專利名稱：生產(chǎn)布尼亞病毒復(fù)制子顆粒的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及重組病毒領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生不能自主擴(kuò)散的重組布尼亞病毒顆粒的方法。由此得到的布尼亞病毒顆粒能夠用作保護(hù)哺乳動物免受布尼亞病毒引起的傳染病的疫苗，并且能夠用作外源基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)的載體。
背景技術(shù)：
布尼亞病毒科被分為五個(gè)屬,其中的四個(gè)(布尼亞病毒屬、內(nèi)羅畢病毒屬、白蛉病毒屬和漢坦病毒屬)包括能夠在人和動物中引起嚴(yán)重疾病的多種病毒種類。熟知的實(shí)例為漢灘病毒(HTNV，漢坦病毒屬)、克里米亞-剛果出血熱病毒(CCHFV、內(nèi)羅畢病毒屬)和裂谷熱病毒(RVFV，白蛉病毒屬)。在獸醫(yī)領(lǐng)域中，RVFV是最可怕的布尼亞病毒之一。反芻動物之間的RVFV的傳播是通過受感染的蚊蟲的叮咬而發(fā)生的，然而，人的感染被認(rèn)為主要是通過受污染的動物產(chǎn)品釋放的懸浮微粒而發(fā)生的。成年反芻動物中的死亡率在10至20%變動。未出生和幼年動物中的死亡率可能是更加的令人記憶深刻的接近100%。盡管人的死亡率根據(jù)歷史事實(shí)估算大約為2%，但是在最近的爆發(fā)后，報(bào)導(dǎo)出了相當(dāng)高的死亡率。雖然目前，病毒被限制在非洲大陸和阿拉伯半島，然而傳播RVFV的蚊蟲并不受限于這些地區(qū)。這就解釋了對RVFV侵入包括歐洲、亞洲和美洲的世界的其它部分的日益增加的關(guān)注。

布尼亞病毒科成員含有包括大(L)片段、中(M)片段和小(S)片段的三片段RNA基因組。所有家族成員從S基因組片段產(chǎn)生結(jié)構(gòu)性核衣殼(N)蛋白，從L基因組片段產(chǎn)生病毒聚合酶蛋白以及從M基因組片段產(chǎn)生Gl和G2結(jié)構(gòu)性糖蛋白。通過白蛉病毒和布尼亞病毒的S片段(簡稱NSs)和M片段(簡稱NSm)編碼非結(jié)構(gòu)蛋白。有趣的是，內(nèi)羅畢病毒的M片段編碼幾種結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白并且這些病毒的糖蛋白合成和加工與布尼亞病毒科的其他成員完全不同。然而，毫無疑問地，技術(shù)人員能夠?qū)⒈景l(fā)明的技術(shù)應(yīng)用于內(nèi)羅畢病毒復(fù)制子顆粒的生產(chǎn)。RVFV M片段編碼結(jié)構(gòu)性糖蛋白G2 (通常簡稱Gn)和Gl (通常簡稱為Ge)以及至少兩個(gè)非結(jié)構(gòu)性蛋白(通稱為Nsm)。M片段編碼帶有多個(gè)翻譯起始位點(diǎn)的單鏈RNA。翻譯產(chǎn)物為Gn，Ge以及至少兩個(gè)Nsm蛋白。病毒基因組片段包括在3'和5'端上充當(dāng)用于片段的復(fù)制和編碼的閱讀框的啟動子的未翻譯區(qū)(UTR)。用于RVFV的反遺傳學(xué)系統(tǒng)的最近建立為生物學(xué)提供了重要的新的見解。在從克隆的cDNA的全RVFV的第一次成功拯救后的幾年里，Habjan等人描述了將報(bào)告微型基因組包封到類病毒顆粒(VLP) (Habjan等人.2009.Virology385,400-408)。在報(bào)告微型基因組的存在下，通過NSm、Gn、Ge、N和L蛋白的瞬間表達(dá)來生產(chǎn)VLP。N和L蛋白誘導(dǎo)來自復(fù)制的微型基因組的報(bào)告蛋白的表達(dá)和隨后將結(jié)構(gòu)性糖蛋白將微型基因組包封到VLP。這些VLP顯示將報(bào)告微型基因組轉(zhuǎn)運(yùn)至接收的細(xì)胞。然而，在這些細(xì)胞中，觀察到初級轉(zhuǎn)錄，微型基因組的復(fù)制依賴于來自轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒的N和L蛋白的產(chǎn)生。僅僅感染有VLP且并不共轉(zhuǎn)染表達(dá)N和L蛋白的構(gòu)建的細(xì)胞表現(xiàn)出對病毒蛋白的限制表達(dá)。病毒基因組是不能復(fù)制的，并且在這些細(xì)胞中不存在基因組的擴(kuò)增。因此，在這些細(xì)胞中僅僅發(fā)生病毒基因組的初級轉(zhuǎn)錄。盡管RVFV、HTNV和CCHFV在人中引起高病死率的嚴(yán)重疾病，沒有疫苗能夠有效地在人類中預(yù)防這些疾病，并且沒有注冊過的抗病毒藥物用于暴露后處理。這些控制手段的發(fā)展的重度復(fù)雜的事實(shí)是:必須在高生物安全防護(hù)措施下處理這些病毒。RVFV還在牲畜中引起高病死率的嚴(yán)重疾病。在非洲大陸以外使用已經(jīng)注冊的有效的但并不安全的疫苗。因此，迫切需要開發(fā)用于布尼亞病毒顆粒的安全且有效生產(chǎn)的手段和方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開非傳播的布尼亞病毒復(fù)制子顆粒，該布尼亞病毒復(fù)制子顆粒能夠自主基因組復(fù)制。在NSm編碼區(qū)的存在和缺失的情況下，通過在結(jié)構(gòu)性糖蛋白Gl (RVFV的Gl稱為Ge)和G2(RVFV的G2稱為Gn)的反式互補(bǔ)作用均能生產(chǎn)布尼亞病毒復(fù)制子顆粒(BRP)。生產(chǎn)的BRP高達(dá)10E7 有感染力的顆粒/ml的滴度。所得到的顆粒能夠在生物安全防護(hù)設(shè)施夕卜，在體內(nèi)或體外用于研究病毒的生命周期的各個(gè)方面。此外，上述顆粒能夠用在病毒中和試驗(yàn)中，該病毒中和試驗(yàn)?zāi)軌蛟谏锇踩雷o(hù)設(shè)施外進(jìn)行，并且生產(chǎn)的抗原可被用于ELISA以及其它血清學(xué)試驗(yàn)。此外，本文所述的方法將有利于治療學(xué)和疫苗的發(fā)展，所述疫苗使失活的疫苗的安全性以及減毒活疫苗的有效性最佳組合。所述方法也可用于新型基因?qū)胂到y(tǒng)的建立。在第一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了一種用于生產(chǎn)重組非傳播BRP的方法，所述方法包括:A)將生長培養(yǎng)基提供給真核細(xì)胞；B1)將足夠的DNA依賴性RNA聚合酶，例如T7聚合酶提供給所述真核細(xì)胞；B2)將足夠的布尼亞病毒(NSm)GnGc蛋白提供給所述真核細(xì)胞；B3)將包括布尼亞病毒L基因組片段的復(fù)制DNA(cDNA)的載體提供給所述真核細(xì)胞，所述布尼亞病毒L基因組片段在5’端側(cè)翼有(flanked by)T7啟動子以及在3’端具有編碼核酶序列的cDNA ；B4)將包括布尼亞病毒S基因組片段的cDNA或布尼亞病毒S基因組片段的一部分的載體提供給所述真核細(xì)胞，所述布尼亞病毒S基因組片段至少包括N基因和3’和5’ UTR，且所述布尼亞病毒S基因組片段在5’端側(cè)翼有T7啟動子以及在3’端具有編碼核酶序列的cDNA ;以及，可選地，B5)將包括布尼亞病毒M基因組片段的cDNA的載體提供給所述真核細(xì)胞，從所述布尼亞病毒M基因組片段，GnGc編碼區(qū)已經(jīng)功能性失活，編碼在3’和5’ UTR之間的基因組片段的cDNA在5’端側(cè)翼有T7啟動子以及在3’端具有編碼核酶序列的cDNA ；C)產(chǎn)生能夠從所述生長培養(yǎng)基中分離出來的重組布尼亞病毒復(fù)制子顆粒；其中，步驟B1、B2、B3、B4、B5的順序是任意的，這些步驟中的部分或者全部可以同時(shí)進(jìn)行。布尼亞病毒L、S和M基因組片段的cDNA以基因組方式定向(in the genomicsense orientation)或以抗基因組方式定向(in the anti genomic sense orientation)存在于上述載體中。當(dāng)布尼亞病毒L、S和M基因組片段的cDNA以基因組方式定向存在于載體中時(shí)，優(yōu)選將產(chǎn)生N和L蛋白的質(zhì)粒提供給細(xì)胞。在根據(jù)本發(fā)明的產(chǎn)生重組布尼亞病毒復(fù)制子顆粒的方法中，布尼亞病毒基因組片段的cDNA在5’端側(cè)翼有用于DNA依賴性RNA聚合酶的啟動子序列。用于DNA依賴性RNA聚合酶的所述啟動子序列選自任何已知的DNA依賴性RNA聚合酶的啟動子序列，例如，但不限于，真核RNA聚合酶I的啟動子序列，例如用于鼠科動物RNA聚合酶1、SP6、T3和T7的啟動子。例如，本發(fā)明還提供了如下方法:在該方法中，將足夠的T3聚合酶提供給真核細(xì)胞，并且，布尼亞病毒基因組片段側(cè)翼有Τ3啟動子序列；或者在根據(jù)本發(fā)明的方法中，將足夠的SP6聚合酶提供給真核細(xì)胞，且其中，編碼布尼亞病毒基因組片段的cDNA側(cè)翼有SP6啟動子序列。優(yōu)選地，Τ7為DNA依賴性RNA聚合酶。盡管說明書和權(quán)利要求書提及Τ7聚合酶，應(yīng)當(dāng)理解的是本發(fā)明并不限于Τ7聚合酶，而是包括其它DNA依賴性RNA聚合酶，比如，例如，Τ3聚合酶和SP6聚合酶。用于Τ7聚合酶的優(yōu)選啟動子序列為TAATACGACTCACTATAG。布尼亞病毒基因組片段或它們的片段的復(fù)制DNA在3’端側(cè)翼有編碼核酶序列的cDNA，該核酶序列通過新生RNA的自切割介導(dǎo)RNA的3’端形成。優(yōu)選的核酶序列為丁型肝炎病毒(HDV)核酶序列。介導(dǎo)DNA依賴性RNA聚合酶的終止的終止序列可進(jìn)一步存在于編碼核酶序列的cDNA的遠(yuǎn)端。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，DNA依賴性RNA聚合酶為T7聚合酶，且終止序列為T7轉(zhuǎn)錄終止序列。用于DNA依賴性RNA聚合酶的啟動子序列，諸如T7聚合酶，以及終止序列，諸如T7轉(zhuǎn)錄終止序列是技術(shù)人員已知的。術(shù)語“重組布尼亞病毒復(fù)制子顆粒”是指包括至少布尼亞病毒L-基因組片段，和包括N-基因、3’UTR和5’UTR的布尼亞病毒S基因組片段的(至少)一部分的布尼亞病毒顆粒。這些基因組片段編碼在感染的細(xì)胞中用于這些病毒基因組片段的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制所需的蛋白，因此導(dǎo)致在感染的細(xì)胞中L和S基因組片段的復(fù)制和擴(kuò)增。被根據(jù)本發(fā)明的重組布尼亞病毒復(fù)制子顆粒感染的細(xì)胞表達(dá)高水平的至少布尼亞病毒L和N蛋白。術(shù)語“L基因組片段”是指基本上完整的L基因組片段。術(shù)語“基本上完整的”用于表明L基因組片段包括L基因組片段的復(fù)制和介導(dǎo)L基因的功能性表達(dá)的順式作用元素(cis-acting element)。術(shù)語“基本上完整”表示不參與L基因組片段的復(fù)制或L基因的功能性表達(dá)的序列可被缺失或被取代。術(shù)語“功能性表達(dá)”是指L蛋白、病毒RNA依賴性RNA聚合酶的表達(dá)，該表達(dá)能夠介導(dǎo)布尼亞病毒基因組片段或布尼亞病毒微型基因組的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。術(shù)語“微型基因組”是指包括在片段的復(fù)制中起作用的布尼亞病毒基因組片段的5’區(qū)域和3’區(qū)域，但是缺少存在于野生型基因組片段上的至少一個(gè)布尼亞病毒編碼區(qū)域的RNA分子。微型基因組可進(jìn)一步包括外源基因，例如，但不限于諸如熒光蛋白、β-葡萄糖苷酸酶以及牛乳糖酶的標(biāo)記基因。術(shù)語“L編碼區(qū)域已經(jīng)從其功能性地失活的L基因組片段”是指包括L基因組片段的3, UTR和5, UTR的L基因組片段。術(shù)語“包括N基因的S基因組片段”是指包括S基因組片段的3'端和5'端的未翻譯區(qū)以及至少包括用于N蛋白的表達(dá)的核苷酸序列(例如用于N基因的轉(zhuǎn)錄和N基因轉(zhuǎn)錄的翻譯的核苷酸序列)的S基因組片段。術(shù)語“NSs和N編碼區(qū)已經(jīng)從其功能性地失活的S基因組片段”是指包括S基因組片段的3, UTR和5, UTR和未翻譯的基因間隔區(qū)的S基因組片段。