專利名稱：五步蛇毒溶解纖維蛋白(原)No.2基因及其應(yīng)用的制作方法
專利說明五步蛇毒溶解纖維蛋白(原)No.2基因及其應(yīng)用 本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說涉及尖吻蝮蛇(五步蛇毒)溶解纖維蛋白(原)No.2基因、含有該基因的載體、利用該載體進(jìn)行基因工程化的宿主細(xì)胞以及將該基因用于制備溶解纖維蛋白(原)的藥物，以對(duì)抗血栓形成所引起的栓塞性疾病。血管內(nèi)血栓形成所引起的栓塞性疾病，尤其是心肌梗塞及腦中風(fēng)，為目前世界上對(duì)人類健康危害最大的疾患，其發(fā)病率及病死率均居各病之首。在我國，隨著大部分傳染性疾病被控制、人們生活水平的顯著提高、人群壽命的普遍延長(zhǎng)和人口結(jié)構(gòu)老齡化的發(fā)展，心、腦血管血栓病的發(fā)病率在各種疾病中已上升至第一位和第二位，每年發(fā)病300萬人以上。并且有理由預(yù)期，此類疾病的發(fā)病率今后仍會(huì)進(jìn)一步增高。
目前，栓塞性疾病的治療主要依靠抗血小板藥(如阿斯匹林)、抗凝血藥(如肝素)和纖溶酶原激活藥。從原理上說，阿斯匹林和肝素均是抑制凝血機(jī)制，使血液失凝而起到預(yù)防血栓形成及血栓擴(kuò)大的作用，對(duì)已經(jīng)存在的血栓則無效，不能作為治療尤其是急救使用。纖溶酶原激活物為目前臨床常用的治療血栓病的藥物，包括鏈激酶、尿激酶和組織型纖溶酶原激活物(tPA)。它們共同的機(jī)制是將內(nèi)源性的無活性纖溶酶原激活為纖溶酶，后者水解血栓中的纖維蛋白而溶栓。因此，這類藥物的共同特點(diǎn)是，其溶纖作用是間接的，起效較慢，且作用較弱，尤其對(duì)較大的血栓更是如此。而在心、腦血管發(fā)生栓塞的情況下，心肌與神經(jīng)元在血流被切斷后，缺氧數(shù)分鐘即發(fā)生死亡。由于其間接溶栓的作用原理，還使得上述三種藥物有對(duì)血栓選擇性差、易引起出血等副作用。此外，鏈激酶還會(huì)發(fā)生過敏反應(yīng)，tPA價(jià)格昂貴而限制了其廣泛的應(yīng)用。
尤其需要著重指出的是，現(xiàn)在使用的溶栓藥，即使聯(lián)合應(yīng)用也有約有25％的患者無效。此外約5-30％的患者使用現(xiàn)有的溶栓藥后發(fā)生“血管再閉塞”。而且此種再閉塞對(duì)繼續(xù)使用溶栓藥無效。
綜上所述，現(xiàn)有的溶栓藥不能完全滿足臨床的使用要求，迫切需要發(fā)展效能更高、療效更加專一迅速的溶栓藥物。
國外有關(guān)蛇毒的研究報(bào)道Agkistrodon contortrix蛇毒含有直接作用的纖溶酶，Crotalus atrox(western diamondback rattlesnake)蛇毒也含有纖維蛋白(原)水解酶，但不激活纖溶酶原，在大鼠靜脈血栓模型靜脈給藥，用造影技術(shù)顯示有溶栓作用。用組織學(xué)的方法檢查未發(fā)現(xiàn)有腎、肝、心、肺組織壞死和出血的反應(yīng)。
在我國臨床上使用的蛇毒制品如去纖酶、抗栓酶，其機(jī)理如凝血酶一樣，是將血漿的纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白，降低血漿的粘度，以求達(dá)到抗栓作用。其療效與機(jī)制根本不能與溶栓藥相比擬。
我國獨(dú)有的五步蛇毒(Agkistrodon acutus venom)中含有直接溶解纖維蛋白的成分，并且具強(qiáng)烈的生物活性。用柱層析方法分離純化法，從15個(gè)組份中得到幾種具有溶纖作用的蛋白質(zhì)。其中組份II(纖溶因子)具有極高應(yīng)用價(jià)值的生物特性(1)直接溶栓用熱板法破壞纖溶酶原后，纖溶因子仍能溶解纖維蛋白；(2)作用快速在體外實(shí)驗(yàn)中，纖溶因子作用比尿激酶快一倍；(3)效能高纖溶因子的生物活性比尿激酶更強(qiáng)(130μg相當(dāng)于尿激酶450u)；(4)副作用低盡管未經(jīng)純化的五步蛇毒具有明顯的出血作用，但纖溶因子在500μg/ml濃度下，亦未見出血反應(yīng)。上述這些特點(diǎn)，強(qiáng)烈支持來自五步蛇毒中的纖溶因子可能成為新一代的治療血栓性疾病的藥物。
但是，自然來源的五步蛇毒，其成分與生物活性都存在著地區(qū)性、季節(jié)性變異，實(shí)際上難于取得穩(wěn)定的臨床療效；此外，由于粗制品蛇毒中成份復(fù)雜，雖經(jīng)純化處理，仍難獲得真正單一的化學(xué)成份，使臨床應(yīng)用隱含某些毒副作用；自然蛇毒產(chǎn)量有限，成本較高，市場(chǎng)占有能力低；其分子結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)與活性的關(guān)系，用蛋白質(zhì)技術(shù)依然不能闡明。因此，解決上述問題，對(duì)真正確立纖溶因子的臨床應(yīng)用的科學(xué)基礎(chǔ)無疑是必不可少的。
酵母不需要特殊的培養(yǎng)基就能迅速生長(zhǎng)和大規(guī)模發(fā)酵；酵母的DNA較簡(jiǎn)單并且克隆篩選方便；酵母是真菌生物具有較大腸桿菌完備的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制和對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的加工修飾，如可以糖基化，能形成正確的二硫鍵等等，已有蛇毒蛋白在酵母表達(dá)成功的先例。本課題以五步蛇毒纖溶因子FII的抗體作探針，從五步蛇毒腺cDNA文庫中篩選出FII的基因，克隆到酵母表達(dá)載體PPIC9K，轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)五步蛇毒纖溶因子FII在酵母中的高效表達(dá)，用層析法純化重組五步蛇毒纖溶因子FII并測(cè)定其溶解纖維蛋白的活性。本研究獲得大量基因工程制備的五步蛇毒纖溶因子FII，為后續(xù)1類新藥的藥效學(xué)研究及評(píng)價(jià)奠定了基礎(chǔ)。
