專利名稱：抗病原體的植物及其生產(chǎn)方法
技術領域：
總的來說，本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)生物技術和植物病害領域。具體來說，本發(fā)明涉及參與植物病原體抗性的負調(diào)控的植物基因及其用途。更具體來說，本發(fā)明涉及具有有缺陷的植物磺肽素(phytosulfokine) (PSK)功能并表現(xiàn)出對植物病原體的抗性提高的植物。本發(fā)明還涉及用于生產(chǎn)對各種病害有抗性的改良植物的方法。此外，本發(fā)明涉及具有有缺陷的PSK受體(PSKR)功能的植物，以及篩選和鑒定調(diào)節(jié)PSKR表達或活性的分子的方法。
背景技術：
植物病原體代表了對作物栽培的永久性威脅。具體來說，由于產(chǎn)量損失和植物被毒素污染，細菌、真菌、卵菌或線蟲對作物的感染可能對農(nóng)業(yè)具有破壞性影響。大多數(shù)植物病原細菌屬于下列屬:雷爾氏菌屬(Ralstonia),歐文氏菌屬(Erwinia),果膠桿菌屬(Pectobacterium),泛菌屬(Pantoea), 土壤桿菌屬(Agrobacterium),假單胞菌屬(Pseudomonas),伯克霍爾德菌屬(Burkholderia),食酸菌屬(Acidovor ax),黃單胞菌屬(Xanthomonas),棒形桿菌屬(Clavibacter),鏈霉菌屬(Streptomyces),木桿菌屬(Xylella),螺原體屬(Spiroplasma)和植原體屬(Phytoplasma)0植物病原細菌引起許多不同種類的癥狀，包括菌癭和增生物、枯萎、葉斑、小斑和凋萎、軟腐病以及瘡痂病和黑腐病。某些植物病原細菌產(chǎn)生毒素或注入引起宿主細胞死亡的特殊蛋白質，或產(chǎn)生分解植物細胞的關鍵結構組分的酶。一個實例是由軟腐細菌產(chǎn)生的降解果膠層的酶，所述果膠層使植物細胞結合在一起。其他植物病原細菌例如雷爾氏菌屬菌種(Ralstonia spp.)定植于導水的木質部導管，引起植物枯萎和死亡。土壤桿菌屬(Agrobacterium)菌種甚至具有遺傳修飾或轉化它們的宿主并導致形成被稱為冠癭的癌樣增生物的能力。植物中的細菌性病害是難以控制的。重點放在防止細菌的擴散而不是治愈植物上。栽培技術可以消除或減少細菌污染來源，例如輪作以減少越冬。然而，最重要的控制方法是通過遺傳改造宿主抗性以提供有抗性的變種、栽培品種或雜交種來確保的。線蟲是用顯微鏡可見的蠕蟲樣生物體。它們最通常以植物根為食，但是某些線蟲也侵入葉組織。線蟲吸出液體營養(yǎng)物并將破壞性物質注入植物中。它們損傷植物細胞或改變植物的正常生長過程。線蟲的癥狀包括莖或根的腫脹、不規(guī)則分枝、葉片變形、不開花和根上的菌癭。線蟲可以促進病毒和真菌進入植物。根結線蟲(根結線蟲屬物種(Meloidogynespp.))和胞囊線蟲(球胞囊線蟲屬物種(Globodera spp.)和異皮線蟲屬物種(Heteroderaspp.))是對園藝和田間作物最具經(jīng)濟破壞性的植物寄生性線蟲屬。目前，殺線蟲劑是控制線蟲的最重要手段。然而，大多數(shù)殺線蟲劑是非特異性的，具有公知的毒性，并且對土壤生態(tài)系統(tǒng)、地下水和人類健康構成威脅。卵菌是對農(nóng)業(yè)和自然生態(tài)系統(tǒng)具有破壞性的真菌樣植物病原體。疫霉屬(Phytophthora)菌種引起諸如梢枯病、馬鈴薯晚疫病、櫟樹猝死病的病害，并造成嚴重的作物損失(例如全世界馬鈴薯產(chǎn)量的30%)。腐霉屬(Pythium)菌種是死體營養(yǎng)型菌種，其殺死植物并造成作物例如玉米的腐皮病。霜霉病菌例如感染葡萄的葡萄生單軸霉(Plasmoparaviticola)是活體營養(yǎng)型病原體，它們保持其宿主存活，但是以嚴重影響產(chǎn)量的方式使其宿主衰弱。霜霉病菌可以通過在葉片下表面上出現(xiàn)白色、微褐色或橄欖色的“霉”來容易地鑒定。來自于白銹菌屬(Albugo)的卵菌在各種有花植物上引起白銹或白皰病。卵菌在很長的一段時間中被認為是真菌，因為它們是異養(yǎng)、形成菌絲體的生物體。然而，幾種形態(tài)學和生物化學特征將卵菌與真菌區(qū)別開。目前的分類學將卵菌與光合生物例如褐藻或硅藻類一起分類在原生藻菌(stramenopile)界中。由于它們特殊的生理特征，目前沒有針對由這些微生物引起的病害的有效治療方法可用。目前用于對抗卵菌的殺蟲劑依賴于苯基酰胺類的甲霜靈，其抑制RNA聚合酶-1。甲霜靈對環(huán)境造成影響，并且病原體快速發(fā)展出對這種殺卵菌劑的抗性，目前這種抗性已成為分別來自于馬鈴薯和辣椒的病原性致病疫霉(P.1nfestans)和辣椒疫霉(P.capsici)種群的普遍特征。
常見真菌病害包括白粉病、銹病、葉斑病、凋萎病、根腐和頸腐病、猝倒病、黑粉病，炭疽病和維管萎蔫病。目前，通過例如施用昂貴且有毒的殺真菌劑，使用例如噻菌靈、三環(huán)唑、咯喹酮和苯酞進行化學處理，或通過燒毀被感染的作物來控制真菌病害。由于真菌病原體能夠發(fā)展出對化學處理的抗性，這些方法僅僅部分成功。為了減少殺蟲劑的使用量，植物育種家和遺傳學家已在嘗試鑒定病害的抗性基因座并利用植物的天然防御機制對抗病原體攻擊。植物能夠識別某些病原體并以抗性響應的形式激活防御，所述抗性響應可以引起病原體生長的限制或停止。已經(jīng)鑒定到許多抗性(R)基因，其為各種植物物種提供了對抗廣范圍病原體的抗性。然而，對于在植物防御機制期間開關這些基因的關鍵因素，仍然了解得很少。此外，病原體可能突變并克服由抗性基因提供的保護。為了控制晚疫病，經(jīng)常使用顯性抗性基因在易感栽培品種中的基因漸滲來管控疫霉屬(Phytophthora)抗性。將來自于野生馬鈴薯物種野生馬鈴薯(Solanum demissum)的11個R基因引入到現(xiàn)代馬鈴薯栽培品種中。然而，致病疫霉(P.1nfestans)菌種很快避開了栽培品種的新的單基因介導的抗性性質。因此，R基因的基因漸滲顯示出其用于疫霉屬(Phytophthora)抗性育種的限制，并且必須開發(fā)替代的程序來提供持久的卵菌抗性。植物磺肽素(PSK)是一種分泌的肽，其首先在源自于蘆笑(Asparagusofficinalis L.)葉肉培養(yǎng)物的培養(yǎng)基中被鑒定到，并被提出是造成“調(diào)理”或“看護”即促生長效應的主要化學因子，所述效應是由先前用于細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基或由物理上分離的“飼養(yǎng)”細胞所觸發(fā)的(Matsubayashi 和 Sakagami, 1996)。PSK肽也分離自源自于水稻(Oryza sativa L.)懸浮培養(yǎng)物的調(diào)理培養(yǎng)基，并被鑒定為以兩種形式存在:硫酸酯化的五肽([H-Tyr (S03H)-1le-Tyr (S03H)-Thr-Gln-OH]，PSK α )及其 C-端截短的四肽([H-Tyr (S03H) -1le-Tyr (S03H) -Thr-OH]，PSK β )(Matsubayashi Y.等，1997)。作者提出，由PSK肽因子介導的信號轉導途徑參與植物細胞增殖。PSK是由約80個氨基酸長的前體肽經(jīng)酪氨酸殘基的翻譯后硫酸酯化和蛋白水解加工而產(chǎn)生的(Yang等，1999)。編碼PSK前體的基因冗余分布在基因組中，并在培養(yǎng)的細胞和各種組織包括葉、莖、花和根中表達(Matsubayashi Y.等,2006 ;Kutschmar等,2008)。在不同植物物種中已鑒定到兩種PSKR受體=PSKRl和PSKR2。這些受體是富含亮氨酸重復序列的受體激酶(LRR-RK)家族的成員。PSK以高度特異性方式與其受體相互作用，具有納摩爾級的解離常數(shù)。此外，已通過光親和標記鑒定到胡蘿卜PSKRl (DcPSKRl)的PSK結合結構域(Shinohara等，2007)。作者發(fā)現(xiàn)，Glu503-Lys517的缺失完全破壞了 DcPSKRl的配體結合活性。