專利名稱：乙型肝炎疫苗及其制備方法
發(fā)明的所屬領(lǐng)域本發(fā)明涉及衍生于乙型肝炎病毒衣殼蛋白質(zhì)的免疫原性多肽，特別是涉及包括乙型肝炎抗原多個HLA限制性表位的復(fù)合多肽，其制備方法及其作為預(yù)防/治療性乙型肝炎疫苗的應(yīng)用。
發(fā)明的背景乙型肝炎是一種由乙型肝炎病毒(HBV)引起的的病毒性傳染病。在中國、東南亞和熱帶非洲地區(qū)，人群感染率高達(dá)50％-70％，HBV攜帶者高達(dá)8％-15％。其中，中國的HBV攜帶者多達(dá)1億多人，約占我國人口的10％，占全世2億多HBV攜帶者的50％以上。中國的乙型肝炎患者約占所有慢性肝炎患者的80％，而且其中大約有10％的急性乙型肝炎可能轉(zhuǎn)為慢性肝炎、肝硬化或肝癌，因此是嚴(yán)重危害人群健康的傳染病之一。
大規(guī)模乙型肝炎疫苗接種是預(yù)防HBV感染的有效措施，但仍有約10％-20％的乙肝患者對疫苗無反應(yīng)性。目前，除干擾素可使少部分乙肝患者獲得痊愈外，尚沒有其它特效的治療藥物。乙肝治療一直是世界上難以解決的醫(yī)學(xué)及社會難題。因此，開發(fā)同時有治療與預(yù)防作用的HBV疫苗具有重要的理論意義及潛在巨大的經(jīng)濟及社會價值。
Dane等人發(fā)現(xiàn)乙型肝炎病毒在血液中存在三種不同形態(tài)的抗原完整HBV的42μm顆粒，只含病毒外膜結(jié)構(gòu)的22nm顆粒，以及由內(nèi)病毒外膜結(jié)構(gòu)組成的絲狀體。此后，Krugman和Hi lleman等人證明22nm表面抗原顆粒能在猩猩和人體內(nèi)有效地引發(fā)保護性免疫反應(yīng)，進而使用從HBV攜帶者血清中分離的22nm的HBV表面抗原顆粒制備了血源性乙型肝炎疫苗。
二十世紀(jì)八十年代，Rutter等人和Tiollai等人先后在酵母和哺乳動物細(xì)胞中成功表達(dá)了HBV表面抗原，并相繼投入工業(yè)化生產(chǎn)。這些基因重組乙型肝炎疫苗取得了比血源乙型肝炎疫苗更好的免疫效果，為預(yù)防乙型肝炎提供了重要措施。
預(yù)防性疫苗的接種對象是健康人群。作為一種安全可靠的被動免疫因子，預(yù)防性疫苗已在世界范圍內(nèi)廣泛用于傳染病的預(yù)防接種，并在預(yù)防和消除許多傳染病中發(fā)揮了重要作用。相反，治療性疫苗的接種對象則是持續(xù)感染患者或病原體攜帶者。治療性疫苗的使用旨在打破機體的免疫耐受，提高機體特異性免疫應(yīng)答水平。作為一種主動免疫治療因子，治療性疫苗的成分相對比較復(fù)雜，而且可能對機體的免疫系統(tǒng)造成一定的損傷，但其作為傳染病綜合治療中的一種提高免疫力的輔助手段，仍具有廣闊的發(fā)展前景，特別是對于那些迄今尚無有效治療方法的傳染病(例如肝炎和愛滋病等)。因此，針對乙型肝炎防治的現(xiàn)狀，發(fā)展有效的治療/預(yù)防性乙型肝炎疫苗，將具有十分重要的意義。
發(fā)明的目的本發(fā)明的一個目的是提供乙型肝炎病毒免疫原性復(fù)合多肽，特征在于所說的免疫原性多肽包括至少部分HBV前S2區(qū)的氨基酸序列，和分別來自乙型肝炎表面抗原、乙型肝炎核心抗原、HBV DNA聚合酶的其他四個連續(xù)的HLA限制性抗原表位的氨基酸序列。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，所說的復(fù)合多肽還包括一個輔助性T淋巴細(xì)胞表位PADRE的氨基酸序列和一個CpG島核心序列。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的乙型肝炎病毒抗原表位分別是相當(dāng)于乙型肝炎表面抗原前S2區(qū)第1-55位氨基酸的肽片段MetGlnTrpAsnSerThrThrPheHisGlnThrLeuGlnAspProArgValArgGlyLeuThrPheProAlaGlyGlySerSerSerGlyThrValAsnProValProThrThrValSerProIleSerLeuIlePheSerLysIleGlyAspLeuAlaLeuAsn；相當(dāng)于乙型肝炎核心抗原第18-27位氨基酸的肽片段PheLeuProSerAspPhePheProSerVal；相當(dāng)于乙型肝炎核心抗原第141-151位氨基酸的肽片段SerThrLeuProGluThrThrValValArgArg；相當(dāng)于乙型肝炎表面抗原第183-191位氨基酸并且N末端帶有甘氨酸接頭的肽片段PheLeuLeuThrArgIleLeuThrIle；相當(dāng)于乙型肝炎病毒核心抗原第98-106位氨基酸的肽片段IleArgGlnLeuLeuTrpPheHisIle，以及相當(dāng)于乙型肝炎病毒DNA聚合酶第455-463位氨基酸的肽片段GlyLeuSerArgTyrValAlaArgLeu。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，所說的免疫原性肽還可包括具有氨基酸序列AlaLysPheValAlaAlaTrpThrLeuLysAlaAlaAla(SEQ ID NO7)的輔助性T細(xì)胞表位PADRE和具有氨基酸序列AsnVal(SEQ ID NO8)的CpG島核心序列。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，構(gòu)成所說的乙型肝炎病毒免疫原性肽是由上述肽片段以任何排列方式串聯(lián)連接的。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中構(gòu)成所說的乙型肝炎病毒免疫原性肽的每兩個獨立的序列之間均有由一個或多個甘氨酸構(gòu)成的接頭。
本發(fā)明的另一個目的是提供制備如上限定的乙型肝炎病毒免疫原性多肽的方法，該方法包括以下步驟(1)分別分段合成編碼如上限定的氨基酸序列的核苷酸小片段；(2)分步退火連接步驟(1)的核苷酸小片段，得到長度約399bp的全復(fù)合基因序列；(3)將步驟(2)的多核苷酸連接到適當(dāng)?shù)妮d體中；(4)用步驟(3)的重組載體轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞；(5)培養(yǎng)步驟(4)的重組體細(xì)胞，并從培養(yǎng)物上清和細(xì)胞內(nèi)分離所需的乙型肝炎病毒免疫原性多肽。
根據(jù)本發(fā)明方法的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的全復(fù)合基因序列也可以是以一次連續(xù)方法合成的。
根據(jù)本發(fā)明方法的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的小片段長度約10-30個堿基。
根據(jù)本發(fā)明方法的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的載體是質(zhì)粒pWR450-1。
根據(jù)本發(fā)明方法的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的宿主細(xì)胞是大腸桿菌細(xì)胞。
