專利名稱：抗微生物病原體的疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種疫苗和一種生產(chǎn)疫苗的方法。更具體地，本發(fā)明提供了一種包含微生物病原體的疫苗和生產(chǎn)此疫苗的方法。
熱激蛋白(hsp)形成一個(gè)高保守蛋白質(zhì)家族，其廣泛分布于植物和動(dòng)物王國(guó)。基于其分子量，將hsp分為6個(gè)不同家族小型(hsp20-30ka)；hsp40；hsp60；hsp70；hsp90；和hsp100。盡管hsp最初是在受熱激的細(xì)胞中鑒別的，但已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其也與許多其它形式的刺激相關(guān)，如感染，并因此也常稱為應(yīng)激蛋白(SP)。
哺乳動(dòng)物hsp90家族成員包括胞質(zhì)hsp90(hsp83)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)hsp90(hsp83)，hsp87，Grp94(Erp99)和gp97，見(jiàn)例如Gething等(1992)，自然35533-45所述。hsp70家族成員包括胞質(zhì)hsp70(p73)和hsp70(p72)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)BiP(Grp78)，及線粒體hsp70(Grp75)。哺乳動(dòng)物hsp60家族成員只在線粒體中鑒別。
應(yīng)激蛋白在細(xì)胞內(nèi)遍在地表達(dá)。應(yīng)激蛋白的一個(gè)作用是伴隨肽從一個(gè)細(xì)胞區(qū)室至另一個(gè)區(qū)室，并將肽呈遞給MHC分子，以在細(xì)胞表面呈遞給免疫系統(tǒng)。在患病細(xì)胞的情況下，應(yīng)激蛋白也伴隨病毒或腫瘤相關(guān)肽至細(xì)胞表面，見(jiàn)Li和Sirivastave(1994)，Behring Inst.Mitt，9437-47及Suzue等(1997)，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)9413146-51。
應(yīng)激蛋白的伴隨功能是在一ATP依賴性反應(yīng)中，通過(guò)在應(yīng)激蛋白和抗原性肽片段之間及在應(yīng)激蛋白和病毒或腫瘤相關(guān)肽片段之間形成復(fù)合物而實(shí)現(xiàn)。與應(yīng)激蛋白復(fù)合的肽片段形成了抗原性復(fù)合物(hspCs)，其由APC捕獲以提供抗原性肽片段。
應(yīng)激蛋白與肽片段的復(fù)合在正常組織中也觀測(cè)到，因此不是腫瘤特異性現(xiàn)象，見(jiàn)Srivastava(1994)，Experimentia 501054-60。據(jù)認(rèn)為hsp70家族成員包括grp96的免疫原性，反映了其在呈遞體(presentosome)中的正常作用，具有荷載I類MHC分子功能的假定胞內(nèi)細(xì)胞器發(fā)揮功能需要其細(xì)胞表面表達(dá)。這個(gè)步驟對(duì)于其由抗原特異性T細(xì)胞進(jìn)行MHC限制識(shí)別是必需的。見(jiàn)Srivastava等(1998)，免疫；Singh-Jasuja等，J.Exp.Med(2000)191，1957。
盡管病原體的hsp已經(jīng)廣泛用作抗原和佐劑，但迄今為止，還未提議使用病原體衍生的內(nèi)源性hsp肽復(fù)合物(hspC)作為疫苗。PCT申請(qǐng)No GB00/03228揭示了病原體衍生的內(nèi)源性hspC的用途，尤其應(yīng)激誘導(dǎo)的hspC在接種的動(dòng)物中示出提供良好的保護(hù)性免疫性。