這個區(qū)域處于兩側帶有細胞外LRR的島結構域中，表明該結構域形成了與PSK直接發(fā)生相互作用的配體結合口袋。已知PSK主要是內(nèi)源性分泌的硫酸酯化的5個氨基酸的肽，其是調(diào)控細胞去分化和再分化的關鍵因子，并通過與PSK受體(PSKR)結合來影響細胞的生長潛力。最近，除了促有絲分裂活性之外，Bahyrycz等(2008)還提出了 PSK肽的抗真菌活性。該文獻顯示了PSK α和β肽在體外以劑量依賴性方式抑制Phoma nareissi和郁金香葡萄孢(Botrytistulipae)病原體的菌絲體生長。Loivamaeki等，2010也提出了 PSK信號轉導在植物創(chuàng)傷形成中的作用。冠癭中PSK/PSKR1的轉錄激活可能是由致瘤期間發(fā)生的細胞再分化過程所造成的。Motose等，Plant Physiol.150, 437-447，2009也已提出作為創(chuàng)傷響應的PSK信號轉導的激活。Amano等，2007涉及與植物磺肽素相關的新型硫酸酯化糖肽PSYl的鑒定及其在發(fā)育過程中的參與。W002/083901涉及基于GREP (生長調(diào)控蛋白)多肽或其在水稻中鑒定到的PSK類似物OsPSK的表達或活性的調(diào)節(jié)來改變植物的生長、體系結構和形態(tài)的方法。因此，在本技術領域中基本上表明PSK是細胞增殖或分化的調(diào)控物，并具有可能的抗真菌活性。在本技術領域中沒有公開或提出PSK是植物中病原體抗性的關鍵調(diào)控物。發(fā)明概述本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)對病原體有抗性的植物的新穎且有效方法。令人吃驚的是，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，具有有缺陷的PSK和/或PSK受體(PSKR)基因的突變植物對植物病害有抗性，而過表達PSK或PSKR基因的植物對植物病害更易感。本發(fā)明人還證實，這種具有有缺陷的PSK或PSKR基因功·能的植物獲得了對不同類型的病原體例如卵菌、線蟲和細菌病原體的提高的抗性，顯示出這一發(fā)現(xiàn)的廣泛應用。因此，本發(fā)明的一個目的涉及包含有缺陷的PSK功能的植物。正如將要討論的，所述植物表現(xiàn)出對植物病原體的抗性提高或增加。優(yōu)選情況下，所述植物是雙子葉植物，優(yōu)選選自爺科(Solanaceae)植物(例如番爺)、百合科(Liliaceae)植物(例如蘆笑)、傘形科(Apiaceae)植物(例如胡蘿卜)、藜科(Chenopodiaceae)植物(例如甜菜)、葡萄科(Vitaceae)植物(例如葡萄)、豆科(Fabaceae)植物(例如大豆)、葫蘆科(Cucurbitaceae)植物(例如黃瓜)或十字花科(Brassicacea)植物(例如油菜籽、擬南芥(Arabidopsisthaliana)),或者是單子葉植物,優(yōu)選選自禾本科(Poaceae)谷類植物(例如小麥、水稻、大麥、燕麥、黑麥、高粱或玉米)。更具體來說，本發(fā)明涉及具有有缺陷的PSK肽和/或PSK受體并表現(xiàn)出對植物病原體的抗性提高的植物，其中所述PSK受體優(yōu)選為PSKRl受體。本發(fā)明的另一個特定目的涉及包含有缺陷的PSK基因并表現(xiàn)出對植物病原體的抗性提高的植物。本發(fā)明的另一個特定目的涉及包含有缺陷的PSKR基因并表現(xiàn)出對植物病原體的抗性提高的植物。本發(fā)明的另一個目的涉及本發(fā)明的植物的種子，或從所述種子長成的或通過其他方式衍生的的植物或植物的后代。
本發(fā)明的另一個目的涉及用于生產(chǎn)對植物病原體具有提高的抗性的植物的方法，其中所述方法包括以下步驟:(a)失活植物細胞中的PSK和/或PSKR基因；(b)任選地，選擇具有有缺陷的PSK和/或PSKR基因的步驟(a)的植物細胞；(c)從步驟(a)或(b)的細胞再生成植物；以及(d)任選地，選擇對病原體具有提高的抗性的(C)的植物，所述植物具有有缺陷的PSK或PSKR基因。正如將在本申請中進一步公開的，可以通過各種技術例如一個或多個核苷酸的缺失、插入和/或取代、位點特異性誘變、甲磺酸乙酯(EMS)誘變、定向誘導基因組局部突變(TILLING)、EcoTILLING、敲除技術或通過由RNA干擾誘導的基因沉默，來使PSK功能變成有缺陷的。也可以通過例如使用特異性抗體或可溶性受體改變PSK肽或受體的活性，來使PSK功能變成有缺陷的。本發(fā)明還涉及用于使植物具有對植物病原體的抗性或提高植物對植物病原體的抗性的方法，所述方法包括通過例如抑制所述植物中PSK基因和/或PSKR基因的表達來永久或暫時地抑制所述植物或其先祖中的PSK功能的步驟。本發(fā)明還涉及用于保護植物抵抗病原體的方法，所述方法包括通過例如抑制所述植物中PSK基因和/或PSKR基因的表達來永久或暫時地抑制所述植物或其先祖中的PSK功能的步驟。本發(fā)明還涉及用于減少植物中的病原體增殖的方法，所述方法包括通過例如抑制所述植物中PSK基因和/或PSKR基因的表達來永久或暫時地抑制所述植物或其先祖中的PSK功能的步驟。 本發(fā)明的另一個目的涉及抑制PSK和/或PSKR基因的表達(例如轉錄或翻譯)的抑制性核酸例如RNA1、反義核酸或核酶。本發(fā)明的另一個目的涉及這樣的核酸的以下用途:用于提高植物或植物細胞對植物病原體的抗性，和/或用于減少植物或植物細胞中的植物病原體增殖，和/或用于保護植物或植物細胞抵抗植物病原體。本發(fā)明還涉及調(diào)節(jié)PSKR基因表達的分子的鑒定方法，所述方法包括:(a)提供包含核酸構建物的細胞，所述核酸構建物包含與報告基因可操作連接的PSKR基因啟動子序列；(b)將所述細胞與候選分子相接觸；(C)通過監(jiān)測所述細胞中由報告基因編碼的標志物蛋白的表達來測定PSKR啟動子的活性；(d)選擇調(diào)節(jié)所述標志物蛋白的表達的分子。優(yōu)選情況下，選擇的分子抑制PSKR的表達或活性，所述PSKR優(yōu)選為PSKRl。本發(fā)明還涉及按照上述方法選擇的分子的以下用途:用于提高植物對植物病原體的抗性，和/或用于減少植物或植物細胞中的植物病原體增殖，和/或用于保護植物或植物細胞抵抗植物病原體。本發(fā)明還涉及與PSK肽或PSK受體特異性結合的抗體，或這樣的抗體的具有基本上相同的抗原特異性的片段或衍生物，以及所述抗體或其片段或衍生物的以下用途:用于在植物中提高或產(chǎn)生病原體抗性，和/或用于減少植物或植物細胞中的植物病原體增殖，和/或用于保護植物或植物細胞抵抗植物病原體。本發(fā)明適用于生產(chǎn)對病原體具有提高的抗性的豆科植物、蔬菜和谷類植物，并且特別適合于生產(chǎn)有抗性的番茄、馬鈴薯、蘆筍、胡蘿卜、甜菜、油菜籽、葡萄、小麥、水稻、大麥、燕麥、黑麥、高粱或玉米。


圖1:PSK2基因的組成性表達。PSK2基因的表達(轉基因擬南芥(Arabidopsis)株系PSK2pro:GFP:⑶S)受到發(fā)育性調(diào)控。(Α-E):根系中PSK2的表達。(A，B)揭示出PSK2啟動子激活的GUS活性(A)和GFP (B)可以在根尖(側根冠)中被檢測到，但是不能在伸長區(qū)中被檢測到。(C，D)在充分分化的根中，PSK2表達集中在維管柱中。(E)側根原基中PSK2的表達；(F-1):芽中PSK2的表達集中在葉和子葉的維管系統(tǒng)(F)、毛狀體(G)和氣孔(H，I)中。在2周齡幼苗上執(zhí)行所有分析。圖2:線蟲和卵菌感染后擬南芥(Arabidopsis thaliana)中PSK基因的表達模式。(2A)通過微陣列雜交來分析PSK基因的表達情況。在分別用南方根結線蟲(M.1ncognita)和H.arabidopsidis感染后的不同時間點，從分離的菌癭和感染的子葉制備樣品。所顯示的是兩個生物學平行樣的感染和未感染組織之間的比率的以2為底的對數(shù)(Log2)的平均值。nc，不改變。(2B)在線蟲接種后(DAI)7天(白色條)、14天(灰色條)和21天(黑色條)時通過定量RT-PCR測定的擬南芥菌癭中與未感染的根相比的PSK轉錄本的相對本積累量。