本發(fā)明的再一個目的是提供上述乙型肝炎病毒免疫原性多肽作為治療/預(yù)防性乙型肝炎疫苗的應(yīng)用。
附圖簡要說明

圖1顯示本發(fā)明的治療/預(yù)防性抗原基因HBV-P/T的分步退火拼接方案。
圖2顯示HBV-P/T抗原基因的全序列。
圖3是重組質(zhì)粒pWR450-1/HBV-P/T的構(gòu)建圖。
圖4是重組質(zhì)粒pWR450-1/HBV-P/T的酶切鑒定圖。其中泳道1是100bp的DNA標(biāo)志物；泳道2是BamHI/EcoRI雙酶切的載體質(zhì)粒pWR450-1；泳道3是BamHI/EcoRI雙酶切的重組質(zhì)粒pWR450-1/HBV-P/T；泳道4是載體質(zhì)粒pWR450-1；泳道5是重組質(zhì)粒pWR450-1/P/T。
圖5顯示重組質(zhì)粒pWR450-1/HBV-P/T在大腸桿菌中表達(dá)產(chǎn)物的純化和western-blotting免疫印跡分析。其中泳道1是低分子量蛋白質(zhì)標(biāo)志物；泳道2和3是純化的復(fù)合多肽；泳道4是空載體表達(dá)的β-半乳糖酐酶蛋白。
圖6顯示本發(fā)明的融合多肽和載體蛋白免疫Balb/c小鼠后特異性IgG抗體水平的比較。
圖7顯示以乳酸脫氫酶(LDH)釋放法檢測接種本發(fā)明融合多肽或載體蛋白的Balb/c小鼠的CTL活性比較。
圖8顯示被免疫小鼠體內(nèi)CD4+和CD8+淋巴細(xì)胞亞群的流式細(xì)胞分析。
圖9顯示以RT-PCR方法檢測的被免疫小鼠脾細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子特異性mRNA水平。
發(fā)明的詳細(xì)內(nèi)容本發(fā)明涉及衍生于乙型肝炎病毒衣殼蛋白質(zhì)的免疫原性多肽，特別是涉及包括乙型肝炎抗原的多個HLA限制性表位的重組多肽，其制備方法及其作為預(yù)防/治療性乙型肝炎疫苗的應(yīng)用。
因此，本發(fā)明的一個目的是提供乙型肝炎病毒免疫原性復(fù)合多肽，特征在于所說的免疫原性多肽包括至少部分HBV前S2區(qū)的氨基酸序列，和分別來自乙型肝炎表面抗原、乙型肝炎核心抗原、HBV DNA聚合酶的其他四個連續(xù)的HLA限制性抗原表位的氨基酸序列。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選優(yōu)選實施方案，所說的復(fù)合多肽還包括一個來自乙型肝炎病毒DNA聚合酶的氨基酸序列。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的乙型肝炎病毒抗原表位分別是相當(dāng)于乙型肝炎表面抗原前S2區(qū)第1-55位氨基酸的肽片段MetGlnTrpAsnSerThrThrPheHisGlnThrLeuGlnAspProArgValArgGlyLeuThrPheProAlaGlyGlySerSerSerGlyThrValAsnProValProThrThrValSerProIleSerLeuIlePheSerLysIleGlyAspLeuAlaLeuAsn；相當(dāng)于乙型肝炎核心抗原第18-27位氨基酸的肽片段PheLeuProSerAspPhePheProSerVal相當(dāng)于乙型肝炎核心抗原第141-151位氨基酸的肽片段SerThrLeuProGluThr ThrValValArgArg；相當(dāng)于乙型肝炎表面抗原第183-191位氨基酸的肽片段PheLeuLeuThrArgIleLeuThrIle；相當(dāng)于乙型肝炎病毒核心抗原第98-106位氨基酸的肽片段IleArgGlnLeuLeuTrpPheHisIle，以及相當(dāng)于乙型肝炎病毒DNA聚合酶第455-463位氨基酸N末端的肽片段GlyLeuSerArgTyrValAlaArgLeu。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，所說的免疫原性肽還可包括氨基酸序列AlaLysPheValAlaAlaTrpThrLeuLysAlaAlaAla的輔助性T細(xì)胞表位PADRE和具有氨基酸序列AsnVal的CpG島核心序列。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，構(gòu)成所說的乙型肝炎病毒免疫原性肽是由上述肽片段以任何排列方式串聯(lián)連接的，并且每兩個獨立的序列之間均有由一個或多個甘氨酸構(gòu)成的接頭。
眾所周知，蛋白質(zhì)抗原的免疫原性主要是通過表位體現(xiàn)的。這里，所說的“抗原表位”是指有特定基因組區(qū)域編碼的至少6個連續(xù)的氨基酸(例如，HBV前S2抗原表位是指由HBV基因組的前S2區(qū)域編碼的至少6個連續(xù)的氨基酸)。在表位水平上對抗原性的認(rèn)識已促成這樣一種趨勢基于抗原分子的免疫干預(yù)手段已不再停留于病原體或天然抗原整體分子水平而開始向表位水平過渡。現(xiàn)代保護性免疫理論認(rèn)為有效的保護性免疫取決于一組表位的合理組合與搭配(Rabinovich NR，et al.，Science2651401，1994)HBV慢性感染的直接原因是感染者不能針對HBV抗原的攻擊產(chǎn)生迅速有效的細(xì)胞免疫應(yīng)答。因此，引發(fā)并提高病人的細(xì)胞免疫應(yīng)答能力，是化學(xué)治療以外的一個重要治療策略(Chisari FV，et al. 1997J ClinInvest.99(7)1472-1477；Bocher WO，et al. 2000Hepatology.31(2)480-487)。由于慢性HBV感染者的免疫系統(tǒng)對HBV抗原已經(jīng)形成程度了不等的免疫耐受，所以要重建或增強HBV抗原特異性免疫應(yīng)答，必須通過適當(dāng)?shù)馗淖兛乖Y(jié)構(gòu)來增強其免疫原性，或通過提高抗原加工、遞呈和上調(diào)T淋巴細(xì)胞的反應(yīng)性等途徑來激活無反應(yīng)性或低反應(yīng)性的HBV抗原特異性T淋巴細(xì)胞(Livingston BD，et al.Hepatology，31(2)548-549，2000)。
本發(fā)明基于HBV表位的研究進展和我們自己的前期工作，充分分析了HBV疫苗研究中存在的問題，特別是考慮到抗HBV免疫學(xué)特征，從HBV基因組中選擇出5個分別來自表面抗原、核心抗原和HBV DNA多聚酶(POL)序列之高度保守區(qū)DNA編碼序列，并將它們與部分pre-S2基因一起組合成包括多個HBV抗原表位的復(fù)合基因，基因命名為P/T。這些表位在四種類型HBV中均具有高度保守，而且已證實為它們的表達(dá)產(chǎn)物均具有刺激CTL反應(yīng)的良好免疫原性。
