專(zhuān)利名稱(chēng)：以納米金為報(bào)告系統(tǒng)的病原體快速檢測(cè)基因芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型涉及一種以納米金為報(bào)告系統(tǒng)的病原體快速檢測(cè)基因芯片。
技術(shù)背景病原體的快速檢測(cè)和鑒定對(duì)于感染性疾病的診斷和治療具有重要的意義。傳統(tǒng)的細(xì)菌分離、培養(yǎng)及生化反應(yīng)，已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足對(duì)各種病原微生物的診斷以及流行病學(xué)的研究?，F(xiàn)在的細(xì)菌學(xué)研究已從一般的功能水平深入到分子生物學(xué)水平，以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的細(xì)菌鑒定方法能夠大大縮短檢測(cè)時(shí)間，提高檢測(cè)靈敏度和特異性，同時(shí)分子生物學(xué)方法主要以微生物的基因?yàn)闄z測(cè)靶標(biāo)，對(duì)微生物進(jìn)行基因分型，這樣就能夠克服以微生物表型特征為基礎(chǔ)檢測(cè)方法的缺點(diǎn)和影響因素，從根本上對(duì)微生物進(jìn)行鑒別和特征分型。
基因芯片技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新的核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，具有快速、敏感、高效、高通量等優(yōu)點(diǎn)。納米金是指直徑為納米范圍的金顆?；蚝鸬幕衔?，其化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，可標(biāo)記于蛋白和核酸。同時(shí)，它具有與銀反應(yīng)后形成比原來(lái)體積大106倍的黑色顆粒，可以用肉眼觀察或用普通記錄裝置如照相、掃描記錄的特點(diǎn)，近年來(lái)受到了科研人員的重視，特別是用不具備吸附能力離散的納米金作為信號(hào)報(bào)告分子的應(yīng)用則是近年生物信號(hào)檢測(cè)中的一個(gè)重要進(jìn)展。
發(fā)明的內(nèi)容本實(shí)用新型的目的是提供一種將納米放大技術(shù)與基因芯片技術(shù)相結(jié)合，能快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)和鑒定病原體的具有一定通量的、操作簡(jiǎn)便、適合臨床使用的以納米金為報(bào)告系統(tǒng)的病原體快速檢測(cè)基因芯片。
為達(dá)到上述目的，本實(shí)用新型采取以下措施該芯片包括固相載體、連接分子、核酸探針；連接分子通過(guò)共價(jià)鍵結(jié)合于固相載體表面而修飾載體；核酸探針包括病原體特異性寡核苷酸探針、陽(yáng)性對(duì)照探針、陰性對(duì)照探針；其中5’端經(jīng)修飾的寡核苷酸探針可與連接分子以共價(jià)鍵結(jié)合于固相載體表面；芯片上的探針可與用納米金標(biāo)記的待檢核酸雜交結(jié)合，利用能與納米金標(biāo)記中的金屬顆粒發(fā)生金屬相反應(yīng)的金屬試劑與已雜交結(jié)合在芯片上的核酸上標(biāo)記的納米金屬反應(yīng)，獲得便于進(jìn)行普通光學(xué)檢測(cè)的放大雜交信號(hào)。為保證檢測(cè)可靠性，采用與人類(lèi)和微生物無(wú)任何同源性的植物基因?yàn)殛?yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照植物基因與樣品并行處理，用于監(jiān)測(cè)待檢樣品的制備、標(biāo)記、雜交、顯色及檢測(cè)過(guò)程，陰性對(duì)照用于檢測(cè)雜交信號(hào)是否正確，空白對(duì)照用于檢測(cè)芯片制備是否正常。