微生物hsp家族的成員包括Dna J和Dna K家族及Gro-EL和Gro-ES家族。在原核細(xì)胞微生物中，這些家族表現(xiàn)為由操縱子編碼，在所述操縱子中的初始基因是控制基因，其抑制所述操縱子中包含的hsp基因的表達(dá)。
在鏈霉菌和螺桿菌中，hspR基因的表達(dá)抑制Dna J和Dna K的表達(dá)。因此缺失hspR基因產(chǎn)生一種遺傳修飾的微生物，其組成型表達(dá)hsp，見(jiàn)Bucca等(1997)，分子微生物學(xué)15633-45。在許多近來(lái)測(cè)序的微生物中包括在鏈霉菌和結(jié)核分枝桿菌的其它菌株和通常使用的相關(guān)疫苗菌株BCG中已經(jīng)鑒別了同源操縱子。
其它阻抑基因也可以控制hsp基因家族成員的表達(dá)，而且它們還可以經(jīng)遺傳工程化以提供組成型表達(dá)hspC的修飾的微生物，其可用于生產(chǎn)疫苗和疫苗載體。這些基因包括但非限于轉(zhuǎn)錄控制基因sigma和rho，及應(yīng)激基因調(diào)節(jié)蛋白基因MerR和HmrR。還應(yīng)意識(shí)到含有組成型hspC的修飾的微生物可以直接用作疫苗，或用作分離hspC的來(lái)源。另外，來(lái)自其它病原體的異源基因在這些微生物中的表達(dá)使其能用作疫苗載體，以便于針對(duì)這些病原體的基于hspC的疫苗的生產(chǎn)。
在觀察熱激誘導(dǎo)的內(nèi)源性微生物hsp肽復(fù)合物的使用時(shí)，將提取的hsp肽復(fù)合物與應(yīng)激誘導(dǎo)的微生物自身作為疫苗的使用相對(duì)比。令人驚奇地，使用所述微生物作為疫苗在接種的動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生比使用分離的肽明顯更好的免疫性。使用遺傳修飾的組成型產(chǎn)生hsp的微生物獲得相似結(jié)果，表明是在原位與內(nèi)源性微生物多肽包括在微生物中由異源基因表達(dá)的重組蛋白形成了hspC。遺傳修飾的微生物也可以用作有效的來(lái)源，以分離hspC用于亞單位和多亞單位疫苗中。
優(yōu)選地，誘導(dǎo)應(yīng)激的刺激導(dǎo)致所述微生物表達(dá)熱激蛋白。
優(yōu)選地，誘導(dǎo)應(yīng)激的刺激是熱激或滲壓震擾。
更優(yōu)選地，誘導(dǎo)應(yīng)激的刺激是所述微生物病原體的遺傳修飾物，這樣熱激蛋白基因的至少一個(gè)阻抑基因被失活，從而使熱激蛋白基因表達(dá)。
優(yōu)選地，所述微生物病原體是能誘導(dǎo)感染性疾病的任何病原體。
優(yōu)選地，所述微生物病原體是一種細(xì)菌，原生動(dòng)物，真菌或一種寄生蟲(chóng)。
優(yōu)選地，所述遺傳修飾導(dǎo)致hspR阻抑基因的失活。
或者，所述遺傳修飾導(dǎo)致應(yīng)激基因調(diào)節(jié)蛋白基因MerR或HmrR阻抑基因失活，或轉(zhuǎn)錄控制基因sigma和rho失活。
優(yōu)選地，所述微生物病原體選自分枝桿菌屬，沙門氏菌屬，弧菌屬，鏈霉菌屬，螺桿菌屬，乳球菌屬和李斯特氏菌屬。
優(yōu)選地，所述微生物病原體是減毒的。
優(yōu)選地，所述疫苗還包含一種佐劑。
優(yōu)選地，所述佐劑選自Freund′s完全佐劑，F(xiàn)reund′s不完全佐劑，Quil A，Detox，ISCOMs和鯊烯。
優(yōu)選地，所述疫苗適于通過(guò)注射施用。
或者，所述疫苗適于口服施用。
優(yōu)選地，所述疫苗適于通過(guò)無(wú)針輸送形式輸送。
本發(fā)明的另一方面是提供了一種接種動(dòng)物的方法，特征在于所述方法包括施用足以激發(fā)動(dòng)物體內(nèi)的免疫應(yīng)答的藥物學(xué)適量的本發(fā)明的疫苗組合物。
優(yōu)選地，所述疫苗作為預(yù)防性疫苗而施用。
或者，所述疫苗作為治療性疫苗而施用。
優(yōu)選地，所述疫苗組合物通過(guò)注射施用。