HBV env基因編碼一段包括55個氨基酸的pre-S2蛋白，有證據(jù)表明該蛋白對產(chǎn)生保護性免疫反應(yīng)具有重要作用。土撥鼠肝炎病毒、地松鼠肝炎病毒、鴨肝炎病毒基因組中也存在類似區(qū)域，推測該區(qū)域與乙肝病毒的宿主特異性和器官特異性有關(guān)(吳玉章等，1993生物化學(xué)和生物物理進展20(3)203)。在不同亞型人乙肝病毒中，該區(qū)域高度保守，因此推斷該區(qū)域激發(fā)的免疫反應(yīng)有可能克服乙肝病毒亞型間的免疫逃避(Neurath RA，et al.，Science.224392，1984)。既往研究也發(fā)現(xiàn)，pre-S2蛋白能激發(fā)猩猩抵抗HBV攻擊的保護性免疫反應(yīng)。
乙型肝炎基因工程預(yù)防性疫苗是最為成功的疫苗之一。但這些疫苗的接種者中，仍有約10-20％不產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答。一般認(rèn)為，導(dǎo)致這種無應(yīng)答狀態(tài)可能與所使用的疫苗未包含pre-S2有關(guān)，因為該區(qū)含有介導(dǎo)HBV與肝細(xì)胞結(jié)合的特異性受體。而目前進入市場的乙肝疫苗，基本都未含有pre-S2抗原。如果在重組基因中加入pre-S2抗原的編碼序列，可望能夠提高重組基因表達(dá)產(chǎn)物的免疫效率和免疫原性。
研究表明，急性自限性乙型肝炎的病情轉(zhuǎn)歸與患者體內(nèi)的多特異性CTL反應(yīng)密切相關(guān)(Penna A，et al.1991Exp Med 1741565)。慢性HBV感染者體內(nèi)的自發(fā)性和γ干擾素(IFN-γ)依賴性的HBV病毒的清除也與細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)(CTL反應(yīng))密切相關(guān)(Guidotti LG，et al.，Prol Natl Acad Sci USA.913764，1994)。CTL是HBV感染的一種主要的防御機制，在HBV慢性感染過程中，其可識別肝細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的HBV抗原，有助于機體清除HBV感染的肝細(xì)胞。CTL通過HBV感染的肝細(xì)胞表面的HLA-I分子與T細(xì)胞受體結(jié)合而發(fā)揮作用。這些HLA-I類分子主要包括A2.1、Aw68、B7等亞型，其中特別是HLA-A2.1在人群中出現(xiàn)的頻率相當(dāng)高，例如其在中國人、日本人、高加索人等人種中的出現(xiàn)頻率分別為55％、43％、46％。因此，本發(fā)明人在整個基因的設(shè)計中，充分考慮到T細(xì)胞特別是CTL作用對HBV疫苗的免疫應(yīng)答的影響，從HBV基因組中優(yōu)選了5個可被HLA分子識別的T細(xì)胞表位，以期為多表位疫苗誘發(fā)高效免疫應(yīng)答提供條件。
在免疫清除HBV的過程中，針對乙型肝炎核心抗原(HBcAg)或其片段的特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答同樣具有重要作用(參見美國專利6,479,282)。目前已在HBcAg中鑒定出多個細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)抗原表位，這類表位的合成肽疫苗對健康人能誘導(dǎo)強的抗HBV細(xì)胞免疫應(yīng)答，并且有證據(jù)表明它們可有效地增強慢性HBV感染者的細(xì)胞免疫應(yīng)答能力(Heathcote J，et al.，Hepatology30(2)531-536，1999；美國專利6,479,282)。研究顯示，急性自限性HBV感染者的外周血單核細(xì)胞(PBMC)受重組HBcAg或HBcAg的CTL抗原表位合成肽刺激后，可產(chǎn)生強的增殖或殺傷活性，而慢性HBV感染者的PBMC則不能或僅能產(chǎn)生微弱的這類活性(Tsai SL.，J Gastroenterol hepatol.，12(9-10)227-235，1997)。因此，HBcAg也有可能作為乙肝治療/預(yù)防性疫苗提供有效抗原表位。
Missale G等曾前后先后報道了位于HBcAg 18-27及141-151位氨基酸的CTL表位，其中前者為HLA-A2限制性表位，后者為HLA-A31及AW68限制性表位。這些抗原表位跨越HBV核心抗原的關(guān)鍵性區(qū)域，在核心抗原的定位、基因組包裝及前核心蛋白的表達(dá)中起到關(guān)鍵作用。對HBV急性自限性感染者及接受IFN-r治療的HBV慢性感染者的外周血單核細(xì)胞，兩者的相應(yīng)肽段均可誘發(fā)顯著的CTL反應(yīng)(Missale G，J Exp Med.，177751-762，1993Nayersina R，JImmunol.，150(10)4659-71，1993)。
本發(fā)明人在多年從事表位研究的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)HBcAg的第98-106位氨基酸序列(GIRQLLWFHI)是良好的HBV CTL表位。經(jīng)體外刺激PBMC后，其可有效的誘導(dǎo)CTL效應(yīng)產(chǎn)生。我們以HepG2細(xì)胞為靶細(xì)胞并采用標(biāo)準(zhǔn)4小時51Gr釋放法證實，在效靶比為100∶1時，溶破靶細(xì)胞效率可達(dá)到60.1％。
在我們的P/T基因中，除了包括衍生于NBV表面和核心抗原的抗原表位序列外，還進一步包括輔助性T淋巴細(xì)胞(HTL)表位及CpG島核心序列。已知通用型輔助性T細(xì)胞(HTL)表位PADRE(AlaLysPheValAlaAlaTrpThrLeuLysAlaAlaAla)能與和大多數(shù)人的HLA-DR分子、小鼠MHC II類分子高親和力結(jié)合，并可有力地激活CD4+T淋巴細(xì)胞，使之分泌IL-2、IL-12等細(xì)胞因子。所說的這些細(xì)胞因子以旁分泌方式作用于HBV抗原特異性T細(xì)胞，從而大大提高疫苗的免疫效率(Livingston B，Immunol Res.18(2)79-92，1998)。也有人曾報道輔助性T細(xì)胞表位可顯著地提高minigeneDNA疫苗的免疫效果。
從急性自限性HBV感染者的外周血中，可檢測到針對HBV的多克隆多特異性CTL和輔助性T淋巴細(xì)胞(HTL)反應(yīng)。這些反應(yīng)被認(rèn)為是與HBV病毒感染的清除控制有關(guān)。而在HBV慢性感染者外周血中，則幾乎檢測不到抗原刺激的T細(xì)胞所誘發(fā)產(chǎn)生的TH1型細(xì)胞因子(Brian D.，et al.，J Immunol.1623088-3095，1999；Chow YH.et al.，J Immunol.1601320-1329，1998)。因此我們相信，TH1型細(xì)胞應(yīng)答在HBV病毒的清除中起到至關(guān)重要的作用。CpGDNA是一類其序列大部分以非甲基化胞嘧啶核苷酸和鳥嘌呤核苷酸(CpG)為基元的寡聚體，其堿基排列大多遵循以下規(guī)律5-PurPur CG PyrPyr-3。這種特征性序列可激活多種免疫效應(yīng)細(xì)胞，尤其是對Th1型免疫應(yīng)答具有顯著的加強作用(Sato Y，Science，273(5)352-354，1996)。因此，在本發(fā)明的重組基因序列中加入可誘發(fā)高水平免應(yīng)答的CpG島序列(5-AACGTT-3’，含有CpG基元5’-嘌呤-嘌呤-CG-嘧啶-嘧啶-3’)，可有效地誘導(dǎo)IFN-r、IL-1等細(xì)胞因子的產(chǎn)生并共刺激信號分子的表達(dá)，從而提高抗乙型肝炎病毒的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)水平。