蛇毒的研究曾經(jīng)對(duì)生物醫(yī)學(xué)的發(fā)展起過關(guān)鍵的作用，如從蛇毒中分離DNA內(nèi)切酶，極大地推動(dòng)過分子生物學(xué)的研究，從銀環(huán)蛇毒中發(fā)現(xiàn)毒素，為神經(jīng)遞質(zhì)受體的純化起了決定性的作用。本發(fā)明用基因工程制備的五步蛇毒纖溶因子FII，與現(xiàn)在臨床應(yīng)用的多種蛇毒生化制劑相比，可以克服生物活性的地區(qū)差異和化學(xué)不均一性，提高療效和產(chǎn)量，成為具有巨大市場(chǎng)價(jià)值并具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的臨床新藥。五步蛇毒纖溶因子FII可以直接溶解纖維蛋白，在有效纖溶劑量下未見出血反應(yīng)。粗制品蛇毒成份復(fù)雜，難以純化為單一成份；蛇毒產(chǎn)量有限，不利于大規(guī)模生產(chǎn)，應(yīng)用基因工程技術(shù)表達(dá)纖溶因子可解決上述問題。本發(fā)明從五步蛇粗毒中分離纖溶因子FII；完成纖溶因子FII基因的篩選、克?。辉诮湍讣?xì)胞中表達(dá)纖溶因子FII；純化表達(dá)產(chǎn)物并測(cè)定纖溶活性。
方法采用離子交換層析和凝膠過濾從五步蛇毒中分離天然五步蛇毒纖溶因了FII，用纖維蛋白原、纖維蛋白作底物測(cè)定其活性，通過SDS-PAGE觀察其在纖維蛋白原的作用位點(diǎn)；制備多克隆抗體、單克隆抗體及五步蛇毒腺cDNA文庫，用抗體作探針從文庫中篩選纖溶因子FII基因，并用酶切連接等方法將其克隆入酵母表達(dá)質(zhì)粒PPIC9K中；通過轉(zhuǎn)化及篩選得到高表達(dá)酵母菌株；用離子交換層析和疏水層析純化重組五步蛇毒纖溶因子FII，SDS-PAGE檢測(cè)純度，纖維蛋白平板法測(cè)定其纖溶性；通過SDS-PAGE觀察其對(duì)IgG和白蛋白的作用；用狗肺血栓模型測(cè)定其體內(nèi)纖溶活性。
結(jié)果通過三次層析從粗毒中純化了纖溶因子FII，SDS-PAGE顯示為單一條帶，分子量為25,500。五步蛇毒纖溶因子FII降解纖維蛋白原的Aα、Bβ鏈，對(duì)γ鏈幾乎沒有降解作用；可以劑量依賴地溶解纖維蛋白。成功制備了多克隆抗體、單克隆抗體及五步蛇毒腺cDNA文庫，從文庫中篩選到一個(gè)纖溶因子FII基因，構(gòu)建了重組質(zhì)粒PPIC9K-FII。轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞后，PCR證實(shí)重組質(zhì)粒被整合到酵母染色體上。以降解纖維蛋白原活性為指標(biāo)，篩選到一高表達(dá)菌株，在表達(dá)第3天活性達(dá)到高峰。通過兩次層析純化的重組五步蛇毒纖溶因子FII在SDS-PAGE呈單一區(qū)帶，對(duì)纖維蛋白有較強(qiáng)的溶解作用，對(duì)IgG和白蛋白無降解作用。對(duì)右下肺動(dòng)脈血栓溶解很好，給藥1小時(shí)后再通率平均為83.3％。結(jié)論在酵母中高效表達(dá)了五步蛇毒纖溶因子FII，重組纖溶因子FII有較高的纖溶活性。
天然五步蛇毒分離的溶纖活性因子FII，產(chǎn)量較低，質(zhì)量不穩(wěn)定。本發(fā)明用基因工程酵母系統(tǒng)表達(dá)的溶纖因子，活性高，產(chǎn)量大，質(zhì)量穩(wěn)定，成本低。在整體動(dòng)物血栓模型，溶栓效果良好，出血反應(yīng)少。強(qiáng)烈地提示其可成為新型的強(qiáng)效的溶栓藥，社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益巨大。

圖1五步蛇毒的DEAE-SephadexA-50離子交換層析；圖2組分II的Sephadex G-75凝膠過濾柱層析；圖3用Sephadex G-75對(duì)組分II的重層析；圖4用SDS-PAGE對(duì)組分II進(jìn)行分子量定量；
圖5SDS-PAGE中蛋白標(biāo)記物的標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖6用SDS-PAGE分離的纖維蛋白原水解產(chǎn)物；圖7組分II的纖維蛋白活性；圖8五步蛇毒腺的全部RNA的甲醛瓊脂糖電泳；圖9五步蛇毒的CDMA文庫結(jié)構(gòu)；圖10抗體篩選五步蛇毒CDMA文庫中組分II的陽性結(jié)果；圖11九個(gè)陽性克隆的插入DNA片段的序列；圖12組分II的ORF DNA序列的推導(dǎo)的氨基酸序列；圖13在大腸桿菌中表達(dá)的組分II融合蛋白的SDS-PAGE分析；圖14在酵母中構(gòu)建組分II目標(biāo)DNA的表達(dá)載體的兩個(gè)步驟；圖15重組質(zhì)粒pPIC9K-FII的雙重限制；圖16用SDS-PAGE分析培養(yǎng)上清液的纖維蛋白活性；圖17培養(yǎng)上清液的DEAE-Sepharose離子交換層析；圖18培養(yǎng)上清液的Buty-Toyopearl層析；圖19用SDS-PAGE對(duì)重組組分II純度的分析；圖20重組組分II的直接纖維蛋白活性；圖21用SDS-PAGE分析重組組分II對(duì)IgG和白蛋白的效果；圖22重組組分II對(duì)狗右肺下動(dòng)脈血栓模型的溶栓效應(yīng)。一、五步蛇毒纖溶因子FII的分離1.DEAE-Sephadex A-50離子交換層析方法DEAE-Sephadex A-50離子交換凝膠在0.05M PH8.0的醋酸銨緩沖液中反復(fù)漂洗并在25℃浸泡約24小時(shí)后裝柱(凝膠柱直徑2.6cm、高100cm)。待流出液pH值接近8.0時(shí)平衡完成，3g五步蛇毒粗毒溶于10ml 0.05M PH8.0的醋酸銨緩沖液中，1500rpm 15分鐘離心去沉渣后上柱。用0.05M PH8.0的醋酸銨緩沖液和1M PH5.0的醋酸銨緩沖液各750ml作直線梯度洗脫，洗脫液收集速度為4tube/h，3ml/tube。在280nm波長(zhǎng)下測(cè)定光吸收值。測(cè)定各峰纖溶活性，具有纖溶活性的組分用mini透析脫鹽、濃縮后，真空冷凍干燥機(jī)凍干備用。
