專利名稱：快速分離、濃集與檢測重要疾病病原體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種分離、濃縮與檢測病原體的方法。
背景技術(shù)：
在人類歷史上，傳染病曾是人類健康與生命的大敵，奪去過千百萬人的生命，給人類造成巨大的災(zāi)難。但人類一直在與傳染病進(jìn)行著長期不懈的斗爭，并在二十世紀(jì)初及中期消滅了天花，脊髓灰質(zhì)炎、小兒破傷風(fēng)等即將被消滅，許多傳染病受到控制等。然而，進(jìn)入二十世紀(jì)70年代以來，在人類傳染病防治方面又出現(xiàn)了許多新情況，主要表現(xiàn)在一些被控制的傳染病又死灰復(fù)燃、卷土重來，如霍亂、結(jié)核等，重新對人類健康構(gòu)成威脅；另外，一系列新傳染病相繼出現(xiàn)或被發(fā)現(xiàn)，其中一些已經(jīng)給人類帶來了巨大災(zāi)難和恐慌，如傳染性非典型肺炎(SARS)、在非洲流行的埃博拉出血熱、全世界流行的艾滋病等。
不論是已有傳染病的死灰復(fù)燃還是新發(fā)現(xiàn)的傳染病，若想得到有效控制，必須遵循早發(fā)現(xiàn)傳染源、切斷傳播途徑、保護(hù)易感人群這一經(jīng)典的傳染病防治策略，其中早期發(fā)現(xiàn)傳染源是最有效的一個環(huán)節(jié)，而建立一套快速、準(zhǔn)確、敏感的病原體檢測方法是實現(xiàn)早期發(fā)現(xiàn)病原體的唯一途徑。
目前，針對病原體的快速檢測方法主要包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、PCR、免疫熒光技術(shù)、生物芯片技術(shù)、直接顯微鏡或電鏡染色技術(shù)等，這些技術(shù)都需要昂貴的儀器設(shè)備、并必須由專門受過培訓(xùn)的人員操作。二十世紀(jì)80年代初發(fā)展起來一種新的免疫檢測技術(shù)——免疫層析技術(shù)。它借助毛細(xì)作用，使樣品在條狀纖維制成的膜上泳動，其中的待測物與膜上一定區(qū)域的配體結(jié)合，通過酶促顯色反應(yīng)或直接使用著色標(biāo)記物。該技術(shù)的優(yōu)點是檢測速度快，5～15分鐘即可出結(jié)果；不須進(jìn)行結(jié)合標(biāo)記物與自由標(biāo)記物的分離，省去了煩瑣的加樣、洗滌步驟，因而操作簡單；且不需儀器，非常適合現(xiàn)場檢測之用。目前有人用此技術(shù)檢測早早孕以及結(jié)核桿菌、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、耶爾森氏菌等病源微生物。但該技術(shù)目前仍存在假陽性及假陰性率較高等問題，原因可能與膠體金材料(尤其是膠體金的粒徑)，抗體純度、特異性，膜材料，樣品處理等有關(guān)。
目前應(yīng)用的病原體快速檢測技術(shù)絕大多數(shù)是建立在微生物的純培養(yǎng)基礎(chǔ)上的，如果將樣品處理、純化、濃集時間算在內(nèi)，則所需時間仍很長。因此，解決微生物的快速、高效分離與濃集技術(shù)也是實現(xiàn)病原體快速檢測的關(guān)鍵技術(shù)之一。中國專利CN200410094032.9公開了“一種納米免疫磁顆粒制備方法及應(yīng)用”，在樣品的分離和濃縮過程中，該項發(fā)明的納米免疫磁顆粒技術(shù)具有多方面的優(yōu)點，包括特異性強、分離效果較好、操作簡便、使用范圍廣(幾乎可用于所有樣品的處理)等。
中國專利CN03142652.2公開了“免疫紙層析條及用其快速檢測食品中致病菌和毒素的方法”它可以快速地檢測樣品中所含有的細(xì)菌或毒素，但實驗中我們發(fā)現(xiàn)，這種檢測方法對于被檢樣品所含病原體量很少的情況下，不易檢出。而一些可以引起“重要疾病”的病原體如嗜肺軍團(tuán)桿菌、霍亂弧菌、沙門氏菌、副溶血弧菌、流行性感冒病毒、丙型肝炎病毒及引起SARS的病原體—冠狀病毒變種的快速分離、濃集與檢測關(guān)系到社會的穩(wěn)定和人民的健康安全。