HBV是一種部分雙鏈環(huán)狀的DNA病毒，長度為3200bp，有四個重疊的讀框編碼不同的病毒產(chǎn)物。DNA聚合酶是最大的讀框，大約有2500bp，它不僅是普通的DNA聚合酶，還對RNA的中間產(chǎn)物起逆轉(zhuǎn)錄的作用。當(dāng)HBV進入肝細(xì)胞，基因組進入細(xì)胞核，轉(zhuǎn)化為共價閉環(huán)的DNA，并被轉(zhuǎn)錄為RNA的中間物。這個中間物可以向細(xì)胞膜移動，在那里病毒聚合酶通過逆轉(zhuǎn)錄將中間物轉(zhuǎn)化為新的DNA。病毒的聚合酶是治療慢性HBV感染的逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑的作用靶點，也是本發(fā)明基因設(shè)計的一個重要切入點。
本發(fā)明針對HBV的免疫學(xué)特征，根據(jù)已報道的HBV表位資料及我們先前在HBV CTL表位研究方面的積累，選擇了5個可誘發(fā)高水平CTL應(yīng)答的表位，與pre-S2基因共同組合成一個新的表達(dá)HBV CTL免疫原性肽的重組基因P/T，預(yù)期本發(fā)明的HBV多表位CTL免疫原性肽和基于該免疫原性肽制備的乙型肝炎疫苗不僅能夠誘發(fā)特異性細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答，而且可有效地激活CTL反應(yīng)并進而殺傷IIBV感染的肝細(xì)胞?？蔀橐倚透窝椎念A(yù)防與治療提供一條新的途徑。
為了得到本發(fā)明的包括多個HBV抗原表位的免疫原性肽序列，我們首先根據(jù)已知的HBV抗原表位設(shè)計并合成如下所示的核苷酸序列(圖2)(SEQ ID NO9)。下示序列的下方注明了其中各片段的來源和氨基酸(aa)數(shù)，并在雙鏈DNA的下面分別給出相應(yīng)的氨基酸序列。其中劃下線部分分別為5′和3′端附加的Hind III/BamH I和Sal I/EcoR I酶切位點，并且給出各抗原表位編碼序列間頭的甘氨酸密碼子(以黑體字示出)。
5′-AGCTTGGATCCATGCAGTGGAACTCCACTACCTTCCACCAGACT3′-ACCTAGGTACGTCACCTTGAGGTGATGGAAGGTGGTCTGAGACGTC CTGCAGGACCCGCGTGTTCGTGGCCTGTACTTCCCGGCTGGTGGCCTGGGCGCACAAGCACCGGACATGAAGGGCCGACCACCGAGAAGGLeu Gln Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Thr Phe Pro Ala Gly Gly-----------------------------------------------------------------TCTTCCTCTGGTACTGTTAACCCGGTACCGACCACTGTTAGACCATGACAATTGGGCCATGGCTGGTGACAAAGGGGCSer Ser Ser Gly Thr Val Asn Pro Val Pro Thr Thr Val-----------------------------------------------------------------
TCCCCGATCTCTCTGATCTTCTCCAAAATCGGCGACCTGGCACTGAAC` TAGAGAGACTAGAAGAGGTTTTAGCCGCTGGACCGTGACTTGCCASer Pro Ile Ser Leu Ile Phe Ser Lys Ile Gly Asp Leu Ala Leu Asn GGTGCTAAATTCGTTGCTGCATGGACTCTGAAGGCTGCAGCGCGATTTAAGCAACGACGTACCTGAGACTTCCGACGTCGCCCAGly Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala GGTTTCCTGCCGTCTGACTTTTTCCCGTCTGTGAAGGACGGCAGACTGAAAAAGGGCAGACACCCAGly Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val GGTTCCACTCTGCCGGAAACTACCGTTGTACGTCGCAAGGTGAGACGGCCTTTGATGGCAACATGCAGCGCCAGly Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val Arg Arg GGTAACGTTTTGCAACCAGly Asn Val GGTTTCCTGCTGACTCGTATCCTGACCATCAAGGACGACTGAGCATAGGACTGGTAGCCA(SEQ ID NO14)Gly Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile GGTATCCGTCAGCTGCTGTGGTTCCACATCTAGGCAGTCGACGACACCAAGGTGTAGCCA(SEQ ID NO15)Gly Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile GGTGGCCTGTCCCGTTACGTAGCTCGTCTG
CCGGACAGGGCAATGCATCGAGCAGACCCA(SEQ ID NO16)Gly Gly Leu Ser Arg Tyr Val Ala Arg Leu GGTTGAGTCGACGAATT-3′ACTCAGCTGCTTAA-5′GlySal I/EcoR I位點本發(fā)明的HBV多抗原表位的復(fù)合基因的核苷酸序列(SEQ ID NO9)如下所示5’AGCTTGGATCCATGCAGTGGAACTCCACTACCTTCCACCAGACTCTGCAGGACCCGCGTGTTCGTGGCCTGTACTTCCCGACCTAGGTACGTCACCTTGAGGTGATGGAAGGTGGTCTGAGACGTCCTGGGCGCACAAGCACCGGACATGAAGGGCGCTGGTGGCTCTTCCTCTGGTACTGTTAACCCGGTACCGACCACTGTTTCCCCGATCTCTCTGATCTTCTCCAAAATCGGCGACCACCGAGAAGGAGACCATGACAATTGGGCCATGGCTGGTGACAAAGGGGCTAGAGAGACTAGAAGAGGTTTTAGCCCGACCTGGCACTGAACGGTGCTAAATTCGTTGCTGCATGGACTCTGAAGGCTGCAGCGGGTTTCCTGCCGTCTGACTTTTGCTGGACCGTGACAAGCCACGATTTAAGCAACGACGTACCTGAGACTTCCGACGTCGCCCAAAGGACGGCAGACTGAAAATCCCGTCTGTGGGTTCCACTCTGCCGGAAACTACCGTTGTACGTCGCGGTAACGTTGGTTTCCTGCTGACTCGTATCCTGAGGGCAGACACCCAAGGTGAGACGGCCTTTGATGGCAACATGCAGCGCCATTGCAACCAAAGGACGACTGAGCATAGGACACCATCGGTATCCGTCAGCTGCTGTGGTTCCACATCGGTGGCCTGTCCCGTTACGTAGCTCGTCTGGGTTGAGTCTGGTAGCCATAGGCAGTCGACGACACCAAGGTGTAGCCACCGGACAGGGCAATGCATCGAGCAGACCCAACTCAGCTGC5’因此，本發(fā)明進一步提供了制備具有上述序列的免疫原性復(fù)合多肽的方法，該方法包括以下步驟(1)分別分段合成編碼如上限定的氨基酸序列的核苷酸小片段；
