專利名稱：供注射用的蛋黃卵磷脂及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及由含有蛋白和脂肪的動物原材料中獲得有用物質(zhì)，尤其是涉及由蛋黃粉獲得注射用的卵磷脂及其制備方法。
背景技術(shù)：
卵磷脂是一類主要由磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、溶血磷脂酰膽堿(LPC)、溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)、神經(jīng)鞘磷脂(SM)、肌醇磷脂、絲磷脂和磷脂酸等組成，并具有明顯生理活性的重要物質(zhì)，目前已經(jīng)廣泛用于醫(yī)藥、食品、化工、輕工等領(lǐng)域。卵磷脂除少量人工合成外，主要來源于從天然植物或動物蛋粉中提取得到，如從大豆提取的大豆磷脂或從蛋黃中提取得到的蛋黃磷脂。但卵磷脂用于靜脈注射用脂肪乳，蛋黃卵磷脂是動物胚胎磷脂，更接近人體需求，生物利用度高，無毒副反應(yīng)，明顯優(yōu)于大豆磷脂。
國內(nèi)外已經(jīng)開展的體外以及臨床研究證明，蛋黃卵磷脂能溶解膽固醇和血脂，保持血管暢通，有效預(yù)防高血壓、高血脂和多種心腦血管病，又能通過血腦屏障直接進入腦內(nèi)參與神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的合成，起健腦增智的作用。同時，由于卵磷脂分子中既有親水性基團，又有親油性的基團，是性能穩(wěn)定、安全的天然乳化劑，尤其適用于靜脈脂肪乳的生產(chǎn)。隨著脂肪乳產(chǎn)品市場每年以10％的速度增長，供注射用的蛋黃卵磷脂需求量也隨之增長。因此，如何制備注射用蛋黃卵磷脂及實現(xiàn)其產(chǎn)業(yè)化是一項研究的熱門課題，具有顯著的經(jīng)濟意義和社會意義。
注射用蛋黃卵磷脂的獲得主要包括提取—分離—濃縮—干燥等4個關(guān)鍵環(huán)節(jié)。在提取工藝上，目前主要有溶劑提取法和超臨界CO2提取法。傳統(tǒng)溶劑法主要涉及的萃取溶劑有烷烴類、丙酮、二甲醚、C1-C3脂肪醇或脂肪醇與烷烴的二元體系，普遍存在有機溶媒耗用量大、工藝時間長等缺點?！渡虾ａt(yī)藥》2001年第1期公開發(fā)表的“靜脈用磷脂的制備”采用以丙酮脫油—乙醇提取—丙酮洗滌—真空干燥的工藝路線，經(jīng)過反復(fù)精制得到注射用的卵磷脂，除了存在有機溶媒耗用量大、工藝時間長等缺點外，卵磷脂的最后平均收率偏低(5.85％)。
國外專利文獻報道的精制卵磷脂制備方法主要是先用大量的丙酮反復(fù)攪拌蛋黃粉多次(5～6次)，充分脫色、脫脂后，再用大量的乙醇攪拌提取多次(4～5次)，提取液濃縮后，通過丙酮反復(fù)洗滌或氧化鋁吸附—洗脫后，富集卵磷脂成分或除去某些雜質(zhì)成分，普遍存在有機溶劑耗用大、生產(chǎn)條件苛刻以及吸附洗脫時間長、單位時間料液處理量有限等缺點，同時需要考慮吸附介質(zhì)的再生問題。
