織RNA，并進(jìn)一步提取分離m RNA,反轉(zhuǎn)錄獲得 cDNA ；b)cDNA雙鏈進(jìn)行末端補(bǔ)平，補(bǔ)平后的cDNA末端加上EcoR I和Hind III酶切位占.c)已加酶切位點(diǎn)的cDNA雙鏈片段用EcoR I和Hind III限制性?xún)?nèi)切酶酶切，酶切片段連入T7載體，連接產(chǎn)物加入到包裝蛋白中進(jìn)行噬菌體體外包裝；d)以纖維蛋白原作為特異性底物淘選噬菌體將纖維蛋白原稀釋至濃度為 10 μ g/ml，用封閉液將其包被在ELISA板上；包被好的ELISA板，每孔加入包裝好的噬菌體 100 μ 1，室溫孵育2小時(shí)；用TBST溶液洗板5次，加洗脫液在室溫孵育20分鐘，從ELISA板上洗脫噬菌體，完成第一輪淘選；再按上述方法以第一輪淘選噬菌體為基礎(chǔ)，再進(jìn)行兩輪淘選，獲得強(qiáng)親和性的含目的基因的噬菌體群；e)從上述噬菌體群中分離培養(yǎng)單個(gè)的噬菌體，以SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4為引物，PCR擴(kuò)增獲得蛇毒類(lèi)凝血酶基因。本發(fā)明提供的技術(shù)方案具有如下的優(yōu)點(diǎn)1.傳統(tǒng)cDNA文庫(kù)以帶有PolyA的mRNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈。cDNA 第二條鏈合成可通過(guò)自身引導(dǎo)法或置換合成法或引導(dǎo)合成法，通過(guò)分級(jí)分離去除小分子 dscDNA并對(duì)其進(jìn)行修飾，切平端，接上接頭或銜接頭，磷酸化后，克隆到能在細(xì)菌中擴(kuò)增的載體中。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，cDNA文庫(kù)的構(gòu)建方法有了很大的改進(jìn)。但傳統(tǒng)cDNA文庫(kù)仍存在不足第一，低豐度表達(dá)序列在文庫(kù)中出現(xiàn)的幾率很低，因此，要想得到低豐度表達(dá)基因，至少要篩選106克?。坏诙?，構(gòu)建傳統(tǒng)cDNA文庫(kù)所需的mRNA量大，達(dá)數(shù)微克第三， 篩選傳統(tǒng)cDNA文庫(kù)的工作復(fù)雜，需要很長(zhǎng)時(shí)間，限制了基因克隆的速度。基于上述原因我們選擇了 T7噬菌體cDNA文庫(kù)，T7噬菌體比傳統(tǒng)的Ml3噬菌體更為有效、便利，使噬菌體展示所用的載體得到了擴(kuò)展，而且已經(jīng)得到了很好的應(yīng)用，與傳統(tǒng)的M13相比，T7克服了絲狀噬菌體只能通過(guò)穿膜分泌展示蛋白的局限性，使文庫(kù)的信息量更大，同時(shí)具有噬菌體穩(wěn)定性好、篩選周期短等優(yōu)點(diǎn)。T7能夠展示低拷貝數(shù)(0. 1-1拷貝每一個(gè)噬菌體)的、大片段的、最長(zhǎng)1200個(gè)氨基酸的肽或蛋白，也可以展示高拷貝數(shù)015拷貝每一個(gè)噬菌體)大小為50個(gè)氨基酸的肽或蛋白。T7能夠比絲狀噬菌體或者λ噬菌體更容易生長(zhǎng)、復(fù)制。在感染到宿主菌1-2小時(shí)后就能夠形成培養(yǎng)物溶解，37°C 3小時(shí)內(nèi)形成噬菌斑，T7能夠在很艱難的環(huán)境下生長(zhǎng)，因而擴(kuò)大了在下一步篩選的過(guò)程中可以使用的試劑成分，在噬菌體肽庫(kù)中，由于呈現(xiàn)在噬菌體表面的多肽已經(jīng)事先與某種外殼蛋白的N端連接，因而可以在預(yù)先不知道多肽結(jié)構(gòu)的情況下，利用ELISA等技術(shù)檢測(cè)噬菌體與靶分子的親和力，從包含上億種噬菌體的肽庫(kù)內(nèi)進(jìn)行高效篩選同時(shí)富集特異的融合型多肽。