術(shù)語“GnGc編碼區(qū)已經(jīng)從其功能性地失活的M基因組片段”是指包括M基因組片段的3'端和5'端的未翻譯區(qū)的M基因組片段。優(yōu)選地，在標(biāo)準(zhǔn)真核表達(dá)載體中克隆布尼亞病毒L基因組片段、布尼亞病毒S基因組片段和布尼亞病毒M基因組片段，而這些基因組片段側(cè)翼有DNA依賴性RNA聚合酶啟動子，優(yōu)選T7啟動子,和HDV核酶序列。合適的載體包括pBluescript (Stratagene),諸如優(yōu)選pUC57 (Genscript)的pUC質(zhì)粒，以及諸如pBR322的中等復(fù)制數(shù)目和低復(fù)制數(shù)目的載體以及它們的衍生物(Mobitec,德國),pACYC184 (Chang 和 Cohen, 1978)，以及 pCCl (EpicentreBiotechnologies,Madison, WI) 0 一些布尼亞病毒基因組片段，尤其是L基因組片段在中等復(fù)制數(shù)目或低復(fù)制數(shù)目的載體(優(yōu)選PCC1)中克隆時(shí)更加穩(wěn)定。術(shù)語“功能性失活”是指在沒有功能性失活的基因的被編碼的RNA或蛋白的活性的相同條件下，被編碼的RNA或蛋白的活性小于10%，更優(yōu)選地小于5%，更優(yōu)選小于2%，更優(yōu)選小于1%的基因。術(shù)語“功能性失活”最優(yōu)選地是指不表達(dá)的基因，因?yàn)樵摶蛭幢晦D(zhuǎn)錄或未被翻譯；或者是指其被編碼的蛋白不是活性的基因，例如通過改變或缺失基因的編碼區(qū)域內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)核苷酸。術(shù)語“功能性失活基因”優(yōu)選地為已經(jīng)缺失部分或全部編碼序列的基因。向真核細(xì)胞提供足夠的T7聚合酶，足夠的布尼亞病毒(NSm)GnGc蛋白，布尼亞病毒L基因組片段，包括至少N基因的布尼亞病毒S基因組片段，以及，可選的，(NSm)GnGc編碼區(qū)域已經(jīng)功能性失活的布尼亞病毒M基因組片段的順序是任意的。這些步驟的全部或部分可一個(gè)接一個(gè)地進(jìn)行，或者也可以同時(shí)進(jìn)行。技術(shù)人員清楚的是:當(dāng)向細(xì)胞提供由布尼亞病毒L基因組片段編碼的RNA聚合酶和/或由布尼亞病毒S基因組片段編碼的N蛋白時(shí)，布尼亞病毒L基因組片段和/或布尼亞病毒S基因組片段可分別包括L基因和/或N基因的功能性缺失。出于實(shí)際的原因，優(yōu)選的是:首先，向真核細(xì)胞提供布尼亞病毒L基因組片段；包括N基因的布尼亞病毒S基因組片段；以及，可選的，布尼亞病毒M基因組片段，從該布尼亞病毒M基因組片段，(NSm)GnGc編碼區(qū)域已經(jīng)功能性失活。隨后將足夠的布尼亞病毒(NSm)GnGc蛋白提供給所得到的細(xì)胞系，以介導(dǎo)將布尼亞病毒基因組片段有效包封到BRP中，該所得到的細(xì)胞系含有布尼亞病毒L基因組片段，包括N基因的布尼亞病毒S基因組片段，以及，可選的布尼亞病毒M基因組片段，從該布尼亞病毒M基因組片段，(NSm) GnGc編碼區(qū)域已經(jīng)功能性失活。可替代地，首先，通過編碼這些蛋白的構(gòu)建體的感染或轉(zhuǎn)染；隨后，通過提供帶有布尼亞病毒L基因組片段，包括N基因的布尼亞病`毒S基因組片段，以及，可選的布尼亞病毒M基因組片段(從該布尼亞病毒M基因組片段，(NSm)GnGc編碼區(qū)域已經(jīng)功能性失活)的細(xì)胞，來將足夠的T7聚合酶以及足夠的重組的布尼亞病毒(NSm)GnGc蛋白提供給細(xì)胞系。術(shù)語“足夠的T7聚合酶”是指提供至真核細(xì)胞的T7聚合酶的量足以有效地介導(dǎo)編碼布尼亞病毒L基因組片段，和完整的S基因組片段或至少包括N基因的布尼亞病毒S基因組片段的部分(它們側(cè)翼有T7啟動子序列和編碼HDV核酶的cDNA)的cDNA分子的轉(zhuǎn)錄。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在巨細(xì)胞病毒啟動子的控制下，例如帶有包括布尼亞病毒L基因組片段，布尼亞病毒M基因組，和/或布尼亞病毒S基因組片段的一個(gè)或多個(gè)，或一個(gè)或多個(gè)布尼亞病毒基因組片段的功能性部分的載體的BSR T7/5細(xì)胞系(Buchholz等人.1999.J.Virol.73:251-259)，通過提供穩(wěn)定表達(dá)T7RNA聚合酶的真核細(xì)胞來拯救(rescue)布尼亞病毒是無效的。當(dāng)真核細(xì)胞剛被感染或用編碼T7聚合酶的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染時(shí)，得到提高的以及可再現(xiàn)的拯救效率(rescuing efficiency)。因此，在根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的方法中，通過用編碼T7聚合酶的表達(dá)載體新轉(zhuǎn)染或感染真核細(xì)胞來將足夠的Τ7聚合酶提供給真核細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方式中，表達(dá)載體為編碼Τ7聚合酶的質(zhì)粒。合適的質(zhì)粒例如為pCAGGS和pcDNA。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，上述表達(dá)載體為重組病毒或編碼T7聚合酶的病毒的載體。合適的病毒或病毒的載體為，例如，諸如慢病毒載體的復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，例如HIV基載體或EIAV基載體，或復(fù)制缺陷型MMLV基載體。通過復(fù)制缺陷型腺病毒載體和桿狀病毒載體提供其它合適的病毒或病毒載體。優(yōu)選的病毒或病毒載體為復(fù)制缺陷型痘病毒，例如，牛痘基病毒。在根據(jù)本發(fā)明的最優(yōu)選的方法中，通過用編碼T7聚合酶的禽痘病毒(FPV)基表達(dá)載體感染真核細(xì)胞來將足夠的 聚合酶提供給真核細(xì)胞。FPV可為復(fù)制活性型(replication competent)或復(fù)制缺陷型(replication defective)。在不受理論限制的情況下，利用FPV基表達(dá)載體獲得提高的并可再現(xiàn)的拯救效率的原因是:T7聚合酶的水平足夠高至能實(shí)現(xiàn)布尼亞病毒cDNA基因組片段的有效轉(zhuǎn)錄。另外的原因可能為=FPV產(chǎn)生它們自身的加帽酶。Τ7轉(zhuǎn)錄的加帽使從cDNA產(chǎn)生的布尼安病毒RNA穩(wěn)定，防止RNA降解。FPV的另一優(yōu)點(diǎn)為:其屬于禽痘病毒屬，并且能夠在禽細(xì)胞中傳播。在例如哺乳動物細(xì)胞的非禽細(xì)胞中，F(xiàn)PV復(fù)制異常終止，而沒有感染性病毒產(chǎn)生。因此，當(dāng)真核細(xì)胞為非禽真核細(xì)胞時(shí)，復(fù)制活性型FPV基表達(dá)載體或復(fù)制缺陷型FPV基表達(dá)載體優(yōu)選用于本發(fā)明的方法。當(dāng)真核細(xì)胞為禽類真核細(xì)胞時(shí)，優(yōu)選的是復(fù)制不足型FPV基表達(dá)載體用于本發(fā)明的方法。術(shù)語“提供(NSm) GnGc蛋白”表不至少提供布尼亞病毒Gn和Ge蛋白。除了 Gn和Ge蛋白外，也可提供一種或多種NSm蛋白。術(shù)語“足夠的布尼亞病毒(NSm)GnGc蛋白”是指提供至真核細(xì)胞的(NSm)GnGc蛋白的量，該量足以在重組布尼亞病毒復(fù)制顆粒中介導(dǎo)布尼亞病毒基因組片段的有效包封。通過用介導(dǎo)布尼亞病毒( NSm)GnGc蛋白的表達(dá)的載體轉(zhuǎn)染或感染細(xì)胞，能夠?qū)⒆銐虻牟寄醽啿《?NSm)GnGc蛋白提供給該細(xì)胞。如果(NSm)GnGc編碼區(qū)域已經(jīng)功能性失活的布尼亞病毒M基因組片段存在于真核細(xì)胞中，優(yōu)選的是，沒有在真核細(xì)胞中的布尼亞病毒(NSm)GnGc蛋白編碼序列和布尼亞病毒M基因組片段之間重疊的序列，以防止包封活性型(packaging-competent)布尼亞病毒的嚴(yán)生。優(yōu)選地，通過用編碼布尼亞病毒(NSm)GnGc蛋白的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞，來將足夠的布尼亞病毒(NSm)GnGc蛋白提供給該真核細(xì)胞。所述表達(dá)質(zhì)粒優(yōu)選地包括控制布尼亞病毒(NSm)GnGc蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)序列的啟動子區(qū)域。合適的啟動子序列在本領(lǐng)域是已知的，包括，但不限于，來自例如巨細(xì)胞病毒(CMV)的病毒的啟動子序列，或來自諸如β-肌動蛋白的看家基因的啟動子區(qū)域，例如雞肌動蛋白啟動子。如果這些表達(dá)載體的導(dǎo)入由于蛋白的毒性而導(dǎo)致產(chǎn)生高水平的這些蛋白的細(xì)胞死亡，那么終點(diǎn)稀釋得到表達(dá)可容許水平的這些蛋白的克隆。已經(jīng)發(fā)現(xiàn):通過隨后(再)導(dǎo)入產(chǎn)生(NSm)GnGc的表達(dá)載體，所選擇的細(xì)胞可容許用于較高的表達(dá)水平。本發(fā)明進(jìn)一步提供了表達(dá)(NSm)GnGc蛋白并且包括布尼亞病毒L基因組片段和布尼亞病毒S基因組片段或包括N基因以及3’ UTR和5’ UTR的布尼亞病毒S基因組片段的至少一部分的真核復(fù)制子細(xì)胞系。已經(jīng)發(fā)現(xiàn):低水平的(NSm)GnGc足以防止布尼亞病毒基因組片段從細(xì)胞損失。在不受理論的約束下，(NSm)GnGc蛋白的表達(dá)(盡管是低水平的)允許連續(xù)再感染細(xì)胞的BRP的產(chǎn)生。為了生產(chǎn)BRP，通過重復(fù)導(dǎo)入提供布尼亞病毒(NSm)GnGc蛋白的載體，來將足夠的布尼亞病毒(NSm)GnGc蛋白提供給真核復(fù)制子細(xì)胞系。
在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，通過用轉(zhuǎn)導(dǎo)布尼亞病毒(NSm)GnGc蛋白的病毒載體感染根據(jù)本發(fā)明的方法中的真核細(xì)胞，來將布尼亞病毒(NSm)GnGc蛋白提供給該真核細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述病毒載體為腺病毒基載體、逆轉(zhuǎn)錄酶病毒基載體或皰疫病毒基載體。轉(zhuǎn)導(dǎo)布尼亞病毒(NSm)GnGc蛋白的優(yōu)選的病毒載體為副粘病毒基載體。優(yōu)選的副粘病毒為包括禽副粘病毒的副粘病毒屬。優(yōu)選的禽副粘病毒為新城疫病毒(Newcastle diseasevirus, NDV)。優(yōu)選的NDV包括稱為NDFL的NDV毒株LaSota的重組cDNA克隆體(Peeters等人.1999.J.Virol.73 =5001-5009)，其中密碼子優(yōu)化的GnGc基因側(cè)翼有新引入的轉(zhuǎn)錄起始序列和終止序列(Kortekaas等人.2010.Vaccine28:4394-4401)。進(jìn)一步優(yōu)選的NDV為源自重組強(qiáng)毒株的轉(zhuǎn)導(dǎo)(NSm)GnGc蛋白的載體,諸如GB Texas, Italien、Milano以及Herts‘33/56。優(yōu)選地，上述載體為非復(fù)制型或非傳播型NDV。優(yōu)選的載體包括來自在編碼HN蛋白的基因中具有缺失的重組強(qiáng)NDV毒株的基因組。該病毒載體在反式互補(bǔ)HN蛋白的細(xì)胞系中產(chǎn)生。在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，通過用轉(zhuǎn)導(dǎo)布尼亞病毒(NSm)GnGc蛋白的重組病毒載體感染真核細(xì)胞，隨后選擇其中持久地存在·重組病毒載體而不引起明顯的細(xì)胞病變效應(yīng)的細(xì)胞，來將布尼亞病毒(NSm)GnGc蛋白提供給上述真核細(xì)胞。