或者，所述疫苗組合物通過(guò)無(wú)針輸送方式施用。
或者，所述疫苗組合物通過(guò)經(jīng)皮，肺部輸送或口服施用。
本發(fā)明的再一方面是提供了生產(chǎn)包含一種免疫原性決定簇的疫苗組合物的方法，特征在于所述方法包括以下步驟使微生物病原體接受誘導(dǎo)應(yīng)激的刺激；并使用該應(yīng)激的微生物作為所述免疫原性決定簇制備疫苗組合物。
優(yōu)選地，所述誘導(dǎo)應(yīng)激的刺激是熱激或滲壓震擾。
更優(yōu)選地，所述誘導(dǎo)應(yīng)激的刺激是阻抑熱激基因表達(dá)的基因的失活。
優(yōu)選地，所述被阻抑的基因是hspR基因。
或者，所述被阻抑的基因是應(yīng)激基因調(diào)節(jié)蛋白基因MerR或HmrR，或轉(zhuǎn)錄控制基因sigma和rho。
優(yōu)選地，所述微生物病原體細(xì)胞在用于所述疫苗中之前被殺滅。
或者，所述微生物病原體細(xì)胞在用于所述疫苗之前被干燥。
優(yōu)選地，所述疫苗組合物是一種水性組合物。
或者，所述疫苗組合物是一種干燥的組合物或一種凍干的組合物。
本發(fā)明還提供了病原性微生物作為進(jìn)一步表達(dá)異源抗原的疫苗載體的應(yīng)用，所述微生物已經(jīng)被遺傳修飾，由此熱激蛋白的至少一個(gè)阻抑基因被失活，從而使熱激蛋白組成型表達(dá)。
優(yōu)選地，所述病原性微生物是一種原核生物，其適于用作一種疫苗載體。
優(yōu)選地，所述原核生物是BCG，所述異源抗原片段是破傷風(fēng)類毒素片段C。
或者，所述原核生物是沙門氏菌屬或乳球菌屬，這樣所述疫苗可以口服施用。
本發(fā)明還提供了病原性微生物作為熱激蛋白-肽復(fù)合物的來(lái)源以用于亞單位和多亞單位疫苗中的應(yīng)用，所述微生物已經(jīng)被遺傳修飾，由此熱激蛋白的至少一個(gè)阻抑基因被失活，從而使熱激蛋白組成型表達(dá)。
“微生物病原體”是指在動(dòng)物體內(nèi)能引起感染性疾病的任何病原體，特別包括細(xì)菌，原核生物，真菌或寄生蟲(chóng)。
“誘導(dǎo)應(yīng)激的刺激”(stress inducing stimuli)是指誘導(dǎo)微生物病原體內(nèi)SP、尤其hsp產(chǎn)生的任何刺激，包括熱激或滲壓震擾。這種誘導(dǎo)應(yīng)激的刺激還包括設(shè)計(jì)的使微生物病原體內(nèi)應(yīng)激蛋白尤其hsp組成型表達(dá)的遺傳改變。這些遺傳改變包括阻抑(抑制)基因的失活，所述基因抑制應(yīng)激蛋白尤其抑制表達(dá)熱激蛋白的基因。這特別包括失活hspR阻抑基因，應(yīng)激基因調(diào)節(jié)蛋白基因MerR和HmrR，或轉(zhuǎn)錄控制基因sigma和rho。
應(yīng)意識(shí)到這些遺傳改變易于通過(guò)分子遺傳方法實(shí)現(xiàn)，包括使用噬菌體或轉(zhuǎn)座子載體的插入誘變，見(jiàn)例如Bucca等，分子微生物學(xué)(1997)17633所述。另外還應(yīng)意識(shí)到微生物病原體中操縱子基因、阻抑基因和SP及hsp的存在，可簡(jiǎn)便地通過(guò)重組DNA技術(shù)而確定。見(jiàn)分子生物學(xué)常用方法(1999)，Wiley出版社。
因此應(yīng)意識(shí)到表達(dá)這些基因的任何微生物均可以進(jìn)行遺傳修飾，以提供本發(fā)明的疫苗。這包括用作活疫苗或滅活疫苗的現(xiàn)有微生物，如分枝桿菌屬，沙門氏菌屬，弧菌和李斯特氏菌屬，特別是這些病原體的減毒品種。特別地，已經(jīng)遺傳修飾為缺失熱激蛋白阻抑基因的分枝桿菌屬突變體，可用于抗結(jié)核的疫苗中，而已經(jīng)遺傳修飾為缺失熱激蛋白阻抑基因的沙門氏菌屬突變體，可用于抗傷寒的疫苗中。本發(fā)明進(jìn)一步提供了這些微生物作為疫苗載體以表達(dá)異源基因的應(yīng)用。
