專利名稱：使用含有非腸道病原體抗原的植物產(chǎn)品的口服免疫的制作方法
眾所周知，在哺乳動(dòng)物中，致病微生物并不引起保護(hù)性的腸道免疫應(yīng)答(非腸道病原體)。直到現(xiàn)在，據(jù)認(rèn)為通過口服免疫不能獲得對(duì)由該非腸道病原體引起的感染進(jìn)行保護(hù)，尤其是當(dāng)來自該病原體的抗原用于抵抗完全活的或減毒的病原體的時(shí)候。
這些病原微生物經(jīng)常是通過非腸道途徑侵染，尤其是通過皮膚上刺破的小口，磨損，切口，或其它的裂口，例如，通過輸血等等。
通過非腸道病原體所致疾病有以下這些乙型肝炎，丙型肝炎，丁型肝炎，黃熱病，拉沙熱，登革熱，狂犬病，破傷風(fēng)，金色葡萄球菌感染，雅司病，回歸熱，鼠咬熱，腺鼠疫，傷寒熱及斑疹熱。
作為上述實(shí)例之一，乙型肝炎病毒(HBV)是導(dǎo)致致病率及死亡率據(jù)高不下的重要的致病病毒，盡管已有許多有效的腸胃外疫苗。據(jù)估計(jì)在1996年，大約有115百萬(wàn)人感染了乙肝病毒。由此導(dǎo)致的死亡人數(shù)據(jù)估計(jì)每年有100萬(wàn)例。在發(fā)達(dá)國(guó)家例如美國(guó)，對(duì)乙肝病毒的免疫率依然是低于已定的目標(biāo)，且每年有超過30萬(wàn)的新的病例發(fā)生，由乙肝病毒感染引起的死亡人數(shù)每年有5000人。此外，在一份對(duì)美國(guó)自1976年至1994年間對(duì)乙肝病毒感染流行的回顧中可以看出，在此期間，盡管使用了乙肝疫苗，乙肝病毒感染率并沒有明顯下降。這樣在發(fā)達(dá)國(guó)家中，仍然有必要對(duì)現(xiàn)行的胃腸外疫苗的替代措施及途徑加以改進(jìn)和完善。隨著越來越多的疫苗成為兒童免疫的一部分，這一點(diǎn)尤為重要，因?yàn)槲覀円欢ㄒ紤]怎樣安全有效地使用兒科免疫計(jì)劃中的眾多的抗原。
另外一個(gè)值得注意的是，全球乙肝發(fā)病率及死亡率占的很大比例出于乙肝病毒蔓延的發(fā)展中國(guó)家。例如，在馬拉維的鄉(xiāng)下，醫(yī)院產(chǎn)婦中72％有明顯的HBV感染，13％是慢性攜帶者。在這些地方，因?yàn)橐呙缧枰鋬霰４婕案哳~的疫苗價(jià)格，現(xiàn)存的胃腸外疫苗的供應(yīng)非常有限。盡管已經(jīng)發(fā)起了一些重要的向發(fā)展中國(guó)家提供乙肝疫苗的活動(dòng)，但是仍然需要有替代途徑。盡管在發(fā)達(dá)國(guó)家免疫率在不斷增加，在缺少有效的全球乙肝免疫計(jì)劃的情況下，乙肝由發(fā)展中國(guó)家進(jìn)入發(fā)達(dá)國(guó)家仍將持續(xù)。
作為一種抗某些疾病的胃腸外免疫的替代途徑是可以通過口服給藥的疫苗。如前所討論的那樣，口服疫苗對(duì)于非腸道病原體通常是無(wú)效的。
已提出了口服免疫的一種特定的途徑，即在轉(zhuǎn)基因植物組織中表達(dá)抗原，然后攝入。這種技術(shù)，可能同時(shí)提供簡(jiǎn)單的生產(chǎn)方式及適于口服免疫的存在于某種基質(zhì)形式的抗原。此外，植物組織如馬鈴薯塊莖有明顯的優(yōu)勢(shì)，因?yàn)槭卟?，甚至在未加工狀態(tài)下，在市場(chǎng)中都有很長(zhǎng)的安全期。最后，表達(dá)口服抗原的轉(zhuǎn)基因植物組織可以有同時(shí)刺激體液及粘膜免疫的額外優(yōu)點(diǎn)，結(jié)果是其比胃腸外免疫方式更為有效地保護(hù)了粘膜表面。直到現(xiàn)在，并沒有發(fā)現(xiàn)表達(dá)非腸道病原體抗原物質(zhì)的轉(zhuǎn)基因植物組織作為口腔疫苗會(huì)比直接通過口腔攝取該種純化的抗原更為有效。