示出的是代表性實驗，其給出了來自于3個技術平行樣的平均值(±SD)。(2C)在轉基因擬南芥株系PSK2pro:GFP:⑶S的被南方根結線蟲感染的根的菌癭中PSK2的表達模式。A，B.在發(fā)育中的菌癭的中心，揭示出GUS活性的降低。C.在連續(xù)共聚焦光學體內(nèi)切面的投影中，在線蟲飼養(yǎng)細胞中沒有檢測到GFP信號。*，巨細胞；n，線蟲。圖3 =PSKRl基因的發(fā)育調(diào)控的表達。(A)在轉基因擬南芥株系PSKRlpro = GFPAUS中，揭示出PSKRl啟動子激活的GUS活性可以在分化的根組織和根冠中被檢測到，但是不能在分裂和伸長區(qū)中被檢測到。(B)在根細胞中通過GFP熒光監(jiān)測到的組成性PSKRl轉錄。(C) PSKRl的轉錄發(fā)生在根和過渡區(qū)中，但不發(fā)生在下胚軸中。(D-E)子葉表皮中的GFP熒光集中于氣孔。使用2周齡幼苗執(zhí)行所有分析。圖4:卵菌感染后擬南芥中PSKRl基因的表達模式。(4A)在用水或霜霉病病原體Hyaloperonospora arabidopsidis (Hpa)的40，000個抱子/ml的分生抱子懸液對擬南芥(生態(tài)型Ws-O )子葉進行噴霧處理后的不同時間點，通過qRT-PCR分析PSKRl轉錄本的豐度。示出了來自于3個技術平行樣的平均值(土SD)，所述值是通過qBasel.3.5軟件計算得到的，并對來自于2個參比基因(At5g62050和At5gl0790)的值進行了歸一化。使用來自于兩個生物學平行樣的樣品進行的實驗給出了相似的趨勢。Dp1:接種后天數(shù)。(4B)通過轉基因擬南芥株系PSKRlpro: GFP: GUS中GUS報告基因的活性所監(jiān)測到的對Hpa感染作出響應的PSKRl轉錄激活。在接種之前，通過O時間點時子葉中的⑶S活性可觀察到PSKRl的組成性表達。在接種后，表達繼續(xù)增加并集中于葉肉的被感染區(qū)域。圖5:線蟲感染后擬南芥中PSKRl基因的表達模式。(5A)在接種后(DAI) 7天(白色條)、14天(灰色 條)和21天(黑色條)時通過qRT-PCR進行的PSKRl轉錄本分析。進行了兩個生物學平行實驗。條表示來自于兩個獨立實驗的平均值(±SD)。(5B)在用150個表面除菌的新鮮孵化的南方根結線蟲J2幼蟲接種后7天(A)和21天(B)時，轉基因擬南芥株系PSKRlpro:GFP AUS的菌癭中在PSKRl啟動子控制下的GFP報告基因的表達模式，所述表達模式是由根中的南方根結線蟲誘導的。圖6:psk3敲除突變體對卵菌感染的易感性降低。(6A)關于PSK3 (基因座At3g44735)的基因組組織、引物附著位點以及T-DNA在來自于株系psk3-l(SAIL_378_F03)的基因組DNA中的插入和方向的示意圖。條表示外顯子，線對應于內(nèi)含子(在外顯子之間)和非翻譯序列(在5’末端和3’末端處)。T-DNA的插入集中在第三外顯子內(nèi)。在突變株系中沒有檢測到揭示出PSK3轉錄本的擴增子，因此證實了分子敲除表型。組成性表達的EFl α基因(Atlg07930)轉錄本的擴增表明，相似量的完整cDNA被用于RT-PCR實驗。(6B) PSK3敲除突變體與H.arabidopsidis的相互作用表型的定量分析。與野生型植物(Col-O)相t:匕，在擬南芥psk3-l突變體的子葉上H.arabidopsidis分離株Noco2的孢子形成減少大于50%。在接種后7天，將小植株收集在Iml水中，渦旋振蕩，并使用血細胞計數(shù)器測定釋放出的分生孢子的滴度。對于統(tǒng)計學分析來說，為每個株系和分析制備了 10個小植株的20個樣品。條表示平均值(±SD)。將實驗重復3次,結果相近。通過Student’ s t_檢驗來確定值與野生型相比的統(tǒng)計學顯著性差異(***P<0.0001)。圖7:PSK2或PSK4基因的過表達提高了對H.arabidopsidis、南方根結線蟲(M.1ncognita)和青枯雷爾氏菌(R.solanacearum)的易感性。(7A)過量生產(chǎn)PSK2 (擬南芥株系p35S:PSK2)和PSK4(擬南芥株系p35S:PSK2)的轉基因株系與H.arabidopsidis的相互作用表型的定量分析。條表示平均值(±SD)。將實驗重復3次,結果相近。通過Student’st-檢驗來確定值與野生型相比的統(tǒng)計學顯著性差異(***P〈0.0001)。(7B)在組成性過表達PSK的轉基因株系中根結線蟲感染被顯著刺激。在萌芽后14天，用150個表面除菌的新鮮孵化的南方根結線蟲J2對擬南芥植物進行體外感染。通過Student’ s t檢驗來確定統(tǒng)計學顯著性差異(*P〈0.01,**P<0.001,***P<0.0001)。(7C)在組成性過表達PSK的轉基因株系中細菌繁殖被強烈增加。將4周齡植物用含有IO7個細菌/ml的致病性細菌分離株RD15的溶液進行根部接種。為了分析細菌的內(nèi)部生長，將三個接種后植物的地上部分稱重，并在添加無菌水(每克濕重2.0ml)后在 研缽中研磨。然后使用無菌水進行研磨材料的各種不同稀釋，并將3x40 μ I細菌懸液點樣在含有固體SMSA培養(yǎng)基的皮氏培養(yǎng)皿上(Elphinstone等，1996)，在30°C下生長。對于每個時間點，對每個擬南芥株系進行三份平行測定。條表示平均值(土SD)。圖8:pskrl敲除突變體對H.arabidopsidis感染的易感性降低。(8A)AtPSKRl(基因座At2g02220 )的基因組組織、引物附著位點以及T-DNA在基因組DNA中的插入和方向的示意圖。(8B) RT-PCR揭示出野生型擬南芥(Col-N8846、Ws、Col-O和Col_8CS60000)中的PSKRl轉錄本。組成性表達的AtEFla基因(Atlg07930)轉錄本的擴增表明，相似量的完整cDNA被用于RT-PCR實驗。(8C) pskrl等位基因突變體顯示出H.arabidopsidis孢子形成減少。對于統(tǒng)計學分析來說，為每個株系和分析制備了 10個小植株的20個樣品。條表示平均值(±SD),***指示通過Student’s t_檢驗確定的野生型與突變體株系之間的顯著性差異，其中P〈0.0001。所有實驗被重復3次并給出相近結果。1-1、1-2、1-3和1-4分別表不突變體 pskrl-1、pskrl-2、pskrl-3 和 pskrl-4。圖9:pskrl敲除突變體對南方根結線蟲感染的易感性降低。正如在接種后10天(IODpi)所分析的，在pskrl突變體和野生型植物中，線蟲以相似程度感染根并引發(fā)菌癭形成。在21Dpi時，在pskrl突變體中觀察到成熟菌癭的量減少。在卵塊的單性繁殖生產(chǎn)期間，在不存在PSKRl的情況下線蟲發(fā)育的抑制變得最為明顯，所述單性繁殖生產(chǎn)在pskrl突變體上在75Dpi時被強烈減少。數(shù)據(jù)表示來自于至少兩個實驗的平均值(土SD)，在每個實驗中對每種株系的最少50個幼苗進行了線蟲感染評估。***表示通過Student’s t_檢驗確定的統(tǒng)計學顯著性差異，其中P〈0.0001。圖10:pskrl敲除突變體對青枯雷爾氏菌(R.solanacearum)感染的易感性降低。將具有Ws (A)和Col (B)遺傳背景的植物分別用致病性細菌分離株RD15和GMI1000進行根部接種。從Jiffy盆的底部切出約2cm，并將植物暴露出的根在含有IO7個細菌/ml的懸液中浸泡3min。然后將植物轉移至生長室，日/夜周期分別為27°C、120-140y E m-ls-28小時和26°C 16小時，保持相對濕度為75%。在接種后3、4、5、6和7天，按照病害指數(shù)(DI)對接種后植物上的病害癥狀進行評分，所述病害指數(shù)覆蓋DIO (無枯萎)和分別表示25%、50%、75%和100%葉片枯萎的DI1、DI2、DI3和DI4。顯示了具有相似結果的數(shù)次平行實驗中的代表性實驗，給出了來自于至少28株植物/株系的接種的平均值(土SD)。在接種后3至5天之間的細菌指數(shù)生長期中，所有pskrl突變體具有顯著降低的易感性，其中P〈0.0001。