篩選出的噬菌體克隆可通過(guò)再次感染細(xì)菌得到擴(kuò)增，所呈現(xiàn)多肽的相應(yīng)結(jié)構(gòu)和功能信息，可以通過(guò)對(duì)陽(yáng)性噬菌體克隆的DNA測(cè)序獲得。本發(fā)明首次構(gòu)建了尖吻蝮蛇毒腺的T7噬菌體展示文庫(kù)，建立了以纖維蛋白原為底物來(lái)篩選蛇毒毒腺T7噬菌體展示文庫(kù)的淘選方法，經(jīng)過(guò)三輪親和淘選，得到了一個(gè)新的類(lèi)凝血酶基因，測(cè)序鑒定，BLAST同源性搜索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與已知的類(lèi)凝血酶家族核酸與氨基酸序列相似程度很高，GenBank登陸號(hào)AY861138. 1。此類(lèi)凝血酶有完整的開(kāi)放閱讀框和終止密碼子，編碼260個(gè)氨基酸。2.類(lèi)凝血酶融合表達(dá)后怎樣純化蛋白是現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，很多文獻(xiàn)中得到的蛋白是以包涵體形式存在，再經(jīng)純化、酶切、重折疊等，蛋白的活性會(huì)大大下降。本發(fā)明用融合表達(dá)，而且是上清表達(dá)的方式得到了重組類(lèi)凝血酶蛋白。我們構(gòu)建了 pET-32 (a) -TLE原核表達(dá)系統(tǒng)，在克隆時(shí)保留N端 χ-Tag和6個(gè)His-Tag兩個(gè)標(biāo)簽，之后在克隆位點(diǎn)插入蛇毒類(lèi)凝血酶基因(TLE基因)并在其3端加入終止密碼子。轉(zhuǎn)化大腸桿菌E. coliBL21 (DE;3)pLysE，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，18°C下表達(dá)(區(qū)別于其他表達(dá)系統(tǒng)溫度)，全菌破菌后發(fā)現(xiàn)重組類(lèi)凝血酶表達(dá)量達(dá)到30%以上，運(yùn)用HPLC等方法純化得到了純度95%以上的重組類(lèi)凝血酶，通過(guò)重組類(lèi)凝血酶的生物學(xué)功能檢測(cè)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其具有很好的生物學(xué)活性。


圖1 尖吻蝮蛇蛇毒毒腺T7噬菌體展示文庫(kù)。原始庫(kù)滴度為IO6級(jí)，PCR鑒定證實(shí)能夠得到大小不一 PCR片段，符合文庫(kù)構(gòu)建要求。圖2 噬菌體文庫(kù)的淘選示意3 尖吻蝮蛇蛇毒類(lèi)凝血酶基因序列表圖4 尖吻蝮蛇蛇毒類(lèi)凝血酶基因(以TLE2示)與其它幾種類(lèi)凝血酶的氨基酸序列同源性比較圖5 尖吻蝮蛇蛇毒類(lèi)凝血酶各基團(tuán)的親/疏水活性分析結(jié)果圖6 同源模建，尖吻蝮蛇蛇毒類(lèi)凝血酶跟其它類(lèi)凝血酶模型比較，其有三個(gè)結(jié)構(gòu)域，信號(hào)肽，類(lèi)胰島素絲氨酸蛋白酶，內(nèi)在的結(jié)構(gòu)，從第M個(gè)氨基酸到第246個(gè)氨基酸之間是類(lèi)凝血酶的功能區(qū)圖7 尖吻蝮蛇蛇毒類(lèi)凝血酶基因原核表達(dá)質(zhì)粒pET-32 (a) -TLE的構(gòu)建流程。圖8 低溫誘導(dǎo)表達(dá)尖吻蝮蛇蛇毒類(lèi)凝血酶蛋白結(jié)果。圖中M為蛋白分子量Maker， 1為誘導(dǎo)前，2為誘導(dǎo)后。圖9 尖吻蝮蛇蛇毒類(lèi)凝血酶蛋白HPLC純化結(jié)果。圖10 尖吻蝮蛇蛇毒類(lèi)凝血酶蛋白純化后的Western分析結(jié)果。圖中M為蛋白分子量Maker，泳道1的綠色熒光為類(lèi)凝血酶蛋白圖11 尖吻蝮蛇蛇毒類(lèi)凝血酶凝血活性。最少為4. 4 μ g的重組類(lèi)凝血酶能使正常人的血漿0. 2ml在65秒鐘凝固；隨著加入的重組類(lèi)凝血量的增加，凝固時(shí)間呈下降趨勢(shì)； 當(dāng)重組類(lèi)凝血酶的達(dá)到10. 5μ g以上后凝固時(shí)間基本保持不變。圖12 重組尖吻蝮蛇蛇毒類(lèi)凝血酶纖維蛋白原水解活性。M為蛋白Maker，對(duì)照為纖維蛋白原(sigma公司，美國(guó))，其余三個(gè)泳道為三個(gè)時(shí)間段重組類(lèi)凝血酶與纖維蛋白的作用結(jié)果。