表達(dá)乙肝表面抗原(HBsAg)的植物實(shí)際上已經(jīng)被開發(fā)，但是同時(shí)令人失望的是通過哺乳動(dòng)物攝取該植物僅產(chǎn)生少量的或不能接受的低免疫應(yīng)答，而從植物中分離的HBsAg已經(jīng)發(fā)現(xiàn)通過腸外給藥可以刺激免疫應(yīng)答。在整個(gè)本說明書中，HBsAg是舉例性的，且代表已知的當(dāng)通過胃腸外給藥時(shí)產(chǎn)生免疫反應(yīng)的其它非腸道病原體抗原。
已開發(fā)了表達(dá)乙肝表面抗原的轉(zhuǎn)基因植物如馬鈴薯，該抗原是一種已知通過胃腸外給藥對(duì)乙肝產(chǎn)生免疫應(yīng)答的抗原。不幸的是，當(dāng)植物例如馬鈴薯僅被簡(jiǎn)單的用于喂養(yǎng)動(dòng)物時(shí)，這樣的免疫應(yīng)答并未被刺激到可以接受的水平。
然而，現(xiàn)在意外地發(fā)現(xiàn)當(dāng)動(dòng)物對(duì)HBsAg為免疫感受態(tài)(immunoreceptive)時(shí)，用植物材料中的抗原喂養(yǎng)動(dòng)物時(shí)可獲得對(duì)非腸道病原體抗原如乙肝表面抗原(HBsAg)的免疫應(yīng)答。現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，可以通過共同施用含抗原的植物材料和適當(dāng)?shù)淖魟┦沟脛?dòng)物對(duì)非腸道病原體抗原如HBsAg呈免疫感受態(tài)。動(dòng)物也可以是由于在先免疫例如初次免疫而為免疫敏感的，在這種情況下，通過給動(dòng)物喂養(yǎng)含有抗原的植物材料，可在動(dòng)物中加強(qiáng)對(duì)該非腸道抗原如HBsAg的免疫應(yīng)答。這種情況下發(fā)現(xiàn)并不需要免疫佐劑。但是可以使用免疫佐劑以達(dá)到獲得更高的免疫應(yīng)答的目的。例如，動(dòng)物如人如果先前對(duì)初次抗乙肝免疫有陽(yáng)性反應(yīng)，可以通過喂養(yǎng)含有該抗原的植物材料加強(qiáng)其對(duì)HBsAg的免疫應(yīng)答。這些植物材料是含有來自于植物的生理學(xué)上可接受的植物材料的物質(zhì)(如果汁，果肉，樹葉，莖，根，水果種子，植物體一部分或其整體)，特別是馬鈴薯，其中它們含有乙肝表面抗原(HBsAg)。這些植物中的HBsAg來自于經(jīng)過遺傳改變植物所表達(dá)的HBsAg。
″非腸道病原體抗原″(NEPA)指經(jīng)過胃腸外途徑可刺激機(jī)體對(duì)非腸道病原體的免疫應(yīng)答的抗原。
所使用的HBsAg指乙肝表面抗原，并在這里用作非腸道病原體抗原的一個(gè)實(shí)例。
目標(biāo)植物材料的來源植物可以是任何植物，只要它含有非腸道病體抗原如HBsAg。植物可以通過轉(zhuǎn)基因改造而表達(dá)HBsAg及其它非腸道病原體抗原。幾乎任何可以被攝取的植物都可以被改造來表達(dá)HBsAg及其它非腸道病原體抗原，但最優(yōu)選的植物是食用植物，如產(chǎn)生果實(shí)、谷物及蔬菜的植物，如香蕉、馬鈴薯及番茄。特別優(yōu)選的植物材料是不含有大量酸的植物材料，如塊莖類植物象馬鈴薯，因?yàn)槟承┲参锊牧先绶鸦蚋涕兕惖墓麑?shí)中的酸可以導(dǎo)致HBsAg降解。另外，含有大量蛋白酶的植物材料如番木瓜可能也不理想，因?yàn)檫@些酶也可以降解HBsAg。這里所用的“大量”指可以使得抗原降解到免疫應(yīng)答明顯減少程度的數(shù)量。
本領(lǐng)域技術(shù)人員已知使得煙草類植物表達(dá)HBsAg及其它抗原的遺傳改造方法，如Mason等人所述″轉(zhuǎn)基因植物中乙肝表面抗原的表達(dá)″，Proc.Natl.Acad.Sci USA,Vol.89,pp.11749,1992年12月。這篇文章作為背景技術(shù)加以引用。遺憾的是煙草不宜攝取，從而不是生理上可接受的。根據(jù)本發(fā)明，類似的方法可用于遺傳改造其它植物使其表達(dá)HBsAg及其它非腸道病原體抗原。適宜的植物尤其為茄科植物，特別是馬鈴薯。下文將詳細(xì)描述關(guān)于馬鈴薯的遺傳改變過程。