纖溶活性測(cè)定參照Astrup和Mullerti方法，用纖維蛋白平板法檢測(cè)纖溶活性。取0.2％小牛纖維蛋白原溶液20ml于直徑為9.5cm的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿水平放置，加入80μl的凝血酶(100U/ml)，混合搖動(dòng)均勻放置形成平板凝塊。加入待測(cè)樣品20μl于平板的表面，每一樣品加三點(diǎn)，37℃保溫12小時(shí)后，以溶解平板的面積表示纖溶活力。
結(jié)果五步蛇毒粗毒經(jīng)DEAE-Sephadex A-50離子交換層析得到10個(gè)蛋白峰(見圖1)，其中第2峰(FII)具有較高的纖溶活性，用纖維蛋白平板測(cè)得的纖溶活性為60.23±16.47mm2/μg。
2.Sephadex G-75凝膠層析方法Sephadex G-75凝膠用0.05M PH8.0的醋酸銨緩沖液反復(fù)漂洗并在25℃浸泡約24小時(shí)后裝柱(凝膠柱直徑1.1cm、高100cm)。平衡完成后，將DEAE-Sephadex A-50離子交換層析得到的纖溶成分85mg溶于2ml 0.05M PH8.0的醋酸銨緩沖液中，上柱，用0.05M PH8.0的醋酸銨緩沖液洗脫，洗脫液在280nm波長(zhǎng)下測(cè)定光吸收值，按前述方法測(cè)定活性后，收集需要活性蛋白峰。
結(jié)果進(jìn)一步經(jīng)Sephadex G-75凝膠過濾層析，得到2個(gè)蛋白峰((見圖2)，其中第一峰有較高的纖溶活性，其纖溶活性為87.51±24.95mm2/μg。
3.Sephadex G-75凝膠再次層析方法將第一次Sephadex G-75凝膠過濾得到的纖溶成分60mg按方法2再次層析。
結(jié)果再次用Sephadex G-75凝膠過濾層析得到一個(gè)蛋白峰(見圖3)，其纖溶活性為90.49±12.41mm2/μg。
二、五步蛇毒纖溶因子FII的純度及活性測(cè)定1.五步蛇毒纖溶因子FII的純度檢測(cè)方法采用SDS-PAGE垂直平板式電泳，分離膠濃度12％，PH8.8，濃縮膠濃度4％，PH6.8，電極緩沖液采用Tris-甘氨酸，電壓200V，電泳時(shí)間為45分鐘。電泳后用20％的三氯乙酸固定，考馬斯亮蘭R250染色，45％甲醇、7％的乙酸脫色。五步蛇毒纖溶因子FII(1mg/ml)20μl上樣。分子量標(biāo)準(zhǔn)采用MBP-β-galactosidase(175,000)，MBP-paramyosin(83,000)，Glutamic dehydrogenase(62,000)，Aldolase(47,500)，Triosephosphate isomerase(32,500)，β-LactoglobulinA(25,000)，Lysozyme(16,500)。
結(jié)果經(jīng)SDS-PAGE得到一條區(qū)帶(見圖4)，通過標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的相對(duì)遷移率Rf(X)對(duì)分子量對(duì)數(shù)1gMW作回歸曲線(見圖5)，得方程1gMW＝-1.55X+5.51，r＝0.95，由此方程計(jì)算得五步蛇毒纖溶因子FII的分子量為25,550。
2.五步蛇毒纖溶因子FII溶解纖維蛋白原活性測(cè)定方法取0.2％的牛纖維蛋白原溶液75μl加于Ependoff管中，再加入五步蛇毒纖溶因子FII(2mg/ml)25ull在37℃保溫。保溫1h時(shí)間后加電泳蛋白質(zhì)樣品處理液50μl，取20μl做SDS-PAGE。以人纖溶酶(0.05U/ml)25μl作陽性對(duì)照。
結(jié)果牛纖維蛋白原與FII作用后的SDS-PAGE結(jié)果(見圖6)。FII對(duì)纖維蛋白原的Aα鏈、Bβ鏈有水解作用，γ鏈幾乎沒有水解，產(chǎn)生的降解片段主要為45,000Da，而纖溶酶對(duì)纖維蛋白原的Aα鏈、Bβ鏈、γ鏈均有水解作用，產(chǎn)生的降解片段分子量為47,000Da、44,000Da和23,000Da，表明FII與纖溶酶均能降解纖維蛋白原，但作用位點(diǎn)不同。
3.五步蛇毒纖溶因子FII溶解纖維蛋白活性測(cè)定方法取0.2％的牛纖維蛋自原20ml于直徑為9.5cm的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿水平放置，加入凝血酶(100U/ml)80μl，混合搖動(dòng)均勻放置形成的纖維蛋白平板凝塊后，加入待測(cè)樣品20μl于平板的表面，每一樣品加三點(diǎn)。37℃保溫12小時(shí)后，以溶解平板的面積表示纖溶活力。
結(jié)果纖維蛋白平板法測(cè)定0.25mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml四個(gè)濃度的五步蛇毒纖溶因子FII纖維蛋白溶解活性，以500u/ml的尿激酶和生理鹽水分別作陽性和陰性對(duì)照。不同濃度五步蛇毒纖溶因子FII的纖維蛋白溶解活力(見表1)，表明五步蛇毒纖溶因子FII可以劑量依賴性地溶解纖維蛋白(見圖7)。