(2)分步退火連接步驟(1)的核苷酸小片段，得到長度約399bp的核苷酸；(3)將步驟(2)的核苷酸連接到適當(dāng)?shù)妮d體中；(4)用步驟(3)的重組載體轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞；(5)培養(yǎng)步驟(4)的重組體細(xì)胞，并從培養(yǎng)物上清和細(xì)胞內(nèi)分離所需的乙型肝炎病毒免疫原性肽。
根據(jù)本發(fā)明方法的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的小片段長度約10-30個堿基。
根據(jù)本發(fā)明方法的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的全復(fù)合基因序列也可以是一次連續(xù)合成的。
根據(jù)本發(fā)明方法的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的載體是質(zhì)粒pWR450-1。
根據(jù)本發(fā)明方法的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的宿主細(xì)胞是大腸桿菌細(xì)胞。
可以使用本領(lǐng)域熟知的方法并使用適當(dāng)?shù)腄NA合成裝置合成如上給出的核苷酸序列。為了便于全序列的合成和純化，可以按照如上所示的雙鏈DNA序列分別合成定名為F1-F18的18個小片段，然后按照本發(fā)明的分步退火方案(參見圖1)首先在DNA聚合酶存在下，將這些小片段中的F2-F17連接成三個較長的雙鏈DNA片段。然后，再連接這三個較長的雙鏈DNA片段，得到包括小片段F2-F17的大片段。最后，分別在如上得到的大片段的5′和3′末端加入Hind III/BamH I和Sal I/EcoR I酶切位點，即得到本發(fā)明所需的復(fù)合基因P/T。由于各表位序列間有甘氨酸編碼序列作為接頭或分割序列，所以可確保各表位的基本獨立。另外，在不影響氨基酸密碼和宿主菌可識別密碼子的情況下，我們還對復(fù)合基因的個別堿基進行調(diào)換，盡可能地刪除某些有害的二級結(jié)構(gòu)。
或者，根據(jù)本發(fā)明方法的一個優(yōu)選實施方案，也可以使用自動合成裝置，一次連續(xù)合成編碼本發(fā)明免疫原性多肽的復(fù)合基因序列。
經(jīng)進一步純化和鑒定后，將所得到的復(fù)合基因P/T連接到分別用Hind III/BamH I和Sal I/EcoR I酶切成線性的質(zhì)粒載體啟動子的下游。然后，用所得到的重組載體轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，得到包含本發(fā)明的復(fù)合基因的重組體細(xì)胞?？梢允褂萌魏芜m于在原核、真核或酵母細(xì)胞中復(fù)制的質(zhì)粒作為攜帶本發(fā)明復(fù)合基因的載體，并可使用任何原核、真核或酵母細(xì)胞作為本發(fā)明重組質(zhì)粒載體的宿主細(xì)胞。然而，根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，最好使用質(zhì)粒pWR450-1作為用于本發(fā)明的表達(dá)載體，并使用大腸桿菌作為重組質(zhì)粒的宿主細(xì)胞。
可以在適于表達(dá)本發(fā)明的外源性復(fù)合基因的條件下，常規(guī)培養(yǎng)如上得到的重組體細(xì)胞，然后從細(xì)胞培養(yǎng)物上清和細(xì)胞裂解產(chǎn)物中回收基因表達(dá)產(chǎn)物。以常規(guī)方法分離并純化所需的的蛋白質(zhì)后，按下述方法進行蛋白質(zhì)產(chǎn)物的理化性質(zhì)鑒定和生物學(xué)活性分析。
聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)顯示，如上得到的表達(dá)產(chǎn)物為分子量約為14KD的堿性蛋白質(zhì)。
然后，進一步使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的抗體檢測實驗、淋巴細(xì)胞增殖實驗、CTL細(xì)胞殺傷活性實驗、淋巴細(xì)胞亞群分析、免疫小鼠細(xì)胞因子檢測等方法，分析本發(fā)明的復(fù)合多肽對被免疫動物(Balb/c小鼠)的體液免疫和細(xì)胞免疫的影響。
我們的實驗結(jié)果清楚地表明，本發(fā)明的復(fù)合多肽可在接受免疫的動物體內(nèi)有效地誘導(dǎo)特異性抗體的生成、強有力地促進細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)的增殖，并提高CTL的靶細(xì)胞殺傷活性。另一方面，我們的安全性試驗證明，本發(fā)明的復(fù)合多肽在10倍有效劑量下使用對動物仍未見任何明顯的不良付作用。
因此，有可能以本發(fā)明的包括多個HBV表位的免疫原性多肽作為復(fù)合免疫原，免疫人或其他哺乳動物并在接受者體內(nèi)引發(fā)主動或被動免疫反應(yīng)，進而達(dá)到預(yù)防或治療乙型肝炎病毒感染的目的。
因此，本發(fā)明的再一個目的是提供如上限定的復(fù)合多肽作為乙型肝炎疫苗的應(yīng)用。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，按本發(fā)明方法得到的多肽可以作為治療和/或預(yù)防性疫苗，用于接種任何可能遭受HBV感染的健康個體、HBV攜帶者，特別是急性或慢性乙型肝炎病人，以作為主動或被動免疫因子用于治療或預(yù)防HBV感染。