在持久感染期間，表達(dá)由病毒編碼的蛋白，例如，布尼亞病毒(NSm)GnGc蛋白。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，相比于用表達(dá)布尼亞病毒GnGc蛋白的表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，持久感染的細(xì)胞容許更高表達(dá)水平的布尼亞病毒GnGc蛋白。用于產(chǎn)生持久感染的細(xì)胞的優(yōu)選病毒載體基于皰疹病毒，例如單純性皰疹病毒、鱗狀病毒或水痘帶狀皰疹病毒；或基于逆轉(zhuǎn)錄病毒，例如HIV、EIAV或MMLV ;或者基于副粘病毒，例如包括禽副粘病毒的腮腺炎病毒。優(yōu)選的禽副粘病毒為新城疫病毒(NDV)。優(yōu)選的NDV包括稱為NDFL的NDV毒株LaSota的重組cDNA的克隆體(Peeters等人.1999.J.Virol.73:5001-5009)，其中密碼子優(yōu)化的GnGc基因存在側(cè)翼有新引入的轉(zhuǎn)錄起始序列和終止序列(Kortekaas 等人.2010.Vaccine28:4394-4401)。真核細(xì)胞可瞬間或穩(wěn)定表達(dá)布尼亞病毒(NSm)GnGc蛋白。最初發(fā)現(xiàn)，不能得到用介導(dǎo)布尼亞病毒(NSm)GnGc蛋白的高表達(dá)水平的表達(dá)質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的真核細(xì)胞。這可通過我們的觀察部分地解釋:在真核細(xì)胞中可能不能容許GnGc的構(gòu)成的高表達(dá)水平。然而，來自持久感染那些真核細(xì)胞的病毒的表達(dá)是容許的。為了能夠產(chǎn)生穩(wěn)定的細(xì)胞系,優(yōu)選地,通過用提供布尼亞病毒(NSm)GnGc蛋白的條件表達(dá)的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染或感染真核細(xì)胞，來將布尼亞病毒(NSm)GnGc蛋白提供給該真核細(xì)胞。術(shù)語“條件表達(dá)”對于技術(shù)人員是已知的，并且是指蛋白的受控表達(dá)，在第一條件下蛋白的受控表達(dá)為不表達(dá)或僅僅是以低水平表達(dá)，但是在第二條件下，表達(dá)增加。在優(yōu)選的條件表達(dá)系統(tǒng)中，布尼亞病毒(NSm)GnGc蛋白的表達(dá)依賴于存在誘導(dǎo)劑或不存在抑制劑。目前，可得到幾個(gè)可誘導(dǎo)的基因表達(dá)系統(tǒng)，它們可用于控制(NSm)GnGc蛋白的受控表達(dá)。Tet-On和Tet-Off表達(dá)系統(tǒng)(例如Tet-On and Tet-Off 先進(jìn)的誘導(dǎo)型基因表達(dá)系統(tǒng)，Clontech)可用于目的基因的可誘導(dǎo)的表達(dá)。在這些系統(tǒng)中，通過四環(huán)素(TC)或四環(huán)素的衍生物(例如強(qiáng)力霉素(dox))的存在(Tet-On)或不存在(Tet-Off)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄活化劑(tTA)的表達(dá)。tTA包括大腸桿菌Tet阻遏蛋白(TetR)以及單純皰疹病毒反式激活域VP16。在由Tet操縱子(TetO)DNA序列和啟動子序列(例如人類巨細(xì)胞病毒(hCMV)啟動子)組成的四環(huán)素反應(yīng)元件(TRE)的控制下，tTA調(diào)節(jié)目的基因的轉(zhuǎn)錄(Baron，U和Bujard, H.Methods Enzymol327，401-421 (2000))。編碼布尼亞病毒(NSm)GnGc 的基因位于四環(huán)素反應(yīng)元件的下游。在Tet-Off 系統(tǒng)中，不存在 TC 或 dox 時(shí)，tTA 結(jié)合至 TRE(Gossen，Μ.和 Bujard，
H.Proc Natl Acad Sci U S A89，5547-5551 (1992))，并且活化布尼亞病毒(NSm) GnGc 蛋白的轉(zhuǎn)錄，而在TC或dox的存在下,tTA不能結(jié)合至TRE并且表達(dá)受到抑制。相比之下,Tet-On系統(tǒng)利用僅能在dox的存在下結(jié)合到TRE的反向tTA(rtTA) (Gossen7M.等人.Science268,1766-1769(1995))。在不存在TC或dox時(shí)，抑制布尼亞病毒(NSm) GnGc蛋白的轉(zhuǎn)錄，并且在TC或dox的存在下，激活布尼亞病毒(NSm)GnGc蛋白的轉(zhuǎn)錄。在其他實(shí)施方式中，利用激素可誘導(dǎo)的基因表達(dá)系統(tǒng)來進(jìn)行條件表達(dá)，激素可誘導(dǎo)的基因表達(dá)系統(tǒng)例如為蛻皮激素可誘導(dǎo)的基因表達(dá)系統(tǒng)(例如RheoSwitch ,New England Biolabs) (Christopherson, K.S.等人.Proc Natl Acad Sci U S A89,6314-6318(1992))。蛻皮激素為昆蟲留體類激素。在表達(dá)蛻皮激素受體的細(xì)胞中，在蛻皮激素激動劑的存在下，形成由蛻皮激素受體(Ecr)和類維生素X受體(RXR)組成的異源雙體。蛻皮激素激動劑可選自蛻皮激素，例如米樂留酮A和百日青蛻皮酮的蛻皮激素類似物中的一種，以及非留體類蛻皮激素激動劑。在激動劑的存在下，Ecr和RXR相互反應(yīng)并且結(jié)合至存在于表達(dá)框上的蛻皮激素應(yīng)答元件。因此，通過將細(xì)胞暴露在蛻皮激素激動劑中來誘導(dǎo)位于蛻皮激素應(yīng)答元件的表達(dá)框下游中的蛋白的轉(zhuǎn)錄。技術(shù)人員清楚的是:通過用介導(dǎo)布尼亞病毒(NSm)GnGc蛋白的條件表達(dá)的載體轉(zhuǎn)染或感染真核細(xì)胞來表達(dá)足夠的布尼亞病毒(NSm)GnGc蛋白能得到真核細(xì)胞系。優(yōu)選地，所述載體為病毒載體，例如源自諸如新城疫病毒的副粘病毒，或更優(yōu)選能夠從染色體DNA (例如質(zhì)粒)獨(dú)立地復(fù)制的染色體外DNA分子。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選方法中，布尼亞病毒L基因組片段，S基因組片段，和/或當(dāng)存在時(shí)，M基因組片段中的一個(gè)或多個(gè)包括外源基因。優(yōu)選地，所述外源基因源自為傳染病的傳送者的有機(jī)體(organism)。優(yōu)選地，所述有機(jī)體選自腺病毒、非洲馬疫病毒、非洲豬瘟、藍(lán)舌病病毒、邊界病毒、博爾納病毒、牛病毒性腹瀉病毒、牛呼吸道合胞病毒、Cache谷熱病毒、屈曲病毒、蠅蛆癥病毒、豬瘟、克里米亞剛果出血熱病毒、內(nèi)羅畢羊瘟病毒、螺旋蠅蛆病毒(Cochliomyia hominivorax)、冠狀病毒、巨細(xì)胞病毒、登革熱病毒、東部馬腦炎病毒、埃博拉病毒、馬腦脊髓炎病毒、馬腦病病毒、口蹄疫病毒、山羊痘病毒、漢灘病毒、亨德拉病毒、肝炎A病毒、肝炎B病毒、肝炎C病毒、肝炎E病毒、單純皰疹病毒、高致病性禽流感病毒、人類免疫缺陷病毒、人類副流感病毒、流感病毒、乙型腦炎病毒、波濟(jì)氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒、拉沙病毒，Lujo病毒、馬爾堡病毒、Marsilia病毒、麻疫病毒、猴痘病毒、腿腺炎病毒、尼帕病毒、病毒組病毒、腫瘍病毒、小反芻動物瘟疫病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、多瘤病毒、狂犬病病毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒、牛瘟病毒、輪狀病毒、風(fēng)疹病毒、白蛉熱那不勒斯病毒、白蛉熱西西里病毒、SARS冠狀病 毒、綿羊痘病毒、猴免疫缺陷病毒、天花圣路易斯病毒、托斯卡納病毒、水痘-帶狀皰疹病毒、西尼羅河病毒、西方馬腦炎病毒、黃熱病病毒、炭疽芽孢桿菌、百日咳桿菌、布氏桿菌、空腸彎曲菌、沙眼衣原體、肉毒桿菌、貝氏柯克斯體、土拉弗朗西斯菌、B組鏈球菌、嗜肺軍團(tuán)菌、鉤端螺旋體、麻風(fēng)分枝桿菌、結(jié)核分枝桿菌、結(jié)核分枝桿菌、腦膜炎奈瑟菌、沙門氏菌、志賀菌、克氏錐蟲、霍亂、鼠疫桿菌、絲狀支原體、瘧原蟲瘧疾、卵形瘧原蟲、瘧原蟲屬、間日瘧原蟲、豬帶絳蟲、絳蟲屬以及布氏錐蟲。所述有機(jī)體也可為與(NSm)GnGc蛋白源自的布尼亞病毒相同或不同的布尼亞病毒。優(yōu)選地，所述外源基因源自流感病毒，且優(yōu)選地包括紅細(xì)胞凝聚素蛋白/或神經(jīng)氨酸酶蛋白。根據(jù)本發(fā)明的另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，外源基因存在于M、L或S微型基因組上。術(shù)語“微型基因組”是指至少包括在基因組片段的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄中起作用的布尼亞病毒M、L和/或S基因組片段的5’區(qū)域和3’區(qū)域的RNA分子。布尼亞病毒M、L和/或S基因組片段的5’區(qū)域和3’區(qū)域包括在各個(gè)片段的編碼區(qū)側(cè)翼的部分互補(bǔ)的未翻譯區(qū)(UTR)。這些UTR的末端的8個(gè)核苷酸保留在這三個(gè)片段之間，同時(shí)這些區(qū)域的殘余序列是一致的(unique)。UTR弓I導(dǎo)病毒RNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，并且介導(dǎo)病毒RNA衣殼化至核蛋白復(fù)合物。除布尼亞病毒L基因組片段和至少包括N基因的S基因組片段外，還優(yōu)選存在微型基因組。此外，可選地存在有GnGc編碼區(qū)域已經(jīng)從其功能性地失活的M基因組片段。優(yōu)選地，當(dāng)存在時(shí)，外源基因位于介導(dǎo)RNA和/或外源基因的蛋白產(chǎn)物的表達(dá)的表達(dá)框中。進(jìn)一步優(yōu)選的是，所述表達(dá)框介導(dǎo)RNA和/或外源基因的蛋白產(chǎn)物的細(xì)胞特異性表達(dá)或組織特異性表達(dá)。本發(fā)明的方法中的真核細(xì)胞優(yōu)選為利用技術(shù)人已知的標(biāo)準(zhǔn)方法能夠容易地感染和/或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，例如，諸如酵母細(xì)胞和雞胚成纖維細(xì)胞。優(yōu)選地，所述真核細(xì)胞為昆蟲細(xì)胞或哺乳動物細(xì)胞。合適的昆蟲細(xì)胞包括，例如卵巢草地貪夜蛾細(xì)胞(例如Sf9和Sf21)，果蠅S2細(xì)胞以及白紋伊蚊C6/36細(xì)胞。合適的哺乳動物細(xì)胞包括，例如幼倉鼠腎細(xì)胞(例如BHK-21)，人胚胎腎細(xì)胞(例如HEK293、VERO細(xì)胞、MDCK細(xì)胞、CHO細(xì)胞、HuH_7、HeLa,Sff13 以及 PER.C6 細(xì)胞)(Fallaux, F.J.等人.1998.Hum Gene Ther9:1909-1917)。優(yōu)選的細(xì)胞為BHK-21。根據(jù)本發(fā)明的 方法可被用于從布尼亞病毒產(chǎn)生重組布尼亞病毒復(fù)制子顆粒，所述布尼亞病毒為或?qū)榧夹g(shù)人員已知。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的方法用于產(chǎn)生重組克里米亞剛果出血熱病毒復(fù)制子顆粒，重組奈洛比綿羊病病毒復(fù)制子顆粒，重組多布拉伐-貝爾格來德病毒復(fù)制子顆粒，或更優(yōu)選地，重組裂谷熱病毒復(fù)制子顆粒。本發(fā)明進(jìn)一步提供一種重組布尼亞病毒復(fù)制子顆粒，包括布尼亞病毒L基因組片段，布尼亞病毒S基因組片段，或至少包括N基因的布尼亞病毒S基因組片段的一部分，以及可選地，GnGc編碼區(qū)已經(jīng)功能性失活的布尼亞病毒M基因組片段。利用本發(fā)明的方法能夠產(chǎn)生所述重組布尼亞病毒復(fù)制子顆粒。