表1.組分II的纖維蛋白活性.(n＝3，mean±SD)Concentration Lysed area(mg/ml) (mm2)0.25 31.33±3.400.5 60.00±3.271 105.00±4.082 137.67±5.31三、抗五步蛇毒纖溶因子FII抗體的制備1.兔抗五步蛇毒纖溶因子FII抗血清的制備方法(1)動(dòng)物免疫 3mg/ml的五步蛇毒纖溶因子FII 1ml與1ml完全弗氏佐劑充分混合乳化后，兔背部皮下多點(diǎn)注射，每周加強(qiáng)免疫一次，共免疫4周。
(2)抗血清制備 已免疫家兔用3％戊巴比妥鈉麻醉后，頸動(dòng)脈插管取血，在室溫下凝固后，離心收上清，放于4℃使血清析出。
(3)ELISA測(cè)定抗體效價(jià) 分別取0.1mg/ml的五步蛇毒纖溶因子FII(溶于pH9.5，NaHCO3/Na2CO3緩沖液)100μl于酶標(biāo)板各孔中，4℃過夜，包被酶標(biāo)板。次日，去掉孔中的液體，用PBST(0.05％Tween-20)洗兩次。用封閉液[1×PBS，1％BSA(bovine serum albumin)]37℃封閉1h，去除封閉液加入2×系列稀釋的兔抗血清(一抗，用1×PBS，1％BSA稀釋)，37℃孵育1h，用PBST洗滌酶標(biāo)板3次，加入羊抗兔HRP-IgG(二抗，1∶1000稀釋)，37℃孵育1h，用PBST洗滌3次后，每孔分別加入底物液A、B各一滴，據(jù)顏色確定抗血清的效價(jià)。
結(jié)果用純化的五步蛇毒五步蛇毒纖溶因子FII作為抗原免疫1、2號(hào)兩只家兔，在免疫4周后，制備抗血清，用ELISA法測(cè)定家兔的抗五步蛇毒纖溶因子FII血清抗體效價(jià)。結(jié)果顯示兩只家兔抗五步蛇毒類凝血酶的血清抗體效價(jià)均為1∶20,000。
2.五步蛇毒纖溶因子FII單克隆抗體的制備方法(1)免疫與細(xì)胞融合及克隆篩選 將五步蛇毒纖溶因子FII(1mg/ml)與等體積完全弗氏佐劑充分混合乳化后，給予7周齡的Balb/C小鼠皮下注射，每次注射0.2ml。2周免疫1次，共免疫3次。融合前3d以0.2ml五步蛇毒纖溶因子FII(1mg/ml)尾靜脈注射。取免疫小鼠脾細(xì)胞制備細(xì)胞懸液與鼠SP2/10骨髓瘤細(xì)胞按10∶1比例混合，在＝50％PEG(u 3700)作用下融合后，分別接種在5塊96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，置于＝5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。第1天至第4天用含＝15％胎牛血清的HAT選擇培養(yǎng)基，第4天至第10天改用的HT培養(yǎng)基。第10天后改用含＝10％胎牛血清的RPMI-1640。
(2)按前述方法用ELISA測(cè)定抗體效價(jià)結(jié)果通過2次融合篩選到20株抗纖溶因子FII細(xì)胞株，其中兩株特異性高(命名為C1、C4)，用IgG分類試劑盒檢測(cè)表明兩株雜交瘤分泌的單克隆抗體均為IgGI，兩株單克隆抗體高效價(jià)。
四、五步蛇毒腺表達(dá)型cDNA文庫的構(gòu)建1.標(biāo)本及總RNA的提取方法(1)將五步蛇斷頭處死，立即取毒腺，取出后放入Eppendorf管，立即用干冰速凍。
(2)用Promega公司試劑盒提取總RNA。稱取雙側(cè)毒腺約1.7g，勻漿后加入20ml變性溶液，再勻漿20秒，加入2M乙酸鈉2ml充分混勻，再加入1ml酚-氯仿-異丙醇混勻，振蕩10秒，冰浴90秒，離心(4℃，12,000rpm，20min)，將上清移至50ml的離心管中，加等體積異丙醇，混勻在-30℃放置20min，離心(4℃，12,000rpm，15min)沉淀RNA。棄上清，沉淀用75％冰冷的乙醇洗滌，離心去上清后，真空干燥，用DEPC(焦碳酸二乙酯)處理的水溶解，測(cè)定RNA的含量及純度。
結(jié)果本實(shí)驗(yàn)用一步酚法提取總RNA426μg，OD260/OD280的比值為20。經(jīng)甲醛瓊脂糖凝膠電泳(見圖8)顯示，18S和28S兩條rRNA帶清晰，且28S的熒光強(qiáng)度約為18S的二倍，表明提取的總DNA保持了較好的分子完整性。
2.RNA的分離純化方法Oligo(dT)纖維柱用層析加樣緩沖液充分洗滌，然后將溶解在DEPC水中的RNA(3mg)于65℃保溫5min，冰浴速降至室溫。加等體積的上樣緩沖液后上柱，用加樣緩沖液洗3次，然后用洗脫緩沖液洗脫mRNA。在260nm波長(zhǎng)下測(cè)定mRNA的光吸收值，計(jì)算純化的mRNA的量。
結(jié)果將總RNA經(jīng)過Oligo(dT)纖維素親和層析柱分離得到mRNA的量為10μg。
3.cDNA文庫的構(gòu)建方法(按照Promega公司cDNA合成試劑盒說明，流程圖(見圖9)(1)cDNA第一鏈的合成。
(2)cDNA第二鏈的合成。
(3)在雙鏈cDNA的末端連接Not I、Sal I接頭。
(4)雙鏈cDNA的連接和轉(zhuǎn)化 含有Not I、Sal I接頭的雙鏈cDNA與線性化載體pSport I 1μg用T4連接酶在16℃連接過夜。連接產(chǎn)物10μl加入50μl感受態(tài)大腸桿菌DH5α中，依次4℃，30min；42℃，120s；4℃，5min；37℃，10min；37℃搖動(dòng)培養(yǎng)1h。取2μl分別稀釋10、100、1000倍，涂布于含氨芐青霉素50μg/ml的LB瓊脂板上，37℃倒置培養(yǎng)12h至單菌落形成，計(jì)數(shù)菌斑并計(jì)算cDNA文庫的滴度，文庫液-80℃保存。