CN1056375C專利公開了一種用超臨界二氧化碳從蛋黃粉中提取高純度蛋黃卵磷脂的方法，按文獻所說即使所得的是一種高純度的蛋黃卵磷脂，其卵磷脂中的組成含磷脂酰膽堿(PC)75.44％、磷脂酰乙醇胺(PE)12.40％，溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)6.64％、神經(jīng)鞘磷脂(SM)2.82％，盡管卵磷脂的純度高，但是溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)是一種對人體有害的物質(zhì)，含量偏高注入體內(nèi)容易引起溶血現(xiàn)象，產(chǎn)生毒副作用，因此該產(chǎn)品還不能作為注射用卵磷脂，僅適用于口服。作為能供人體注射用的卵磷脂，其質(zhì)量要求就比口服的要嚴格得多，首先必須符合一般藥物注射劑的通用標準，如毒性、熱原、過敏性、降壓試驗、細菌等等，還必須符合蛋黃卵磷脂的藥用注射劑標準，如含磷量、含氮量、碘值、皂化值、酸值等，且供注射用的蛋黃卵磷脂主要是用于配制脂肪乳注射劑，故對卵磷脂的乳化性能(以乳化力指標評價)要求高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種可供人體注射用的蛋黃卵磷脂；另一個目的是提供一種注射用的蛋黃卵磷脂的制備方法。
由于供注射用的蛋黃卵磷脂主要是用于配制脂肪乳注射劑，對卵磷脂的乳化性能即乳化力要求高，經(jīng)我們多年的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這與卵磷脂的組成有密切關(guān)系。
為實施本發(fā)明的目的所采用的技術(shù)方案是一種供注射用的蛋黃卵磷脂，皂化值為195.0～212.0，含磷量為3.5～4.1％，含氮量為1.75～1.95％，在蛋黃卵磷脂中含有甘油三酸酯(TP)0.5～3.0％，磷脂酰膽堿(PC)70～90％，溶血磷脂酰膽堿(LPC)0.1～3.0％，磷脂酰乙醇胺(PE)7.0～16.0％，溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)≤1.0％，神經(jīng)鞘磷脂(SM)1.0～3.0％，游離脂肪酸≤1.0％。
供注射用的蛋黃卵磷脂的制備方法是用蛋黃粉為原料，用常規(guī)的藥物制粒工藝制成含水量≤3.0％的顆粒，投入超臨界二氧化碳萃取裝置的萃取釜中，采用超臨界二氧化碳萃取和二級分離方法，萃取釜壓力為30～50MPa，溫度為45～55℃；第一級分離壓力8～12MPa，溫度45～60℃；第二級分離壓力4～7MPa，溫度35～45℃，二氧化碳的流量為30～56Kg/Kg原料h，萃取時間2～5小時，在分離釜中得蛋黃油和膽固醇，從萃取釜中取出脫去蛋黃油和膽固醇的蛋黃粉加4～15倍量的乙醇溶解，取澄清溶液濃縮至投料量的1/4～2/3時用丙酮洗滌，所得的固體物用乙醇溶解后加水攪拌，離心得沉淀物進行冷凍干燥，所得干品為注射用的蛋黃卵磷脂。
為了在超臨界二氧化碳萃取時，更徹底地去除蛋黃粉中的蛋黃油及膽固醇，使超臨界二氧化碳萃取的工藝操作能順利進行，本發(fā)明采取了將蛋黃粉用常規(guī)的藥物制粒工藝制成顆粒后置超臨界二氧化碳萃取釜中，制粒后干燥至含水量≤3.0％為佳。顆粒含水量＞3.0％時，不但脫油率降低，膽固醇也難以徹底除去，而且容易造成循環(huán)系統(tǒng)堵塞。