本發(fā)明所使用的植物至少應(yīng)含有每克要消化的植物產(chǎn)品5μg，優(yōu)選是7μg至15μg HBsAg。動(dòng)物如人應(yīng)該攝取足夠量的植物材料以提供每千克體重約10～約100微克的乙肝表面抗原。動(dòng)物例如人通常應(yīng)該攝取足夠量的植物材料以提供每千克體重約2～5克的植物材料。
如果系列間隔地?cái)z取植物材料可以提高免疫應(yīng)答，例如，2次或3次的系列攝取，每次應(yīng)至少間隔5天，優(yōu)選是至少間隔7～14天。
本發(fā)明的植物材料如果缺少本發(fā)明要求的方法步驟時(shí)口服使用并不產(chǎn)生明顯的免疫應(yīng)答，也就是來自免疫應(yīng)答的保護(hù)能力。按照本發(fā)明，含有HBsAg或其它非腸道病原體抗原的植物材料必需，或者給先前已例如通過胃腸外注射初次免疫的個(gè)體口服使用，或者與可以有效地使得HBsAg或者非腸道病原體抗原產(chǎn)生保護(hù)性免疫反應(yīng)的免疫佐劑聯(lián)合口服使用。在本發(fā)明以前，不可能預(yù)測(cè)針對(duì)NEPA如HBsAg的免疫應(yīng)答可以通過含有NEPA的植物材料被先前已有初次免疫的個(gè)體攝取或者與免疫佐劑聯(lián)合攝取而產(chǎn)生。
可能有效的佐劑包括細(xì)菌質(zhì)粒DNA，抗HB抗體，含有免疫刺激劑CpG的寡脫氧核苷酸分子，修飾的霍亂毒素(CT)，修飾的大腸桿菌熱穩(wěn)定性淋巴毒素，胞壁酰基二肽的親脂衍生物(MDP-Lys(L18))，磷酸鋁或者硫酸鋁，細(xì)胞因子，或者丙肝核心蛋白。大量的已接受抗乙肝免疫的受治個(gè)體當(dāng)用本發(fā)明的方法進(jìn)行治療時(shí)顯示出免疫增強(qiáng)反應(yīng)，例如，有60％甚至更多的受治對(duì)象。但是，應(yīng)該認(rèn)識(shí)到還有一部分因不明原因而不產(chǎn)生可測(cè)的免疫增強(qiáng)反應(yīng)的受治個(gè)體。其中可能的原因有這些受治個(gè)體盡管先前已經(jīng)接受過初次免疫治療，但事實(shí)上并未產(chǎn)生強(qiáng)的初次免疫反應(yīng)或因?yàn)槌醮蚊庖吆髸r(shí)間太長(zhǎng)受治個(gè)體中的記憶細(xì)胞太少。類似的結(jié)果也發(fā)生在已有疫苗中，不管以什么樣的方式使用，換句話說，有的受治個(gè)體根本不產(chǎn)生反應(yīng)。
本發(fā)明可以用下述實(shí)施例來證明。
給動(dòng)物喂養(yǎng)表達(dá)且含有HBsAg的馬鈴薯，所產(chǎn)生的抗乙肝免疫應(yīng)答可以用酶聯(lián)免疫方法來測(cè)定。
之所以用馬鈴薯作為本發(fā)明可用植物的優(yōu)選實(shí)例是基于下列幾點(diǎn)考慮的。首先是因?yàn)榕c其它的植物材料尤其是某些果實(shí)相比較，馬鈴薯相對(duì)為中性；另外，已有大量的關(guān)于馬鈴薯的遺傳特性或者可能的轉(zhuǎn)基因修飾的研究；更為重要的是，馬鈴薯是人類主要的食物，據(jù)估計(jì)全球每人每年消費(fèi)1到100千克的馬鈴薯，美國(guó)人均年消費(fèi)據(jù)估計(jì)已達(dá)到36千克。此外，在美國(guó)，馬鈴薯作為一種蔬菜原料被列入聯(lián)邦法規(guī)[21 CFR 101.44(b)]的20種最常用蔬菜原料之一。用于生產(chǎn)當(dāng)前通用的HBV-EPV轉(zhuǎn)基因植物的馬鈴薯的具體的栽培變種，按照本發(fā)明具體的實(shí)施例，同樣可以生產(chǎn)表達(dá)其它抗原的轉(zhuǎn)基因植物。這些植物的未加工或者已經(jīng)削皮的馬鈴薯與來自于同一馬鈴薯親本的未轉(zhuǎn)化的馬鈴薯一樣安全，且在其它表達(dá)的腸道抗原的Ⅰ期臨床試驗(yàn)中耐受良好。