本文所用術(shù)語(yǔ)“疫苗”是指含有免疫原性決定簇的任何組合物，其刺激免疫系統(tǒng)，這樣可以更好地應(yīng)答隨后的感染。應(yīng)意識(shí)到疫苗通常含有一種免疫原性決定簇和一種佐劑，所述佐劑非特異性地增強(qiáng)對(duì)該免疫原性決定簇的免疫應(yīng)答。適當(dāng)?shù)淖魟┦潜绢I(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，包括Freund′s完全佐劑，F(xiàn)reund′s不完全佐劑，Quil A，Detox，ISCOMs或鯊烯。
然而，應(yīng)意識(shí)到本發(fā)明的疫苗不用佐劑也是有效的。
對(duì)于SP的非遺傳誘導(dǎo)，誘導(dǎo)SP的最佳條件可以通過(guò)簡(jiǎn)便的反復(fù)試驗(yàn)而易于確定，刺激變化的作用可使用常規(guī)方法確定，如對(duì)動(dòng)物進(jìn)行體內(nèi)測(cè)試，或通過(guò)其它方法，例如《免疫學(xué)當(dāng)前方案》，WileyInterscience，1997所述。其它的這類條件在PCT申請(qǐng)No GB00/03228中有描述并在此加以引用。
本發(fā)明還提供了將動(dòng)物暴露于本發(fā)明疫苗的方法，其包括施用足以激發(fā)所述動(dòng)物體內(nèi)的免疫應(yīng)答的藥物學(xué)適量的本發(fā)明疫苗，任選地組合佐劑。
所述動(dòng)物典型是人。然而，本發(fā)明還可用于治療其它動(dòng)物，如馬，牛，山羊，綿羊或豬，及治療鳥(niǎo)類，特別是家禽如雞或火雞。優(yōu)選地，選擇用于本發(fā)明的特定疫苗中的微生物病原體，導(dǎo)致接受所述疫苗的動(dòng)物物種或密切相關(guān)物種發(fā)生疾病或感染。本發(fā)明的疫苗既可以用作預(yù)防性疫苗，也可以用作治療性疫苗，但由于其生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)實(shí)惠性而特別用作預(yù)防性疫苗。
本發(fā)明的疫苗組合物可以通過(guò)任何適當(dāng)方法施用，如口服，通過(guò)吸入，經(jīng)皮或通過(guò)注射及在任何適當(dāng)?shù)妮d體介質(zhì)中。然而，優(yōu)選將疫苗作為水性組合物使用任何適當(dāng)?shù)挠嗅樆驘o(wú)針技術(shù)注射施用。
本發(fā)明的疫苗可以用作初次治療，隨后以相同或不同劑量，每次治療間隔1-26周，通過(guò)一或多次“加強(qiáng)”治療，提供對(duì)所述病原體的延長(zhǎng)的免疫性。
現(xiàn)在通過(guò)以下實(shí)施例，參考附圖對(duì)本發(fā)明加以闡述。


圖1示出結(jié)核分枝桿菌的hspR基因的核苷酸序列。
圖2示出鑒別的與hspR同源的阻抑基因列表。
實(shí)施例1熱激微生物的制備將M.vaccae菌株NCTC11659在Sauton′s培養(yǎng)基中生長(zhǎng)至飽和狀態(tài)，在新鮮培養(yǎng)基中稀釋并生長(zhǎng)過(guò)夜，以提供對(duì)數(shù)期培養(yǎng)物，然后將其在42℃熱激3小時(shí)，或在39℃熱激5小時(shí)，并培養(yǎng)過(guò)夜。接著將細(xì)胞在培養(yǎng)基中洗滌，隨后在鹽水中洗滌，以單獨(dú)的疫苗等份凍干或直接對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行免疫。為進(jìn)行對(duì)比，如PCT申請(qǐng)NoGB00/03228所述制備分離的內(nèi)源性SP-肽復(fù)合物。簡(jiǎn)而言之，將洗過(guò)的應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞重懸浮于均質(zhì)緩沖液如具有5％Tween的PBS中，，然后將細(xì)胞通過(guò)凍融循環(huán)或使用細(xì)胞破裂器(例如珠攪拌器，法國(guó))破碎。