擬南芥的Col遺傳背景(B)顯示出對青枯雷爾氏菌總體較高的易感性，并且pskrl突變的效應在Ws遺傳背景(A)中在pskrl-2中最為顯著。通過將功能完整的PSKRl基因導入pskrl-2遺傳背景中(互補擬南芥株系Cppskrl-2,與圖11的圖例說明進行比較),對青枯雷爾氏菌的全部易感性得以恢復。在組成性35S啟動子控制下過表達PSKRl的株系(過表達株系PSKR1-0E，與圖11的圖例說明進行比較)中，觀察到病害在感染的晚期時間點加速。圖11:通過表達有功能的PSKR基因逆轉了 pskr突變體的降低的易感性。PSKR基因的過表達提高了對H.arabidopsidis的易感性。霜霉病易感性與PSKRl的表達相關(A)在用H.arabidopsidis感染后在pskrl-2突變體和轉基因株系中獲得的分生孢子/mg Fff的水平。在Cppskrl-2株系中，通過用包含At2g02220的1，771bb的翻譯起始密碼子5’區(qū)、3027bp的整個編碼 序列和650bp的3’非翻譯區(qū)的5，472bp的基因組片段進行互補，pskrl-2 (Ws-O背景)的突變體表型被完全逆轉。通過PCR擴增該基因組片段，將其克隆到Gateway目的載體pHGW (Karimi等,2002)中，并通過土壤桿菌介導的轉化轉入pskrl-2中。PSKRl在Ws-O野生型中的過表達(株系PSKR1-0E)使霜霉病易感性增加幾乎100%。為了基因的過表達，從基因組DNA擴增包括起始和終止密碼子的3，060bp的編碼區(qū)，將其克隆到Gateway目的載體pH2GW7 (Karimi等,2002)中，并通過土壤桿菌介導的轉化轉入擬南芥中。如上所述進行病原體測定。條表示平均值(±SD), ***表示通過Student’ s t_檢驗確定的野生型與突變體株系之間的顯著性差異，其中P〈0.0001。所有實驗被重復3次并給出相似結果。(B)在用H.arabidopsidis感染后獲得的在不同突變體和轉基因株系中的PSKRl表達水平。通過定量實時RT-PCR測定擬南芥幼苗(播種后15天)中PSKRl轉錄本的相對積累量。使用2_(ΔΔα)方法來計算表達比率，將UBP22 (At5gl0790)用于歸一化，并以野生型PSKRl表達作為參比物。條(土 SD)表示三個技術平行樣的平均值。圖12:pskrl突變體的降低的病害易感性不是組成性激活或病原體觸發(fā)的防御響應的結果。擬南芥中水楊酸(SA)、茉莉酸(JA)和乙烯(JA/乙烯)介導的防御信號轉導途徑的激活不依賴于PSKR1。SA、JA和JA/乙烯介導的信號轉導途徑的標志物基因分別是 PRla (At2gl4610)、PDFl.2 (At5g44420)和 PR4 (At3g04720)。在野生型(Ws)、突變體(pskrl-2)和轉基因PSKRl過表達株(PSKRl-OE)植物中，在用水或H.arabidopsidis分離株Emwal的分生孢子懸液(40，000個孢子/ml)對子葉進行噴霧處理后，通過定量實時RT-PCR分析了這些防御相關基因的表達。在O時間點以及處理開始后24、48、72和120小時，制備用于RNA提取和qRT-PCR的樣品。使用Q-Base軟件，用AtOXAl (At5g62050)和AtUBP22(At5gl0790)對標志物基因轉錄本的相對量進行歸一化。顯示的是來自于3個技術平行樣的平均值(±SD)。兩個獨立的實驗給出相似結果。圖13:PSKR1 的抑制引起青枯雷爾氏菌(R.soIanacearum)>H.arabidopsidis和南方根結線蟲(M.1ncognita)的增殖降低。(A，B)在pskrl-2突變體中，在不存在PSKRl的情況下細菌繁殖被強烈地減少。對于每個擬南芥株系，在每個時間點執(zhí)行三份平行測定。條表示平均值(土SDXA和B是相同實驗結果的圖示，其中細菌滴度分別作為絕對值和對數(shù)值給出。細菌繁殖在pskrl-2突變體中急劇減少( 1，000倍)，在互補株系Cppskrl-2中恢復，并在過表達株系PSKRl-OE中增加( 2倍)。(C)在pskrl-2突變體中，在不存在PSKRl的情況下葉組織中的卵菌菌絲發(fā)育減少。將植物用40，000個孢子/ml進行噴霧接種，并在接種后5天收集子葉。被感染子葉中菌絲的發(fā)育通過臺盼藍染色來觀察。在Ws野生型植物中觀察到充分發(fā)育的分枝菌絲網(wǎng)絡。這種網(wǎng)絡和菌絲分枝在不存在PSKRl的情況(株系pskrl-2)下被強烈地減少，但是在PSKRl過表達(株系PSKR1-0E)后變得異常。顯示的是代表性透射光學顯微照片。(D)在不存在PSKRl的情況下南方根結線蟲卵塊生產(chǎn)的減少是巨細胞尺寸減小的結果。為了進行形態(tài)學分析，在接種后第7、14和21天，將pskrl-2、PSKRl-OE和野生型植物(生態(tài)型Ws)的被線蟲感染的根在含2%戊二醛的50mMPipes緩沖液(pH6.9)中固定,然后脫水并按照制造商所述包埋在Technovit7100 (Heraeus Kulzer,Wehrheim,Germany)中。將包 埋的組織切片(3 μ m),在0.05%甲苯胺藍中染色，固定在Depex(Sigma)中，并使用亮視野光學部件執(zhí)行顯微術。使用數(shù)字相機(Axiocam ;Zeiss)收集圖像。與對照相比，在接種后7天來自于pskrl-2和PSKRl-OE的菌癭的組織切片在菌癭和巨細胞形成方面未顯示出差異。在菌癭發(fā)育的較晚階段(接種后14和21天)，來自于pskrl-2突變體植物的巨細胞顯著更小。為了進行巨細胞表面測量，使用AxioVision 乂4.8.1.0軟件檢查用甲苯胺藍染色的連續(xù)切片。選擇來自于每種表型至少50個菌癭中每個菌癭的3個最大的巨細胞進行測量。在接種后14天，來自于pskrl-2突變體植物的菌癭與對照植物相比含有顯著更小的巨細胞。圖14:TILLING策略后鑒定到的在S1PSKR1中的番茄突變的圖示。在TILLING方法中被靶向的S1PSKR1基因組區(qū)域由箭頭靶I和靶2標出。使用TILLING方法鑒定到的6個突變?nèi)缦?pskrl.1A88T, pskrl.2T119C, pskrl.3G502A, pskrl.4G856A, pskrl.5G2285A和pskrl.6G1978A。圖中還將蛋白結構域表示為底部的箭頭，標出了信號肽(SP)、富含亮氨酸的重復序列結構域(LRR)、跨膜結構域(TM)和激酶結構域。用大寫字母標出用于TILLING的引物附著位點。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)具有有缺陷的PSK和/或PSK受體功能并對病原體具有抗性的植物的新穎且有效的方法?，F(xiàn)在，本發(fā)明人令人吃驚地發(fā)現(xiàn)PSK起到植物對植物病原體的抗性的負調(diào)控物的作用，也就是說，它們的抑制通過降低易感性而提高抗性。就我們所知，這是植物中抗性受生長因子負調(diào)控的第一個實例。因此，PSK信號轉導途徑代表了用于生產(chǎn)對病原體具有提高的抗性的目標植物的新的且高度有價值的靶點。本發(fā)明人進一步證實，具有有缺陷的PSK和/或PSK受體功能的植物對不同類型的病原體例如卵菌、線蟲和細菌病原體具有降低的易感性，顯示出本發(fā)明的廣泛應用。通過參考下面的定義，將最好地理解本公開:定義當在本文中使用時，術語“PSK肽”是指起到植物抗性的負調(diào)控物作用的硫酸酯化的植物磺肽素肽。這樣的PSK肽優(yōu)選包含氨基酸序列H-Tyr (S03H) -1le-Tyr (S03H) -Thr-OH(SEQ ID NO:1)或氨基酸序列 H-Tyr (S03H)-1le-Tyr (S03H)-Thr-Gln-OH (SEQ ID NO:2),或其任何自然變體(例如在其他植物中存在或來自于多態(tài)現(xiàn)象的變體)。優(yōu)選情況下，PSK肽含有至少4個氨基酸。更優(yōu)選情況下，PSK肽含有至少5個氨基酸。典型情況下，PSK肽含有至少兩個硫酸酯化的氨基酸殘基，所述氨基酸殘基優(yōu)選為酪氨酸殘基。術語PSK肽還指稱所述肽的任何前體或未成熟形式，例如包含SEQ ID NO:3、4、5、6或7的氨基酸序列的PSK前體蛋白。