本發(fā)明的免疫原性復(fù)合多肽可以單獨使用，但最好是將所說的多肽與醫(yī)藥生產(chǎn)領(lǐng)域已知的并且醫(yī)藥上可接受的載體或賦形劑以及其他輔助成分混合在一起，制成疫苗組合物使用。例如，在制成溶液劑的情況下，所說的載體或賦形劑可以是無菌蒸餾水、注射用水、等滲氯化鈉或葡萄糖溶液，或低濃度(如1-100mM)磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)、以及含有乙醇、多元醇(如乙二醇、丙二醇及液態(tài)聚乙二醇)的溶劑或分散介質(zhì)等。其他輔助成分例如可以是抗氧化劑(如抗壞鹽酸)、抗微生物素(如青霉素和鏈霉素或其他抗真菌劑等)及防腐劑(如苯甲酸鈉、三氯叔丁醇、度米酚、山梨酸等)，以及增溶劑和用于維持分散劑中所需顆粒大小的表面活性劑。為了可制成冷凍干燥的疫苗制劑，免除了疫苗生產(chǎn)、運輸、儲存和使用過程中的“冷鏈”壓力并保證疫苗的接種效果，還可在所說的疫苗組合物中加入適當(dāng)?shù)姆€(wěn)定劑，例如由海藻糖、谷氨酸、抗壞血酸、尿素、山梨醇、肌醇和低分子右旋糖酐等成分組成的凍干穩(wěn)定劑(參見中國專利00120743.1)，將含有本發(fā)明的復(fù)合多肽的疫苗組合物制成凍干制劑。
實施例下列實施例旨在舉例描述本發(fā)明的免疫原性復(fù)合多肽的制備方法及其生物學(xué)活性。在不改變本發(fā)明的精神和原則的前提下，對本發(fā)明的任何改動都將落入本發(fā)明的待批權(quán)利要求范圍內(nèi)。特別是，就本發(fā)明免疫原性復(fù)合多肽的氨基酸結(jié)構(gòu)而言，在不改變所說的多肽的空間結(jié)構(gòu)的前提下，對所說氨基酸序列中個別氨基酸的任何取代、置換、加入或刪除，都將落入本發(fā)明的待批權(quán)利要求范圍內(nèi)。
實施例1復(fù)合多肽的核苷酸編碼序列的制備(1)HBV抗原表位的分析和鑒定經(jīng)PCGENE軟件分析，從HBcAg的氨基酸序列中找出一段具有獨立結(jié)構(gòu)的9氨基酸疏水序列(GIRQLLWFHI)(98-106aa)，并合成與該肽序列重疊或交叉一系列短肽。使用標(biāo)準(zhǔn)4小時51Cr釋放法檢測這些短肽誘導(dǎo)CTL殺傷活性的能力。簡單地說，該方法包括用所說的短肽免疫動物后第6周，取作為靶細(xì)胞的HLA-A2外周血單核細(xì)胞(5×106細(xì)胞/mL)，在含有10％滅活胎牛血清、Con-A和IL-2的RPMI 1640/DMEM培養(yǎng)基中，于HBV短肽(10μmol/L)存在下培養(yǎng)8天。同時取作為效應(yīng)細(xì)胞的HLA-A2限制性HepG2細(xì)胞(2×106細(xì)胞/ml)，在含20％胎牛血清和3.7MBq51Cr及HBV短肽的培養(yǎng)基中37℃保溫2小時。洗滌并離心分離細(xì)胞后，用含10％胎牛血清的RPMI 1640/DMEM培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞至105/ml。然后，按效應(yīng)細(xì)胞/靶細(xì)胞(E∶T)20～100∶1比例(各100μl)加入96孔板中。每組設(shè)3個復(fù)孔。用100μl RPMI 1640培養(yǎng)基取代效應(yīng)細(xì)胞作為自然釋放孔，并用等體積的10％Triton X-100取代效應(yīng)細(xì)胞作為最大釋放孔。保溫5小時后，離心分離培養(yǎng)物上清，并使用γ計數(shù)器測定各孔的cpm值。結(jié)果表明，所選擇的九肽作為HbcAg表位序列，確實可誘發(fā)針對外周血單核細(xì)胞的CTL殺傷活性。
以上述同樣方法篩選并分析HBV蛋白中其他活性抗原表位序列。
(2)HBV復(fù)合抗原表位基因的設(shè)計基于HBV表位的現(xiàn)有資料及我們的前期工作，從HBV基因組中篩選出5個分別來自HBV表面抗原、核心抗原、HBV DNA多聚酶的高度保守的HLA識別表位肽。此外，為了進一步提高本發(fā)明復(fù)合多肽的免疫原活性，我們還在基因序列中加入了了輔助性T淋巴細(xì)胞(HTL)表位及CpG島核心序列。根據(jù)計算機分析數(shù)據(jù)，借助甘氨酸接頭將這些表位序列與HBV前S2基因序列連接在一起，得到長度約399bp的復(fù)合多表位抗原基因。
(3)編碼HBV抗原表位的核苷酸片段的拼接分別分段合成包括上述6個HBV抗原表位的核苷酸編碼序列的18個小DNA片段。然后按照圖1所示的方案進行分步退火連接。
除片段FI和片段F18外，取其余各片段(各1μl)分別將F2與F11、F3與F12、F4與F13、F5與F14、F6與F15、F7與F16、F8與F17混和在一管中。各管中分別加入14μlddH2O，2μl 10mmol/L ATP，0.5μl T4多核苷酸激酶；F1和F18管則分別加入7μlddH2O，1μl 10x多核苷酸激酶緩沖掖，1μl 10mmol/L ATP，0.5μl T4多核苷酸激酶，然后在37℃下保溫30分鐘。在F9和F10中分別加入1μl F18和F1，再各加入9μl ddH2O，。所有9管均沸水浴20分鐘，然后自然冷卻退火至室溫(約10小時)。
退火后，分別混合F2/F11與F3/F12、F4/F13與F5/F14、F6/F15、F7/F16與F8/F17，并各加1μ 10mmol/L ATP，1μl T4連接酶存在下16℃連接過夜，得到三個較大的片段。然后將這三個段混合在一起，于1μl 10mmol/L ATP，0.5μl T4連接酶存在下16℃連接過夜。最后，混合所有片段，并于1μl10mmol/L ATP，0.5μl T4連接酶存在下16℃連接過夜。電泳回收約400bP的目的片段后，用T4多核苷酸酶使兩5’末端磷酸化，得到5’末段帶有BamHI/EcoRI雙酶切位點的HBV多表位免疫原基因，其序列如圖2所示。
實施例2攜帶HBV多表位免疫原基因的重組質(zhì)粒的構(gòu)建和宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化用已知的插膜法和1％瓊脂糖凝膠電泳分離并純化如上得到的免疫原基因后，按常規(guī)方法將其連接到BamHI/EcoRI雙酶切的質(zhì)粒載體pWR450-1((由中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所郭禮和構(gòu)建，參見Li-He Guo，et al.，ChineseJourney of Biotechnology1(2)14-33，1985)上，重新環(huán)化后用所得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a菌株。在含IPTG和X-gal的氨芐青霉素平板上挑取白色菌落抽提質(zhì)粒進行鑒定。經(jīng)BamHI/EcoRI雙酶切并進行1％瓊脂糖凝膠電泳后，篩選陽性克隆并切出相當(dāng)于399bp的條帶(圖4)，從而得到攜帶HBV多抗原表位基因的重組質(zhì)粒，并將其命名為p WR450-1/HBV-P/T(圖3)。
用如此得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21菌株的細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)后按下述方法篩選陽性重組克隆先在含IPTG和X-gal的平板上進行初步篩選包含重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化體，然后挑取白色菌落并抽提質(zhì)粒DNA。以酶切鑒定法和核苷酸序列分析法進一步鑒定陽性克隆質(zhì)粒。酶切鑒定結(jié)果如圖4所示。