采用超臨界二氧化碳脫除蛋黃油及膽固醇的提取效果不僅與萃取釜和分離釜的壓力及溫度有密切關(guān)系，而且與萃取方法有直接關(guān)系。為了提高蛋黃粉的脫油率和徹底去除膽固醇，所說的超臨界二氧化碳萃取是在循環(huán)萃取前先靜態(tài)萃取0.5～1.5小時，使二氧化碳與蛋黃粉原料充分混合，更好地溶解出蛋黃油和膽固醇。然后循環(huán)萃取1.5～3.5小時，二氧化碳的流量為30～56Kg/Kg原料·h，在循環(huán)萃取過程中同時進行二級分離，在分離釜I得到的主要是蛋黃油和膽固醇，而在分離釜II得到的主要是水和少量的蛋黃油。在萃取釜得到的是脫去蛋黃油及膽固醇的蛋黃粉，這部分主要含卵磷脂、蛋白質(zhì)，可作口服食品或保健品，但作為供注射用的卵磷脂必須再進一步精制。
精制時，將脫去蛋黃油和膽固醇的蛋黃粉加4～15倍量的乙醇溶解時，一般用70～100％的乙醇溶液溶解為好，又以優(yōu)選濃度為90～95％的乙醇溶解為佳。
精制工序需在符合GMP的條件下進行操作，尤其是冷凍干燥和產(chǎn)品包裝環(huán)節(jié)需要在局部100級的潔凈環(huán)境下進行，以保證產(chǎn)品符合注射用的標準。
采用本發(fā)明所提供的方法，產(chǎn)品中溶劑殘留量極微，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，乳化性能好；工藝流程簡單，操作方便，提取效率高，適合于工業(yè)化生產(chǎn)。
本發(fā)明的制備注射用蛋黃卵磷脂的工藝的優(yōu)點1、蛋黃粉原料經(jīng)過制粒預(yù)處理，采用超臨界CO2萃取二級分離技術(shù)大大提高了萃取效率，蛋黃粉中的蛋黃油和膽固醇脫除更加完全，同時大大減少了有機溶劑的用量，減少了環(huán)境污染。
2、脫除蛋黃油和膽固醇后的蛋黃粉，經(jīng)過簡單的精制處理即可獲得供注射用的蛋黃卵磷脂。從實驗室小試到中試以及生產(chǎn)放大，工藝設(shè)備簡單，易于操作，生產(chǎn)成本低，溶媒殘留量低，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定。
3、用本發(fā)明的工藝生產(chǎn)的蛋黃卵磷脂所有指標均滿足注射用蛋黃卵磷脂的標準。
下面結(jié)合實施例和附圖詳細敘述本發(fā)明的技術(shù)。


圖1、為本發(fā)明所提供的注射用蛋黃卵磷脂產(chǎn)品的紫外—可見光在200～600nm波長范圍內(nèi)的掃描圖譜。
測定方法取蛋黃卵磷脂產(chǎn)品0.1g，加無水乙醇溶解稀釋至10ml，按照《中國藥典》2000版附錄IVA進行掃描。
圖中曲線1為市售高純度蛋黃卵磷脂樣品的掃描圖譜；曲線2～5為本發(fā)明提供的蛋黃卵磷脂樣品掃描圖譜。
如圖所示，樣品1～5的吸收值均在2.0～3.5之間，但市售高純度蛋黃卵磷脂在370～510nm有雜質(zhì)吸收峰，可見本發(fā)明工藝制備的蛋黃卵磷脂產(chǎn)品明顯優(yōu)于市售高純度的蛋黃卵磷脂樣品。
具體實施方案實施例1取蛋黃粉6Kg(組成為水≤4.0％，游離脂肪酸≤4.5％，脂肪≥60.0％。下同)，用78％乙醇溶液作濕潤劑，制成軟材，造粒，在50℃下干燥，得含水量為2.6％的蛋黃粉顆粒。置超臨界二氧化碳萃取釜中，預(yù)熱至設(shè)定溫度后，CO2經(jīng)高壓泵開至36Mpa，采用靜態(tài)萃取30min后，開始循環(huán)萃取。萃取釜的壓力為36MPa，溫度50℃，一級分離8MPa/55℃，二級分離5MPa/40℃，二氧化碳的流量為42Kg/Kg原料·h。循環(huán)萃取3小時后，于分離器中收集蛋黃油和膽固醇。從萃取釜中取出脫去蛋黃油和膽固醇的蛋黃粉3.3Kg用85％乙醇15000ml攪拌溶解，澄清液于3000pa，40℃進行真空低溫濃縮至2200ml，用少量丙酮洗滌后，加入9000ml95％乙醇溶解后再加6000ml水，攪拌離心，析出物置-20℃預(yù)凍后，于-45℃，30Pa進行冷凍干燥，得注射用蛋黃卵磷脂產(chǎn)品834g，收率為13.9％(對投料蛋黃粉量計，下同)。