PSK前體的具體實例包括包含選自SEQ ID NO:8_13的序列的三角葉楊(Populustrichocarpa)PSK 前體，包含選自 SEQ ID NO: 14_19、95、97、99、101、103 的序列的水稻(Oryza sativa)PSK前體,包含選自 SEQ ID NO:20_24 的序列的釀酒葡萄(Vitis vinifera)PSK前體，以及包含選自SEQ ID NO:69、71、73或75的序列的番茄(Solanum Iycopersicum)前體。在本發(fā)明的文本中，術語“PSK基因”是指編碼PSK肽(或其前體)的任何核酸。根據(jù)具體情況，術語“PSK基因”包括PSK DNA (例如基因組DNA)和PSK RNA (例如mRNA)。具體來說，“PSK基因”包括編碼如上所定義的植物磺肽素肽或這樣的肽的自然變體的任何核酸。PSK 基因的實例 包括擬南芥(Arabidopsis thaliana)、番爺(Solanum Iycopersicum(Lycopersicon esculentum))、7jC 稻(Oryza sativa)、玉米(Zea mays)、高梁(Sorghumbicolor)、小麥(Triticum aestivum)、蘆笑(Asparagus officinalis)、甘藍型油菜(Brassica napus)、舌甘菜(Beta vulgaris)、馬鈴薯(Solanum tuberosum)、大豆(Glycinemax)、釀酒葡萄(Vitis vinifera)和胡蘿卜(Daucus carota)的 PSK 基因組 DNA 或 RNA。PSK基因的具體實例包含SEQ ID NO:25-29、86-90的核酸序列(擬南芥)，SEQ ID NO:68、70、72或74的核酸序列(番茄)，SEQ ID NO:94、96、98、100、102、104、105的核酸序列(水稻)。PSK基因或肽的其他實例如下所列:7k稻(Oryza sativa)GenBank:BAF11381.2，0s03g0232400NCBI 參考序列:ΝΡ_001050886.1，Swiss-Prot:Q9FRF9.1Q9FRF9, PSK3GenBank:AAG46077.1GenBank:BAF12800.1GenBank:EEC75912.1，假設的蛋白 0sl_12987GENE ID:43337080s03g0675600GenBank:ABF98161.1，推測的植物磺肽素3前體GenBank:EAZ28113.1，假設的蛋白 0sJ_12080
玉米(Zea mays)GenBank:ACG49207.1，PSK4GenBank:DAA00297.1, PSKNCBI 參考序列:NP_001105796.1，PSKlGenBank:ACG23972.1, PSKGenBank:ACG41544.1,植物磺肽素前體蛋白GenBank:ACG27399.1，植物磺肽素前體蛋白高梁(Sorghum bicolor) GENE ID:8085257S0RBIDRAFT_01g042120GENE ID:8084300S0RBIDRAFT_02g001950GenBank:EES08686.lS0RBIDRAFT_05g021760小壽(Triticum aestivum)GenBank:DAA00296.1，推測的植物磺肽素肽前體GenBank:ABG66637.1，植物磺肽素-α 2 前體GenBank:ABG66638.1，植物磺肽素-α 2 前體野牛.蘆算(蘆算(Asparagus officinalis))Swiss-Prot:Q9FS10, PSK GenBank:BAB20706.1，前植物磺肽素原油菜籽(甘藍型油菜(Brassica napus))GenBank:DAA00277.1，推測的植物磺肽素肽前體舌甘菜(Beta vulgaris)Swiss-Prot:CAK22422.1，植物磺肽素-α 肽前體番前(Solanum Iycopersicum)GenBank:DAA00287.1，PSK4馬鈴蓄(Solanum tuberosum)GenBank:DAA00294.1，PSKGenBank:DAA00293.1, PSK大豆(Glycine max)GenBank:ACU23402.1，植物磺肽素肽前體GenBank:DAA00280.1，推測的植物磺肽素肽前體GenBank:DAA00283.1，推測的植物磺肽素肽前體GenBank:DAA00282.1，推測的植物磺肽素肽前體GenBank:DAA00279.1，推測的植物磺肽素肽前體葡萄(酉良酒葡萄(Vitis vinifera))GenBank:CBI38497.3, PSKGenBank:CAN65538.1 和 CBI25131.3，PSKGenBank:CBI 19372.1, PSKGenBank:CBI30250.3，未命名的蛋白質產(chǎn)物GenBank:CBI 17083.3
GenBank:CAN62427.1，假設的蛋白質香蕉(Musa acuminata)GenBank:ABF70025.1，植物磺肽素家族蛋白百臼菊(Zinnia violacea)Swiss-Prot:Q8H0B9，前植物磺肽素原木棉(Gossypium arboreum)GenBank:DAA00278.1，推測的植物磺肽素肽前體白楊(三角葉楊(Populus trichocarpa))NCBI 參考序列:ΧΡ_002320667.1，PSKGenBank:EEE98982.1，PSKNCBI 參考序列:ΧΡ_002320021.1，PSKNCBI 參考序列:ΧΡ_002301142.1，PSKGenBank:EEE87877.1松樹(火炬松(Pinus taeda))GenBank:DAA00 289.1, PSK花旗松(Pseudotsuga menziesii)GenBank:ACH59688.1GenBank:ACH59689.1GenBank:ACH59690.1GenBank:ACH59691.1GenBank:ACH59692.1GenBank:ACH59693.1GenBank:ACH59694.1GenBank:ACH59695.1GenBank:ACH59696.1GenBank:ACH59697.1GenBank:ACH59698.1GenBank:ACH59699.1GenBank:ACH59701.1GenBank:ACH59702.1GenBank:ACH59703.1GenBank:ACH59704.1GenBank:ACH59705.1GenBank:ACH59706.1GenBank:ACH59707.1GenBank:ACH59708.1GenBank:ACH59709.1當在本文中使用時，術語“PSKR”或“PSK受體”是指PSK肽的受體。典型情況下，PSKR具有與如上定義的PSK肽結合的細胞外結構域和具有激酶活性的細胞內(nèi)信號轉導結構域。已經(jīng)從包括擬南芥、番茄、胡蘿卜、水稻和釀酒葡萄在內(nèi)的多個物種分離并克隆了PSKR0 PSKR的示例性序列被提供為SEQ ID NO:30、31 (擬南芥)，SEQ ID NO:32 (胡蘿卜)，SEQ ID NO:33 (釀酒葡萄)，SEQ ID NO:111,113 (三角葉楊)，SEQ ID NO:34、107、109 (水稻)和SEQ ID NO: 35、114 (番茄)。本發(fā)明的優(yōu)選PSKR是PSKRl受體。“PSKR基因”是指編碼PSKR受體的任何核酸。具體來說，視情況而定，“PSKR基因”可以是編碼植物磺肽素肽的受體的任何DNA或RNA。PSKR基因的具體實例包括包含SEQ IDNO:36或37的序列的核酸，所述序列編碼擬南芥的PSKRl或PSKR2的氨基酸序列。在另一個實施方案中，“PSKR基因”編碼PSKRl或PSKR2蛋白的任何天然變體或同源物。PSKR基因的實例包括番茄、胡蘿卜、釀酒葡萄的PSKR基因或RNA。示例性序列被提供為SEQ ID NO:38、39、40、67、91、92、93、108、109、110 或 112。在本發(fā)明的文本中，術語“病原體”總的來說是指植物的所有病原體。更具體來說，病原體是真菌、卵菌、線蟲或細菌病原體。