實施例3轉(zhuǎn)化體細(xì)胞的培養(yǎng)和表達(dá)產(chǎn)物的分離與純化在通用的LB培養(yǎng)基中，于37℃下培養(yǎng)如上得到的重組體細(xì)胞并加入誘導(dǎo)劑(IPTG)，誘導(dǎo)復(fù)合基因與載體質(zhì)粒β-半乳糖酐酶基因融合表達(dá)后，離心分離培養(yǎng)物上清并從所說的上清和細(xì)胞裂解物中分離并純化所需的復(fù)合多肽。例如，包涵體溶出物經(jīng)徹底透析后，可以使用SP-Sepharose陽離子柱(9HiTrapSP-Sepharose HP，Amersham Biosciences公司)，層析純化HiTrap SP-SepharoseHP 5ml預(yù)裝柱，該柱經(jīng)20mmol/L、pH9.0Tris.CL緩沖平衡液，將透析液上SP柱，用20mmol/L、緩沖液及含1mol/L NaCl的Tris-HCL緩沖液(pH9.0)進行梯度洗脫并分步收集洗脫峰。如此得到的蛋白質(zhì)純度可達(dá)到93％。SDS-PAGE結(jié)果表明如此得到的蛋白質(zhì)為分子量約75KD的蛋白的堿性蛋白質(zhì)。進一步的Western印跡分析顯示，抗HBV患者血清可特異識別本發(fā)明的復(fù)合蛋白，而不可識別載體pWR450-1所表達(dá)的β-半乳糖酐酶蛋白，表明該復(fù)合蛋白具有較理想的免疫原性(圖5)。
實施例4包含HBV抗原表位的復(fù)合多肽的生物學(xué)活性分析本實施例中使用的所有檢測方法均為本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法。
(1)被免疫小鼠的抗體水平檢測將平均體重為15-20g的Balb/c小鼠隨機分為三組重組復(fù)合多肽免疫組(P/BPT)(實驗組)、β-半乳糖酐酶載體蛋白免疫組(P)(陽性對照組)和生理鹽水空白對照組。實驗組和陽性對照組每只動物每次接種0.1mg(0.5ml)蛋白質(zhì)，空白對照組動物接受等體積的生理鹽水。按常規(guī)輔以弗氏佐劑皮下多點免疫Balb/C小鼠，兩周一次，共三次。每周小鼠眼底動脈采血，分離血清并用于抗體水平檢測。
用本發(fā)明的融合多肽免疫小鼠后，以間接免疫ELISA方法檢測被免疫動物的血清抗體水平。結(jié)果，免疫接種后第二周動物體內(nèi)即有特異性IgG抗體產(chǎn)生，第九周抗體達(dá)到最高水平，且明顯高于陰性和陽性對照組(P值分別小于0.05和0.01)(圖6)。
(2)被免疫小鼠的CTL殺傷活性檢測以乳酸脫氫酶(LDH)釋放法檢測被免疫小鼠CTL細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。結(jié)果表明，當(dāng)效應(yīng)細(xì)胞∶靶細(xì)胞比例約為100∶1時，接受本發(fā)明融合多肽的實驗組小鼠的特異性CTL活性可高達(dá)40.5％，并明顯高于載體蛋白組和PBS對照組(P＜0.05)(圖7)。
(3)被免疫小鼠的淋巴細(xì)胞增殖實驗免疫后第8周，以MTT法檢測被免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖能力，結(jié)果以培養(yǎng)物上清的470nm吸光率和由之計算的刺激指數(shù)SI表示。實驗結(jié)果可見，接受本發(fā)明融合多肽的免疫組小鼠的脾細(xì)胞刺激指數(shù)SI值高于載體蛋白免疫組(P＝0.03)，亦明顯高于PBS空白對照組(P＝0.003)，但載體蛋白免疫組的SI值和空白對照組的SI值無顯著差別(P＝0.081)。說明本發(fā)明的多肽確實激活了動物的免疫系統(tǒng)，并促進了動物淋巴細(xì)胞的增生。結(jié)果如下列表1所示。
表1被免疫小鼠的淋巴細(xì)胞增殖活性測定組別 動物數(shù) 實驗組(A470 對照組A470 SI0.548±0.015 0.371±0.0131.477融合蛋白 3 0.536±0.028 0.309±0.0161.7310.403±0.021 0.235±0.0061.7150.524±0.025 0.433±0.0641.210載體蛋白 3 0.465±0.022 0.309±0.0161.3680.243±0.005 0.210±0.0061.4700.219±0.006 0.212±0.0071.033空白對照 3 0.322±0.006 0.286±0.0081.1250.378±0.09 0.318±0.0291.189(4)被免疫小鼠的淋巴細(xì)胞亞群分析免疫接種后第8周，以流式細(xì)胞分選法分析被免疫動物的脾淋巴細(xì)胞亞群及其比例。結(jié)果可見，融合多肽免疫組小鼠的CD4/CD8平均比值為2.69±0.302，載體蛋白免疫組的平均值為1.89±0.090，二者相比P＜0.05?？瞻讓φ战M動物的CD4/CD8平均比值為1.96±0.147，與載體蛋白組相比P＝0.03＜0.05。這些結(jié)果表明，本發(fā)明的融合多肽可促進CD4+T淋巴細(xì)胞的增殖(圖8)。另外，比較不同淋巴細(xì)胞亞群的比例顯示，CD4+T淋巴細(xì)胞亞群比例顯著高于空白對照組(P＝0.04＜0.05)，但三組間的CD8+T淋巴細(xì)胞亞群比例則無明顯差異(P＞0.05)。
(5)被免疫小鼠的血清內(nèi)細(xì)胞因子水平融合多肽免疫小鼠后，以RT-PCR法半定量檢測小鼠脾細(xì)胞特異性細(xì)胞因子mRNA的水平。結(jié)果顯示，接種載體蛋白的對照組動物IL-6、IL-12m RNA水平未見顯著升高(P值分別為0.817和0.254)。而與載體蛋白組相比，接種本發(fā)明的融合多肽的實驗組動物的IFN-r水平則明顯升高(P＝0.038＜0.05)。表明本發(fā)明的融合多肽可刺激細(xì)胞因子IFN-r的生成與分泌(圖9)。
(6)安全性試驗小鼠經(jīng)疫苗接種后，注射部位無明顯紅腫。觀察期間動物正常進食，未見明顯的異常行為，并且各組動物體重亦無明顯改變。接種10倍于有效劑量的本發(fā)明的復(fù)合蛋白10周后，大體解剖除發(fā)現(xiàn)復(fù)合蛋白免疫組小鼠的脾臟輕微有腫大外，未見小鼠肝及淋巴結(jié)等其它器官發(fā)生明顯的改變。肌肉免疫組織化學(xué)檢查亦無異常發(fā)現(xiàn)。
序列表<110>熱帶病研究所<120>乙型肝炎疫苗及其制備方法<140>
<141>
<160>9<210>1<211>176<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的帶有5′端附加酶切位點的HBV前S2區(qū)抗原表位編碼序列。
<400>1AGCTTGGATC CATGCAGTGG AACTCCACTA CCTTCCACCAGACTCTGCAG GACCCGCGTG TTCGTGGCCT GTACTTCCCGGCTGGTGGCT CTTCCTCTGG TACTGTTAAC CCGGTACCGACCACTGTTTC CCCGATCTCT CTGATCTTCT CCAAAATCGGCGACCTGGCA CTGAAC<210>2<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>帶有N末端甘氨酸接頭的合成的輔助性T淋巴細(xì)胞表位的編碼序列.