轉(zhuǎn)化植物以表達(dá)HBsAg及其它抗原的方法對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的，例如美國(guó)專利5,484,719；5,914,123及5,612,487所描述的那樣，這些專利在這里列為本發(fā)明的背景技術(shù)。
HBsAg先前已經(jīng)在轉(zhuǎn)基因煙草植物(茄科(馬鈴薯)成員之一)中表達(dá)。在這個(gè)體系中，HBsAg的表達(dá)率占總可溶葉蛋白的0.01％。與那些源于重組酵母的衍生HBsAg相應(yīng)的HBsAg顆粒物在葉組織的抽提物中被發(fā)現(xiàn)。當(dāng)該材料與完全弗氏佐劑(CFA)一起經(jīng)腹膜內(nèi)(i.p.)給予小鼠時(shí)，其產(chǎn)生抗HBS，并未有明顯的副反應(yīng)發(fā)生。
選擇用于這些實(shí)施例的表達(dá)HBsAg的馬鈴薯是來自S.tuberosumL.c.v.Frito-Lay 1607 HB-7的轉(zhuǎn)化系。這些轉(zhuǎn)化系被命名為FL-1607 HB-7及HB114-16。為了獲取這些轉(zhuǎn)化系，來自于一個(gè)HBV中國(guó)adr分離株的pMT-SA克隆的HBsAg基因被插入到轉(zhuǎn)化質(zhì)粒載體(pHB-7及pHB114)中，其被運(yùn)載到根癌土壤桿菌(LBA4404)中，然后用其轉(zhuǎn)化Solanum tuberosum L cv.″Frito-Lay 1607″。用于構(gòu)造這些實(shí)施例中所用馬鈴薯系pHB-7及pHB114-16的質(zhì)粒載體都含有表達(dá)新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(NPTII，也稱為APH(3’)II)的基因。該基因同樣可以被整合到馬鈴薯基因組中并在馬鈴薯細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。大腸桿菌衍生的NPTII已被證明有與植物表達(dá)的NPTII同樣的生化特性。大腸桿菌衍生自的NPTII在模擬哺乳動(dòng)物消化系統(tǒng)的條件下迅速降解，并且在喂養(yǎng)給小鼠純化的蛋白至5g/kg體重的情況下并未有任何有害作用。轉(zhuǎn)化的FL-1607用根癌土壤桿菌處理，并進(jìn)行無(wú)性繁殖，根據(jù)其高水平的HBsAg表達(dá)能力選擇了FL-1607 HB-7及HB114-16系。FL-1607轉(zhuǎn)化系的抽提物通過ELISA技術(shù)來測(cè)試HBsAg濃度，HB-7平均每克塊莖重1100ngHBsAg,HB114-16平均每克塊莖重8500ng±2100ngHBsAg。
此外，抽提的HBsAg自發(fā)形成病毒樣顆粒(VLP)，其與來自于酵母的HBsAgVLP在同樣的密度沉降。電泳遷移及Western印跡分析都顯示出塊莖表達(dá)的抗原與來自酵母的抗原無(wú)法區(qū)別。
通過細(xì)胞系無(wú)性繁殖成倍增加該植株的數(shù)量，并通過土壤盆栽以獲取實(shí)施例中所要用的塊莖。轉(zhuǎn)化系通過體外無(wú)性繁殖來保持。
未轉(zhuǎn)化的親本馬鈴薯系FL-1607通過無(wú)性繁殖來保持，并以盆栽形式來生產(chǎn)對(duì)照組所使用的塊莖。來自這些塊莖的組織并不表達(dá)任何與檢測(cè)HBsAg的試劑反應(yīng)的蛋白。
實(shí)施例1給BALB/c小鼠喂養(yǎng)或者削皮的HB-7馬鈴薯切片或者對(duì)照未轉(zhuǎn)化的馬鈴薯。在第0,7,14天分別給予5g的馬鈴薯來喂養(yǎng)每組小鼠。霍亂毒素(CT)的B亞單位(Sigma)被用作口服佐劑。10μg佐劑被放置在馬鈴薯切片上(在試驗(yàn)組及對(duì)照組)并與抗原一起為動(dòng)物所食用。這樣喂養(yǎng)HB-7的動(dòng)物獲得平均每次給食5.5μg的HBsAg，或者在所提供的三次給食中接受16.5μg HBsAg的平均總量。