實施例2取蛋黃粉5Kg，用80％的乙醇溶液作濕潤劑，制成軟材，造粒，在45℃下干燥，得含水量為2.3％的蛋黃粉顆粒。置超臨界二氧化碳萃取釜中，預(yù)熱至設(shè)定溫度后，CO2經(jīng)高壓泵開至40Mpa，采用靜態(tài)萃取40min后，開始循環(huán)萃取。萃取釜的壓力為40MPa，溫度45℃，一級分離10Mpa/50℃，二級分離4.5MPa/40℃，二氧化碳的流量為50Kg/Kg原料·h。循環(huán)萃取3小時，即可完全脫去蛋黃油和膽固醇。從萃取釜中取出脫去蛋黃油和膽固醇的蛋黃粉2.6Kg用95％乙醇13000ml攪拌溶解，澄清液于3500pa，40℃進行真空低溫濃縮至1900ml，用少量丙酮洗滌后，加入95％乙醇7500ml溶解后再加5000ml水，攪拌離心，析出物置-20℃預(yù)凍后，于-45℃，35Pa進行冷凍干燥，得注射用蛋黃卵磷脂產(chǎn)品675g，收率為13.5％。
實施例3取蛋黃粉4Kg，用90％乙醇溶液作濕潤劑，制成軟材，造粒，在40℃下干燥，得含水量為2.1％的蛋黃粉顆粒。置于超臨界二氧化碳萃取釜中，預(yù)熱至設(shè)定溫度后，CO2經(jīng)高壓泵開至32Mpa，采用靜態(tài)萃取90min后，開始循環(huán)萃取。萃取釜的壓力為32Mpa，溫度55℃，一級分離12MPa/60℃，二級分離6MPa/42℃，二氧化碳的流量為48Kg/Kg原料·h。。循環(huán)萃取2.5小時，即可完全脫除蛋黃油和膽固醇。從萃取釜中取出脫去蛋黃油和膽固醇的蛋黃粉2.1Kg用80％乙醇9000ml攪拌溶解，澄清液于4000pa，40℃進行真空低溫濃縮至1500ml，用少量丙酮洗滌后，加入7000ml95％乙醇溶解后加4500ml水，攪拌離心，析出物置-21℃預(yù)凍后，于-45℃，28Pa進行冷凍干燥，得注射用蛋黃卵磷脂產(chǎn)品552g，收率為13.8％。
實施例4取蛋黃粉5.5Kg，用82％的乙醇溶液作濕潤劑，制成軟材，造粒，在45℃下干燥，得含水量為2.3％的蛋黃粉顆粒。置超臨界二氧化碳萃取釜中，預(yù)熱至設(shè)定溫度后，CO2經(jīng)高壓泵開至38Mpa，采用靜態(tài)萃取60min后，開始循環(huán)萃取。萃取釜的壓力為38MPa，溫度48℃，一級分離7.8MPa/52℃，二級分離5.2MPa38℃，二氧化碳的流量為54Kg/Kg原料·h。。循環(huán)萃取2.5小時后，即可完全去除蛋黃油和膽固醇。從萃取釜中取出去除蛋黃油和膽固醇的蛋黃粉2.9Kg用85％乙醇25000ml攪拌溶解，取澄清液于4200pa，38℃進行真空低溫濃縮至2100ml，用少量丙酮洗滌后，加入93％乙醇8000ml溶解后再加5800ml水，攪拌離心，析出物置-22℃預(yù)凍后，于-45℃，32Pa進行冷凍干燥，得注射用蛋黃卵磷脂748g，收率為13.6％。