具體實(shí)施例方式尖吻蝮蛇是我國(guó)特有的一種蝰蛇科蛇種，為了得到蛇毒毒液中的抗凝血蛋白組分，本發(fā)明構(gòu)建了尖吻蝮蛇毒腺的T7噬菌體展示文庫(kù)。以纖維蛋白原作為特異性底物，通過(guò)生物學(xué)淘選的方法來(lái)淘選噬菌體。經(jīng)過(guò)三輪 “吸附一洗脫一擴(kuò)增”，遞呈特異多肽的噬菌體得到了高度富集，篩選到了特異性結(jié)合的噬菌體。由此建立了使用纖維蛋白/纖維蛋白原淘選抗凝組分的方法在固相介質(zhì)(ELISA 板)上包被纖維蛋白原后，洗去非特異性結(jié)合的噬菌體后，將特異性結(jié)合的噬菌體洗脫下來(lái)進(jìn)行下一輪淘選，經(jīng)過(guò)三輪“吸附一洗脫一擴(kuò)增”，富集了特異性結(jié)合的噬菌體。噬菌體洗脫后用PCR方法來(lái)擴(kuò)增目的基因并測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)Blast比對(duì)，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與Genebank Accession Number為AF159060的類(lèi)凝血酶基因同源性達(dá)到97%的新的尖吻蝮蛇蛇毒類(lèi)凝血酶基因，如SEQ ID N0:1所示，基因長(zhǎng)78;3bp，編碼260個(gè)氨基酸，如SEQ ID NO 2所示，GenBankAccessionNumber為AY861138。分析此凝血酶基團(tuán)的親疏水性，發(fā)現(xiàn)具有明顯的親水性。同源建模分析，發(fā)現(xiàn)其具有三個(gè)結(jié)構(gòu)域信號(hào)肽，類(lèi)胰島素絲氨酸蛋白酶，內(nèi)在結(jié)構(gòu)域。為了用基因工程的方法表達(dá)制備類(lèi)凝血酶蛋白，本發(fā)明構(gòu)建了原核融合表達(dá)系統(tǒng)，選用了 Novagen公司的pET-32(a)-c(+)質(zhì)粒作為載體，轉(zhuǎn)入Ε. coli BL21(DE3) PLysE (Novagen公司，德國(guó))中，在濃度為0. 7mmol/L的IPTG (異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷，sigma公司，美國(guó))和溫度18°C條件下誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，得到了高效融合表達(dá)的類(lèi)凝血酶，進(jìn)一步純化得到了純度95 %以上的重組類(lèi)凝血酶蛋白。在上述適宜濃度IPTG和適宜溫度誘導(dǎo)下，大大降低了類(lèi)凝血酶蛋白的包涵體表達(dá)，利于后續(xù)簡(jiǎn)便快捷地純化蛋白。通過(guò)體外凝血和纖維蛋白原降解實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)所獲蛋白的活性，發(fā)現(xiàn)得到的蛋白具有很好的抗凝血活性，為后續(xù)大規(guī)模生產(chǎn)和制備治療心血管疾病藥物奠定了基礎(chǔ)。以下本文將通過(guò)具體的實(shí)施例來(lái)描述發(fā)明。如未特別指明之處，可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的《分子可隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版)(Cold Spring Harbor laboratory I^ess)、《細(xì)胞實(shí)驗(yàn)指南》(科學(xué)出版社，北京，中國(guó)，2001年)、《RNA實(shí)驗(yàn)技術(shù)手冊(cè)》(科學(xué)出版社，北京，中國(guó)，2004年)、《免疫檢測(cè)技術(shù)》(科學(xué)出版社，北京，中國(guó)，1991)等實(shí)驗(yàn)手冊(cè)以及本文所引用的參考文獻(xiàn)中所列方法來(lái)實(shí)施，正如在本文完整引用一樣。