喂養(yǎng)HB-7的小鼠形成HBsAg特異的血清IgM及IgG應(yīng)答，而喂養(yǎng)未轉(zhuǎn)化馬鈴薯的對(duì)照組并未產(chǎn)生任何抗體。經(jīng)過第三次喂養(yǎng)可以觀察到免疫應(yīng)答在70mIU/ml左右達(dá)到頂峰。經(jīng)過單次腹膜內(nèi)接種明礬中的0.5μg酵母衍生的重組HBsAg(rHBsAg)(正常亞免疫劑量)后可以觀察到在1700mIU/ml達(dá)到頂峰的再次應(yīng)答。該應(yīng)答的主要免疫球蛋白是IgG。但在喂養(yǎng)未轉(zhuǎn)化馬鈴薯及CT的對(duì)照組并未發(fā)現(xiàn)有初次、再次應(yīng)答發(fā)生。沒有口服佐劑則不產(chǎn)生對(duì)HBsAg的明顯應(yīng)答。
實(shí)施例2下一步實(shí)驗(yàn)使用Frito-Lay 1607HB114-16細(xì)胞系，在這個(gè)細(xì)胞系中的表達(dá)由35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，這些試驗(yàn)所用的塊莖表達(dá)平均為8.37μgHBsAg/每克塊莖濕重。
給BALB/c小鼠(5只/組)喂養(yǎng)或者HB114-16或者對(duì)照非轉(zhuǎn)基因馬鈴薯。在這兩組中馬鈴薯中都加入了10μg CT。一周和兩周后重復(fù)喂養(yǎng)。在3周期間，給每一小鼠轉(zhuǎn)基因馬鈴薯HBsAg的平均劑量為125.5μg。然后，在經(jīng)第一次喂養(yǎng)后70天，或者經(jīng)初次免疫反應(yīng)后3-6周后回到基線，經(jīng)過皮下注射以鋁劑作為佐劑給予對(duì)小鼠亞免疫劑量(0.5μg)的rHBsAg(Merck)進(jìn)行免疫。
在這些劑量水平，經(jīng)過二次給食后往往能立即出現(xiàn)起始免疫反應(yīng)。這些免疫反應(yīng)持續(xù)升高且在6周左右達(dá)到100mIU/ml的頂峰?，F(xiàn)在得到許可的可注射乙肝疫苗在經(jīng)過三次給藥的人體中出現(xiàn)僅10mIU/ml的滴度就被認(rèn)為已成功免疫。這些免疫反應(yīng)在13周后回到基線，16周時(shí)給予動(dòng)物rHBsAg增強(qiáng)劑量。這將導(dǎo)致免疫滴度迅速升高至大于3000mIU/ml，在試驗(yàn)的剩余時(shí)間內(nèi)其將保持在超過1000mIU/ml的水平(40周)。這證明在初次免疫過程中產(chǎn)生的抗原特異性免疫記憶細(xì)胞，可以在二次免疫(加強(qiáng))時(shí)被迅猛地激活。
給予非轉(zhuǎn)化馬鈴薯+CT的本試驗(yàn)對(duì)照組動(dòng)物并未產(chǎn)生針對(duì)HBsAg的免疫反應(yīng)和在亞免疫劑量的二次攻擊(如上所述)過程中并未產(chǎn)生再次應(yīng)答，證明所述結(jié)果的特異性。沒有CT而僅給予轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的對(duì)照組動(dòng)物僅產(chǎn)生低水平的如10mIU/ml滴度的初次免疫反應(yīng)，且在一周后就回到基線。在如上所述的亞免疫劑量的二次攻擊過程中僅產(chǎn)生50mIU/ml的再次免疫反應(yīng)且僅在兩周后就回到10mIU/ml的水平。
實(shí)施例3轉(zhuǎn)基因馬鈴薯還被用于加強(qiáng)小鼠先前已存在的亞免疫劑量的rHBsAg。在本試驗(yàn)中，BALB/c小鼠(5只/組)用亞免疫劑量的rHBsAg(Merck)以明礬作為佐劑來進(jìn)行皮下免疫。5周后，每一小鼠或用HB114-16或用對(duì)照非轉(zhuǎn)基因馬鈴薯喂養(yǎng)。在這兩組中在馬鈴薯中都加入了10μgCT。一周和兩周后重復(fù)喂養(yǎng)，每一小鼠的總平均劑量在三周期內(nèi)為125.55μg。