優(yōu)選地，所述布尼亞病毒復(fù)制子顆粒選自漢坦病毒屬，內(nèi)羅畢病毒屬，布尼亞病毒屬以及白蛉病毒屬，它們包括能夠在動物和人類中引起嚴(yán)重疾病的許多病毒種類。熟知的例子為:漢灘病毒(HTNV)和多布拉伐-貝爾格來德病毒(DOBV)(均屬于漢坦病毒屬)；克里米亞-剛果出血熱病毒(CCHFV)以及杜貝病毒(均屬于內(nèi)羅畢病毒屬)；布尼安維拉病毒(布尼亞病毒)，奧羅波克病毒(正布尼亞病毒)，裂谷熱病毒(RVFV，白蛉病毒屬)以及白蛉病毒屬的其它成員:托斯卡納病毒、白蛉熱那不勒斯病毒、蓬塔托羅病毒，吳孔尼米病毒、Massilia病毒以及嚴(yán)重發(fā)熱伴血小板減少綜合癥病毒。進(jìn)一步優(yōu)選的布尼亞病毒包括，但不限于，德拉加濟(jì)汗病毒組、休斯病毒組、內(nèi)羅畢羊病病毒組、蓋勒尤卜病毒組、薩哈林病毒組以及Thiafora病毒組的病毒。優(yōu)選的是，根據(jù)本發(fā)明的重組布尼亞病毒復(fù)制子顆粒的布尼亞病毒L基因組片段，S基因組片段和/或當(dāng)存在時(shí)，M基因組片段中的一個(gè)或多個(gè)包括外源基因。優(yōu)選地，所述外源基因源自為傳染病的傳送者的有機(jī)體。可替代地，根據(jù)本發(fā)明的重組布尼亞病毒復(fù)制子顆粒包括存在于M、L或S微型基因組上的外源基因。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的重組布尼亞病毒復(fù)制子顆粒源自選自克里米亞-剛果出血熱病毒、內(nèi)羅畢綿羊病病毒、多布拉伐_貝爾格來德病毒以及裂谷熱病毒的布尼亞病毒。最優(yōu)選的布尼亞病毒為裂谷熱病毒。此外，本發(fā)明提供一種用于生產(chǎn)重組布尼亞病毒復(fù)制子顆粒的方法，所述方法包括:A)將生長培養(yǎng)基提供給真核細(xì)胞；B)將足夠的布尼亞病毒(NSm) GnGc提供給所述真核細(xì)胞；以及C)用本發(fā)明的重組布尼亞病毒復(fù)制子顆粒感染所述真核細(xì)胞，從而生產(chǎn)布尼亞病毒復(fù)制子顆粒。優(yōu)選地，所述真核細(xì)胞為被轉(zhuǎn)導(dǎo)布尼亞病毒(NSm)GnGc蛋白的病毒載體持久感染的細(xì)胞，或者為穩(wěn)定的細(xì)胞，在所述穩(wěn)定細(xì)胞中，表達(dá)布尼亞病毒(NSm)GnGc蛋白的表達(dá)構(gòu)建體并入基因組。所述表達(dá)構(gòu)建體優(yōu)選地包括用于布尼亞病毒(NSm)GnGc蛋白的條件表達(dá)的工具。根據(jù)本發(fā)明的重組布尼亞病毒復(fù)制子顆粒是安全的且可在生物安全防護(hù)裝置外部使用。例如，所述 重組布尼亞病毒復(fù)制子顆?？杀挥糜诳共《驹噭┑暮Y選和研發(fā)，例如，合適的化合物庫的篩選的高通量系統(tǒng)的研發(fā)。所述重組布尼亞病毒復(fù)制子顆粒也可用于測試或試驗(yàn)，包括病毒中和試驗(yàn)或病毒中和測試(VNT)以及ELISA(包括全病毒ELISA)，和紅細(xì)胞凝聚試驗(yàn)。例如，典型的VNT需要處理活的布尼亞病毒且因此必須在合適的生物安全防護(hù)設(shè)施內(nèi)進(jìn)行。典型的VNT的另一不足是:試驗(yàn)需要5至7天來完成。使用布尼亞病毒復(fù)制子顆粒，例如RVFV復(fù)制子顆粒(RRP)來代替活的布尼亞病毒的優(yōu)點(diǎn)是:VNT可在生物安全設(shè)施外進(jìn)行。另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是VNT僅需要24至48小時(shí)來完成。本發(fā)明進(jìn)一步提供根據(jù)本發(fā)明的重組布尼亞病毒復(fù)制子顆粒用作藥物的應(yīng)用。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的重組布尼亞病毒復(fù)制子顆粒用作用于在動物(包括人類)的布尼亞病毒感染的改善的藥物。一種包括根據(jù)本發(fā)明的重組布尼亞病毒復(fù)制子顆粒的藥用藥物另外可包括藥學(xué)上可接受的佐劑、稀釋劑或載體。根據(jù)本發(fā)明的藥物優(yōu)選地與其他治療方案相結(jié)合，其他治療方案包括但不限于結(jié)合三氮唑核苷，和/或三氮唑核苷的衍生物(例如利巴韋林(taribavirin))的聯(lián)合治療。本發(fā)明進(jìn)一步提供一種疫苗，所述疫苗包括根據(jù)本發(fā)明的重組布尼亞病毒復(fù)制子顆粒。優(yōu)選地，所述疫苗包括佐劑。佐劑物質(zhì)用于刺激免疫原性。常用的免疫佐劑的實(shí)例為鋁鹽、免疫刺激復(fù)合物(ISCOMS)，非離子嵌段聚合物或共聚物、細(xì)胞因子(如IL-l、IL-2、IL-7等)、皂莢類、單磷酰脂質(zhì)A(MPLA)、胞壁酰二肽、維生素E、聚丙烯酸酯樹脂和油乳劑。優(yōu)選地，上述佐劑為硫基脂多糖，例如Hilgers等人.Vaccinel99412 =653-660中描述的SLP/S/W佐劑。通過三萜，例如鯊烯以及它們的衍生物和修飾物來提供進(jìn)一步優(yōu)選的佐劑。根據(jù)本發(fā)明的布尼亞病毒復(fù)制子顆粒，例如RRP，是能夠自主基因組復(fù)制的非傳播型顆粒。根據(jù)本發(fā)明的布尼亞病毒復(fù)制子顆粒含有S基因組片段和L基因組片段或它們的功能性片段，但是缺少布尼亞病毒M基因組片段或包括GnGc編碼區(qū)已經(jīng)功能性失活的布尼亞病毒M基因組片段。編碼N蛋白和L蛋白的L基因組片段和S基因組片段的存在，使得所得的顆粒能夠自主地基因組復(fù)制。GnGc編碼區(qū)的缺失或失活防止病毒顆粒的組裝和傳播。復(fù)制子顆粒能夠在將GnGc反向提供至滴定度高達(dá)10E7感染的顆粒/ml的細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生。在宿主細(xì)胞中，當(dāng)與通過接種類布尼亞病毒顆?；蜃硬《镜呐６徽T發(fā)的免疫應(yīng)答相比時(shí)，布尼亞病毒基因的復(fù)制和/或N蛋白和L蛋白的表達(dá)導(dǎo)致提高的免疫應(yīng)答。例如，單劑量接種RRP保護(hù)小鼠免受RVFV毒株35/74的致死劑量。通過本領(lǐng)域已知的任何方法可將所述疫苗施藥給動物,包括人類。優(yōu)選地，所述疫苗通過無針、無創(chuàng)技術(shù)給藥，例如口服、鼻腔給藥和/或氣管內(nèi)給藥，例如通過吸入或鼻腔噴劑的應(yīng)用。更優(yōu)選地，所述疫苗腸胃外給藥，例如肌肉給藥、皮下給藥、腹腔給藥、皮內(nèi)給藥等，優(yōu)選肌肉給藥。根據(jù)本發(fā)明的疫苗根據(jù)預(yù)期的潛在暴露至布尼亞病毒的時(shí)間確定的時(shí)間表以有效劑量給藥。在這種方式下，經(jīng)處理的動物，包括人類，可具有在自然暴露之前建立免疫力的時(shí)間。典型的治療方案或給藥方案包括在潛在暴露前的至少約2至8周，單劑量單位的腸胃外給藥，優(yōu)選肌肉注射。如果需要，在潛在暴露前的約2至4周給藥第二劑量單位?？赏ㄟ^與第一劑量單位相同或不同的方法給藥第二劑量。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的疫苗的給藥用來保護(hù)動物，包括人類，免受布尼亞病毒的后續(xù)感染。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的疫苗包括使得動物，包括人類，免受裂谷熱病毒的后續(xù)感染的重組裂谷熱病毒復(fù)制子顆粒。根據(jù)本發(fā)明的疫苗的重要的優(yōu)點(diǎn)是:在經(jīng)接種疫苗的動物中，病毒不能自主地傳播。不能從預(yù)防接種的初始位點(diǎn)傳播，大大增加了該疫苗對預(yù)防接種的動物，疫苗的管理者以及環(huán)境的安全性。在接種疫苗的動物中不能引起病毒血癥也防止了任何關(guān)于該疫苗可能通過昆蟲載體傳播的顧慮(參見Moutailler等人.2010.Vector Borne Zoonotic DislO:681-688)。根據(jù)本發(fā)明的包括缺少NS基因的非傳播性布尼亞病毒復(fù)制子顆粒的疫苗(例如實(shí)施例1 以及 Kortekaas 等人.2011.J Virol.Accepted for publication 中所報(bào)導(dǎo)的那些)被認(rèn)為具有最佳的安全性，由于疫苗缺少該主要的致病因子。

相比于失活的疫苗或子疫苗，根據(jù)本發(fā)明的疫苗的另一重要優(yōu)點(diǎn)在于以下方面:現(xiàn)存的疫苗不根據(jù)佐劑來誘導(dǎo)免疫力。此外，根據(jù)本發(fā)明的疫苗可以以良好的性價(jià)比來生產(chǎn)，并且在免疫力的持久性方面是優(yōu)越的。盡管由于不能表達(dá)GnGc蛋白，病毒是非傳播性的，病毒基因組能夠在感染的細(xì)胞內(nèi)復(fù)制且可以表達(dá)N蛋白和L蛋白，這就在受體中導(dǎo)致強(qiáng)的長時(shí)間誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。重要的是需要注意，存在對MP-12 (Morrill 等人.1991.Vaccine9:35-41,Morrill等人.1997.Am J Vet Res58:1104-1109, Morrill 等人.1997.58:1110-1114, Morrill 等Λ.2011.204:229-236，Morrill 等人.2011.J Infect Dis204:617-625)、Clonel3 (Muller等人.，1995.Am J Trop Med Hyg.53:405-411，Vialat 等人.2000.J Virol74:1538-1543，Dungu 等人.2010.Vaccine28:4581-4587)以及 R566，含有 Clonel3 病毒的 S 片段和 MP-12病毒的L和M片段的重配病毒(Flick等人.2009.Antiviral Res84:101-118)的安全性的顧慮。MP-12疫苗病毒被證實(shí)在三個(gè)基因組片段的每一個(gè)上含有潛在的減毒突變(Vialat等人.1997.Virus Res52:43-50)。但是，響應(yīng)于病毒的減毒的核苷酸變化未得到反映。因此，可能的是，只有一種核苷酸改變能導(dǎo)致毒性逆轉(zhuǎn)。盡管一些研究已經(jīng)指出了 MP-12疫苗的安全性(參見Morrill等人的文章，如上標(biāo)注)，進(jìn)一步的研究表明MP-12疫苗在妊娠的頭三個(gè)月期間在給藥至懷孕母羊時(shí)是不安全的(Hunter等人.，20020nderstepoort J Vet Res69 ;95_98)。由于 R566 疫苗含有 MP-12 病毒的 L 片段和 M片段，對于該疫苗的安全性也出現(xiàn)了相同的關(guān)注。在Clonel3病毒的第一篇文章中報(bào)導(dǎo)了由于神經(jīng)系統(tǒng)疾病和麻痹，Clonel3接種疫苗的小鼠的死亡(Vialat等人.2000.J Virol74:1538-1543)。該發(fā)現(xiàn)表明Clonel3病毒的安全性也應(yīng)該在涉及大量動物的臨床試驗(yàn)中進(jìn)一步地研究。接種根據(jù)本發(fā)明的布尼亞病毒復(fù)制子顆粒的動物沒有一個(gè)患有與接種有關(guān)的并發(fā)癥。本發(fā)明進(jìn)一步提供了在動物中，包括人類中，刺激抗布尼亞病毒的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括:將根據(jù)本發(fā)明的重組布尼亞病毒復(fù)制子顆粒提供給動物。在優(yōu)選的方法中，將根據(jù)本發(fā)明的重組裂谷熱病毒復(fù)制子顆粒提供給動物，包括人類，以刺激抗裂谷熱病毒的免疫應(yīng)答。本發(fā)明進(jìn)一步提供根據(jù)本發(fā)明的重組布尼亞病毒復(fù)制子顆粒的應(yīng)用，其用于刺激抗外源基因編碼的蛋白的免疫應(yīng)答。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述外源基因優(yōu)選地編碼通過正粘病毒，優(yōu)選流感A病毒表達(dá)的抗原蛋白，或編碼通過正粘病毒表達(dá)的蛋白的免疫活性部分或衍生物。用于判定蛋白或蛋白的一部分或衍生物是否是免疫活性的方法對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員是已知的，包括預(yù)測蛋白的免疫原性的算法，例如Parker的算法以及Rammensee的算法(在Provenzano等人.2004.Bloodl04:Abstract2862中公開的),以及包括在合適的動物中注射純化的蛋白或蛋白的一部分或衍生物，并且判定蛋白，或蛋白的一部分或衍生物是否能夠刺激抗蛋白或蛋白的一部分或衍生物的抗體。術(shù)語“免疫活性部分”表示能夠在動物(包括人類)中誘導(dǎo)抗蛋白的細(xì)胞和/或體液免疫應(yīng)答的蛋白的一部分。術(shù)語“免疫活性衍生物”是指例如通過一個(gè)或多個(gè)氨基酸的增力口、缺失或改變來修飾的，并且能夠在動物(包括人類)中誘導(dǎo)抗蛋白的細(xì)胞和/或體液免疫應(yīng)答的蛋白或蛋白的一部分。優(yōu)選的是與親本蛋白相比，免疫活性衍生物具有高于70%的序列同一性，例如通過正粘病毒表達(dá)的蛋白，優(yōu)選流感A病毒。如基于上述蛋白或蛋白部分的氨基酸序列，更優(yōu)選序列同一性高于80 %，更優(yōu)選高于90 %，更優(yōu)選高于95 %，更優(yōu)選高于99%，最優(yōu)選的為100%。例如，所述免疫活性衍生物為包括用于分泌出(secretionout)信號肽的細(xì)胞的信號肽的蛋白；包括提供跨膜，例如I型、II型或III型靶向域的序列的蛋白；或其中蛋白酶裂解位點(diǎn)已經(jīng)改變以提高蛋白的半衰期的蛋白。