除非特別說(shuō)明，各實(shí)施步驟及方法按照所用試劑盒使用說(shuō)明進(jìn)行，所涉及的百分比單位為重量百分比，份數(shù)比為重量份數(shù)比。實(shí)施例1 尖吻蝮蛇毒腺噬菌體展示文庫(kù)構(gòu)建尖吻蝮蛇毒腺噬菌體展示文庫(kù)構(gòu)建示例性地采用如下技術(shù)方案1.蝮蛇蛇毒毒腺RNA的提取小心分離新鮮廣西尖吻蝮蛇蛇毒毒腺，剝離肌肉組織后稱(chēng)重(約0. 18-0. 20mg/ 個(gè))，于_80°C保存。將尖吻蝮蛇蛇毒毒腺組織置于液氮預(yù)冷的研缽中，小心研磨至粉末狀。Mj^ffiTrizolti(CHC)MCZYNSKI P. A reagent for the single2step simultaneous isolation of RNA, DNA andproteins from cell and tissue samples[J]. Bio Techniques, 1993，15 :53225371)提取組織RNA。取2μ 1 RNA，稀釋25倍后，在紫外分光光度計(jì)下測(cè)260nm和^Onm波長(zhǎng)下的OD值，計(jì)算提取的總RNA的濃度。用DEPC (焦碳酸二乙酯)水配制的IXTAE制備的1. 0%瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)所獲得的RNA的完整性。2.尖吻蝮蛇毒腺mRNA的提取分離選用 Novagen 公司的 Straight A，s mRNA Isolation system 試劑盒來(lái)提取分離 m RNA。最后用25 μ 1的DEPC水溶解得到mRNA。3.尖吻蝮蛇毒腺mRNA反轉(zhuǎn)錄cDNA取第2步提純的mRNA4 μ g，以O(shè)ligodT作為引物，用Novagen公司的Orient ExpressRandom Primer cDNA Synthesis Kits 試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。4. cDNA雙鏈進(jìn)行末端補(bǔ)平補(bǔ)平反應(yīng)體系取22 μ 1上述合成的cDNA雙鏈，3 μ IlOXFlush Buffer, 1. 5μ 1 100mMDTT,0. 3 μ 1 IOmM dNTP mix, 1. 5U T4DNA 連接酶。5. cDNA末端加上酶切位點(diǎn)。反應(yīng)體系，在PCR管中，加入以下成分10 μ 1上述末端補(bǔ)平的cDNA，2 μ 1 IOXligation Buffer, 2 μ 1 ImM ATP, 2 μ 1 Directional EcoR I/Hind III Linkers, 5 μ 1 T4Polynucleotidekinase,1. 5 μ 1 Nuclease-free water。6.已加酶切位點(diǎn)的DNA雙鏈片段用EcoR I和Hind III限制性?xún)?nèi)切酶酶切。7.第6步的酶切片段連入T7載體。8.噬菌體體外包裝。5 μ 1的連接產(chǎn)物加入到25 μ 1的包裝蛋白中，用槍頭緩慢混勻。22°C室溫下，孵育 2小時(shí)。轉(zhuǎn)移至已消毒的1.5ml EP管中，用含有羧卞青霉素濃度為40 μ g/ml的LB液終止包裝反應(yīng)。9.測(cè)定包裝好的噬菌體的滴度，結(jié)果如圖1。5支滅菌好的15ml管中，每管加入100 μ 1不同稀釋度的噬菌體液、250 μ 1新?lián)u好的細(xì)菌、3ml預(yù)熱并保溫55°C的頂層瓊脂，迅速搖勻后，倒入至保溫37°C的LB板中。