在第三次喂養(yǎng)時(shí)開始出現(xiàn)再次免疫反應(yīng)且其在初次致敏免疫后11周且尚未下降時(shí)升高到約1000mIU/ml的水平。在對(duì)照組中喂養(yǎng)非轉(zhuǎn)基因馬鈴薯沒有出現(xiàn)免疫反應(yīng)。
實(shí)施例442個(gè)自愿者經(jīng)測(cè)試沒有HIV并且先前接受過商業(yè)乙肝疫苗的初次免疫，并經(jīng)過了一段時(shí)間其抗HBsAg滴度低于115mIU/ml。在一個(gè)隨機(jī)雙盲研究中，給這些自愿者食用含有HBsAg的馬鈴薯及在對(duì)照組中給其食用不含HBsAg的馬鈴薯。解開密碼后確定組1為對(duì)照組，接受100克非轉(zhuǎn)基因馬鈴薯FL-1607的三種劑量。組2接受100克轉(zhuǎn)基因馬鈴薯FL-1607HB114-16的兩種劑量及非轉(zhuǎn)基因馬鈴薯-FL-1607的一種劑量。組3接受100克轉(zhuǎn)基因馬鈴薯FL-1607HB114-16的三種劑量。
現(xiàn)有的臨床前數(shù)據(jù)表明，(1)以重量計(jì)，小鼠自由消耗多至其體重的25％的馬鈴薯不產(chǎn)生任何毒性作用；及(2)在約15克馬鈴薯中共16μg劑量的HBsAg與口服佐劑一起在初次免疫實(shí)驗(yàn)中有免疫原性。來自其它馬鈴薯疫苗的現(xiàn)有臨床數(shù)據(jù)表明，(1)消耗100克未加工的馬鈴薯一般耐受良好；及(2)以重量計(jì)，一個(gè)體重70公斤的人消耗100克相當(dāng)于其體重的0.14％。這個(gè)數(shù)量比在臨床前試驗(yàn)中小鼠所消耗的量少了約178倍(重量)。
這樣，對(duì)于該人體試驗(yàn)，每次給自愿者食用100到110克馬鈴薯。本研究計(jì)劃使用的臨床材料每克馬鈴薯含有8.5±2.1μg HBsAg。在整個(gè)28天內(nèi)，接受兩個(gè)100克劑量轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的受治個(gè)體接受總劑量1,280至2,120μg的HBsAg；接受三個(gè)劑量的受治個(gè)體接受總共1,920至3,180ug的HBsAg。
給藥的每一天(第0,14及28天)，配藥人員用清潔技術(shù)給每組(試驗(yàn)組及對(duì)照組)分別取一定數(shù)目的馬鈴薯并加工以給每人分配100到110克的劑量。簡(jiǎn)單來說，洗干凈所選擇的馬鈴薯，并將其削皮、切片并放置于冰水混合物水浴中。馬鈴薯削皮是為了去除含有生物堿-茄堿的馬鈴薯皮，因?yàn)樵撋飰A可能導(dǎo)致腹部不適或惡心且有一定的苦味。經(jīng)過削皮及切片，按照所劃分的組別及受治個(gè)體的識(shí)別號(hào)碼(SID)給每個(gè)研究個(gè)體稱取100到110克劑量的馬鈴薯。收集馬鈴薯皮及未用的部分并將其處理掉。將用于每一受治個(gè)體的馬鈴薯在水中保存以防止其在切片后至為受治個(gè)體食用期間氧化變色。將用于每組每次給食的處理后的馬鈴薯樣品的一部分保留下來冷凍用于進(jìn)一步處理以驗(yàn)證抗原含量。
在表1、2、3所顯示的天數(shù)對(duì)受治個(gè)體進(jìn)行抗-HBsAg的滴度測(cè)試。結(jié)果清楚顯示了食用遺傳轉(zhuǎn)化的馬鈴薯導(dǎo)致對(duì)所給HBsAg NEPA抗原的免疫反應(yīng)提高。有超過60％的接受三個(gè)劑量含HBSAg NEPA抗原的馬鈴薯的受治個(gè)體顯示免疫反應(yīng)有顯著的增強(qiáng)。表中清楚地顯示，在許多情況下，攝取含有遺傳表達(dá)的HBsAg NEPA的植物材料可以有效地加強(qiáng)初次乙肝免疫。對(duì)照組中接受三組劑量的非轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的受治個(gè)體沒有一例在整個(gè)檢測(cè)過程中抗體滴度發(fā)生任何變化。