嗜肺軍團(tuán)桿菌可以引起軍團(tuán)病，軍團(tuán)病臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、周身酸痛、咳嗽、胸痛、呼吸困難和腹瀉等，肺部X光片有肺炎改變，死亡率15.4％(美國資料)，軍團(tuán)病在臨床表現(xiàn)上與SARS基本一樣，但幾乎無傳染性。因此，如何快速檢測與診斷軍團(tuán)病，或者說如何快速區(qū)分檢測與診斷軍團(tuán)病和SARS對早期發(fā)現(xiàn)、隔離、治療與控制SARS具有十分重要的意義。目前，分離培養(yǎng)和直接免疫熒光技術(shù)是檢測軍團(tuán)病病原體的最常用方法，但操作繁瑣、耗時很長(7～14天)，而且嗜肺軍團(tuán)桿菌培養(yǎng)很困難，必須用特殊的培養(yǎng)基。PCR及其相關(guān)技術(shù)在嗜肺軍團(tuán)桿菌檢測方面屢有報道，并被認(rèn)為是較有前途的快速檢測技術(shù)，然而，檢測時間仍需4～8小時。
目前普遍認(rèn)為引起SARS的病原體為冠狀病毒變種，目前已經(jīng)報道了幾種快速檢測方法，如PCR技術(shù)、基因芯片、ELISA技術(shù)、免疫熒光技術(shù)及病原體分離培養(yǎng)等。這些檢測方法本身需要2個小時或更長時間。樣品處理目前能見到的報道包括5月8日由國家質(zhì)檢總局中國進(jìn)出口商品檢驗技術(shù)研究所研制開發(fā)的食品、動植物及其產(chǎn)品中SARS病毒檢測方法中包含病毒的富集與分離內(nèi)容，但采用的仍是傳統(tǒng)的技術(shù)；東南大學(xué)吳健雄實驗室報道一種“空氣中SARS病毒快速濃集裝置”，他們采用一種類似于鼻腔結(jié)構(gòu)和鼻粘膜材料的氣體吸收腔濃集病毒并利用PCR技術(shù)進(jìn)行病毒檢測。但WHO傳染病部門項目負(fù)責(zé)人斯托爾認(rèn)為上述檢測與診斷技術(shù)都需要專業(yè)人員在專業(yè)實驗室中進(jìn)行，耗時太長，臨床上急需的是操作簡單、結(jié)果準(zhǔn)確、快速的檢測與診斷方法或技術(shù)。
霍亂弧菌的檢測與診斷主要靠傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)與生化鑒定技術(shù)，由于涉及細(xì)菌分離、濃集與純化步驟，所以一般需要7～15天左右時間才能確診，給預(yù)防與治療帶來很大困難。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種快速分離、濃集與檢測重要疾病病原體的方法。本發(fā)明可以將待檢樣本中小于106個致病微生物/ml的重要疾病病原體進(jìn)行分離、濃集并進(jìn)行檢測。
本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下一種快速分離、濃集與檢測重要疾病病原體的方法，其特征是包括如下步驟(1)制備納米免疫磁顆粒懸液①葡聚糖納米磁顆粒的制備a.將0.5～1.2mol/L的FeCl3·6H2O水溶液10～20ml與0.5～2.5mol/L FeCl2·4H2O水溶液2～6ml混合，在氮氣氛下，滴加至10～30ml的30～70％的葡聚糖T-40水溶液中，所述葡聚糖T-40水溶液的濃度為g/ml百分比濃度，混合，50～70℃，水浴10～30分鐘，在150～500轉(zhuǎn)/分鐘的攪拌下，10～30分鐘內(nèi)，向混合液中滴加3～7mol/L的氨水35-45ml，溫度保持50～70℃，并始終通氮氣，制成懸液；b.將懸液用乙酸或稀鹽酸調(diào)至pH為6.0-8.0；c.