待冷卻后，倒放在37°C隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱，孵育4小時(shí)。取出各平皿，取可見(jiàn)噬菌斑的稀釋度最低的平皿，計(jì)數(shù)噬菌斑。滴度=噬菌斑個(gè)數(shù)XlOX稀釋度。原始庫(kù)滴度為IO6級(jí)，PCR鑒定證實(shí)能夠得到大小不一 PCR片段，符合文庫(kù)構(gòu)建要求。10.尖吻蝮蛇蛇毒毒腺噬菌體文庫(kù)的淘選(參見(jiàn)圖2)。(1)用去離子水沖洗ELISA板數(shù)次，去除孔多余的水分。(2)用TBS將靶蛋白纖維蛋白原(Fibrinogen)稀釋?zhuān)蛊錆舛葹?0 μ g/ml。(3)每孔中加入100μ 1稀釋的靶蛋白，4°C過(guò)夜，將孔封閉好防止液體揮發(fā)。(4)使用IXTBS洗去未結(jié)合的蛋白質(zhì)，300μ1/次，洗三次。(5)用去離子水把封閉液(Blocking Reagent)稀釋到5 %，每孔中添加溶液 200 μ 1。(6)板子放在4 °C過(guò)夜。(7)用去離子水洗板5次，每次200 μ 1/孔，包被板子放在4°C保存。(8)包被好的ELISA板中，每孔加入步驟8中的噬菌體100 μ 1，室溫孵育2小時(shí)。⑶)用TBST溶液洗板5次，每次200 μ 1/孔，稍加孵育，將液體甩出，用紙巾把殘余液珠吸出。(10)加200 μ 1 Τ7洗脫緩沖液(Elution Buffer)在室溫孵育20分鐘，從ELISA 板上洗脫噬菌體。(11)將洗脫的噬菌體轉(zhuǎn)移到一個(gè)15ml離心管中。(12)將250 μ L洗脫的噬菌體添加到50ml 0D_為0. 8的BLT5403細(xì)菌中，37°C培養(yǎng)1-3小時(shí)，直至觀察到裂解的發(fā)生。(13)將裂解液轉(zhuǎn)移到50ml的干凈離心管中，8000g離心10分鐘，將上清轉(zhuǎn)移至一個(gè)滅菌的管中，第一輪淘選結(jié)束，4°C保存到下一輪淘選。(14)再按上述方法以第一輪淘選為基礎(chǔ)，再進(jìn)行兩輪淘選，得到的噬菌體4°C保存，或者加入0. 1倍體積的80%的甘油，保存于-80°c。尖吻蝮蛇T7噬菌體展示文庫(kù)經(jīng)3輪親和淘選后，獲得強(qiáng)親和性的含目的基因的噬菌體群。實(shí)施例2 尖吻蝮蛇蛇毒類(lèi)凝血酶基因序列和蛋白結(jié)構(gòu)分析1.尖吻蝮蛇蛇毒類(lèi)凝血酶基因的獲得。(1)按前述方法，3輪篩選后的噬菌體液用LB液體培養(yǎng)基1 IO8稀釋后，取 100 μ 1噬菌體液、250 μ 1新?lián)u好的BLTM03細(xì)菌(Novagen公司，德國(guó))，3ml保溫55°C的頂層瓊脂，混勻后立刻倒入鋪有LB的平皿中，冷卻后，37°C溫箱孵育2小時(shí)?？梢?jiàn)有單個(gè)的噬菌斑形成。(2)從LB上把單個(gè)的噬菌斑刮下來(lái)，放入EP管中，加入100 μ IlOmM EDTA (乙二胺四乙酸二鈉)，PH 8.0的溶液。(3)渦旋離心管，65°C加熱10分鐘。(4)冷卻至室溫，14000g離心3分鐘。(5)吸上清做PCR，首先在80°C下，酶熱啟動(dòng)三分鐘；94°C 50sec，50°C lmin, 72°C lmin 35cycles ；72°C 6min。PCR反應(yīng)體系如下
權(quán)利要求
1.一種蛇毒類(lèi)凝血酶蛋白的制備方法，其特征在于包括如下步驟(1)制備蛇毒類(lèi)凝血酶基因a)小心分離新鮮蛇毒毒腺，提取組織RNA，并進(jìn)一步提取分離mRNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA；b)cDNA雙鏈進(jìn)行末端補(bǔ)平，補(bǔ)平后的cDNA末端加上EcoR I和Hind III酶切位點(diǎn)；c)已加酶切位點(diǎn)的cDNA雙鏈片段用EcoRI和Hind III限制性?xún)?nèi)切酶酶切，酶切片段連入T7載體，連接產(chǎn)物加入到包裝蛋白中進(jìn)行噬菌體體外包裝；d)以纖維蛋白原作為特異性底物淘選噬菌體將纖維蛋白原稀釋至濃度為10yg/ml， 