實施例5取蛋黃粉4.8Kg，用73％的乙醇溶液作濕潤劑，制成軟材，造粒，在46℃下干燥，得含水量為1.9％的蛋黃粉顆粒。置超臨界二氧化碳萃取釜中，預(yù)熱至設(shè)定溫度后，CO2經(jīng)高壓泵開至42Mpa，采用靜態(tài)萃取40min后，開始循環(huán)萃取。萃取釜的壓力為42MPa，溫度48℃，一級分離9.5MPa/50℃，二級分離5MPa/40℃，二氧化碳的流量為63Kg/Kg原料·h。循環(huán)萃取3.5小時，即可去除蛋黃油和膽固醇。從萃取釜中取出脫去蛋黃油和膽固醇的蛋黃粉2.4Kg用14000ml 95％的乙醇攪拌溶解，澄清液于4000pa，40℃進行真空低溫濃縮至2000ml，用少量丙酮洗滌后，加入95％乙醇7500ml溶解后加5000ml水，攪拌離心，析出物置-23℃預(yù)凍后，于-45℃，27Pa進行冷凍干燥，得注射用蛋黃卵磷脂產(chǎn)品691g，收率為14.4％。
實施例6取蛋黃粉3.5Kg，用75％的乙醇溶液作濕潤劑，制成軟材，造粒，在50℃下干燥，得含水量為2.1％的蛋黃粉顆粒。置于超臨界二氧化碳萃取釜中，預(yù)熱至設(shè)定溫度后，CO2經(jīng)高壓泵開至38Mpa，采用靜態(tài)萃取60min后，開始循環(huán)萃取。萃取釜的壓力為38MPa，溫度46℃，一級分離9MPa/50℃，二級分離5MPa/38℃，二氧化碳的流量為38KKg/Kg原料·h。。循環(huán)萃取3.5小時，即可去除蛋黃油和膽固醇。從萃取釜中取出脫去蛋黃油和膽固醇的蛋黃粉1.7Kg用80％乙醇21000ml攪拌溶解，澄清液于4000pa，40℃進行真空低溫濃縮至1500ml，用少量丙酮洗滌后，加入95％乙醇6500ml溶解后再加4000ml水，攪拌離心，析出物置-25℃預(yù)凍后，于-45℃，30Pa進行冷凍干燥，得注射用蛋黃卵磷脂產(chǎn)品493.5g，收率為14.1％。
實施例所得的蛋黃油及卵磷脂收率和卵磷脂產(chǎn)品中殘余溶媒含量結(jié)果匯總見下表

按中國衛(wèi)生部藥品標準二部第六冊(生化藥品分冊)中(供注射用)“卵磷脂”的方法進行理化指標檢測分析，結(jié)果見下表

注射用蛋黃卵磷脂產(chǎn)品的組分檢測采用“SHIMATZU”-高效液相色譜儀GC-6A，以己烷/異丙醇/水作為洗脫液，以二氧化硅為載體的分流柱進行分離，使用耐受100℃的漂移管，ELSD光散射檢測器的規(guī)格為VAREXMKIII，(美國)，結(jié)果見下表

蛋黃卵磷脂產(chǎn)品乳化力的測定方法精密稱取0.2g的蛋黃卵磷脂樣品，加入0.25M的KH2PO4緩沖液200ml，充分攪拌使溶解，取出50ml加入50ml的精制大豆油，高速攪拌乳化后，靜置，觀察10ml、20ml、30ml處油相與水相分離時間，分離時間與乳化力成正比，也就是說分離時間越長乳化力越好，結(jié)果見表

實施例中供注射用蛋黃卵磷脂產(chǎn)品中各種元素的含量表

檢測依據(jù)JY/T015-1996(國家教委“感耦等離子體原子發(fā)射光譜通則”)測試使用儀器IRISAdvantage(HR)全譜直讀等離子體原子發(fā)射光譜儀。括號內(nèi)的數(shù)據(jù)為本儀器的定量測定下限，供參考。
用AFS-230型原子熒光光度計檢測，砷(As)含量平均值為0.0096μg/g，汞(Hg)0.020μg/g，均符合規(guī)定。
按中國藥典對實施例1～6所制得的蛋黃卵磷脂產(chǎn)品，進行了異常毒性試驗、熱源檢測、過敏性試驗、降壓試驗、細菌檢測等各項指標均符合注射劑規(guī)定。
權(quán)利要求