結(jié)果將文庫菌液稀釋后涂板計(jì)數(shù)菌落，計(jì)算出文庫菌液的滴度為5×107pfu/ml。
五、五步蛇毒纖溶因子FII基因的獲得1.抗體篩選cDNA文庫方法(1)取文庫菌液適當(dāng)稀釋后，取100μl，均勻涂布于含氨芐青霉素50μg/ml的LB培養(yǎng)板上，37℃倒置培養(yǎng)12-16h至菌落長(zhǎng)至針尖大小。
(2)將用IPTG(10mmol/ml)溶液浸透并晾干的NC膜(硝酸纖維素膜)貼在長(zhǎng)滿菌落的LB培養(yǎng)板，用針頭在3個(gè)不對(duì)稱的位置上作好標(biāo)記，揭下NC膜置于瓊脂糖板上(有菌落的一面朝上)，置37℃再培養(yǎng)6-8h，原LB培養(yǎng)板于4℃保存。
(3)取出NC膜，用氯仿固定30min后，置于封閉液(4μg/ml溶菌酶、1μg/ml DNA酶、1％BSA)中輕搖30min，隨后用PBST洗膜3次(每次15ml，5min)，在10ml兔抗血清稀釋液中(1×PBS，1％BSA，一抗稀釋比1∶1000)輕搖NC膜3h，用PBST洗膜3次(每次15ml，5min)，NC膜與10ml羊抗兔HRP-IgG(二抗，1∶1000稀釋)輕搖3h，再洗膜3次。
(4)NC膜在DAB顯色液中輕搖30min，用蒸餾水漂洗，觀察。陽性克隆為棕色，對(duì)照原LB培養(yǎng)板，找出陽性菌落。
(5)將多克隆陽性克隆分別涂板，用單抗再次篩選、方法同前。
結(jié)果用多克隆抗體(兔抗血清)以直徑為9cm平板約含5×103個(gè)菌落的密度進(jìn)行篩選，共篩選了約20萬個(gè)菌落，獲得15個(gè)初篩陽性克隆，每一克隆再復(fù)篩一次，仍呈陽性反應(yīng)的克隆共有11個(gè)。(陽性反應(yīng)克隆在NC膜上呈現(xiàn)棕色斑點(diǎn)，見圖10)。
將上述11個(gè)免疫血清篩選好的陽性克隆分別涂板，用單克隆抗體再次篩選，有9個(gè)與C1、C4兩株單抗均起陽性反應(yīng)。
2.抽提質(zhì)粒cDNA序列測(cè)定方法按照QIAGEN公司的質(zhì)粒提取試劑盒說明書進(jìn)行。挑取陽性單菌落，于5ml LB培養(yǎng)基中37℃振蕩培養(yǎng)24h。
(1)取1.5ml過夜培養(yǎng)菌，離心30s(4℃，12000rpm)，回收細(xì)菌。
(2)棄上清，沉淀用250μl溶液P1重懸，劇烈振蕩，直到看不見塊狀細(xì)菌。
(3)加入250μl溶液P2，快速顛倒離心管5次。
(4)加入350μl溶液N3，立即將管倒置，顛倒5次，使溶液在粘稠的細(xì)菌裂解物中分散均勻。
(5)離心10min(4℃，12000rpm)，可見白沉淀。
(6)吸取上清液移入QIA離心柱中。離心30-60s，丟棄離心液。
(7)加入0.5ml溶液PB，離心30-60s，丟棄離心液。
(8)加入0.75ml溶液PE，離心30-60s，丟棄離心液。
(9)空離心1min。
(10)加50μl溶液EB或H2O，靜置1min，離心1min。
抽提的質(zhì)粒，以T7和SP6作測(cè)序引物，采用Sanger雙脫氧末端終止法測(cè)定插入片段的序列。
結(jié)果分別挑取上述9個(gè)陽性單菌落，于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中過夜振蕩培養(yǎng)后，取1.5ml抽提質(zhì)粒。用質(zhì)粒多克隆位點(diǎn)兩端的通用引物T7、SP6做引物，進(jìn)行PCR反應(yīng)，9個(gè)陽性克隆全部擴(kuò)增出特異條帶。
采用Sanger雙脫氧末端終止法，將上述9個(gè)陽性克隆插入cDNA片斷全部測(cè)序，結(jié)果(見圖11)。
3.序列的同源性分析方法通過互聯(lián)網(wǎng)進(jìn)入NCBI(The National Center of BiotechnologyInformation)網(wǎng)站，運(yùn)用BLASTn和BLASTp程序進(jìn)行核苷酸和推導(dǎo)可能蛋白質(zhì)的同源性分析。確定含有五步蛇毒纖溶因子FII基因的FII質(zhì)粒。
結(jié)果把得到的9個(gè)cDNA序列在NCBI-BlasTn和BLASTP數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性檢索，發(fā)現(xiàn)這幾個(gè)序列大多屬于SVMPs家族(氨基酸序列同源性最高可達(dá)85％)，而其中的FII-2和和FII-4在序列上更為保守，屬于與SVMPs家族相關(guān)的ADAM家族。功能實(shí)驗(yàn)表明FII-4具有溶纖性大，出血性小特點(diǎn)，故而在得到的9個(gè)cDNA序列中，優(yōu)先對(duì)FII-2(將含有該插入序列的質(zhì)粒定為FII質(zhì)粒，該序列以下即將其稱為FII基因)進(jìn)行蛋白表達(dá)。其可能的氨基酸序列(見圖12)。
六、五步蛇毒纖溶因子FII基因在大腸桿菌中的表達(dá)方法取0.2ml過夜菌(經(jīng)過抽提含F(xiàn)II質(zhì)粒的菌落)加入20ml含氨芐的SOB培養(yǎng)基中，37℃振搖3小時(shí)至OD600＝0.5左右，加入IPTG終濃度為1μm，振搖4小時(shí)，1500rpm，離心20min，去上清，沉淀加0.5ml水及0.5ml SDS上樣緩沖液，100℃水浴5min，10,000rpm離心，取上清20μl上樣作SDS-PAGE。
結(jié)果經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)后的含F(xiàn)II質(zhì)粒的大腸桿菌裂解物，在SDS-PAGE圖譜上存在一大小約為40KD的條帶，在未誘導(dǎo)及空的大腸桿菌沒有此條帶(見圖13)。結(jié)果提示FII基因可以以融合蛋白的形式在大腸桿菌中表達(dá)。