將懸液中的聚集體在離心力為600×g，離心10～20分鐘去除；游離的葡聚糖經(jīng)聚丙烯酰胺葡聚糖S-300凝膠層析柱過濾與葡聚糖納米磁顆粒分離，洗脫平衡液為pH為6～pH為8的0.005～0.02mol/L磷酸鹽緩沖液，收集的顆粒冷凍干燥，使葡聚糖納米磁顆粒懸液的濃度為5～10mg/ml；d.取葡聚糖納米磁顆粒懸液0.5～2.0ml，加入10～30mmol/L NaIO4水溶液0.25ml，150轉(zhuǎn)/分鐘避光阻氧震蕩0.5～12小時后，加入1-3mol/L乙二醇的水溶液0.1～0.3ml終止氧化，用pH為6～pH為8的0.005-0.02mol/L磷酸鹽緩沖液4℃透析18～48小時，去除過量的NaIO4，使葡聚糖納米磁顆粒懸液的濃度為3～8mg/ml；②納米免疫磁顆粒懸液的制備向葡聚糖納米磁顆粒懸液中加入10～30μg/mg葡聚糖納米磁顆粒量的SARS冠狀病毒抗體或霍亂弧菌抗體或嗜肺軍團(tuán)桿菌抗體或沙門氏菌抗體或副溶血弧菌抗體或流行性感冒病毒抗體或丙型肝炎病毒抗體，混勻后，4℃避光放置6～24小時，加入0.2～1mol/LNaBH4水溶液還原10～60分鐘，加入NaBH4的量為0.1～0.5ml/ml葡聚糖納米磁顆粒懸液，多余的抗體用Sephacryl S-300凝膠層析柱過濾與結(jié)合物分離，制成納米免疫磁顆粒懸液；(2)免疫層析試紙條的制備在紙質(zhì)或塑料載體表面設(shè)置硝酸纖維素膜，在所述硝酸纖維素膜表面的一端設(shè)置樣品板，在所述硝酸纖維素膜與樣品板之間設(shè)置膠體金探針結(jié)合物墊，所述膠體金探針結(jié)合物墊的長度為所述樣品板長度的1/4～1/2，所述膠體金探針結(jié)合物墊的一端與所述樣品板的近中端齊平，所述硝酸纖維素膜表面的另一端設(shè)置吸水紙，在所述樣品板與所述吸水紙之間依次設(shè)置對照線、病原體檢測線，所述膠體金探針結(jié)合物墊結(jié)合有SARS冠狀病毒抗體或霍亂弧菌抗體或嗜肺軍團(tuán)桿菌抗體或沙門氏菌抗體或副溶血弧菌抗體或流行性感冒病毒抗體或丙型肝炎病毒抗體；(3)檢測①在1ml檢測樣本中加入納米免疫磁顆粒懸液2～20μl，吸附3～20分鐘，在15～35℃，磁板吸引2-10分鐘，棄上清后用含體積百分比為0.05％～0.1％的吐溫-20的0.005～0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液0.5～1.0ml洗滌一次，加入0.5～5.0ml生理鹽水制成懸液；②將免疫層析試紙條的樣品板端插入步驟①制成的懸液中，控制所述懸液不要沒過樣品板的近中端；③觀察免疫層析試紙條上的溶液泳動到吸收紙時，取出免疫層析試紙條，放置2～20分鐘觀察結(jié)果。
本發(fā)明的優(yōu)點是1、操作簡便，不需要任何儀器設(shè)備；2、檢測快速，納米免疫磁顆粒濃集、分離病原體只需2～30分鐘，免疫層析試紙條檢測病原體只需2～15分鐘，非常適于現(xiàn)場快速檢測病原體；3、這套技術(shù)可以明顯提高病原體的檢測靈敏度，比ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗)靈敏度提高1～3個數(shù)量級。


圖1為本發(fā)明采用TECNAI-20透射電子顯微鏡拍得的納米免疫磁顆粒電鏡照片，放大倍數(shù)×100000。照片顯示葡聚糖納米磁顆粒核心大小為5～10nm。
圖2為免疫層析試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明實施例1納米免疫磁顆粒的制備①葡聚糖納米磁顆粒的制備a.將1.0mol/L的FeCl3·6H2O水溶液15ml與2.0mol/L FeCl2·4H2O水溶液4ml混合，在氮氣氛下，滴加至20ml的50％的葡聚糖T-40水溶液中，所述葡聚糖T-40水溶液的濃度為g/ml百分比濃度，混合，60℃，水浴20分鐘，在轉(zhuǎn)速為300轉(zhuǎn)/分鐘的攪拌下，20分鐘內(nèi)，向混合液中滴加5mol/L的氨水40ml，溫度保持60℃，并始終通氮氣，制成懸液；b.