用封閉液將其包被在ELISA板上；包被好的ELISA板，每孔加入包裝好的噬菌體100 μ 1，室溫孵育2小時(shí)；用TBST溶液洗板5次，加洗脫液在室溫孵育20分鐘，從ELISA板上洗脫噬菌體，完成第一輪淘選；再按上述方法以第一輪淘選噬菌體為基礎(chǔ)，再進(jìn)行兩輪淘選，獲得強(qiáng)親和性的含目的基因的噬菌體群；e)從上述噬菌體群中分離培養(yǎng)單個(gè)的噬菌體，以SEQID NO :3和SEQ ID NO :4為引物， PCR擴(kuò)增獲得蛇毒類(lèi)凝血酶基因，如SEQ ID NO 1所示；(2)將蛇毒類(lèi)凝血酶基因克隆入質(zhì)粒載體中，構(gòu)建原核表達(dá)載體；(3)用原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌；(4)挑取含表達(dá)載體的單克隆菌株在37°C下過(guò)夜振蕩培養(yǎng)至A600= 0. 6-0. 8，加異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷至終濃度為0. 7mmol/L，18°C振蕩培養(yǎng)8小時(shí)，誘導(dǎo)表達(dá)蛇毒類(lèi)凝血酶蛋白；(5)收集菌體，-80°C凍存；重新取出菌體，加入裂解液，攪勻，冰上超聲破菌；(6)在4°C，SOOOg下離心10分鐘，收集上清，進(jìn)一步純化制備類(lèi)凝血酶蛋白。
2.一種克隆獲得蛇毒類(lèi)凝血酶基因的方法，其特征在于包括如下步驟(1)小心分離新鮮蛇毒毒腺，提取組織RNA，并進(jìn)一步提取分離mRNA，反轉(zhuǎn)錄獲得 cDNA ；(2)cDNA雙鏈進(jìn)行末端補(bǔ)平，補(bǔ)平后的cDNA末端加上EcoR I和Hind III酶切位點(diǎn)；(3)已加酶切位點(diǎn)的cDNA雙鏈片段用EcoRI和Hind III限制性?xún)?nèi)切酶酶切，酶切片段連入T7載體，連接產(chǎn)物加入到包裝蛋白中進(jìn)行噬菌體體外包裝；(4)以纖維蛋白原作為特異性底物淘選噬菌體將纖維蛋白原稀釋至濃度為IOyg/ ml，用封閉液將其包被在ELISA板上；包被好的ELISA板，每孔加入包裝好的噬菌體 100 μ 1，室溫孵育2小時(shí)；用TBST溶液洗板5次，加洗脫液在室溫孵育20分鐘，從ELISA板上洗脫噬菌體，完成第一輪淘選；再按上述方法以第一輪淘選噬菌體為基礎(chǔ)，再進(jìn)行兩輪淘選，獲得強(qiáng)親和性的含目的基因的噬菌體群；(5)從上述噬菌體群中分離培養(yǎng)單個(gè)的噬菌體，以SEQID NO :3和SEQ ID NO :4為引物，PCR擴(kuò)增獲得蛇毒類(lèi)凝血酶基因。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種蛇毒類(lèi)凝血酶蛋白的制備方法，首先分離廣西尖吻蝮蛇毒腺組織，構(gòu)建噬菌體展示文庫(kù)，以纖維蛋白/纖維蛋白原為底物，經(jīng)過(guò)三輪淘選，獲得了一個(gè)新的尖吻蝮蛇蛇毒類(lèi)凝血酶基因。本發(fā)明還構(gòu)建了尖吻蝮蛇蛇毒類(lèi)凝血酶基因的原核表達(dá)載體pET-32(a)-TLE，誘導(dǎo)表達(dá)、親和純化和分子篩純化后，獲得了具有生物學(xué)活性的重組蛇毒類(lèi)凝血酶蛋白。該酶可用于制備心血管溶栓藥物。
文檔編號(hào)C12N15/10GK102296055SQ20111024120
公開(kāi)日2011年12月28日 申請(qǐng)日期2011年8月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月22日
發(fā)明者孫樹(shù)漢, 王俊杰, 王凱慧, 胡振林, 陸一鳴, 魏玉保 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)