圖1來自RVFV S基因組片段的N蛋白的表達(dá)。BSR-T7/5細(xì)胞(A)或FP-T7感染的BHK-21細(xì)胞(B)用質(zhì)粒PUC57-S轉(zhuǎn)染，編碼以抗基因組方式定向的RVFV S基因組片段。利用N蛋白-特異性的mAb和HRP-結(jié)合的抗小鼠IgG抗體來檢測RVFV N蛋白的表達(dá)。圖2
含有三個(gè)基因組片段的裂谷熱病毒復(fù)制子顆粒(RRP)的生產(chǎn)。BHK細(xì)胞被FP-T7感染，并且隨后用編碼M-eGFP微型基因組(M-eGFP)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，或與編碼RVFV L和S基因組片段(M-eGFP/L/S)的質(zhì)粒組合，或與前述的質(zhì)粒和pCAGGS-NSmGnGc (M-eGFP/L/S+NSmGnGc)組合。通過流式細(xì)胞儀測定eGFP陽性生產(chǎn)細(xì)胞，受體細(xì)胞或之前用輔助質(zhì)粒(+HP) pCIneo-RVFV-L和pCAGGS-N轉(zhuǎn)染的受體細(xì)胞的數(shù)目。圖3含有兩個(gè)基因組片段的RRP的生產(chǎn)。BHK細(xì)胞被FP-T7感染并且隨后用編碼S-eGFP微型基因組(S-eGFP)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，或與編碼RVFV L基因組片段(S_eGFP/L)的質(zhì)粒組合，或與前述的質(zhì)粒和pCAGGS-NSmGnGc (S-eGFP/L+NSmGnGc)組合。通過流式細(xì)胞儀測定eGFP陽性生產(chǎn)細(xì)胞，受體細(xì)胞或之前用輔助質(zhì)粒(+HP) pCIneo-RVFV-L和pCAGGS-N轉(zhuǎn)染的受體細(xì)胞的數(shù)目。圖4BHK-GnGc細(xì)胞中GnGc的表達(dá)。利用針對Gn和Ge蛋白的多克隆抗體的IPMA檢測BHK-21細(xì)胞(陰性對照，A)和BHK-GnGc細(xì)胞⑶的GnGc表達(dá)，以及利用肽抗血清在Western斑點(diǎn)(C)上檢測細(xì)胞裂解液中的Ge。圖5BHK-GnGc細(xì)胞中eGFP的表達(dá)，BHK-GnGc細(xì)胞持久地被將RVFV L基因組片段和S-eGFP微型基因組保持在第18細(xì)胞傳代的NDV-GnGc感染。圖6在引入pCAGGS-GnGc 或 pCAGGS-NSmGnGc 后，通過 BHK-GnGc 細(xì)胞生產(chǎn) RRP。在轉(zhuǎn)染后的16h，用新鮮的培養(yǎng)基更換培養(yǎng)基。利用Spearman-Karber方法在BHK-21細(xì)胞上測定RRP滴度(Karbcr 1931.Arch.Exp.Path.Pharmakl62,480-483 ；Spearman 1908Br.J.Psychol2,227-242)。 圖7(A)部分序列pUC57-L:質(zhì)粒編碼抗基因組方式定向的RVFV毒株35/75L基因組片段。側(cè)翼有T7啟動子和編碼HDV核酶的cDNA的RVFV毒株35/74L基因組片段的cDNA由GenScript公司合成,并用KpnI/Hindlll在pUC57載體中進(jìn)行克隆。分別用下劃線表示出了 T7啟動子和HDV核酶序列以及T7終止序列。UTR用斜體表示，編碼L蛋白的開放閱讀框用黑體表示。(B)質(zhì)粒pUC57-M的部分序列:質(zhì)粒編碼以抗基因組方式定向的RVFV毒株35/74M基因組片段。偵彳翼有T7啟動子和編碼HDV核酶的cDNA的RVFV毒株35/74M基因組片段中編碼抗基因組方式的RNA的cDNA由GenScript公司合成，并用EcoRI/Sall在pUC57載體中進(jìn)行克隆。分別用下劃線表示T 7啟動子和HDV核酶序列以及T7終止序列。UTR以斜體表示，編碼NSmGnGc蛋白的開放閱讀框用黑體表示。(C)質(zhì)粒pUC57-S㈠的部分序列:質(zhì)粒編碼以基因組方式定向的RVFV毒株35/74S基因組片段。偵彳翼有T7啟動子和編碼HDV核酶的cDNA的RVFV毒株35/74S基因組片段的編碼基因組方式的RNA的cDNA由GenScript公司合成，并用BamHI/Xbal在pUC57載體中進(jìn)行克隆。分別用下劃線表示T7啟動子和HDV核酶序列以及T7終止序列。UTR和基因間區(qū)以斜體表示，編碼N和NSs蛋白的開放閱讀框用黑體表示。(D)質(zhì)粒pUC57_SANSs的部分序列:質(zhì)粒編碼抗基因組方式定向的RVFV毒株35/74S基因組片段，其中主要缺失在NSs中。在pUC57的XbaI和ApaI之間克隆合成的DNA。分別用下劃線表示T7啟動子和HDV核酶序列以及T7終止序列。UTR和基因間區(qū)用斜體表示，編碼N的開放閱讀框以及編碼部分NSs蛋白的開放閱讀框用黑體表示。(E)質(zhì)粒pUC57-S的部分序列:質(zhì)粒編碼抗基因組方式定向的RVFV毒株35/74M基因組片段。為了構(gòu)建編碼抗基因組方式定向的完整的S基因組片段的cDNA，從pUC57_S(_)構(gòu)建體中分離出在Nco1、EcoRV之間的序列，并且用來替代在質(zhì)粒pUC57-SANSs的NcoI和EcoRV之間的序列，從而產(chǎn)生pUC57-S。分別用下劃線表示T7啟動子和HDV核酶以及T7終止序列。UTR和基因間區(qū)以斜體表示，編碼N和NSs蛋白的開放閱讀框用黑體表示。(F)質(zhì)粒pUC57-S_eGFP的部分序列:質(zhì)粒編碼抗基因組方式定向的RVFV毒株35/74M基因組片段，其中，NSs基因替代編碼增強(qiáng)的綠色熒光蛋白(eGFP)的基因。分別用下劃線表示T7啟動子和HDV核酶以及T7終止序列。UTR和基因間區(qū)以斜體表示，編碼N和eGFP蛋白的開放閱讀框用黑體表示。在pUC57的KpnI和SalI之間克隆序列。用下劃線表示沉默的C —T突變。(G)質(zhì)粒pUC57_Mv的部分序列:質(zhì)粒編碼基因組方式定向的RVFV毒株35/74M基因組片段，其中缺失完整的NSmGnGc ORF并且引入NcoI和XbaI位點(diǎn)。分別用下劃線表示T7啟動子和HDV核酶以及T7終止序列。UTR以斜體表示，在UTR之間的序列以黑體表示。在pUC57的EcoRI和PstI之間進(jìn)行克隆。(H)質(zhì)粒pUC57-Mv-eGFP的部分序列，質(zhì)粒編碼基因組方式定向的RVFV毒株35/74M基因組片段，其中缺失了完整的NSmGnG`c ORF并且eGFP被引入在NcoI和XbaI位點(diǎn)之間。用下劃線表示T7啟動子和HDV核酶序列。(I)質(zhì)粒pUC57_GnGc的部分序列，質(zhì)粒編碼在第四甲硫氨酸密碼子處起始的RVFV毒株35/74M基因組片段的密碼子優(yōu)化型開放閱讀框。合成基因并且在EcoRI和HindIII之間克隆。該基因利用EcoRI和NotI (下劃線標(biāo)出)來構(gòu)建pCIneo-GnGc和pCAGGS-GnGc。GnGc開放閱讀框以黑體表示。(j)質(zhì)粒pCIneo-NSmGnGc和pCAGGS-NSmGnGc編碼在第一甲硫氨酸密碼子處起始的RVFV毒株35/74M基因組片段的開放閱讀框?；驈?5/74cDNA擴(kuò)增，并利用EcoRI和NotI (下劃線標(biāo)出)在pCIneo和pCAGGS中克隆。NSmGnGc開放閱讀框以黑體表示。(K)質(zhì)粒pUC57-N編碼RVFV毒株35/74的密碼子優(yōu)化型N開放閱讀框。利用EcoRI和NotI (下劃線標(biāo)出)將基因引入pCAGGS和pCIneo。N蛋白的開放閱讀框以黑體表示。(L)質(zhì)粒pCIneo-L含有RVFV毒株35/75的L基因的開放閱讀框。利用XhoI和NotI (下劃線標(biāo)出)引入基因。也用下劃線表示導(dǎo)致亮氨酸-1971被蘇氨酸替換的轉(zhuǎn)換突變(T5912C)。L蛋白的開放閱讀框以黑體表示。圖8RRP不能自主擴(kuò)散。BHK細(xì)胞以m.ο.1.為I用RRP感染。兩天后，在感染的細(xì)胞中觀測到eGFP表達(dá)(左側(cè)板)。用收集的上清液培養(yǎng)新鮮的BHK細(xì)胞，并且在三天后檢測eGFP表達(dá)(右側(cè)板)。圖9
RRP生產(chǎn)動力學(xué)。BHK-Rep細(xì)胞在用5%血清補(bǔ)充的GMEM中生長，并且保持為未處理(-GP)或用pCAGGS-NSmGnGc轉(zhuǎn)染(+GP)。利用eGFP表達(dá)作為讀出參數(shù)在不同時(shí)間點(diǎn)對BHK細(xì)胞測定RRP滴度。利用Speamian-Karto方法測定滴度。圖10RRP 蛋白的 Western 斑點(diǎn)分析。以 IOOOOOxg 超速離心被 pCAGGS-NSmGnGc (+GP)轉(zhuǎn)染的BHK-R印細(xì)胞(-GP)或BHK-R印細(xì)胞的培養(yǎng)基2小時(shí)。在4至12% NuPAGE Bis-Tris凝膠中分離以凝塊(pellet)存在的蛋白，并且隨后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素印跡膜。通過抗Gn ( a -Gn)或抗-Ge ( α -Ge)肽抗血清或?qū)蛋白(α N)特異的mAb檢測特異性蛋白。用箭頭表示NSm、Gn、Ge和N蛋白的位置。分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白以千道爾頓表示在右側(cè)。圖11哺乳動物和昆蟲的細(xì)胞的RRP感染。細(xì)胞用RRP感染，并且在感染后的42小時(shí)(BHK和HEK293T)或72小時(shí)(S2和C6/36)用流式細(xì)胞術(shù)(f low-cytometry)測定陽性細(xì)胞的數(shù)目。(A)來自RRP感染的哺乳動物的細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)的代表性結(jié)果。分別以灰色和綠色代表未感染的對照細(xì)胞和感染的細(xì)胞的計(jì)數(shù)。(B)柱狀圖用SD示出了三次獨(dú)自測量的平均結(jié)果。圖12RRP的疫苗有效性。小鼠為未接種疫苗的(η = 9，Mock)，或用106TCID50的RRP經(jīng)由肌肉途徑(頂)或皮下途徑(SC)接種一次或兩次。經(jīng)由腹膜內(nèi)途徑以已知致死劑量的RVFV毒株35/74挑戰(zhàn)(challenge)小鼠。直至挑戰(zhàn)后的21天檢測死亡率(d.p.c.)。圖13