將懸液用乙酸調(diào)至pH為7.0；c.將懸液中的聚集體在離心力為600×g，離心15分鐘去除；游離的葡聚糖經(jīng)聚丙烯酰胺葡聚糖S-300凝膠層析柱過濾與葡聚糖納米磁顆粒分離，洗脫平衡液為pH為7的0.01mol/L磷酸鹽緩沖液，收集的顆粒冷凍干燥，使葡聚糖納米磁顆粒懸液的濃度為8mg/ml；d.取葡聚糖納米磁顆粒懸液1.0ml，加入20mmol/LNaIO4水溶液0.25ml，150轉(zhuǎn)/分鐘避光阻氧震蕩6小時后，加入2mol/L乙二醇的水溶液0.2ml終止氧化，用pH為7的0.01mol/L磷酸鹽緩沖液4℃透析24小時，去除過量的NaIO4，使葡聚糖納米磁顆粒懸液的濃度為5mg/ml；②納米免疫磁性顆粒懸液的制備向葡聚糖納米磁顆粒懸液中加入20μg/mg葡聚糖納米磁顆粒量的SARS冠狀病毒抗體，混勻后，4℃避光放置12小時，加入0.6mol/LNaBH4水溶液還原30分鐘，加入NaBH4的量為0.3ml/ml葡聚糖納米磁顆粒懸液，多余的抗體用Sephacryl S-300凝膠層析柱過濾與結(jié)合物分離，制成納米免疫磁顆粒懸液；(2)免疫層析試紙條的制備(見圖2)在紙質(zhì)載體1的表面設(shè)置硝酸纖維素膜2，在所述硝酸纖維素膜表面的一端設(shè)置紙質(zhì)的樣品板3，在所述硝酸纖維素膜與樣品板之間設(shè)置膠體金探針結(jié)合物墊4，所述膠體金探針結(jié)合物墊的長度為所述樣品板長度的1/4，所述膠體金探針結(jié)合物墊的一端與所述樣品板的近中端齊平，所述硝酸纖維素膜表面的另一端設(shè)置吸水紙5，在所述樣品板與所述吸水紙之間依次設(shè)置對照線6、病原體檢測線7，所述膠體金探針結(jié)合物墊結(jié)合有SARS冠狀病毒抗體；對照線是通過機器噴涂或手工描劃的濃度為2mg/ml的羊抗兔抗體水溶液或羊抗鼠抗體水溶液或葡萄球菌A蛋白水溶液線；
病原體檢測線是通過機器噴涂或手工描劃的濃度為0.5～3mg/ml SARS冠狀病毒抗體的線。
(3)檢測①在1ml檢測樣本中加入納米免疫磁顆粒懸液10μl，吸附10分鐘，在20℃，磁板吸引6分鐘，棄上清后用含體積百分比為0.08％的吐溫-20的0.008mol/L的磷酸鹽緩沖液0.8ml洗滌一次，加入2ml生理鹽水制成懸液；②將免疫層析試紙條的樣品板端插入步驟①制成的懸液中，控制所述懸液不要沒過樣品板的近中端；③觀察免疫層析試紙條上的溶液泳動到吸收紙時，取出免疫層析試紙條，放置10分鐘觀察結(jié)果。
檢測樣品包括臨床樣品(如，血液、痰液、尿、腦脊液、糞便、唾液)，食品(畜禽肉類、海產(chǎn)品、牛奶、蛋、飯、菜、飲料)，環(huán)境樣品(各種水—飲用水、純凈水、污水、河水、湖水)。
實施例2快速分離、濃集與檢測重要疾病病原體的方法，包括如下步驟(1)制備納米免疫磁顆粒懸液①葡聚糖納米磁顆粒的制備a.將0.5mol/L的FeCl3·6H2O水溶液20ml與2.5mol/L FeCl2·4H2O水溶液2ml混合，在氮氣氛下，滴加至10ml的70％的葡聚糖T-40水溶液中，所述葡聚糖T-40水溶液的濃度為g/ml百分比濃度，混合，50℃，水浴30分鐘，在150轉(zhuǎn)/分鐘攪拌下，10分鐘內(nèi)，向混合液中滴加3mol/L的氨水45ml，溫度保持50℃，并始終通氮氣，制成懸液；b.將懸液用調(diào)至pH為6.0；c.將懸液中的聚集體在離心力為600×g，離心10分鐘去除；游離的葡聚糖經(jīng)聚丙烯酰胺葡聚糖S-300凝膠層析柱過濾與葡聚糖納米磁顆粒分離，洗脫平衡液為pH為6的0.005mol/L磷酸鹽緩沖液，收集的顆粒冷凍干燥，使葡聚糖納米磁顆粒懸液的濃度為5mg/ml；d.