七、五步蛇毒纖溶因子FII基因克隆方法(見流程14)1.PCR擴(kuò)增FII基因用兩步PCR法將α信號(hào)的序列引入目的基因的5’端，同時(shí)引入限制酶切位點(diǎn)。
引物15’AGA GAG GCT GAA GCT AAT CTT ACT CCT GAA C3’引物25’CT CTC GAG AAA AGA GAG GCT GAA GCT AAT C3’反向引物引物35’GAG CGG CCG CCT CAC GCC TCC AAA AGT TC3’步驟
(1)第一輪引物1為正向，引物3為反向，F(xiàn)II質(zhì)粒為模板 (2)第二輪為引物2為正向，引物3為反向以第一輪PCR產(chǎn)物為模板，反應(yīng)條件與第一輪相同。
2.重組質(zhì)粒PPIC9K-FII構(gòu)建(目的基因克隆到PPIC9中)第二輪PCR產(chǎn)物，經(jīng)1％瓊脂糖電泳后，切膠回收目的片段。將回收的目的片段及質(zhì)粒PPIC9分別用Xho I、Not I酶切，電泳、回收，然后在T4連接體系中，16℃連接12小時(shí)，轉(zhuǎn)化感受菌Top 10F，涂布含氨芐的LB培養(yǎng)板，挑取菌落，抽提質(zhì)粒，酶切鑒定，將含有目的片段的質(zhì)粒純化。
3.重組表達(dá)質(zhì)粒PPIC9K-FII構(gòu)建(目的基因克隆到PPIC9K中)用Sac I和Not I雙酶切帶有目的片段的質(zhì)粒PPIC9及質(zhì)粒PPIC9K，然后連接，轉(zhuǎn)化，挑取陽性克隆，鑒定，抽提大量PPIC9K-FII質(zhì)粒。
結(jié)果先以引物1、引物3為擴(kuò)增引物，F(xiàn)II質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，再以引物2，引物3作擴(kuò)增引物，前述PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，獲得一大小約為700bp的與五步蛇毒纖溶因子FII的基因大小一致產(chǎn)物。將產(chǎn)物回收后與質(zhì)粒PPIC-9分別用XhoI、NotI雙酶切，然后連接構(gòu)建重組質(zhì)粒PPIC9-FII，經(jīng)雙酶切反應(yīng)鑒定。
Sac I、Not I雙酶切重組質(zhì)粒 PPIC9-FII，將切下較小片段亞克隆入同樣用Sac I、Not I雙酶切的PPIC9K質(zhì)粒中，建立重組酵母表達(dá)質(zhì)粒PPIC9K-FII。經(jīng)雙酶切反應(yīng)鑒定，有大小為700bp為的產(chǎn)物，與理論值一致(見圖15)。用Sanger雙脫氧末端終止法進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果證明重組質(zhì)粒PPIC9K-FII中含有五步蛇毒纖溶因子FII的DNA序列。
八、五步蛇毒纖溶因子FII在酵母表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)1.酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化及篩選方法將提取的PPIC9K-FII質(zhì)粒50ug用Sac I酶切線性化，用酚、氯仿抽提，乙醇沉淀，TE溶解，-30℃凍存。酵母感受態(tài)的制備，采用3％聚乙二醇。將線性化的質(zhì)粒，加鮭魚精DNA混勻，加入酵母感受細(xì)胞內(nèi)，均勻涂布在兩塊RD平板上，30℃倒置平96小時(shí)，將RD板上的菌株用蒸餾水洗下，涂布在含不同濃度G418(0.5、1、2、3、4mg/ml的YPD平板上，倒置平板30℃培養(yǎng)，低濃度G418平板從第四天開始有菌落，第6天挑取3mg/ml G418平板上菌落，抽提DNA，PCR鑒定。
結(jié)果提取PPIC9K-FII質(zhì)粒，用Sac I酶切線性化，純化后用PEG法轉(zhuǎn)化感受態(tài)酵母細(xì)胞。轉(zhuǎn)化物涂布于含G418的YPD板上后，低濃度(0.5mg/ml)板第四天開始有菌落長(zhǎng)出。第六天挑取3mg/ml G418平板6個(gè)菌落。
2.高表達(dá)菌株的篩選及FII的大量表達(dá)方法挑取6株將經(jīng)PCR證實(shí)有目的基因的酵母菌株，分別接種在10ml的MD培養(yǎng)基中，30℃振搖過夜、離心、沉沉加入BMMY培養(yǎng)基，30℃振搖，每天補(bǔ)1％的甲醇，每天取樣，樣品與纖維蛋白原37℃反應(yīng)后，做SDS-PAGE，觀察纖維蛋白原的降解活性。第3天取樣品的其中3個(gè)管凍存。
取凍存菌一支，加入100ml MD培養(yǎng)基中，30℃振搖過夜，然后擴(kuò)大至2個(gè)5升大瓶，各2升，30℃振搖24小時(shí)加入發(fā)酵缸100升，BMMY培養(yǎng)基30℃，24小時(shí)加1％甲醇，每天補(bǔ)加至1％，發(fā)酵96小時(shí)，離心取上清，超濾濃縮至2升。
結(jié)果將有FII基因的酵母菌6株培養(yǎng)后，每天取樣各1份，將各樣品上清與纖維蛋白原37℃保溫1h后，做SDS-PAGE。其中第1，2和3號(hào)菌株在培養(yǎng)第3天所取樣品上清即對(duì)纖維蛋白原有水解作用(見圖16)，以天然五蛇毒纖溶酶FII作陽性對(duì)照)，對(duì)纖維蛋白原的水解方式及水解后產(chǎn)生的主要片段與天然纖溶因子FII相同。結(jié)果提示此三株酵母菌株可以高效分泌表達(dá)纖溶因子FII。
經(jīng)過甲醇誘導(dǎo)后，在發(fā)酵96小時(shí)收集表達(dá)上清，獲得大量表達(dá)的FII。