細(xì)胞裂解物然后通過(guò)離心處理，典型地以3-5000g離心5分鐘，以除去核及細(xì)胞碎片，隨后通過(guò)高速離心步驟，典型地以100,000g離心15-30分鐘。將由此獲得的上清進(jìn)行加工，以提供適用于疫苗中的SP/抗原性肽片段復(fù)合物，這可以簡(jiǎn)便地使用20-70％硫酸銨通過(guò)硫酸銨沉淀而進(jìn)行。具體地，在4℃加入20％(w/w)硫酸銨，棄去沉淀，隨后加入更多的硫酸銨以使?jié)舛冗_(dá)到70％w/w。通過(guò)離心收集蛋白質(zhì)沉淀，然后用適當(dāng)?shù)纳韺W(xué)可注射緩沖液如鹽水透析，以在使用之前除去硫酸銨。所述SP復(fù)合物可以以任何適當(dāng)濃度使用，以提供疫苗組合物中的免疫原性決定簇。
優(yōu)選的是，誘導(dǎo)的應(yīng)激蛋白-肽復(fù)合物的量在10-600微克，更優(yōu)選10-100微克，最優(yōu)選25微克/kg動(dòng)物體重。
為確定SP復(fù)合物的免疫原性，可以使用T細(xì)胞增殖分析。適當(dāng)?shù)姆治霭ɑ旌系牧馨图?xì)胞反應(yīng)(MLR)，通過(guò)含氚胸苷攝取而進(jìn)行測(cè)定，及胞毒性分析，以確定靶細(xì)胞中釋放的51Cr，見(jiàn)《免疫學(xué)當(dāng)前方案》，Wiley Interscience，1997所述。對(duì)于分枝桿菌，使用商購(gòu)的試劑盒(CSL公司)，MLR也可以用于分析對(duì)細(xì)胞因子產(chǎn)生的誘導(dǎo)情況，如干擾素γ的產(chǎn)生?；蛘撸贵w的產(chǎn)生可以使用標(biāo)準(zhǔn)免疫分析或噬斑裂解分析而檢測(cè)，或通過(guò)胎兒的子宮內(nèi)保護(hù)作用而確定，見(jiàn)《免疫學(xué)當(dāng)前方案》所述。
用在磷酸鹽緩沖鹽水中的熱激的微生物或分離自熱激的微生物的內(nèi)源性SP肽復(fù)合物對(duì)小鼠進(jìn)行免疫接種，在初次或加強(qiáng)接種中均未加入任何佐劑。
與通過(guò)分離的內(nèi)源性SP-肽復(fù)合物誘導(dǎo)的免疫相比，用完整的應(yīng)激誘導(dǎo)的微生物以及尤其是凍干的微生物進(jìn)行的免疫，提供了更好的免疫性，包括產(chǎn)生的IFN-γ和抗體增多。實(shí)施例2組成型hsp突變體的制備和使用組成型產(chǎn)生hsp的微生物可以通過(guò)剔除轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物抑制基因而構(gòu)建，所述基因如hspR，MerR(汞抗性操縱子調(diào)節(jié)蛋白)，HmrR(重金屬調(diào)節(jié)蛋白)及其同源物或轉(zhuǎn)錄控制基因rho和sigma。這種基因通過(guò)用典型的測(cè)試序列掃描基因組序列數(shù)據(jù)庫(kù)而易于鑒別。這種典型的測(cè)試序列例如是結(jié)核分枝桿菌的hsp基因(見(jiàn)圖1)。經(jīng)鑒別與hspR基因同源的抑制基因示于圖2。
組成型產(chǎn)生hspC的M.bovis菌株是通過(guò)遺傳工程化M.bovis菌株BCG構(gòu)建的，以產(chǎn)生hspR基因的缺失突變體。所述hspR基因使用自殺載體通過(guò)同源重組缺失，所述載體攜帶hspR基因的一個(gè)大片段和一個(gè)卡那霉素選擇標(biāo)記。所述hspR基因片段是使用衍生自圖1所示結(jié)核分枝桿菌hspR序列的引物通過(guò)PCR從BCG基因組DNA中克隆的。這種方法應(yīng)該可以廣泛適用于從攜帶相關(guān)抑制基因的任何原核生物中產(chǎn)生類似的突變體。