取葡聚糖納米磁顆粒懸液0.5ml，加入10mmol/L NaIO4水溶液0.25ml，150轉(zhuǎn)/分鐘避光阻氧震蕩0.5小時后，加入1mol/L乙二醇的水溶液0.3ml終止氧化，用pH為6的0.005mol/L磷酸鹽緩沖液4℃透析48小時，去除過量的NaIO4，使葡聚糖納米磁顆粒懸液的濃度為3mg/ml；②納米免疫磁性顆粒懸液的制備向葡聚糖納米磁顆粒懸液中加入10μg/mg葡聚糖納米磁顆粒量的霍亂弧菌抗體，混勻后，4℃避光放置6小時，加入0.2mol/LNaBH4水溶液還原60分鐘，加入NaBH4的量為0.1ml/ml葡聚糖納米磁顆粒懸液，多余的抗體用Sephacryl S-300凝膠層析柱過濾與結(jié)合物分離，制成納米免疫磁顆粒懸液；(2)免疫層析試紙條的制備在紙質(zhì)或塑料載體表面設(shè)置硝酸纖維素膜，在所述硝酸纖維素膜表面的一端設(shè)置樣品板，在所述硝酸纖維素膜與樣品板之間設(shè)置膠體金探針結(jié)合物墊，所述膠體金探針結(jié)合物墊的長度為所述樣品板長度的1/2，所述膠體金探針結(jié)合物墊的一端與所述樣品板的近中端齊平，所述硝酸纖維素膜表面的另一端設(shè)置吸水紙，在所述樣品板與所述吸水紙之間依次設(shè)置對照線、病原體檢測線，所述膠體金探針結(jié)合物墊結(jié)合有霍亂弧菌抗體；對照線是通過機器噴涂或手工描劃的濃度為2mg/ml的羊抗兔抗體水溶液或羊抗鼠抗體水溶液或葡萄球菌A蛋白水溶液線。
病原體檢測線是通過機器噴涂或手工描劃的濃度為0.5～3mg/ml霍亂弧菌抗體線。
(3)檢測①在1ml檢測樣本中加入納米免疫磁顆粒懸液2μl，吸附20分鐘，在35℃，磁板吸引2分鐘，棄上清后用含體積百分比為0.05％％的吐溫-20的0.005mol/L的磷酸鹽緩沖液1.0ml洗滌一次，加入0.5ml生理鹽水制成懸液；②將免疫層析試紙條的樣品板端插入步驟①制成的懸液中，控制所述懸液不要沒過樣品板的近中端；③觀察免疫層析試紙條上的溶液泳動到吸收紙時，取出免疫層析試紙條，放置20分鐘觀察結(jié)果。
實施例3快速分離、濃集與檢測重要疾病病原體的方法，包括如下步驟(1)制備納米免疫磁顆粒懸液①葡聚糖納米磁顆粒的制備a.將1.2mol/L的FeCl3·6H2O水溶液10ml與0.5mol/L FeCl2·4H2O水溶液6ml混合，在氮氣氛下，滴加至30ml的30％的葡聚糖T-40水溶液中，所述葡聚糖T-40水溶液的濃度為g/ml百分比濃度，混合，70℃，水浴10分鐘，在500轉(zhuǎn)/分鐘攪拌下，30分鐘內(nèi)，向混合液中滴加7mol/L的氨水35ml，溫度保持70℃，并始終通氮氣，制成懸液；b.將懸液用乙酸調(diào)至pH為8.0；c.將懸液中的聚集體在離心力為600×g，離心20分鐘去除；游離的葡聚糖經(jīng)聚丙烯酰胺葡聚糖S-300凝膠層析柱過濾與葡聚糖納米磁顆粒分離，洗脫平衡液為pH為8的0.02mol/L磷酸鹽緩沖液，收集的顆粒冷凍干燥，使葡聚糖納米磁顆粒懸液的濃度為10mg/ml；d.取葡聚糖納米磁顆粒懸液2.0ml，加入30mmol/L NaIO4水溶液0.25ml，150轉(zhuǎn)/分鐘避光阻氧震蕩12小時后，加入3mol/L乙二醇的水溶液0.1ml終止氧化，用pH為8的0.02mol/L磷酸鹽緩沖液4℃透析18小時，去除過量的NaIO4，使葡聚糖納米磁顆粒懸液的濃度為8mg/ml；②納米免疫磁性顆粒懸液的制備向葡聚糖納米磁顆粒懸液中加入30μg/mg葡聚糖納米磁顆粒量的嗜肺軍團(tuán)桿菌抗體，混勻后，4℃避光放置24小時，加入1mol/LNaBH4水溶液還原10分鐘，加入NaBH4的量為0.5ml/ml葡聚糖納米磁顆粒懸液，多余的抗體用Sephacryl S-300凝膠層析柱過濾與結(jié)合物分離，制成納米免疫磁顆粒懸液；(2)免疫層析試紙條的制備在紙質(zhì)或塑料載體表面設(shè)置硝酸纖維素膜，在所述硝酸纖維素膜表面的一端設(shè)置樣品板，在所述硝酸纖維素膜與樣品板之間設(shè)置膠體金探針結(jié)合物墊，所述膠體金探針結(jié)合物墊的長度為所述樣品板長度的1/3，所述膠體金探針結(jié)合物墊的一端與所述樣品板的近中端齊平，所述硝酸纖維素膜表面的另一端設(shè)置吸水紙，在所述樣品板與所述吸水紙之間依次設(shè)置對照線、病原體檢測線，所述膠體金探針結(jié)合物墊結(jié)合有嗜肺軍團(tuán)桿菌抗體；對照線是通過機器噴涂或手工描劃的濃度為2mg/ml的羊抗兔抗體水溶液或羊抗鼠抗體水溶液或葡萄球菌A蛋白水溶液線。