在接種疫苗后的不同時(shí)間點(diǎn)觀察的注射位點(diǎn)反應(yīng)。O分:無明顯偏差；1:觀察到腫脹；2:最大5cm直徑的圓形腫脹；3:主要腫脹/膿腫破裂的機(jī)會。PM，死后。結(jié)果用平均值SD (η = 6)表示。圖14用RVFV挑戰(zhàn)之前和之后，接種疫苗的和未接種疫苗的(Mock)羔羊的直腸溫度。每天測量直腸體溫(°C)。發(fā)熱定義為體溫在41°C以上(虛線)。結(jié)果用平均值SD (η = 6)表不。圖15在用RVFV挑戰(zhàn)感染之后，在不同時(shí)間點(diǎn)獲得的接種疫苗的和未接種疫苗的羔羊的血漿樣品中的病毒RNA的檢測。陽性樣品的數(shù)目在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)不同。結(jié)果用平均值SD(n=6)表示。圖16用所表示的疫苗中的一種接種一次的羔羊的體重。結(jié)果用平均值SD(n = 6)表示。圖17血清樣品的生化分析。ALT、ALP、TP、肌氨酸酐以及BUN濃度用平均值(n = 6) SD表示。用虛線表示上限參考值和下限參考值。圖18用于制備生產(chǎn)SHA3和SNA4蛋白的復(fù)制子細(xì)胞系的方法的概略示意圖。G0I，目的基因(在該研究中，為eGFP，SHA3或sNA4，基因)。
圖19流式細(xì)胞術(shù)表明在第8次細(xì)胞傳代中生產(chǎn)N蛋白的復(fù)制子細(xì)胞系的百分比。N蛋白表達(dá)依賴于S基因組片段和L基因組片段的存在，其中S基因組片段含有目的外源基因(GOI)。表達(dá)L基因組片段和S-eGFP基因組片段的細(xì)胞(A);表達(dá)L片段和S-CD5-HA-GCN4-ST (即 S-sHA3)片段的細(xì)胞(B);表達(dá) L 片段和 S-CD5-0S-GCN4-NA (即S-sNA4)片段的細(xì)胞(C);在⑶(E)和(F)中示出表達(dá)GnGc的對照細(xì)胞。圖20在銀染的聚丙烯酰胺凝膠⑷以及利用用于檢測的Strep-Tacting-HRP的Western斑點(diǎn)(B)上分析純化的SHA3和sNA4。通過隨后利用從表達(dá)eGFP的復(fù)制子細(xì)胞收集的培養(yǎng)基的純化步驟來提供陰性對照樣品(eGFP)。分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白的位置以kDa顯示在左側(cè)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例實(shí)施例1材料和方法細(xì)胞和生長條件

由教授 K.Conzelmann 博士(Max von Pettenkofer-1nstitut,慕尼黑，德國)提供了 BSR-T7/5。BHK-GnGc為以下將描述的含有基因組整合的質(zhì)粒pCIneo-GnGc的BHK-21細(xì)胞。在添加4%胰蛋白示磷酸肉湯(Invitrogen), I %非必須氨基酸(Invitrogen), 10%胎牛血清(FBS ；Pam Biotech,艾登巴赫,德國)以及青霉素/鏈霉素(Invitrogen)的格拉斯哥極限必需培養(yǎng)基(GMEM ；Invitrogen,CA,USA)中分別以100U/ml和100 μ g/ml的濃度生長BSR-T7/5和BHK-GnGc細(xì)胞。為了維持穩(wěn)定的細(xì)胞系，以lmg/ml的濃度使用遺傳霉素(G-418 ；Invitrogen)。細(xì)胞在 37。。和 5% CO2 下生長。質(zhì)粒和病毒質(zhì)粒pCIneo-GnGc和pCAGGS-GnGc含有始于第四甲硫氨酸密碼子處的RVFV毒株35/74的M片段的開放閱讀框(ORF)(圖71)。質(zhì)粒pCAGGS-N含有編碼N基因的0RF(圖7K)。N編碼序列和GnGc編碼序列經(jīng)密碼子優(yōu)化，以用于哺乳動物細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞中的優(yōu)化表達(dá)，并且由 GenScript 公司(Piscataway, NJ, USA)合成。質(zhì)粒 pCAGGS-NSmGnGc 含有始于第一個(gè)甲硫氨酸密碼子的M片段的可靠的0RF(圖7J)。pCIneo-RVFV-L編碼該可靠的0RF，該可靠的ORF編碼RVFV毒株35/74的病毒聚合酶(圖7L)。該基因含有使得亮氨酸-1971取代蘇氨酸的轉(zhuǎn)換突變(T5912C)。未研究該突變的影響。通過巨細(xì)胞病毒(CMV)即刻早期增強(qiáng)子/啟動子控制來自PCIneo質(zhì)粒的RVFV基因的表達(dá)，而通過CMV即刻早期增強(qiáng)子/β-肌動蛋白(CAG)啟動子控制來自pGAGGS質(zhì)粒的基因的表達(dá)((Niwa等人.1991.Genel08: 193-199)。在農(nóng)業(yè)研究理事會-Onderstepoort獸醫(yī)研究所(ARC-0VI),從在1974年南非自由州省中在RVFV爆發(fā)期間死亡的綿羊的肝臟分離RVFV毒株35/74 (Barnardl979.J S Afr Vet Assoc50:155)。通過腦內(nèi)注射在乳鼠中將該病毒傳代四次并且對BHK-21細(xì)胞傳代三次。用SBS Genetech AMV-RT、TaKaRa Ex Taq HS以及Bird等人所述的引物通過一步法RT-PCR來進(jìn)行基因組片段的擴(kuò)增(Bird等人.2007.J Virol81:2805-2816)。在瓊脂糖凝膠上分離后用Qiagen凝膠提取試劑盒純化PCR產(chǎn)物,并且在Inqaba Biotec (比勒陀利亞，南非)于GSFLX測序之前以合適的相等的量混合?；救鐚τ赿sRNA病毒基因組所描述的(Potgieter等人.2009.J Gen Virol90:1423-1432)進(jìn)行測序和序列組裝。在GenScript公司(皮斯卡塔韋，新澤西，美國)的標(biāo)準(zhǔn)克隆載體pUC57中合成并克隆對應(yīng)于各個(gè)基因組片段的共有序列。pUC57-L(圖7A)，pUC57-M(圖7B)以及pUC57_S (圖7E)分別編碼抗基因組(即陽性)方式定向的RVFV L、M以及S基因組片段。這些轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒各自含有病毒RNA片段的完整復(fù)制體，并且側(cè)翼有T7啟動子和HDV核酶序列。在pUC57-S_eGFP (-)(圖7F)中，NSs基因被編碼增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(eGFP)的基因所替代。需要注意的是，該質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生S-eGFP微型基因組，在該微型基因組中，eGFP基因?yàn)榛蚪M(即陰性方式)定向。在質(zhì)粒？此57-1^-冗 ？(-)(圖7!1)中，M片段的完整的ORF被eGFP基因所替代。從該質(zhì)粒產(chǎn)生的M-eGFP微型基因組也為基因組方式定向。此后，產(chǎn)生RVFV結(jié)構(gòu)性糖蛋白Gn和Ge (即NDFL-GnGc)的重組新城疫病毒(NDV)如前所述(以下稱作 NDV-GnGc) (Kortekaas 等人.2010.Vaccine28:4394-4401)。此后，由動物健康研究所(IAH，康普頓，英國)提供產(chǎn)生被稱為fpEFLT7pol的T7聚合酶的重組禽痘病毒(Das等人.2000.J Virol Meth89:119-127)，以下稱作FP-T7。利用Spearman-KMrber方法對BHK-21細(xì)胞測定病毒滴度為50 %組織培養(yǎng)感染劑量(TCID50) ( Kiirber 1931.Arch.Exp.Path.Pharmakl62, 480-483 ； Spearman 1908Br.J.Psychol2,227-242)。重組RVFV毒株35/74的拯救。BSR-T7/5細(xì)胞被播種(seed)在6孔板中，并且根據(jù)制造商(Polyplus-transfection SA,伊爾基希,法國)的使用說明利用jetPEI轉(zhuǎn)染試劑用Iyg的質(zhì)粒PUC57-L、pUC57-M以及pUC57_S共轉(zhuǎn)染。在培養(yǎng)6天后，收集培養(yǎng)基。為了檢測感染性病毒，用收集的 上清液培養(yǎng)BHK-21細(xì)胞。當(dāng)觀察到明顯的細(xì)胞病變作用時(shí)，這些細(xì)胞用4%多聚甲醛/PBS固定40分鐘。隨后將這些板完全浸沒在80%乙醇4%乙酸中以使病毒失活，并用PBS清洗。進(jìn)行免疫過氧化物酶單層試驗(yàn)(IPMA)，以下將進(jìn)行描述?？商娲?，BHK-21細(xì)胞被FRP-T7感染。在六孔板的各個(gè)孔中用1.5ml的含有10E5TCID50的FP-T7的培養(yǎng)基種植(inoculate)大約10E6的細(xì)胞(0.1的感染復(fù)數(shù)[m.ο.1.])。在用FP-T7種植后I小時(shí)并且恢復(fù)另外一小時(shí)后，用如同對BSR-T7/5細(xì)胞所述的相似方法處理該細(xì)胞。RVFV BRP (RRP)的拯救在6孔板中播種BHK-21或BHK-GnGc細(xì)胞，并且在37°C下用FP-T7培養(yǎng)I小時(shí)。更換培養(yǎng)基并且允許細(xì)胞恢復(fù)I小時(shí)。為了生產(chǎn)含有3個(gè)基因組片段的RRP，用600ng的質(zhì)粒 pUC57-L、pUC57-S、pUC57_Mv_eGFP (-)以及 pCAGGS-NSmGnGc 依次轉(zhuǎn)染上述細(xì)胞。為了生產(chǎn)含有兩個(gè)基因組片段的RRP，用pUC57-L、pUC57-S-eGFP (-)以及pCAGGS-NSmGnGc轉(zhuǎn)染細(xì)胞。第二天更換培養(yǎng)基。可替代地，當(dāng)NDV用于提供Gn和Ge時(shí)，NDV-GnGc感染與FP-T7一起進(jìn)行。NDV-GnGc以0.05的m.0.1.使用。在72h后收獲上清液，室溫下以5000rpm預(yù)澄清5min,并在4°C下存儲至進(jìn)一步應(yīng)用。NuPAGE 以及 Western 印跡法如(Kortekaas等人.2010.疫苗 28:2271-2276)描述的來進(jìn)行 NuPAGE 和 Western印跡法。簡單地說，蛋白在3x Laemmli樣品緩沖液(0.5M Tris pH6.8,6% (w/w) SDS, 26%(v/v)丙三醇，15% (v/v) 2-巰基乙醇以及0.002% (w/w)溴苯酚藍(lán))中稀釋，并在裝載至4%至12% NuPAGE Bis-Tris凝膠前，在95°C下加熱5分鐘。隨后，蛋白被轉(zhuǎn)移至移至硝酸纖維素印跡膜。為了使Ge可視化，使用之前對Ge-衍生的肽提出的兔多克隆抗體(殘余的 975-VFERGSLPQTRNDKTFAASK-994) (De Boer 等人.2010.Vaccine28:2330_2339。綴合至辣根過氧化物酶(HRP)的羊抗兔IgG抗體(Dako, Heverlee, Belgium)被用作二抗。利用 Amersham ECL Western 印跡法測定試劑(GE Healthcare, Diegem, Belgium)測定過氧化物酶活性。為了測定N蛋白，單克隆抗體FlDll (由Alejandro Brun博士，CISA-1NIA，Madrid, Spain提供)被用作一抗,并且兔抗鼠IgG(DAKO)被用作二抗。免疫過氧化物酶單層試驗(yàn)(IPMA)如之前所述進(jìn)行IPMA(deBoer等人.2010.疫苗28:2330-2339)。作為一抗，可以使用之前從用NDFL-GnGc接種的綿羊獲得的多克隆抗血清(Kortekaas等人.2010.Vaccine28:4394-4401)。為了檢測RVFV N蛋白，使用之前由Alejandro fcun博士提供的(CISA INIA，西班牙)mAb FlDllo使用HRP綴合的兔抗小鼠IgG抗體(Dako, Heverlee,比利時(shí))作為二抗。流式細(xì)胞術(shù)對于流式細(xì)胞術(shù)，用3ml PBS清洗6孔板中的細(xì)胞，并且隨后用0.3ml0.5%胰蛋白酶-EDTA(Invitrogen·)受胰蛋白酶作用。在37°C下培養(yǎng)2至3分鐘并且再懸浮后，將這些細(xì)胞稀釋在Iml的培養(yǎng)基。通過離心沉淀細(xì)胞，在0.5ml PBS中再懸浮并且再次沉淀。通過在PBS中加入0.1ml的4% PFA將細(xì)胞固定15至30分鐘，并隨后在0.5ml的PBS中稀釋。