BCG hspR缺失突變體用于產(chǎn)生hspC，而且得自這些突變體的蛋白質(zhì)產(chǎn)量與得自熱激的野生型菌株的那些蛋白質(zhì)產(chǎn)量相當(dāng)。同樣，這種方法應(yīng)該可以廣泛適用于從攜帶相關(guān)抑制基因的任何原核生物中產(chǎn)生hspC。由此為生產(chǎn)基于hspC的疫苗提供了有利資源。因此，從BCG hspR缺失突變體中產(chǎn)生的hspC誘導(dǎo)的抗結(jié)核分枝桿菌氣溶膠攻擊的保護(hù)性免疫，可與由得自熱激野生型BCG菌株的hspC誘導(dǎo)的免疫相當(dāng)。
BCG hspR缺失突變體還可以用作疫苗載體，以表達(dá)異源抗原。例如，用表達(dá)破傷風(fēng)類毒素(TT)片段C的BCG hspR缺失突變體免疫的小鼠，通過(guò)Western印跡示出抗TT抗體產(chǎn)生。使用適于作為疫苗的載體的任何原核生物的突變體，這種方法應(yīng)該可以廣泛適用于生產(chǎn)表達(dá)異源疫苗抗原的相似載體。例如使用沙門氏菌屬或乳球菌屬突變體，能生產(chǎn)用于經(jīng)粘膜輸送疫苗的載體。根據(jù)此原理產(chǎn)生的疫苗在其可以口服施用的情況中是特別有益的。
權(quán)利要求
1.一種包含作為免疫決定簇的微生物病原體的疫苗，其中所述微生物病原體已經(jīng)接受誘導(dǎo)應(yīng)激的刺激。
2.權(quán)利要求1的疫苗，其中誘導(dǎo)應(yīng)激的刺激引起所述微生物表達(dá)熱激蛋白。
3.權(quán)利要求1或2的疫苗，其中所述誘導(dǎo)應(yīng)激的刺激是熱激或滲壓震擾。
4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的疫苗，其中誘導(dǎo)應(yīng)激的刺激是對(duì)微生物病原體進(jìn)行的遺傳修飾，這樣熱激蛋白基因的至少一個(gè)阻抑基因被失活，從而使熱激蛋白基因表達(dá)。
5.前述任一權(quán)利要求的疫苗，其中所述微生物病原體是能誘導(dǎo)感染性疾病的任何病原體。
6.前述任一權(quán)利要求的疫苗，其中所述微生物病原體是細(xì)菌，動(dòng)物，真菌或寄生蟲(chóng)。
7.權(quán)利要求4-6任一項(xiàng)的疫苗，其中所述遺傳修飾導(dǎo)致hspR阻抑基因失活。
8.權(quán)利要求4-6任一項(xiàng)的疫苗，其中所述遺傳修飾導(dǎo)致應(yīng)激基因調(diào)節(jié)蛋白基因MerR或HmrR失活。
9.權(quán)利要求4-6任一項(xiàng)的疫苗，其中所述遺傳修飾導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄控制基因rho或sigma失活。
10.前述任一權(quán)利要求的疫苗，其中所述微生物病原體選自分枝桿菌屬，沙門氏菌屬，弧菌屬，李斯特氏菌屬，鏈霉菌屬，螺桿菌屬和乳球菌屬。
11.前述任一權(quán)利要求的疫苗，其中所述微生物病原體是減毒的。
12.前述任一權(quán)利要求的疫苗，其中所述疫苗還包含一種佐劑。
13.權(quán)利要求12的疫苗，其中所述佐劑選自Freund′s完全佐劑，F(xiàn)reund′s不完全佐劑，Quil A，Detox，ISCOMs和鯊烯。
14.前述任一權(quán)利要求的疫苗，其中所述疫苗適于通過(guò)注射施用。
15.權(quán)利要求1-13任一項(xiàng)的疫苗，其中所述疫苗適于口服施用。
16.權(quán)利要求14的疫苗，其中所述疫苗適于通過(guò)無(wú)針輸送方式輸送。
17.一種接種動(dòng)物的方法，特征在于所述方法包括施用藥物學(xué)適量的權(quán)利要求1-13任一項(xiàng)的疫苗組合物，所述數(shù)量足以激發(fā)所述動(dòng)物的免疫應(yīng)答。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述疫苗作為預(yù)防性疫苗施用。