病原體檢測線是通過機器噴涂或手工描劃的濃度為0.5～3mg/ml嗜肺軍團(tuán)桿菌抗體線。
(3)檢測①在1ml檢測樣本中加入納米免疫磁顆粒懸液20μl，吸附3分鐘，在15℃，磁板吸引10分鐘，棄上清后用含體積百分比為0.1％的吐溫-20的0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液0.5ml洗滌一次，加入5.0ml生理鹽水制成懸液；②將免疫層析試紙條的樣品板端插入步驟①制成的懸液中，控制所述懸液不要沒過樣品板的近中端；③觀察免疫層析試紙條上的溶液泳動到吸收紙時，取出免疫層析試紙條，放置2分鐘觀察結(jié)果。
實施例4快速分離、濃集與檢測重要疾病病原體的方法，步驟同實施例1，將其中的步驟(1)中②納米免疫磁性顆粒懸液的制備中的SARS冠狀病毒抗體用沙門氏菌抗體取代；步驟(2)中免疫層析試紙條的制備中膠體金探針結(jié)合物墊結(jié)合有沙門氏菌抗體；病原體檢測線為沙門氏菌抗體的線。
實施例5快速分離、濃集與檢測重要疾病病原體的方法，步驟同實施例1，將其中的步驟(1)中②納米免疫磁性顆粒懸液的制備中的SARS冠狀病毒抗體用副溶血弧菌抗體取代；步驟(2)中免疫層析試紙條的制備中膠體金探針結(jié)合物墊結(jié)合有副溶血弧菌抗體；病原體檢測線為副溶血弧菌抗體的線。
實施例6快速分離、濃集與檢測重要疾病病原體的方法，步驟同實施例2，將其中的步驟(1)中②納米免疫磁性顆粒懸液的制備中的霍亂弧菌抗體用流行性感冒病毒抗體取代；步驟(2)中免疫層析試紙條的制備中膠體金探針結(jié)合物墊結(jié)合有流行性感冒病毒抗體；病原體檢測線為流行性感冒病毒抗體的線。
實施例7快速分離、濃集與檢測重要疾病病原體的方法，步驟同實施例3，將其中的步驟(1)中②納米免疫磁性顆粒懸液的制備中的嗜肺軍團(tuán)桿菌抗體用丙型肝炎病毒抗體取代；步驟(2)中免疫層析試紙條的制備中膠體金探針結(jié)合物墊結(jié)合有丙型肝炎病毒抗體；病原體檢測線為丙型肝炎病毒抗體的線。
實施例8臨床樣品中病原體的快速檢測取懷疑霍亂患者的腹瀉病人糞便10ml放入一錐形瓶中，加生理鹽水10ml，劇烈振搖，稍靜置，取上清液在1ml，加入實施例1制備的納米免疫磁性顆粒懸液5μl孵育30分鐘，磁板吸引10分鐘，棄上清后用含體積百分比為0.05％的吐溫-20的0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液洗滌一次，在15分鐘內(nèi)使相應(yīng)的霍亂弧菌分離，用1ml生理鹽水沖懸磁顆粒，將免疫層析試紙條的樣品板端放置于待檢樣品內(nèi)，待樣品液泳動到吸收板墊時，取出免疫層析試紙，放置5分鐘觀察結(jié)果。若結(jié)果顯示對照線和檢測線均出現(xiàn)紅色，則檢測結(jié)果為陽性，若對照線出現(xiàn)紅色，不出現(xiàn)紅色檢測線，則結(jié)果為陰性，若兩條線均不出現(xiàn)，則檢測失敗。
實施例9人工染SARS冠狀病毒樣品的快速檢測在1ml尿液，或呼吸道分泌物，或血液，或糞便中加入107/mlTCID50(組織半數(shù)感染劑量)的SARS冠狀病毒，加生理鹽水1ml，劇烈振搖，稍靜置，取上清液在1ml，加入實施例1制備的納米免疫磁性顆粒懸液5μl孵育30分鐘，磁板吸引10分鐘，棄上清后用含體積百分比為0.05％的吐溫-20的0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液洗滌一次，在15分鐘內(nèi)使相應(yīng)的SARS冠狀病毒分離。用1ml生理鹽水沖懸磁顆粒，將免疫層析試紙條放置于待檢樣品內(nèi)，(放置的高度不可超過檢測試紙條中的膠體金結(jié)合物墊)，待樣品液泳動到吸收板墊時，取出免疫層析試紙，放置5分鐘觀察結(jié)果。若結(jié)果顯示對照線和檢測線均出現(xiàn)紅色，則檢測結(jié)果為陽性，若對照線出現(xiàn)紅色，不出現(xiàn)紅色檢測線，則結(jié)果為陰性，若兩條線均不出現(xiàn)，則檢測失敗。