在特定實施方案中，真菌病原體是谷類植物的真菌病原體。這樣的病原體的實例包括但不限于稻痕病菌屬(Magnaporthe)、柄銹菌屬(Puccinia)、曲霉屬(Aspergillus)、黑粉菌屬(UstiIago)、殼針孢屬(Septoria)、白粉菌屬(Erisyphe)、絲核菌屬(Rhizoctonia)和鏈抱霉屬(Fusarium)菌種。在更優(yōu)選實施方案中，病原體是活體營養(yǎng)或半活體營養(yǎng)的選自疫霉屬(Phytophthora)、霜霉屬(Peronospora)、Hyaloperonospora 屬和單軸霉屬(Plasmopara)的卵菌病原體。最優(yōu)選的卵菌病原體是Hyaloperonospora arabidopsidis、寄生疫霉(Phytophthora parasitica)、致病 疫霉(Phytophthora infestans)、辣椒疫霉(Phytophthora capsici)和葡萄單軸霉(Plasmopara viticola)。在另一個優(yōu)選實施方案中，病原體是線蟲病原體。最優(yōu)選的線蟲病原體是根結線蟲屬物種(Meloidogyne spp.)(南方根結線蟲(M.1ncognita)、爪睡根結線蟲(M.javanica)、花生根結線蟲(M.arenaria)、北方根結線蟲(M.hapla)、擬禾本科根結線蟲(M.graminicola))、球胞囊線蟲屬物種(Globodera spp.)和異皮線蟲屬物種(Heteroderaspp.)o在另一個優(yōu)選實施方案中，病原體是細菌病原體。最優(yōu)選的細菌病原體是青枯雷爾氏菌(Ralstonia solanacearum)?，F(xiàn)在將進一步更詳細地描述本發(fā)明的不同實施方案。除非另有指明，否則如此定義的每個實施方案可以與任何其他實施方案組合。具體來說，被指明為優(yōu)選或有利的任何特征可以與被指明為優(yōu)選或有利的任何其他特征組合。PSK或PSKR缺陷的棺物如前所述，本發(fā)明是基于PSK和PSKR基因是植物對植物病原體的抗性的負調(diào)控物這一發(fā)現(xiàn)。本發(fā)明人證實，PSK或PSKR基因的失活提高了植物對植物病原體的抗性。因此，本發(fā)明涉及基于PSK途徑的調(diào)控來提高植物中的病原體抗性的方法。本發(fā)明還涉及通過降低或抑制所述植物中的PSK功能以保護植物抵抗病原體的方法。本發(fā)明還涉及具有有缺陷的PSK功能的植物或植物細胞。本發(fā)明還涉及適用于生產(chǎn)這樣的植物和細胞的構建物(例如核酸、載體、細胞等)，以及用于生產(chǎn)植物抗性調(diào)控物的方法。根據(jù)第一實施方案，本發(fā)明涉及包含有缺陷的PSK功能的植物或植物細胞。術語“PSK功能”表示在植物細胞中由PSK肽或受體介導的任何活性。PSK功能可以通過PSK基因表達或PSK肽活性以及PSKR基因表達或PSKR受體活性來實現(xiàn)。在本發(fā)明的文本中，與PSK功能相關的術語“有缺陷的”、“失活的”或“失活”是指細胞或植物中存在的活性PSK肽或活性PSKR受體的水平降低。與野生型植物相比，這樣的降低典型為約20%，更優(yōu)選30%。降低可以是更加顯著(例如，超過50%、60%、70%、80%或更高)或完全的(即敲除植物)。PSK或其受體的失活可以通過在本技術領域中本身已知的技術來執(zhí)行，例如但不限于通過遺傳學方法、酶學技術、化學方法或其組合。失活可以在DNA、mRNA或蛋白質水平上進行，并且抑制PSK或PSKR的表達(例如轉錄或翻譯)或活性。優(yōu)選的失活方法影響表達，并引起在細胞內(nèi)不產(chǎn)生有功能的PSK肽和/或PSKR受體。應該指出，PSK或PSKR的抑制可以是暫時或永久的。在第一實施方案中，通過在一個或多個PSK或PSKR基因中缺失、突變、插入和/或取代一個或多個核苷酸來獲得有缺陷的PSK或PSKR。在優(yōu)選實施方案中，目標植物中的所有PSK基因被失活。這可以通過在本技術領域中本身已知的技術來執(zhí)行，所述技術例如為位點特異性誘變、甲磺酸乙酯(EMS)誘變、定向誘導基因組局部突變(TILLING)、EcoTILLING、同源重組、接合等。本發(fā)明的TILLING方法旨在從誘變?nèi)后w中鑒定PSK或PSKR基因中的SNP(單核苷酸多態(tài)性)和/或插入和/或缺失。它能夠提供一系列等位的沉默、錯義、無義和剪接位點突變，以研究基因中各種突變的效應。EcoTILLING是TILLING的一種變體，其研究群體中的自然遺傳變異。另一種特定方法是通過插入外來序列，例如通過使用被稱為轉座子的移動遺傳元件的轉座子誘變來進行基因 失活，所述轉座子可以是自然或人造來源的。在最優(yōu)選實施方案中，有缺陷的PSK或PSKR是通過敲除技術來獲得的，例如使基因的全部或一部分缺失，被缺失部分的尺寸足以防止從所述基因表達有功能的蛋白。被缺失部分優(yōu)選包含基因的至少50個連續(xù)的核苷酸。在特定實施方案中，用插入的外來核酸代替基因組中被缺失的基因或部分。根據(jù)另一個優(yōu)選實施方案，通過使用RNA干擾、核酶或反義技術進行基因沉默來獲得有缺陷的PSK或PSKR。在特定實施方案中，用于基因沉默的抑制性核酸分子包含與數(shù)個PSK或PSKR基因或RNA共有的序列互補的序列。優(yōu)選情況下，這樣的抑制性核酸分子包含與同一物種的所有PSK基因或RNA或PSKR基因或RNA中存在的序列互補的序列，所述物種例如擬南芥、番爺、水稻、玉米、高粱、小麥、蘆契^甘藍型油菜、甜菜、馬鈴薯、大豆、釀酒葡萄和/或胡蘿卜。也可以通過突變或沉默參與PSK或PSKR生物合成途徑的基因，例如PSK酪氨酸殘基的硫酸酯化所需的磺基轉移酶(SOT)的編碼基因，來減少植物中PSK或PSKR的合成?？蛇x地，也可以通過表達(過表達)PSK或PSKR的負調(diào)控物例如轉錄因子或第二信使，來操縱PSK或PSKR的合成和/或活性。在另一個實施方案中，可以在植物中表達(過表達)參與PSK或PSKR合成的基因的突變的等位基因。也可以例如通過向植物施加(例如噴灑)外源試劑例如抑制PSK或PSKR活性的分子，來暫時地執(zhí)行PSK或PSKR的失活。
優(yōu)選的失活是由破壞PSK或PSKR基因的完整性、例如通過缺失基因序列的片段(例如至少50個連續(xù)的bp)和/或插入外來序列而產(chǎn)生的永久性失活。正如在實施例中所示的，具有有缺陷的PSK或PSKR基因的psk或pskr敲除植物仍然是活的，不顯示異常發(fā)育表型，并且表現(xiàn)出對植物病原體的抗性提高。在特定實施方案中，通過敲除技術使一個以上的PSK或PSKR基因變成有缺陷的。在另一個實施方案中，在PSK肽的水平上獲得有缺陷的PSK功能。例如，可以通過將植物暴露于針對PSK肽的抗體(例如抗磺基酪氨酸單克隆抗體)或通過在植物細胞中表達所述抗體，來失活PSK肽。還可以通過將植物暴露于含有細胞外結合結構域但不含細胞內(nèi)信號轉導結構域的PSKR或通過過表達所述PSKR，來失活PSK肽。