每個(gè)樣品含有來自一個(gè)孔的所有細(xì)胞。將樣品儲藏在4°C直至分析。所有的測量均在收獲細(xì)胞的當(dāng)天進(jìn)行。使用裝配有488nm波長激光器的CyAn ADP流式細(xì)胞儀(Beckman,武爾登，荷蘭)進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)。用Summit v4.3軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果使用BSR-T7/5細(xì)胞從cDNA拯救重組RVFV毒株35/74。使用編碼抗基因組方式定向的三個(gè)病毒RNA片段L、M和S的三種質(zhì)粒拯救重組RVFV毒株35/74 (rec35/74)。該三種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至BSR-T7/5細(xì)胞3至4天后，導(dǎo)致細(xì)胞病變效應(yīng)。BHK-21細(xì)胞用收集的上清液種植。在病毒的兩次傳代后，獲得10E9TCID50/ml的滴度。在重組RVFV毒株35/74中未引入同義突變以確保拯救和排除非重組野生型病毒的污染，這是由于在拯救rec35/74之前，從未有野生型病毒存在于我們的實(shí)驗(yàn)室中。使用來自質(zhì)粒的NSmGnGc的即刻表達(dá)來生產(chǎn)含有報(bào)告微型基因組的VLP。由于第一步為裂谷熱病毒復(fù)制子顆粒(RRP)生產(chǎn)系統(tǒng)的建立，因此開放微型復(fù)制子系統(tǒng)。設(shè)計(jì)質(zhì)粒以在該質(zhì)粒中，編碼eGFP的基因被放置在M片段未翻譯區(qū)(UTR)之間。該質(zhì)粒被稱為pUC57-MV-eGFP(_)并且編碼基因組方式定向的M-eGFP微型基因組。和全長構(gòu)建體一樣，編碼該微型基因組的cDNA側(cè)翼有T7聚合酶啟動子和編碼HDV核酶序列的cDNA。pUC57-MV-eGFP (-)與質(zhì)粒pUC57_L和pUC57_S —起轉(zhuǎn)染僅在很少的細(xì)胞中導(dǎo)致eGFP表達(dá)(未示出數(shù)據(jù))。在改善報(bào)告微型基因組表達(dá)的嘗試中，將兩個(gè)輔助質(zhì)粒pCIneo-RVFV-L和pCAGGS-N加入至轉(zhuǎn)染混合物。這將導(dǎo)致陽性細(xì)胞的數(shù)目略有增加(未示出數(shù)據(jù))。盡管eGFP陽性細(xì)胞的數(shù)目非常低，仍然嘗試通過用pCAGGS-NSmGnGc共轉(zhuǎn)染這些細(xì)胞將基因組片段包封到VLP中。如果確實(shí)生產(chǎn)了 VLP，我們推定這些VLP可以含有一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)基因組片段。為了還能夠檢測只包含報(bào)告微型基因組的VLP，將上清液不僅加入至未處理的BHK-21細(xì)胞，也加入至之前用輔助質(zhì)粒pCIneo-RVFV-L和pCAGGS-N轉(zhuǎn)染的BHK-21細(xì)胞。用收集的上清液培養(yǎng)的極少數(shù)的BHK-21細(xì)胞在種植18至24小時(shí)后，顯示出表達(dá)eGFP，并且該表達(dá)只可在之前用輔助質(zhì)粒感染的細(xì)胞中觀察到(未示出數(shù)據(jù))。因此，盡管生產(chǎn)了VLP,顯然這些VLP中沒有一個(gè)包含所有的三個(gè)基因組片段。利用提供Gn和Ge的NDV來生產(chǎn)含有報(bào)告微型基因組的VLP。盡管之前我們能夠通過在昆蟲細(xì)胞表達(dá)GnGc來生產(chǎn)大量的VLP (de Boer等人2010.Vaccine28:2330-2339)，然而在之前的實(shí)驗(yàn)中，在哺乳動物細(xì)胞中從pol-1I啟動子生產(chǎn)GnGc是極其糟糕的，在培養(yǎng)基上清液中未產(chǎn)生可檢測到的VLP(未公開的結(jié)果)。之前我們還報(bào)道了產(chǎn)生GnGc糖蛋白的NDV重組(即NDFL-GnGc，此后簡稱為NDV-GnGc)的生產(chǎn)。有趣地是，被該重組病毒感染的BHK-21細(xì)胞確實(shí)在上清液中導(dǎo)致可檢測量的Gn和Ge的產(chǎn)生(Kortekaas等人.2010.Vaccine28:4394-4401)。在目前的工作中，我們想知道，是否NDV-GnGc能夠提供用于RVFV基因組片段的包封的Gn蛋白和Ge蛋白。細(xì)胞首先用pUC57、pUC57-L-S和pUC57-MV_eGFP(-)轉(zhuǎn)染，并且稍后用NDV-GnGc感染。在小百分比的生產(chǎn)細(xì)胞和極少數(shù)的受體細(xì)胞中觀察到eGFP的表達(dá)(未示出數(shù)據(jù))。受體細(xì)胞中的eGFP的表達(dá)再次取決于之前使用輔助質(zhì)粒pCIneo RVFV-L和pCAGGS-N的轉(zhuǎn)染。這些實(shí)驗(yàn)表明:將NDV-GnGc用作糖蛋 白源，我們能夠?qū)?bào)告基因組包封至VLP，但沒有獲得能夠自主復(fù)制的顆粒。將重組禽痘病毒用作T7聚合酶源由cDNA的RVFV的改進(jìn)拯救，以及RRP的成功生產(chǎn)。由BSR-T7/5細(xì)胞恢復(fù)病毒是不可再現(xiàn)的。作為BSR-T7/5細(xì)胞的替代物，我們決定使用表達(dá)T7聚合酶的重組禽痘病毒(即FP-T7) (Das等人.2000.J Virol Methods89:119-127)。在比較使用BSR-T7/5細(xì)胞和FP-T7感染的BHK-21細(xì)胞的RVFV拯救效率的試驗(yàn)中，使用FP-T7在5/5嘗試中導(dǎo)致RVFV拯救，而使用BSR-T7/5細(xì)胞的拯救沒有成功。我們預(yù)計(jì):通過FP-T7的較高水平的T7聚合酶的表達(dá)，能由抗基因組的(即陽性方式)基因組片段導(dǎo)致N和L蛋白的更高的生產(chǎn)水平，促進(jìn)了復(fù)制的開始。為了驗(yàn)證該假設(shè)，PUC57-S片段轉(zhuǎn)染至BSR-T7/5細(xì)胞以及之前被FP-T7感染的BHK-21細(xì)胞。通過T7聚合酶的pUC57-S質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄導(dǎo)致抗基因組方式的病毒RNA，其N基因?yàn)樵摲绞蕉ㄏ?。而在用PUC57-S轉(zhuǎn)染的BSR-T7/5細(xì)胞中不能檢測到N蛋白(圖1A)，用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的FP-T7感染的BHK-21細(xì)胞被抗N抗體強(qiáng)烈地染色(圖1B)。然后，我們在FP-T7感染的BHK-21細(xì)胞中進(jìn)行pUC57_S、pUC57_L和pUC57-MV-eGFP(-)的共轉(zhuǎn)染。鑒于在使用BSR-T7/5細(xì)胞的之前實(shí)驗(yàn)中，只觀察到少數(shù)的eGFP陽性細(xì)胞，在這些實(shí)驗(yàn)中，F(xiàn)ACS分析表明:1.3%的細(xì)胞對eGFP為陽性(圖2)。在使用pCAGGS-NSmGnGc共轉(zhuǎn)染細(xì)胞時(shí)進(jìn)行類似的實(shí)驗(yàn)。在該實(shí)驗(yàn)中，2.5%的細(xì)胞對eGFP為陽性(圖2)。有趣的是，eGFP陽性細(xì)胞的簇的觀察表明含有報(bào)告微型基因組的VLP的局部擴(kuò)散(未示出數(shù)據(jù))。三天后，收集培養(yǎng)物上清液，并且用BHK-21細(xì)胞培養(yǎng)，該BHK-21細(xì)胞未用輔助質(zhì)粒pCIneoRVFV-L和pCAGGS-N處理，或用其轉(zhuǎn)染。在用輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，1.3%的細(xì)胞對eGFP表達(dá)為陽性(圖2)。此外，0.9%的之前未用輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞對eGFP表達(dá)為陽性，這表明我們成功地生產(chǎn)了含有所有三個(gè)基因組片段的復(fù)制子顆粒(圖2)。
生產(chǎn)包含兩個(gè)基因組片段的RRP。為了促進(jìn)系統(tǒng)的進(jìn)一步優(yōu)化，我們旨在生產(chǎn)只包含兩個(gè)基因組片段的RRP。為此，生產(chǎn)報(bào)告微型基因組，其中，編碼S片段的NSs基因的基因被替換為編碼eGFP基因(即S-eGFP)。之前的研究證實(shí):NSs基因是對于在組織培養(yǎng)中的生長是非必要的(Muller等人.1995.Am J Trop Med Hyg53:405-411)，并且其他研究證實(shí):含有該缺失的病毒是可存活的(Ikegami 等人.2006.J Virol80:2933-2940)。所得質(zhì)粒 pUC57_S_eGFP (-)與 pUC57_L的共轉(zhuǎn)染導(dǎo)致在小百分比的細(xì)胞中的eGFP的表達(dá)。然而，當(dāng)將pCAGGS-NSmGnGc加入至轉(zhuǎn)染混合物中時(shí)，21.5%的細(xì)胞對eGFP為陽性，如通過FACS分析測定(圖3)。當(dāng)未提供輔助質(zhì)粒時(shí)，用收集的上清液培養(yǎng)BHK-21細(xì)胞導(dǎo)致4.7%的陽性細(xì)胞，而當(dāng)包括輔助質(zhì)粒時(shí)，細(xì)胞的數(shù)目上升至28.7% (圖3)。產(chǎn)生Gn和Ge糖蛋白的穩(wěn)定的BHK-21細(xì)胞系的生產(chǎn)。為了生產(chǎn)一個(gè)用于RRP連續(xù)生產(chǎn)的系統(tǒng)的目的，生產(chǎn)構(gòu)建性地生產(chǎn)Gn和Ge蛋白的穩(wěn)定的細(xì)胞系。簡單地說，BHK-21細(xì)胞被pCIneo-GnGc轉(zhuǎn)染，并且整合有質(zhì)粒的克隆體在遺傳霉素G-418的存在下生長。通過IPMA對一些克隆體測試Gn/Gc表達(dá)。來自自然感染的綿羊的高度陽性抗血清并未展現(xiàn)出任何Gn/Gc陽性細(xì)胞(未示出數(shù)據(jù))。然而，源自之前已接種過NDV-GnGc的綿羊的抗血清被成功地用于識別陽性克隆體。如IPMA所展現(xiàn)的，這些克隆體中的一個(gè)克隆體清楚地顯示了最高的Gn和Ge表達(dá)水平，雖然表達(dá)水平表現(xiàn)為較低(圖4)。通過來自細(xì)胞裂解液的蛋白的Western印跡法檢測該克隆體的Ge的表達(dá)。使用之前所述的對源自Ge的肽特異的多克隆抗血清，清楚地檢測到Ge表達(dá)(圖4C)。該細(xì)胞系為標(biāo)示的BHK-GnGc。為了確定是否由這些細(xì)胞產(chǎn)生VLP，超速離心上清液，并通過Western印跡法分析存在于所收集的凝塊中的蛋白。在凝塊部分中未檢測到Ge蛋白，這表明沒有VLP產(chǎn)生，或糖蛋白產(chǎn)量太低而未被檢測到。保持RVFV L和S-eGFP片段的細(xì)胞系的用途對RRP的有效生產(chǎn)是必要的。用FP-T7感染BHK-21細(xì)胞來生產(chǎn)RRP，并且隨后引入提供L片段、S-eGFP片段以及pCAGGS-NSmGnGc的質(zhì)粒導(dǎo)致最大為10E3至10E4TCID50/ml的RRP滴度(未示出數(shù)據(jù))。盡管BHK-GnGc細(xì)胞系呈現(xiàn)出不適合RRP的構(gòu)建性大規(guī)模生產(chǎn)，引人注意地發(fā)現(xiàn):FP_T7的弓I入以及隨后提供L片段、S-eGFP片段和pCAGGS-NSmGnGc的質(zhì)粒的引入，產(chǎn)生陽性細(xì)胞簇，這些陽性細(xì)胞簇在數(shù)量和尺寸上比由正常BHK-21細(xì)胞得到的那些大。保持RVFV L和S_eGFP片段的細(xì)胞系對于多種應(yīng)用可能非常有價(jià)值，上述應(yīng)用包括在生物安全防護(hù)設(shè)施外的抗病毒試劑的高通量篩選。因此，我們旨在生產(chǎn)其中的各個(gè)細(xì)胞含有RVFV L和S-eGFP片段的細(xì)胞培養(yǎng)物。