實施例10人工染沙門氏菌食品的快速檢測米飯、切成片狀的饅頭以及市場上購賣的醬豬肝、豬肉、牛肉、羊肉、雞肉、鴨肉生熟各50g，切成小片，放入潔凈錐形瓶中，加103/ml甲型沙門氏菌(菌種號為50004購自于衛(wèi)生部國家菌種保存中心)10ml，一定時間培養(yǎng)。固體樣品取10g放入另一錐形瓶中，加生理鹽水90ml，劇烈振搖，稍靜置，取上清液用于檢測；牛奶取1ml用9ml生理鹽水稀釋后直接用于檢測，各稀釋樣品液用瓊脂計數(shù)法計細(xì)菌總數(shù)。在1ml檢測樣本中，加入實施例1制備的納米免疫磁性顆粒懸液20μl孵育5分鐘，磁板吸引2分鐘，棄上清后用含體積百分比為0.1％的吐溫-20的0.005mol/L的磷酸鹽緩沖液洗滌一次，在10分鐘內(nèi)使相應(yīng)的沙門氏菌分離。用1ml生理鹽水沖懸磁顆粒，將免疫層析試紙條放置于待檢樣品內(nèi)，待樣品液泳動到吸收板墊時，取出免疫層析試紙，放置5分鐘觀察結(jié)果。若結(jié)果顯示對照線和檢測線均出現(xiàn)紅色，則檢測結(jié)果為陽性，若對照線出現(xiàn)紅色，不出現(xiàn)紅色檢測線，則結(jié)果為陰性，若兩條線均不出現(xiàn)，則檢測失敗。
實施例11人工染嗜肺軍團(tuán)桿菌水樣的快速檢測在10ml水樣中加入109/ml嗜肺軍團(tuán)桿菌(I型)。取1ml樣品，加入實施例1制備的納米免疫磁性顆粒懸液20μl孵育5分鐘，磁板吸引2分鐘，棄上清后用含體積百分比為0.1％的吐溫-20的0.005mol/L的磷酸鹽緩沖液洗滌一次，在10分鐘內(nèi)使相應(yīng)的嗜肺軍團(tuán)桿菌分離。用1ml生理鹽水沖懸磁顆粒，將免疫層析試紙條放置于待檢樣品內(nèi)，待樣品液泳動到吸收板墊時，取出免疫層析試紙，放置5分鐘觀察結(jié)果。若結(jié)果顯示對照線和檢測線均出現(xiàn)紅色，則檢測結(jié)果為陽性，若對照線出現(xiàn)紅色，不出現(xiàn)紅色檢測線，則結(jié)果為陰性，若兩條線均不出現(xiàn)，則檢測失敗。
霍亂弧菌、沙門氏菌、副溶血弧菌在中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心保存，保藏號分別為CMCC16001、CMCC50013、CMCC20001。按規(guī)定程序，研究人員可以從該所獲得。
SARS冠狀病毒、流行性感冒病毒、丙型肝炎病毒毒株在中國疾病預(yù)防控制中心病毒所有保存，但無保藏號。按規(guī)定程序，研究人員可以從該所獲得。
嗜肺軍團(tuán)桿菌在中國疾病預(yù)防控制中心流行病研究所有保存，但無保藏號。按規(guī)定程序，研究人員可以從該所獲得。
權(quán)利要求
1.快速分離、濃集與檢測重要疾病病原體的方法，其特征是包括如下步驟(1)制備納米免疫磁顆粒懸液①葡聚糖納米磁顆粒的制備a.將0.5～1.2mol/L的FeCl3·6H2O水溶液10～20ml與0.5～2.5mol/L FeCl2·4H2O水溶液2～6ml混合，在氮氣氛下，滴加至10～30ml的30～70％的葡聚糖T-40水溶液中，所述葡聚糖T-40水溶液的濃度為g/ml百分比濃度，混合，50～70℃，水浴10～30分鐘，在150～500轉(zhuǎn)/分鐘的攪拌下，10～30分鐘內(nèi)，向混合液中滴加3～7mol/L的氨水35-45ml，溫度保持50～70℃，并始終通氮氣，制成懸液；b.將懸液用乙酸或稀鹽酸調(diào)至pH為6.0-8.0；c.