可選地，通過改變PSKR受體的活性來獲得有缺陷的PSK功能。更具體來說，可以通過PSKR受體的拮抗劑來失活PSKR受體。在特定實施方案中，這樣的拮抗劑結合于PSKR受體的Glu503-Lys517殘基。因此，可以在PSK 基因組 DNA、PSK mRNA、PSK 肽、PSKR 基因組 DNA、PSKR mRNA 或PSKR受體活性的水平上控制PSK在植物抗性中的功能。在一種變體中，本發(fā)明涉及對植物病原體具有提高的抗性的植物，其中所述植物包含失活的PSK基因，更具體來說是失活的PSK基因組DNA。有缺陷的PSK基因優(yōu)選選自PSKl、PSK2、PSK3、PSK4和PSK5。在另一個優(yōu)選實施方案中，植物中存在的所有PSK基因都是有缺陷的，例如全部PSK1-5基因。在另一種變體中，本發(fā)明涉及對植物病原體具有提高的抗性的植物，其中所述植物包含失活的PSK肽。在另一種變體中，本發(fā)明涉及對植物病原體具有提高的抗性的植物，其中所述提高的抗性是由PSKR基因組DNA的失活造成的。有缺陷的PSKR基因可以是擬南芥PSKRl基因的直向同源基因。在另一種變體中，本發(fā)明涉及對植物病原體具有提高的抗性的植物，其中所述提高的抗性是由PSK或PSKR mRNA的失活造成的。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及已通過PSK功能的失活被工程化改造成對植物病原體(更)有抗性的轉基因植物或植物細胞。在特定實施方案中，改良植物是喪失功能的psk或pskr突變體植物，對植物病原體具有提高的抗性。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的植物的種子，以及從所述種子長成的或通過其他方式衍生的植物或植物的后代，所述植物對病原體具有提高的抗性。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的植物的植物性材料,例如根、葉、花、愈合組織等。本發(fā)明還涉及用于生產(chǎn)對病原體具有提高的抗性的植物的方法，其中所述方法包括以下步驟:(a)失活植物細胞中的PSK和/或PSKR基因；(b)任選地，選擇具有有缺陷的PSK和/或PSKR基因的步驟(a)的植物細胞；(c)從步驟(a)或(b)的細胞再生成植物；以及(d)任選地，選擇對病原體具有提高的抗性的植物，所述對病原體具有提高的抗性的植物具有有缺陷的PSK或PSKR基因。
PSK和/或PSKR基因的失活可以如上所公開的來進行。PSK或PSKR基因中的遺傳改變，也可以按照例如由Toki等(2006)所描述的方案，使用Ti質粒和土壤桿菌感染方法通過轉化來進行。在優(yōu)選方法中，失活是由使用例如敲除技術進行的PSK或PSKR基因破壞所造成的。具有有缺陷的PSK和/或PSKR基因的植物細胞的選擇，可以通過技術人員本身已知的技術(例如PCR、雜交、使用可選擇標志物基因、蛋白定量、western印跡等)來進行。可以使用技術人員本身已知的方法獲得來自于改良細胞的植物世代。具體來說，可以從愈合組織培養(yǎng)物或其他未分化的細胞生物質誘導芽和根的形成?？梢詫⒂纱双@得的小植株移栽出來并用于栽培。例如Fennell等(1992)Plant Cell Rep.11:567-570, Stoeger等(1995)Plant Cell Rep.14:273-278描述了從細胞再生成植物的方法。得到的植物可以按照本技術領域中已知的技術進行育種和雜交。優(yōu)選情況下，應該生長兩代或更多代以便確?；蛐突虮硇褪欠€(wěn)定并且可遺傳的。對病原體具有提高的抗性的植物的選擇，可以通過向植物施加病原體、測定抗性并與野生型植物進行比較來進行。在本發(fā)明的文本中，術語對病原體的“提高的抗性”是指抗性優(yōu)于尚未應用本發(fā)明的方法的對照植物例如野生型植物的抗性?！疤岣叩目剐浴边€表示由病原體引起的病害癥狀的表現(xiàn)減少、減弱或被阻止。病害癥狀優(yōu)選包括直接或間接對植物品質，產(chǎn)量，植物在飼料、播種、生長、收獲等中的用途造成不利影響的癥狀。這樣的癥狀包括例如植物或其部分(例如不同組織、葉、花、果實、種子、根、芽)的感染和病變、被感染組織表面上出現(xiàn)色點和孢子床、組織的浸解、真菌毒素的積累、組織壞死、組織的產(chǎn)孢病變、色斑等。優(yōu)選情況下，根據(jù)本發(fā)明，與對照植物相比，病害癥狀減少至少5%或10%或15%，更優(yōu)選至少20%或30%或40%，特別優(yōu)選50%或60%，最優(yōu)選70%或80%或90%或更高。術語植物對病原體的“提高的抗性”還表示植物對植物病原體感染的易感性降低或缺少這樣的易感性。本發(fā)明人第一次證實了 PSK或PSKR基因的表達與對感染的易感性之間的關聯(lián)性。正如在實驗部分中所示的，用卵菌病原體感染植物觸發(fā)了 PSK和PSKRl基因的轉錄激活。此外，本發(fā)明人顯示，PSK基因和PSKRl的過表達促進病害，而PSK3和PSKRl的敲除提高抗性。因此，本發(fā)明人提出，PSK信號轉導提高了植物對感染的易感性并有利于病害的發(fā)展。因此，在優(yōu)選實施方案中，PSK或PSKR缺陷的植物對植物病原體的抗性是由這些植物失去對病原體的易感性造成的。本發(fā)明的優(yōu)選植物或細胞對于PSK或PSKR基因失活來說應該是純合的，即兩個PSK或PSKR等位基因均無活性。在最優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的方法被用于產(chǎn)生具有有缺陷的PSK或PSKR基因并對卵菌、線蟲和/或細菌病原體具有提高的抗性的雙子葉植物或單子葉植物。這樣的植物的實例以及它們抵抗病原體的能力被公開在實驗部分中。本發(fā)明的具體目的涉及茄科(Solanaceae)植物，優(yōu)選為番茄植物，其中所述植物的細胞缺少全部或一部分PSK或PSKRl基因并且PSK功能是有缺陷的。這樣的植物對病原體例如真菌、卵菌、線蟲或細菌病原體表現(xiàn)出 提高的抗性。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及番茄植物，其中所述植物的細胞缺少全部或一部分PSKRl基因。優(yōu)選的植物至少缺少如圖13所公開的靶I或靶2中的基因的一部分(即超過50個連續(xù)核苷酸)。更優(yōu)選情況下，被缺失部分涵蓋至少一個下述核苷酸:A88，T119，G502, G856，G2285和G1978。本發(fā)明的另一個具體目的涉及茄科植物，優(yōu)選為番茄植物，其中所述植物的細胞具有突變的PSKRl基因并且PSK功能是有缺陷的。這樣的植物對病原體例如真菌、卵菌、線蟲或細菌病原體表現(xiàn)出提高的抗性。在優(yōu)選實施方案中，突變存在于如圖13所公開的靶I和靶2結構域中。更優(yōu)選情況下，突變選自pskrl.1A88T、pskrl.2T119C、pskrl.3G502A、pskrl.4G856A、pskrl.5G2285A 和 pskrl.6G1978A。本發(fā)明的另一個具體目的涉及傘形科(Apiaceae)植物，優(yōu)選為胡蘿卜植物，其中所述植物的細胞缺少全部或一部分PSK或PSKRl基因并且PSK功能是有缺陷的。這樣的植物對病原體例如真菌、卵菌、線蟲或細菌病原體表現(xiàn)出提高的抗性。本發(fā)明的另一個具體目的涉及禾本科(Poaceae )植物,優(yōu)選為小麥、水稻、大麥、燕麥、黑麥、高粱或玉米植物，其中所述植物的細胞缺少全部或一部分PSK或PSKRl基因并且PSK功能是有缺陷的。這樣的植物對病原體例如真菌、卵菌、線蟲或細菌病原體表現(xiàn)出提高的抗性。棺物杭件調(diào)節(jié)物的篩詵本發(fā)明還公開了選擇或生產(chǎn)植物抗性調(diào)控物的新方法，以及在這樣的方法中使用的工具和構建物。在特定方面，本發(fā)明涉及用于篩選或鑒定調(diào)節(jié)植物抗性的分子的方法，所述方法包括測試候選化合物是否調(diào)節(jié)PSKR基因的表達或活性。所述測試可以在含有被克隆在PSKR啟動子序列控制下的報告物DNA構建物的細胞或表達PSKR或PSKR融合蛋白的細胞中進行。優(yōu)選情況下，這樣的方法包括以下步驟:
-提供包含核酸構建物的細胞，所述核酸構建物包含與報告基因可操作連接的PSKR基因啟動子序列；-將所述細胞與候選分子相接觸；-通過監(jiān)測所述細胞中由報告基因編碼的標志物蛋白的表達來測定PSKR啟動子的活性；以及-選擇調(diào)節(jié)所述標志物蛋白的表達的分子。在另一個實施方案中，本發(fā)明還涉及用于篩選或鑒定調(diào)節(jié)PSKR活性的分子的方法，所述方法包括以下步驟:-提供細胞，所述細胞包含在轉錄因子控制下的報告基因以及包含與所述轉錄因子的DNA結合結構域融合的PSKR蛋白的融合蛋白；-將所述細胞與另一個融合蛋白相接觸，所述另一個融合蛋白包含與所述轉錄因子的轉錄激活結構域融合的候選分子；-通過監(jiān)測所述細胞中由報告基因編碼的標志物蛋白的表達來測定PSKR的活性，所述標志物蛋白只有在兩種融合蛋白相互作用時才表達；-選擇誘導所述標志物蛋白的表達的分子。優(yōu)選的調(diào)節(jié)物是PSKR表達的抑制物。在另一個實施方案中，本發(fā)明還涉及抑制PSKR表達或活性的化合物用于提高植物對植物病原體的抗性的用途。典型地使用上述篩選方法來鑒定這樣的化合物。這樣的化合物的使用典型地包括通過例如噴灑或浸泡在與水的混合物中將植物暴露于這樣的化合物，由此引起PSK暫時失活以及對病原體的抗性的暫時提高。就此而言，本發(fā)明還涉及與PSK肽或受體特異性結合的抗體，或這樣的抗體的具有基本上相同的抗原特異性的片段或衍生物。這樣的抗體可以是多克隆抗體，或者更優(yōu)選是單克隆抗體?？贵w片段的實例包括Fab片段、Fab’片段、CDR結構域。衍生物的實例包括單鏈抗體、人源化抗體、重組抗體等。這樣的抗體可以通過本技術領域中本身已知的技術來生產(chǎn)，例如免疫和多克隆抗體的分離，或免疫、分離抗體產(chǎn)生細胞、選擇并將其與例如骨髓瘤細胞融合以產(chǎn)生生產(chǎn)單克隆抗體的雜交瘤。可以使用已知技術來制備片段及其衍生物。PSK肽或受體的特異性抗體是與這樣的肽或受體結合的親和性比與其他肽或受體結合的親和性高的抗體。優(yōu)選的特異性抗體基本上不與其他肽或受體結合。在另一個實施方案中，本發(fā)明還涉及與PSKR相互作用、為功能性PSKR信號轉導所需的、并可以作為附加的靶點進行失活以提高抗性的蛋白的鑒定方法。這樣的篩選方法優(yōu)選為允許鑒定細胞質與膜結合蛋白的相互作用對的Y2H系統(tǒng)，例如分離-泛素(split-ubiquitin)系統(tǒng)(Stagljar等，1998)和基于交配的分離-泛素(mating-basedsplit-ubiquitin)系統(tǒng)(Grefen等，2009)。也可以使用在酵母核中起作用的經(jīng)典GAL4Y2H系統(tǒng)(Fields和Song，1989)來鑒定與單個PKSR結構域相互作用的蛋白質。

本發(fā)明的其他方面和優(yōu)點被提供在下面的實施例中，提供所述實施例是出于示例的目的而不是為了限制。
實施例材料和方法用于植物磺肽素PSK1、PSK2、PSK3、PSK4、PSK5及其受體PSKRl的編碼基因的功能分析的突變體和轉基因擬南芥(Arabidopsis)株系的產(chǎn)生。本發(fā)明人對表I中列出的數(shù)種突變體和轉基因株系進行了分析。表1:突變體和轉基因擬南芥(Arabidopsis)株系
權利要求
1.用于保護植物抵抗病原體的方法，所述方法包括永久或暫時地抑制所述植物或其先祖中的植物磺肽素(PSK)功能的步驟。
2.用于提高植物中的病原體抗性的方法，所述方法包括永久或暫時地抑制所述植物或其先祖中的植物磺肽素(PSK)功能的步驟。
3.用于減少植物中的病原體增殖的方法，所述方法包括永久或暫時地抑制所述植物或其先祖中的植物磺肽素(PSK)功能的步驟。
4.權利要求I至3任一項的方法，其中所述植物具有有缺陷的PSK基因、有缺陷的PSK肽、有缺陷的PSK受體(PSKR)基因和/或有缺陷的PSKR受體。
5.權利要求4的方法，其中由于一個或多個核苷酸的缺失、插入和/或取代、位點特異性誘變、甲磺酸乙酯(EMS)誘變、定向誘導基因組局部突變(TILLING)、EcoTILLING、敲除技術、用核酶或反義核酸失活、或由RNA干擾誘導的基因沉默，所述PSK基因或PSKR基因是有缺陷的。
6.權利要求5的方法，其中所述PSK基因和/或PSKR基因被完全或部分缺失。
7.權利要求4至6任一項的方法，其中當所述植物細胞中存在PSK基因的數(shù)個拷貝時，使PSK基因的每個拷貝變成有缺陷的。
8.權利要求4至6任一項的植物，其中在所述植物細胞中，使PSKRl基因和PSKR2基因變成有缺陷的。
9.權利要求4的方法，其中通過將所述植物暴露于針對PSK肽的抗體或可溶性PSKR受體或者通過在所述植物中表達針對PSK肽的抗體或可溶性PSKR受體，來失活所述PSK肽。
10.前述權利要求任一項的方法，其中所述植物病原體選自真菌、卵菌、線蟲或細菌。
11.前述權利要求任一項的方法，其中所述植物是雙子葉植物，優(yōu)選自茄科(Solanaceae)植物(例如番爺)、百合科(Liliaceae)植物(例如蘆笑)、傘形科(Apiaceae)植物(例如胡蘿卜)、藜科(Chenopodiaceae)植物(例如甜菜)、葡萄科(Vitaceae)植物(例如葡萄)、豆科(Fabaceae)植物(例如大豆)、葫蘆科(Cucurbitaceae)植物(例如黃瓜)或十字花科(Brassicacea)植物(例如油菜籽、擬南芥(Arabidopsis thaliana)),或者是單子葉植物，優(yōu)選自禾本科(Poaceae )谷類植物(例如小麥、水稻、大麥、燕麥、黑麥、高粱或玉米)。
12.用于生產(chǎn)對植物病原體具有提高的抗性的植物的方法，其中所述方法包括以下步驟 (a)失活植物細胞中的PSK基因和/或PSKR基因； (b)任選地，選擇具有有缺陷的PSK基因和/或PSKR基因的步驟(a)的植物細胞； (c)從步驟(a)或(b)的細胞再生成植物；以及 Cd)任選地，選擇對病原體具有提高的抗性的(c)的植物，所述植物具有有缺陷的PSK基因或PSKR基因。
13.權利要求12的方法，其中在步驟(a)中，通過一個或多個核苷酸的缺失、插入和/或取代、位點特異性誘變、甲磺酸乙酯(EMS)誘變、定向誘導基因組局部突變(TILLING)、EcoTILLING、敲除技術或通過由RNA干擾誘導的基因沉默來失活所述PSK基因或PSKR基因。
14.權利要求12或13的方法，其中所述植物是雙子葉植物，優(yōu)選自茄科(Solanaceae)植物(例如番茄)、百合科(LiIiaceae)植物(例如蘆筍)、傘形科(Apiaceae)植物(例如胡蘿卜)、藜科(Chenopodiaceae)植物(例如甜菜)、葡萄科(Vitaceae)植物(例如葡萄)、豆科(Fabaceae)植物(例如大豆)、葫蘆科(Cucurbitaceae)植物(例如黃瓜)或十字花科(Brassicacea)植物(例如油菜籽、擬南芥(Arabidopsis thaliana)),或者是單子葉植物，優(yōu)選自禾本科(Poaceae )谷類植物(例如小麥、水稻、大麥、燕麥、黑麥、高粱或玉米)。
15.權利要求12至14任一項的方法，其中所述植物病原體選自真菌、卵菌、線蟲或細菌。
16.抑制PSK基因或PSKR基因的表達的RNAi分子的以下用途用于提高植物或植物細胞對植物病原體的抗性，和/或用于減少植物或植物細胞中的植物病原體增殖，和/或用于保護植物或植物細胞抵抗植物病原體。
17.調(diào)節(jié)PSKR基因表達的分子的鑒定方法，所述方法包括 Ca)提供包含核酸構建物的細胞，所述核酸構建物包含與報告基因可操作連接的PSKR基因啟動子序列； (b)將所述細胞與候選分子相接觸； (c)通過監(jiān)測所述細胞中由報告基因編碼的標志物蛋白的表達來測定PSKR啟動子的活性； Cd)選擇調(diào)節(jié)所述標志物蛋白的表達的分子。
18.權利要求17的方法，其中所述分子抑制PSKR的表達。
19.按照權利要求17或18選擇的分子的以下用途用于提高植物對植物病原體的抗性，和/或用于減少植物或植物細胞中的植物病原體增殖，和/或用于保護植物或植物細胞抵抗植物病原體。
20.與PSK肽或PSK受體特異性結合的抗體，或這樣的抗體的具有基本上相同的抗原特異性的片段或衍生物。
全文摘要
本發(fā)明涉及參與植物病原體抗性的負調(diào)控的植物基因及其用途。更具體來說，本發(fā)明涉及具有有缺陷的植物磺肽素(PSK)功能并表現(xiàn)出對植物病原體的抗性提高的植物。本發(fā)明還涉及用于生產(chǎn)對各種病害有抗性的改良植物的方法。此外，本發(fā)明涉及具有有缺陷的PSK受體(PSKR)功能的植物，以及篩選和鑒定調(diào)節(jié)PSKR表達或活性的分子的方法。
文檔編號C12N15/82GK103237893SQ201180046167
公開日2013年8月7日 申請日期2011年8月5日 優(yōu)先權日2010年8月6日
發(fā)明者娜塔莉亞·羅迪克, 伊夫斯·馬可, 布魯諾·法維里, 哈拉爾德·凱勒 申請人:加諾普蘭特-維勒公司