在上述固相載體上設(shè)有5’端經(jīng)修飾的寡核苷酸探針包括(1)金黃色葡萄球菌探針(2)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌mecA基因探針(3)大腸埃希菌探針(4)銅綠假單胞菌探針(5)表皮葡萄球菌探針(6)腦膜炎奈瑟氏菌探針(7)化膿性鏈球菌探針(8)肺炎鏈球菌探針(9)傷寒沙門(mén)氏菌探針
(10)腸球菌探針(11)白色念珠菌探針(12)乙肝病毒探針(13)丙肝病毒探針(14)陽(yáng)性對(duì)照植物基因探針(15)陰性對(duì)照植物基因探針。
本實(shí)用新型的優(yōu)點(diǎn)(1)快速病原體特異性基因片段擴(kuò)增只需2小時(shí)，核酸標(biāo)記及基因芯片雜交也僅需8～10小時(shí)，而傳統(tǒng)的細(xì)菌分離、培養(yǎng)及生化反應(yīng)的鑒定方法至少需要3～4天，縮短了診斷時(shí)間。
(2)特異以公認(rèn)的種、型特異性基因片段為各病原體核酸標(biāo)志，針對(duì)其設(shè)計(jì)特異性寡核苷酸探針，利用生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)探針各參數(shù)進(jìn)行評(píng)估，計(jì)算機(jī)模擬篩選，并利用反向膜雜交技術(shù)對(duì)探針進(jìn)行篩選和驗(yàn)證。
(3)敏感最低檢測(cè)值可達(dá)100fM，同目前常用的熒光素cy3為報(bào)告分子的方法相比，其靈敏度要高出50倍。
(4)準(zhǔn)確采用一段與微生物無(wú)任何同源性的植物基因?yàn)殛?yáng)性對(duì)照，與樣品并行處理，對(duì)檢測(cè)進(jìn)行全程監(jiān)控，芯片上還加入了陰性對(duì)照及空白對(duì)照，從而對(duì)芯片檢測(cè)實(shí)施系統(tǒng)監(jiān)控，確保檢測(cè)的可靠性和準(zhǔn)確性。
(5)實(shí)用適用于臨床常見(jiàn)感染標(biāo)本的檢測(cè)，包括血、腦脊液、尿液、胸水、腹水、膿液等，設(shè)備要求低，檢測(cè)結(jié)果可以用肉眼或普通光學(xué)儀器記錄，適合普通實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展。
本實(shí)用新型的制作方法(1)各病原體特異性核酸片段擴(kuò)增引物5’端巰基(SH)修飾。
(2)特異性寡核苷酸探針5’端氨基修飾。
(3)基因芯片陣列的設(shè)計(jì)采用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)，芯片材料采用玻璃片、硅片、尼龍膜、硝酸纖維膜，這些材料已被證明可行并在國(guó)內(nèi)外普遍應(yīng)用于基因芯片片基。
(4)低密度基因芯片的制備采用探針預(yù)先合成后再用點(diǎn)樣儀點(diǎn)于片基上的方法，探針固定采用氨基化探針與醛基活化的玻璃片共價(jià)結(jié)合的方法。
(5)核酸的標(biāo)記采用直徑為1.4nm的單順丁烯二乙酰亞胺修飾的納米金(monomaleimido-gold)，該納米微粒在pH6.0-7.0、含20mM NaH2PO4、150mMNaCL、1mM EDTA的緩沖液中，能和游離的巰基反應(yīng)生成穩(wěn)定的共價(jià)結(jié)合物，使核酸標(biāo)記上納米金顆粒。
(6)雜交信號(hào)檢測(cè)方法納米金顆粒與銀反應(yīng)后可形成比原來(lái)體積大106倍的黑色顆粒，可以用肉眼觀察或用普通記錄裝置如照相、掃描記錄。


圖1是以納米金為報(bào)告系統(tǒng)的病原體快速檢測(cè)基因芯片示意圖，包括1固相載體，2病原體特異性寡核苷酸探針，3陽(yáng)性對(duì)照探針，4陰性對(duì)照探針，5空白對(duì)照探針。
圖2是以納米金為報(bào)告系統(tǒng)的病原體快速檢測(cè)基因芯片結(jié)構(gòu)示意圖，包括1固相載體，2病原體特異性寡核苷酸探針，6連接分子。