九、重組五步蛇毒纖溶因子FII的純化及活性測(cè)定1.DEAE-Sepharose FF陰離子交換層析方法(1)超濾濃縮將上清經(jīng)Millipore超濾濃縮，濃縮至2L時(shí)，加2倍體積50mM NH4Ac超濾。
(2)DEAE-Sepharose FF用上樣緩沖液(50mM NH4AC PH8.0)平衡柱后，超濾濃縮后50倍的樣品上柱體積，然后用上樣緩沖液至基線，加0.1M NH4ACPH6.5洗雜質(zhì)，然后用含0.2M NH4AC PH5.2的洗脫液洗脫目的蛋白。
結(jié)果FII經(jīng)過大量的表達(dá)后，收集表達(dá)上清，超濃縮50倍后的樣品200ml上DEAE-sepharose柱，經(jīng)過洗脫后得到5個(gè)蛋白峰(見圖17)，0.2M NH4Ac pH5.2的洗脫峰有較高的纖溶活性。
2.疏水層析(Buty-Toyopearl)方法將過離子交換后的樣品加2M NaCl上Buty-Toyopearl，用4倍體積的含1M NaCl，20mM PBS液洗雜質(zhì)，達(dá)到基線，然后用0.1M NaCl，20mM PBS液洗雜質(zhì)蛋白，最后用2mM PBS液洗結(jié)合目的蛋白。
結(jié)果將活性峰濃縮后，進(jìn)一步經(jīng)Buty-Toyopearl疏水層析，得到3個(gè)蛋峰(見圖18)，其中第3峰具有較高纖溶活性。將第3峰收集、脫鹽、干燥即得重組五步蛇毒纖溶因子FII。
3.重組五步蛇毒纖溶因子FII的純度檢測(cè)方法采用SDS-PAGE，具體操作同前。
結(jié)果經(jīng)SDS-PAGE可見純化后的重組五步蛇毒纖溶因子FII為單一區(qū)帶(見圖19)。
4.重組五步蛇毒纖溶因子FII的直接纖維蛋白溶解活性測(cè)定方法采用加熱纖維蛋白平板法，將制備好的纖維蛋白平板在85℃加熱30分鐘，冷卻到室溫。分別在加熱纖維蛋白平板表面加入重組五步蛇毒纖溶因子FII 2mg/ml，1mg/ml，0.5mg/ml，0.25mg/ml，0.125mg/ml，天然FII 0.5mg/ml，尿激酶5000IU/ml及生理鹽水。37℃保溫12小時(shí)后，以溶解平板的面積表示纖溶活力。
結(jié)果加熱纖維蛋白平板法測(cè)定重組五步蛇毒纖溶因子FII的直接纖維蛋白溶解活性，結(jié)果顯示，重組五步蛇毒纖溶因子FII依量地溶解纖維蛋白，且活性較天然FII強(qiáng)(重組五步蛇毒纖溶因子FII 0.5mg/ml產(chǎn)生的溶圈面積為50mm2，而天然FII 0.5mg/ml產(chǎn)生的溶圈面積為40mm2。見圖20，表2)。在加熱纖維蛋白到85℃已將其中的纖溶酶原滅活，所以FII可以直接溶解纖維蛋白而不依賴?yán)w溶酶原的激活。
表2 重組組分II的直接纖維蛋白活性Concentration Lysed area(mg/ml) (mm2)2 1471 1100.5 500.25280.125 14FII 0.5 405.重組五步蛇毒纖溶因子FII對(duì)人IgG和白蛋白的作用方法取10mg/ml的人IgG溶液10μl于Ependoff管中，再加入重組五步蛇毒纖溶因子FII(0.5mg/ml)10μl在37℃保溫。保溫24h后加電泳蛋白質(zhì)樣品處理液10μl，取20μl做SDS-PAGE。以同樣濃度的人白蛋白代替IgG重復(fù)該實(shí)驗(yàn)。
結(jié)果人IgG、白蛋白與重組五步蛇毒纖溶因子FII作用后的SDS-PAGE結(jié)果(見圖21)。人IgG與重組五步蛇毒纖溶因子FII作用24h后，其重鏈有一定的水解，輕鏈仍保持完整。人白蛋白與重組五步蛇毒纖溶因子FII作用24h后，肽鏈仍保持完整，提示重組五步蛇毒纖溶因子FII對(duì)人白蛋白沒有水解作用。
十、重組五步蛇毒纖溶因子FII對(duì)狗肺動(dòng)脈血栓的作用方法參照Nowk素的肺動(dòng)脈血栓模型進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)前取Beagle狗血15ml。體外凝固2小時(shí)后作為實(shí)驗(yàn)用的血栓。將Beagle狗隨機(jī)分兩組，一組為給藥組、另一組為生理鹽水組，每組6只。用戊巴比妥鈉30mg％，1ml/kg。將狗麻醉后分離股靜脈，把S＝6.0Fcobra或Humterhead導(dǎo)管插入股靜脈，經(jīng)下腹靜脈、右心房、右心室、肺動(dòng)脈干，選擇性進(jìn)入右下肺動(dòng)脈。然后將15ml的狗血栓經(jīng)導(dǎo)管注入右下肺動(dòng)脈，人工形成右下肺動(dòng)脈血栓。用數(shù)字減影肺動(dòng)脈造影方法記錄右下肺動(dòng)脈血栓栓塞的變化。當(dāng)右下肺動(dòng)脈血栓經(jīng)過2小時(shí)后，開始iv給藥，重組五步蛇毒纖溶因子FII劑量為0.24mg/kg。對(duì)照組給生理鹽水1ml/kg。給藥前、給藥后15、30、60、90、120min，分別用數(shù)字減影肺動(dòng)脈造影方法記錄右下肺動(dòng)脈血栓復(fù)通有效率。以肺動(dòng)脈復(fù)通率來評(píng)價(jià)FII的溶栓作用。
結(jié)果給予重組五步蛇毒纖溶因子FII 0.24mg/kg組，右下肺動(dòng)脈血栓溶解很好(見圖22)，給藥1小時(shí)后再通率平均為83.3％(見表3)。而生理鹽水組，右下肺動(dòng)脈血栓變化很少，給生理鹽水后1小時(shí)再通率平均為0.6％。
表3 重組組分II對(duì)狗右肺下動(dòng)脈血栓模型的溶栓效應(yīng)Recovery rate of pulmonary arteryBeagle dog(number) Time after injection(％)31h ＞9021h ＞801- ＞706NS 0.6