1.一種供注射用的蛋黃卵磷脂，產(chǎn)品的皂化值為195.0～212.0，含磷量為3.5～4.1％，含氮量為1.75～1.95％，其特征在于在卵磷脂中含有甘油三酸酯(TP)0.5～3.0％，磷脂酰膽堿(PC)70～90％，溶血磷脂酰膽堿(LPC)0.1～3.0％，磷脂酰乙醇胺(PE)7.0～16.0％，溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)≤1.0％，神經(jīng)鞘磷脂(SM)1.0～3.0％，游離脂肪酸≤1.0％。
2.一種供注射用的蛋黃卵磷脂的制備方法，其特征在于用蛋黃粉為原料，用常規(guī)的藥物制粒工藝制成含水量≤3.0％的顆粒，投入超臨界二氧化碳萃取裝置的萃取釜中，采用超臨界二氧化碳萃取和二級分離方法，萃取釜的壓力為30～50MPa，溫度為45～55℃；第一級分離壓力8～12MPa，分離溫度45～60℃；第二級分離壓力4～7MPa，分離溫度35～45℃，二氧化碳的流量為30～56Kg/Kg原料.h，萃取時間2～5小時，在分離釜中收集到蛋黃油和膽固醇；從萃取釜中取出脫去蛋黃油及膽固醇的蛋黃粉加4～15倍量的乙醇溶解，取澄清溶液濃縮至投料量的1/4～2/3時用丙酮洗滌，所得的固體物用乙醇溶解后加水攪拌，離心得沉淀物進行冷凍干燥，所得干品為注射用的蛋黃卵磷脂。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的蛋黃卵磷脂的制備方法，其特征在于，所說的超臨界二氧化碳萃取是先靜態(tài)萃取0.5～1.5小時，然后再循環(huán)萃取1.5～3.5小時，在循環(huán)萃取過程中同時進行二級分離。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的蛋黃卵磷脂的制備方法，其特征在于所說的脫去蛋黃油及膽固醇的蛋黃粉加4～15倍量的乙醇溶解時，用70～100％的乙醇溶液溶解。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的蛋黃卵磷脂的制備方法，其特征在于所說的脫去蛋黃油及膽固醇的蛋黃粉加4～15倍量的乙醇溶解時用90～95％的乙醇溶液溶解。
全文摘要
本發(fā)明是一種供注射用的蛋黃卵磷脂及其制備方法，涉及由含有蛋白和脂肪的動物原材料中獲得有用物質(zhì)，尤其是涉及由蛋黃粉獲得注射用的蛋黃卵磷脂及其制備方法。該法是以蛋黃粉為原料，制成含水量≤3.0％的顆粒后，采用超臨界二氧化碳先靜態(tài)萃取0.5～1.5小時后，連續(xù)循環(huán)萃取1.5～3.5小時，同時進行二級分離。將去除蛋黃油和膽固醇的蛋黃粉用乙醇溶解濃縮，用丙酮洗滌后乙醇溶解，加水沉淀出卵磷脂，進行冷凍干燥得到注射用蛋黃卵磷脂。本發(fā)明工藝設(shè)備簡單，易于操作，大大減少了有機溶劑的用量，減少了環(huán)境污染，生產(chǎn)成本低；產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，溶媒殘留量低。
文檔編號A61K31/683GK1522703SQ03140389
公開日2004年8月25日 申請日期2003年9月4日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月4日
發(fā)明者葛發(fā)歡, 李金華, 林秀仙, 周錦珂, 史慶龍 申請人:廣州漢方現(xiàn)代中藥研究開發(fā)有限公司