圖3是以納米金為報(bào)告系統(tǒng)的病原體快速檢測(cè)基因芯片檢測(cè)結(jié)構(gòu)示意圖，包括1固相載體，2病原體特異性寡核苷酸探針，6連接分子，7納米金標(biāo)記待檢靶核酸，8納米金顆粒，9銀顆粒。
權(quán)利要求1.一種以納米金為報(bào)告系統(tǒng)的病原體快速檢測(cè)基因芯片，其特征是該芯片包括固相載體、連接分子、陣列排列的核酸探針；連接分子通過(guò)共價(jià)鍵結(jié)合于固相載體表面而修飾載體；核酸探針包括病原體特異性寡核苷酸探針、陽(yáng)性對(duì)照探針、陰性對(duì)照探針；其中病原體特異性寡核苷酸探針的5’端經(jīng)修飾后可與連接分子以共價(jià)鍵結(jié)合于固相載體表面；芯片上的探針可與用納米金標(biāo)記的待檢核酸雜交結(jié)合，利用能與納米金標(biāo)記中的金屬顆粒發(fā)生金屬相反應(yīng)的金屬試劑與已雜交結(jié)合在芯片上的核酸上標(biāo)記的納米金屬反應(yīng)，獲得便于進(jìn)行普通光學(xué)檢測(cè)的放大雜交信號(hào)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的以納米金為報(bào)告系統(tǒng)的病原體快速檢測(cè)基因芯片，其特征在于在上述固相載體上陣列設(shè)有的病原體特異性寡核苷酸探針包括(1)金黃色葡萄球菌探針，(2)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌mecA基因探針，(3)大腸埃希菌探針，(4)銅綠假單胞菌探針，(5)表皮葡萄球菌探針，(6)腦膜炎奈瑟氏菌探針，(7)化膿性鏈球菌探針，(8)肺炎鏈球菌探針，(9)傷寒沙門(mén)氏菌探針，(10)腸球菌探針，(11)白色念珠菌探針，(12)乙肝病毒探針，(13)丙肝病毒探針。
3.根據(jù)權(quán)利1、2要求所述的以納米金為報(bào)告系統(tǒng)的病原體快速檢測(cè)基因芯片，在所述固相載體上的核酸探針陣列中設(shè)置有空白點(diǎn)。
4.根據(jù)權(quán)利1、2要求所述的以納米金為報(bào)告系統(tǒng)的病原體快速檢測(cè)基因芯片，其特征在于所說(shuō)的固相載體為玻片、硅片、尼龍膜、硝酸纖維膜。
專(zhuān)利摘要一種以納米金為報(bào)告系統(tǒng)的病原體快速檢測(cè)基因芯片，其特征是芯片包括固相載體、連接分子、核酸探針；連接分子通過(guò)共價(jià)鍵結(jié)合于固相載體表面；核酸探針包括病原菌特異性寡核苷酸探針、陽(yáng)性對(duì)照探針、陰性對(duì)照探針；其中5’端經(jīng)修飾的寡核苷酸探針可與連接分子以共價(jià)鍵結(jié)合于固相載體表面；芯片上的探針可與用納米金標(biāo)記的待檢核酸雜交結(jié)合，利用能與納米金標(biāo)記中的金屬顆粒發(fā)生金屬相反應(yīng)的金屬試劑與已雜交結(jié)合在芯片上的核酸上標(biāo)記的納米金屬反應(yīng)，獲得便于進(jìn)行普通光學(xué)檢測(cè)的放大雜交信號(hào)。由于芯片上加入了陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照及空白對(duì)照，對(duì)芯片檢測(cè)實(shí)施系統(tǒng)監(jiān)控，確保檢測(cè)的可靠性和準(zhǔn)確性。具有快速、特異性好、靈敏度高等特點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N31/00GK2699290SQ20042003444
公開(kāi)日2005年5月11日 申請(qǐng)日期2004年4月20日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月20日
發(fā)明者周元國(guó), 魯衛(wèi)平, 顧大勇, 王 華 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)野戰(zhàn)外科研究所