<400>2GGTGCTAAAT TCGTTGCTGC ATGGACTCTG AAGGCTGCAG CG<210>3<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>帶有N末端甘氨酸接頭的合成的HBV核心抗原表位的編碼序列。
<400>3GGTTTCCTGC CGTCTGACTT TTTCCCGTCT GTG<210>4
<210>4<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>帶有N末端甘氨酸接頭的合成的HBV核心抗原表位的編碼序列。
<400>4GGTTCCACT CTGCCGGAAA CTACCGTTGT ACGTCGC<210>5<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>帶有N末端甘氨酸接頭的合成的CpG核心的編碼序列。
<400>5GGTAACGTT<210>6<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>帶有N末端甘氨酸接頭的合成的HBV表面抗原表位的編碼序列。
<400>6GGTTTCCTGC TGACTCGTAT CCTGACCATC<210>7<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>帶有N末端甘氨酸接頭的合成的HBV核心抗原表位的編碼序列。
<400>7GGTATCCGTC AGCTGCTGTG GTTCCACATC<210>8<211>47<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>帶有3′末端酶切位點的乙型肝炎病毒DNA聚合酶表位的編碼序列。
<400>8
GGTGGCCTGTCCCGTTACGTAGCTCGTCTGGGTTGAGTCGACGAATT<210>9<211>399<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>復(fù)合多肽基因序列(正鏈)。
<400>9AGCTTGGATC CATGCAGTGG AACTCCACTA CCTTCCACCA GACTCTGCAG GACCCGCGTG TTCGTGGCCTGTACTTCCCG GCTGGTGGCT CTTCCTCTGG TACTGTTAAC CCGGTACCGA CCACTGTTTC CCCGATCTCTCTGATCTTCT CCAAAATCGG CGACCTGGCA CTGAACGGTG CTAAATTCGT TGCTGCATGG ACTCTGAAGGCTGCAGCGGG TTTCCTGCCG TCTGACTTTT TCCCGTCTGT GGGTTCCACT CTGCCGGAAA CTACCGTTGTACGTCGCGGT AACGTTGGTT TCCTGCTGAC TCGTATCCTG ACCATCGGTA TCCGTCAGCT GCTGTGGTTCCACATCGGTG GCCTGTCCCG TTACGTAGCT CGTCTGGGTT GAGTCCTGC
權(quán)利要求
1.乙型肝炎病毒免疫原性復(fù)合多肽，特征在于所說的免疫原性多肽包括至少部分HBV前S2區(qū)的氨基酸序列，和分別來自乙型肝炎表面抗原、乙型肝炎核心抗原、HBV DNA聚合酶的其他四個連續(xù)的HLA限制性抗原表位的氨基酸序列及由之形成的空間結(jié)構(gòu)。
2.據(jù)權(quán)利要求1的復(fù)合多肽，其中所說的乙型肝炎病毒抗原表位分別是相當(dāng)于乙型肝炎表面抗原前S2區(qū)第1-55位氨基酸的肽片段MetGlnTrpAsnSerThrThrPheHisGlnThrLeuGlnAspProArgValArgGlyLeuThrPheProAlaGlyGlySerSerSerGlyThrValAsnProValProThrThrValSerProIleSerLeuIlePheSerLysIleGlyAspLeuAlaLeuAsn(SEQ ID NO1)；相當(dāng)于乙型肝炎核心抗原第18-27位氨基酸的肽片段PheLeuProSerAspPhePheProSerVal(SEQ ID NO2)；相當(dāng)于乙型肝炎核心抗原第141-151位氨基酸的肽片段SerThrLeuProGluThrThrValValArgArg(SEQ ID NO3)；相當(dāng)于乙型肝炎表面抗原第183-191位氨基酸并且N末端帶有甘氨酸接頭的肽片段PheLeuLeuThrArgIleLeuThrIle(SEQ ID NO4)；相當(dāng)于乙型肝炎病毒核心抗原第98-106位氨基酸的肽片段IleArgGlnLeuLeuTrpPheHisIle(SEQ IDNO5)，以及相當(dāng)于乙型肝炎病毒DNA聚合酶第455-463位氨基酸的肽片段GlyLeuSerArgTyrValAlaArgLeu(SEQ ID NO6)。
3.據(jù)權(quán)利要求1的復(fù)合多肽，所說的免疫原性肽還可包括具有氨基酸序列AlaLysPheValAlaAlaTrpThrLeuLysAlaAlaAla(SEQ ID NO7)的輔助性T細(xì)胞表位PADRE和具有氨基酸序列AsnVal(SEQ ID NO8)的CpG島核心序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的復(fù)合多肽，構(gòu)成所說的乙型肝炎病毒免疫原性肽是由權(quán)利要求2肽片段以任何排列方式串聯(lián)連接的。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的復(fù)合多肽，其中構(gòu)成所說的乙型肝炎病毒免疫原性肽的每兩個獨立的序列之間均有由一個或多個甘氨酸構(gòu)成的接頭。
6.制備如權(quán)利要求1限定的乙型肝炎病毒免疫原性多肽的方法，該方法包括以下步驟(1)分別分段合成編碼如上限定的氨基酸序列的核苷酸小片段；(2)分步退火連接步驟(1)的核苷酸小片段，得到長度約399bp的全復(fù)合基因序列；(3)將步驟(2)的多核苷酸連接到適當(dāng)?shù)妮d體中；(4)用步驟(3)的重組載體轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞；(5)培養(yǎng)步驟(4)的重組體細(xì)胞，并從培養(yǎng)物上清和細(xì)胞內(nèi)分離所需的乙型肝炎病毒免疫原性多肽。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所說的全復(fù)合基因序列也可以是以一次連續(xù)方法合成的。
8.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所說的小片段長度約為10-30個堿基。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的乙型肝炎病毒免疫原性多肽作為治療/預(yù)防性乙型肝炎疫苗的應(yīng)用。
10.具有預(yù)防和/或治療乙型肝炎病毒感染作用的疫苗，特征在于所說的疫苗含有作為基本活性成分的權(quán)利要求1的免疫原性復(fù)合多肽。
全文摘要
本發(fā)明涉及衍生于乙型肝炎病毒衣殼蛋白質(zhì)的免疫原性多肽，特別是涉及包括乙型肝炎抗原的多個HLA限制性表位的復(fù)合多肽，其制備方法及其作為預(yù)防/治療性乙型肝炎疫苗的應(yīng)用。
文檔編號A61P1/16GK1594359SQ0314043
公開日2005年3月16日 申請日期2003年9月8日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月8日
發(fā)明者李明, 駱利敏, 王萍 申請人:熱帶病研究所