五步蛇毒溶解纖維蛋白(原)No.2基因及其應(yīng)用<110>中山大學(xué)<120>五步蛇毒溶解纖維蛋白(原)No.2基因及其應(yīng)用<160>1<210>1<211>702bp<212>DNA<213>尖吻蝮蛇(Agkistrodon acutus snake)<220>
<221>CDS<222>(1)...(702)<400>1aaaagagagg ctgaagctaa tcgtactcct gaacaacaaa tctatgaccc ctacaaatac 60gttgagactg tctttgttgt ggacaaagca atggtcacaa aatacaatgg cgatttagat 120aagataaaaa caagaatgta cgaagctgcc aacaatatga atgagatgta cagatatatg 180ttttttcgtg tagtaatggt tggcctaata atttggaccg aagaagataa gattaccgtg 240aagccagatg tggattatac tttgaacgca tttgcagaat ggagaaaaac atatttgctg 300gctgagaaaa aacatgataa tgctcagtta atcacgggca ttgacttcag aggaagcatt 360ataggatacg cttacattgg cagcatgtgc cacccgaagc gttctgtagg aattattcag 420gattatagcc caataaatct tgtgcttgcc gttataatgg cccatgagat gggtcacaat 480ctgggcattc accatgacga cggttactgt tattgcggtg gttacccatg cattatgggt 540ccctcgataa gccctgaacc ttccaaattt ttcagcaatt gtagttatat ccaatgttgg 600gactttatta tgaatcacaa cccagaatgc attgacaatg aacccttggg aacagatatt 660atttcacctc cactttgtgg aaatgaactt ttggaggcgt ga 70權(quán)利要求
1.一種分離的多核苷酸(No.2基因)，它包括以下的其中一組(A)、一種具有與以下序列的多核苷酸5’-aaaagagaggctgaagctaatcgtactcctgaacaacaaatctatgacccctacaaatacgttgagactgtctttgttgtggacaaagcaatggtcacaaaatacaatggcgatttagataagataaaaacaagaatgtacgaagctgccaacaatatgaatgagatgtacagatatatgttttttcgtgtagtaatggttggcctaataatttggaccgaagaagataagattaccgtgaagccagatgtggattatactttgaacgcatttgcagaatggagaaaaacatatttgctggctgagaaaaaacatgataatgctcagttaatcacgggcattgacttcagaggaagcattataggatacgcttacattggcagcatgtgccacccgaagcgttctgtaggaattattcaggattatagcccaataaatcttgtgcttgccgttataatggcccatgagatgggtcacaatctgggcattcaccatgacgacggttactgttattgcggtggttacccatgcattatgggtccctcgataagccctgaaccttccaaatttttcagcaattgtagttatatccaatgttgggactttattatgaatcacaacccagaatgcattgacaatgaacccttgggaacagatattatttcacctccactttgtggaaatgaacttttggaggcgtga-3’(702bp)；(B)、一種與(A)的多核苷酸至少有80％同源性的多核苷酸；(C)、(A)或(B)的多核苷酸的片段。
2.權(quán)利要求1中的多核苷酸，其特征在于該多核苷酸是DNA。
3.一種含有權(quán)利要求2的DNA的載體。
4.一種用權(quán)利要求3的載體基因工程化的宿主細(xì)胞。
5.用于溶解纖維蛋白(原)以對(duì)抗血栓形成所引起的栓塞性疾病的藥物組合物，其中包含權(quán)利要求1或2的多核苷酸作為活性成分。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說涉及尖吻蝮蛇(五步蛇毒)溶解纖維蛋白(原)No.2基因、含有該基因的載體、利用該載體進(jìn)行基因工程化的宿主細(xì)胞以及將該基因用于制備溶解纖維蛋白(原)的藥物，以對(duì)抗血栓形成所引起的栓塞性疾病。從五步蛇粗毒中分離纖溶因子FII；完成纖溶因子FII基因的篩選、克??；在酵母細(xì)胞中表達(dá)纖溶因子FII；純化表達(dá)產(chǎn)物并測(cè)定纖溶活性。本發(fā)明用基因工程酵母系統(tǒng)表達(dá)的溶纖因子，活性高，產(chǎn)量大，質(zhì)量穩(wěn)定，成本低，可成為新型的強(qiáng)效的溶栓藥，社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益巨大。
文檔編號(hào)A61K38/17GK1584029SQ0314021
公開日2005年2月23日 申請(qǐng)日期2003年8月20日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月20日
發(fā)明者顏光美, 陳家樹, 邱鵬新, 單鴻 申請(qǐng)人:中山大學(xué)