表1第一組(接受三個(gè)劑量的非轉(zhuǎn)基因馬鈴薯塊莖)滴度(1m/ml)
表2第二組(接受兩個(gè)劑量的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯塊莖及一個(gè)劑量的非轉(zhuǎn)基因馬鈴薯塊莖)滴度(1m/ml)
表3第三組(接受三個(gè)劑量的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯塊莖)滴度(1m/ml)
權(quán)利要求
1．一種在對(duì)非腸道病原體抗原(NEPA)為免疫感受態(tài)的動(dòng)物中產(chǎn)生對(duì)NEPA免疫應(yīng)答的方法，其特征在于用包含含NEPA的生理學(xué)上可接受的植物材料的物質(zhì)喂養(yǎng)該動(dòng)物。
2．如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于NEPA為乙肝表面抗原(HBsAg)。
3．如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于通過用所述物質(zhì)和使動(dòng)物對(duì)NEPA免疫感受的佐劑一起喂養(yǎng)該動(dòng)物使得所述動(dòng)物對(duì)NEPA為免疫感受態(tài)。
4．如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于NEPA為HBsAg。
5．如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述動(dòng)物是人。
6．如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于植物材料來自于經(jīng)遺傳改造表達(dá)所述抗原的植物。
7．如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于人體攝取足夠量的植物材料以獲得每千克人體體重大約10至100微克的NEPA。
8．如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于人體攝取足夠量的植物材料以獲得每千克人體體重大約2至5克的植物材料。
9．如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于人體多次攝取所述植物材料，所述各次彼此間隔至少5天。
10．如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述多次為3次。
11．如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于植物材料是來自于茄科植物的材料。
12．如權(quán)利要求11所述的方法，該植物為馬鈴薯。
全文摘要
一種通過給對(duì)NEPA為免疫感受態(tài)的動(dòng)物喂養(yǎng)包含于植物材料中的抗原獲得對(duì)諸如乙肝表面抗原的非腸道病原體抗原(NEPA)的免疫應(yīng)答的方法?，F(xiàn)發(fā)現(xiàn)可以通過給予含NEPA的該植物材料和適當(dāng)?shù)淖魟┦箘?dòng)物對(duì)NEPA為免疫感受態(tài)。該植物材料是一種含有生理學(xué)上可接受的植物材料的物質(zhì),尤其是馬鈴薯,其中含有NEPA,如乙肝表面抗原。植物中的NEPA如乙肝表面抗原來自該植物經(jīng)過遺傳改造表達(dá)的NEPA。
文檔編號(hào)A61P37/04GK1302662SQ0013714
公開日2001年7月11日 申請(qǐng)日期2000年10月13日 優(yōu)先權(quán)日1999年10月13日
發(fā)明者Y·塞納瓦拉, C·J·阿恩茨恩 申請(qǐng)人:健康研究公司, 博伊斯湯普森植物研究所公司