將懸液中的聚集體在離心力為600×g，離心10～20分鐘去除；游離的葡聚糖經(jīng)聚丙烯酰胺葡聚糖S-300凝膠層析柱過濾與葡聚糖納米磁顆粒分離，洗脫平衡液為pH為6～pH為8的0.005～0.02mol/L磷酸鹽緩沖液，收集的顆粒冷凍干燥，使葡聚糖納米磁顆粒懸液的濃度為5～10mg/ml；d.取葡聚糖納米磁顆粒懸液0.5～2.0ml，加入10～30mmol/L NaIO4水溶液0.25ml，150轉(zhuǎn)/分鐘避光阻氧震蕩0.5～12小時后，加入1-3mol/L乙二醇的水溶液0.1～0.3ml終止氧化，用pH為6～pH為8的0.005-0.02mol/L磷酸鹽緩沖液4℃透析18～48小時，去除過量的NaIO4，使葡聚糖納米磁顆粒懸液的濃度為3～8mg/ml；②納米免疫磁顆粒懸液的制備向葡聚糖納米磁顆粒懸液中加入10～30μg/mg葡聚糖納米磁顆粒量的SARS冠狀病毒抗體或霍亂弧菌抗體或嗜肺軍團(tuán)桿菌抗體或沙門氏菌抗體或副溶血弧菌抗體或流行性感冒病毒抗體或丙型肝炎病毒抗體，混勻后，4℃避光放置6～24小時，加入0.2～1mol/LNaBH4水溶液還原10～60分鐘，加入NaBH4的量為0.1～0.5ml/ml葡聚糖納米磁顆粒懸液，多余的抗體用Sephacryl S-300凝膠層析柱過濾與結(jié)合物分離，制成納米免疫磁顆粒懸液；(2)免疫層析試紙條的制備在紙質(zhì)或塑料載體表面設(shè)置硝酸纖維素膜，在所述硝酸纖維素膜表面的一端設(shè)置樣品板，在所述硝酸纖維素膜與樣品板之間設(shè)置膠體金探針結(jié)合物墊，所述膠體金探針結(jié)合物墊的長度為所述樣品板長度的1/4～1/2，所述膠體金探針結(jié)合物墊的一端與所述樣品板的近中端齊平，所述硝酸纖維素膜表面的另一端設(shè)置吸水紙，在所述樣品板與所述吸水紙之間依次設(shè)置對照線、病原體檢測線，所述膠體金探針結(jié)合物墊結(jié)合有SARS冠狀病毒抗體或霍亂弧菌抗體或嗜肺軍團(tuán)桿菌抗體或沙門氏菌抗體或副溶血弧菌抗體或流行性感冒病毒抗體或丙型肝炎病毒抗體；(3)檢測①在1ml檢測樣本中加入納米免疫磁顆粒懸液2～20μl，吸附3～20分鐘，在15～35℃，磁板吸引2-10分鐘，棄上清后用含體積百分比為0.05％～0.1％的吐溫-20的0.005～0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液0.5～1.0ml洗滌一次，加入0.5～5.0ml生理鹽水制成懸液；②將免疫層析試紙條的樣品板端插入步驟①制成的懸液中，控制所述懸液不要沒過樣品板的近中端；③觀察免疫層析試紙條上的溶液泳動到吸收紙時，取出免疫層析試紙條，放置2～20分鐘觀察結(jié)果。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種快速分離、濃集與檢測重要疾病病原體的方法，包括如下步驟(1)制備納米免疫磁顆粒懸液①葡聚糖納米磁顆粒的制備；②納米免疫磁顆粒懸液的制備；(2)免疫層析試紙條的制備(3)檢測①在檢測樣本中加入納米免疫磁顆粒懸液，吸附，磁板吸引，棄上清后洗滌，加入生理鹽水制成懸液；②將免疫層析試紙條的樣品板端插入懸液中；③觀察免疫層析試紙條上的溶液泳動到吸收紙時，取出免疫層析試紙條，放置2～20分鐘觀察結(jié)果，本發(fā)明操作簡便，不需要任何儀器設(shè)備，檢測快速，納米免疫磁顆粒濃集、分離病原體只需2～30分鐘，免疫層析試紙條檢測病原體只需2～15分鐘，非常適于現(xiàn)場快速檢測病原體。
文檔編號G01N33/558GK1766614SQ20051001565
公開日2006年5月3日 申請日期2005年10月27日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月27日
發(fā)明者李君文, 王新為, 金敏, 諶志強 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所