19.權(quán)利要求17的方法，其中所述疫苗作為治療性疫苗施用。
20.權(quán)利要求17的方法，其中所述疫苗組合物通過(guò)注射施用。
21.權(quán)利要求17的方法，其中所述疫苗組合物通過(guò)無(wú)針輸送方式施用。
22.權(quán)利要求17的方法，其中所述疫苗組合物是經(jīng)皮施用。
23.權(quán)利要求17的方法，其中所述疫苗組合物通過(guò)肺部輸送施用。
24.權(quán)利要求17的方法，其中所述疫苗口服施用。
25.一種生產(chǎn)包含免疫原性決定簇的疫苗組合物的方法，特征在于所述方法包括以下步驟使微生物病原體接受誘導(dǎo)應(yīng)激的刺激；及使用所述應(yīng)激的微生物作為所述免疫原性決定簇制備所述疫苗組合物。
26.權(quán)利要求25的方法，特征在于所述誘導(dǎo)應(yīng)激的刺激是熱激或滲壓震擾。
27.權(quán)利要求25的方法，特征在于所述誘導(dǎo)應(yīng)激的刺激是抑制熱激蛋白基因表達(dá)的基因的失活。
28.權(quán)利要求25的方法，特征在于所述阻抑基因是hspR基因。
29.權(quán)利要求25的方法，特征在于所述阻抑基因是MerR或HmrR。
30.前述任一權(quán)利要求的方法，特征在于所述微生物病原體細(xì)胞在用于所述疫苗中之前被殺死。
31.前述任一權(quán)利要求的方法，特征在于所述微生物病原體細(xì)胞在用于所述疫苗之前被干燥。
32.權(quán)利要求25-31任一項(xiàng)的疫苗組合物，特征在于所述組合物是一種水性組合物。
33.權(quán)利要求25-31任一項(xiàng)的疫苗組合物，特征在于所述組合物是一種干燥組合物。
34.權(quán)利要求25-31任一項(xiàng)的疫苗組合物，特征在于所述組合物是一種凍干的組合物。
35.一種病原性微生物作為疫苗載體以進(jìn)而表達(dá)異源抗原的用途，所述微生物已經(jīng)被遺傳修飾，這樣熱激蛋白的至少一個(gè)阻抑基因被失活，從而使熱激蛋白組成型表達(dá)。
36.權(quán)利要求34的病原性微生物的用途，其中所述病原性微生物是一種原核生物，其適用于作為疫苗載體。
37.權(quán)利要求35的病原性微生物的用途，其中所述原核生物是BCG，所述異源抗原片段是破傷風(fēng)類毒素片段C。
38.權(quán)利要求34的病原性微生物的用途，其中所述原核生物是沙門氏菌屬或乳球菌屬，這樣所述疫苗可以口服。
39.一種病原性微生物作為熱激蛋白-肽復(fù)合物的來(lái)源以用于亞單位和多亞單位疫苗中的用途，所述微生物已經(jīng)被遺傳修飾，這樣熱激蛋白的至少一個(gè)阻抑基因被失活，從而使熱激蛋白組成型表達(dá)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種包含微生物病原體的疫苗，其中所述微生物病原體接受了誘導(dǎo)應(yīng)激的刺激。所述誘導(dǎo)應(yīng)激的刺激可以是熱激或滲壓震擾，優(yōu)選所述微生物病原體被遺傳修飾，這樣熱激蛋白基因的至少一個(gè)阻抑基因被失活，使熱激蛋白組成型表達(dá)。尤其地，當(dāng)將熱激蛋白阻抑基因突變體細(xì)菌用于本發(fā)明疫苗中時(shí)，其示出有效誘導(dǎo)免疫性。本發(fā)明還提供了一種生產(chǎn)包含應(yīng)激誘導(dǎo)的微生物病原體的疫苗的方法，以及熱激蛋白阻抑基因缺失突變微生物作為疫苗載體的用途，其可額外地使異源抗原片段得以表達(dá)。
文檔編號(hào)A61K39/04GK1452495SQ0181513
公開(kāi)日2003年10月29日 申請(qǐng)日期2001年9月4日 優(yōu)先權(quán)日2000年9月4日
發(fā)明者卡米洛·安東尼·利奧·塞爾溫·科拉索 申請(qǐng)人:免疫生物學(xué)有限公司