為此，引入FP-T7病毒，隨后引入提供L片段和S-eGFP片段的質(zhì)粒。為了便于L片段和S-eGFP片段的傳播，在細(xì)胞傳代后，數(shù)次引入pCAGGS-NSmGnGc。利用這種方法，得到野生型BHK-21細(xì)胞以及BHK-GnGc的細(xì)胞系，其中即使不是全部細(xì)胞，也是大多數(shù)細(xì)胞表達(dá)eGFP報(bào)告基因。然而，鑒于表達(dá)eGFP的BHK-21細(xì)胞的重復(fù)傳代導(dǎo)致eGFP的損失，表達(dá)eGFP的BHK-GnGc細(xì)胞的傳代未導(dǎo)致eGFP表達(dá)的任何損失。這些細(xì)胞中的eGFP表達(dá)保持至少50個(gè)細(xì)胞傳代不變。當(dāng)未被轉(zhuǎn)染時(shí)，含有RVFV復(fù)制子的BHK-GnGc細(xì)胞被發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生非常少量的RRP，最大產(chǎn)率為10E2TCID50/ml。更重要地，在這些細(xì)胞中引入pCAGGS-NSmGnGc或pCAGGS-GnGc分別導(dǎo)致最大為10E6.8或10E6.4TCID50/ml的RRP滴度(圖5)。利用NDV-GnGc的RRP的有效生產(chǎn)。當(dāng)與來自質(zhì)粒的表達(dá)相比時(shí)，考慮由NDV生產(chǎn)GnGc的優(yōu)勢，我們測試了是否可以通過用NDV-GnGc感染細(xì)胞來生產(chǎn)RRP。BHK-GnGc細(xì)胞用FP-T7和NDV-GnGc共感染，在恢復(fù)后，用PUC57-L和pUC57-S-eGFP(-)轉(zhuǎn)染。在培養(yǎng)72小時(shí)后，在燒瓶中觀察到極其大的陽性細(xì)胞“彗星云(comets)”(未示出數(shù)據(jù))。該結(jié)果表明，當(dāng)NDV-GnGc用于提供糖蛋白時(shí)，產(chǎn)生大量的RRP。隨后，我們將培養(yǎng)物分裝在兩個(gè)燒瓶中。一個(gè)保持不做處理，另一個(gè)再次用NDV-GnGc感染。48h后收集這些細(xì)胞的上清也，并且對BHK-21細(xì)胞測定TCID50RRP滴度。被NDV-GnGc感染兩次的細(xì)胞的上清液含有10E7TCID50/ml滴度，而只感染一次的細(xì)胞的上清液含有10E4.5TCID50/ml滴度。后者的細(xì)胞系傳代18次，之后再次測定RRP滴度。令人驚訝地，其顯示出10E6TCID50/ml的滴度。此外，通過熒光顯微鏡對該細(xì)胞系的目視檢查表明，大部分的細(xì)胞(如果不是全部的細(xì)胞)表達(dá)eGFP(圖6)。該結(jié)果使得我們認(rèn)為:這些細(xì)胞被NDFL-GnGc持久感染，從而提供了連續(xù)的Gn源和Ge源。事實(shí)上，使用對NDV F蛋白特異的mAb的IPMA，展示了在細(xì)胞的亞群中存在病毒。然而，重要的是需要注意:在這些細(xì)胞的上清液中存在的病毒被證明是非傳染性的。然而，這是預(yù)料之中的，因?yàn)槿醵拘蚇DV毒株，例如當(dāng)前工作中使用的重組LaSota毒株，為了傳染性需要通過類胰蛋白酶來清除F蛋白。最后，利用細(xì)胞被NDFL-GnGc持久感染，可連續(xù)地產(chǎn)生RRP直至至多10E7 TCID50/ml的滴度。為了證實(shí)RRP不能自主傳播，在感染復(fù)數(shù)(m.0.1)為I時(shí)用RRP感染BHK細(xì)胞。兩天后，通過熒光顯微鏡觀察eGFP表達(dá)(圖8，左側(cè)板)。用收集到的預(yù)澄清過的上清液培養(yǎng)BHK細(xì)胞，并且在三天后，對細(xì)胞監(jiān)測eGFP表達(dá)。未觀察到eGFP表達(dá)，證實(shí)了通過被RRP感染的BHK細(xì)胞沒有產(chǎn)生 后代傳染性顆粒(圖8，右側(cè)板)。為了建立RRP生產(chǎn)的動力學(xué)，BHK-1^p細(xì)胞用pCAGGS—NSmGnGc轉(zhuǎn)染，并且在轉(zhuǎn)染后的不同時(shí)間點(diǎn)收集培養(yǎng)基。利用eGFP表達(dá)作為讀出參數(shù)對BHK細(xì)胞進(jìn)行RRP滴定。這個(gè)試驗(yàn)證實(shí):在22h后已得到接近106TCID50/ml的滴度(圖9)。為了使RRP蛋白可視化，通過超速離心沉淀RRP。在NuPAGE凝膠中分離蛋白，將所得蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，并利用對Gn和Ge蛋白特異的肽抗血清或?qū)蛋白特異的單克隆抗體來檢測。從未轉(zhuǎn)染的BHK-Rep細(xì)胞得到的上清液的分析僅顯示出N蛋白(圖10)。有趣地是，該結(jié)果表明:RVFV N蛋白可能以核糖核蛋白核顆粒的形式從細(xì)胞中釋放，類似于先前描述的來自對CCHFV的研究的結(jié)果(Bergeron等人.，2007.J Virol81:13271-13276)。對被pCAGGS-NSmGnGc (pCAGGS-Μ)感染的BHK-R印細(xì)胞的上清液的分析顯不出Gn蛋白、NSm蛋白、Ge蛋白和N蛋白(圖10)。實(shí)施例2克里米亞-剛果出血熱病毒毒株IbArl0200的布尼亞病毒復(fù)制子顆粒(BRP)的生
產(chǎn)合成編碼L基因組片段(GenBank:AY389508.2)、M基因組片段(GenBank:AF467768.2)以及S基因組片段(GenBank:U88410.1) CCHFV毒株IbArl0200的抗病毒方式的(anti virus-sense)全長RNA的cDNA，并且其側(cè)翼有T7聚合酶啟動子和編碼HDV核酶序列的cDNA。優(yōu)選地，T7轉(zhuǎn)錄終止序列位于核酶cDNA的下游?；救鐚?shí)施例1中例示的，這些序列被克隆到 PUC57 載體，產(chǎn)生 pUC57-CCHFV-L、pUC57_CCHFV_M 和 pUC57_CCHFV_S。為了便于將編碼CCHFV L基因組片段的cDNA克隆至pUC57，Kpn I限制位點(diǎn)被引入緊鄰T7啟動子序列的上游以及緊鄰T7轉(zhuǎn)錄終止序列的下游。為了便于編碼CCHFV M基因組片段的cDNA的克隆，KpnI限制位點(diǎn)被引入在緊鄰T7啟動子序列的上游，并且SalI限制位點(diǎn)被引入在緊鄰T7轉(zhuǎn)錄終止序列的下游。為了便于編碼CCHFV S基因組片段的cDNA的克隆，EcoR I限制位點(diǎn)被引入在緊鄰T7啟動子序列的上游，并且BamHI限制位點(diǎn)被引入在緊鄰T7轉(zhuǎn)錄終止序列的下游。M基因組片段的完整的開放閱讀框(M-ORF，GenBank序列AF467768.2的核苷酸93-5147)被引入pCIneo的CMV啟動子的下游。通過將pCIneo-M-ORF轉(zhuǎn)染至BHK-21細(xì)胞來產(chǎn)生穩(wěn)定的細(xì)胞系，并且通過在G-418的存在下培養(yǎng)來選擇具有整合的質(zhì)粒的細(xì)胞。作為替代方式 ，通過用轉(zhuǎn)導(dǎo)CCHFV M-ORF編碼的多聚蛋白的重組病毒載體感染真核細(xì)胞，隨后選擇其中持久存在該重組病毒載體而不會引起明顯細(xì)胞病變效應(yīng)的細(xì)胞，來將CCHFV M-ORF編碼的蛋白提供給BHK-21細(xì)胞。(條件地或構(gòu)建性地)表達(dá)CCHFVM-ORF編碼的蛋白的細(xì)胞被FP-T7感染，并且在恢復(fù)后，用質(zhì)粒PUC57-CCHFV-L和pUC57-CCHFV_S轉(zhuǎn)染。當(dāng)有效生產(chǎn)需要時(shí)，在合適聚合酶II啟動子(例如在PCAGGS質(zhì)粒中的CAG啟動子)的控制下，編碼CCHFV結(jié)構(gòu)性糖蛋白的構(gòu)建體也被轉(zhuǎn)染或感染以提供CCHFV結(jié)構(gòu)性糖蛋白。該過程導(dǎo)致不含有CCHFV M基因組片段的CCHFV復(fù)制子顆粒的生產(chǎn)。所使用的T7啟動子具有如下核苷酸序列:5，-TAATACGACTCACTATAG-3，。所使用的HDV核酶序列具有如下核苷酸序列:5，-GGGTCGGCATGGCATCTCC-3 。所使用的T7終止序列具有如下核苷酸序列:5-TAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTG-3’。實(shí)施例3多布拉伐-貝爾格萊德病毒(DOBV)毒株DOBV/Ano-Poroia/Af 19/1999的布尼亞病毒復(fù)制子顆粒(BRP)的生產(chǎn)合成編碼L基因組片段(GenBank:AJ410617.1)、M基因組片段(GenBank:AJ410616.1)以及 S 基因組片段(GenBank:AJ410615.1) DOBV 毒株 DOBV/Ano-Poroia/Af 19/1999的抗病毒方式的全長RNA的cDNA，并且其側(cè)翼有T7聚合酶啟動子和編碼HDV核酶序列的cDNA。優(yōu)選地，T7轉(zhuǎn)錄終止序列位于所引入的核酶cDNA的下游?；救鐚?shí)施例I中例示，這些序列被克隆到PUC57載體，產(chǎn)生pUC57-D0BV-L、pUC57-D0BV_M以及PUC57-D0BV-S。為了便于將編碼DOBV L基因組片段的cDNA克隆至pUC57，BamHI限制位點(diǎn)被引入緊鄰T7啟動子序列的上游以及緊鄰T7轉(zhuǎn)錄終止序列的下游。為了便于編碼DOBV M基因組片段的cDNA的克隆，KpnI限制位點(diǎn)被引入在緊鄰T7啟動子序列的上游，并且SalI限制位點(diǎn)被引入在緊鄰T7轉(zhuǎn)錄終止序列的下游。為了便于編碼DOBV S基因組片段的cDNA的克隆，KpnI限制位點(diǎn)被引入在緊鄰T7啟動子序列的上游，并且SalI限制位點(diǎn)被引入在緊鄰T7轉(zhuǎn)錄終止序列的下游。M基因組片段的完整的開放閱讀框(MD0BV-0RF，GenBank序列AJ410616.1的核苷酸41-3448)被引入pCIneo的CMV啟動子的下游。通過將pCIneo-MDOBV-OR轉(zhuǎn)染至BHK-21細(xì)胞來產(chǎn)生穩(wěn)定的細(xì)胞系，并且通過在G-418的存在下培養(yǎng)來選擇具有整合的質(zhì)粒的細(xì)胞?？商娲?，通過用產(chǎn)生MDOBV蛋白的重組病毒載體感染真核細(xì)胞，隨后選擇其中持久存在該重組病毒載體而不會引起明顯細(xì)胞病變效應(yīng)的細(xì)胞，來將MD0BV-0RF編碼的蛋白提供給該真核細(xì)胞。(條件地或構(gòu)建性地)表達(dá)MD0BV-0RF編碼的蛋白的細(xì)胞被FP-T7感染，并且在恢復(fù)后，用質(zhì)粒PUC57-D0BV-L和pUC57-D0BV_S轉(zhuǎn)染。當(dāng)有效生產(chǎn)需要時(shí)，在合適聚合酶II啟動子(例如在PCAGGS質(zhì)粒中的CAG啟動子)的控制下，編碼DOBV結(jié)構(gòu)性糖蛋白的構(gòu)建體也被轉(zhuǎn)染或感染以提供DOBV結(jié)構(gòu)性糖蛋白。該過程導(dǎo)致DOBV復(fù)制子顆粒的生產(chǎn)。所使用的T7啟動子具有如下核苷酸序列:5，-TAATACGACTCACTATAG-3，。所使用的HDV核酶序列具有如下核苷酸序列:5， -GGGTCGGCATGGCATCTCC-3，所使用的T7終止序列具有如下核苷酸序列:5-TAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTG-3，實(shí)施例4RVFV NSm、Gn和Ge蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)的Tet-Off系統(tǒng)根據(jù)制造商的使用說明，用pTet-Off高級質(zhì)粒(Clontech公司，CA, USA)轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞。在選定G-418后，選擇抗性克隆體，產(chǎn)生BHK-Tet-Off預(yù)制(advanced)細(xì)胞系O用側(cè)翼的KpnI (5'端)以及NotI和SalT (3'端)限制位點(diǎn)合成RVFV毒株35/74的M片段的完整的開放閱讀框(核苷酸21-3614)，并利用KpnI I和SalI限制位點(diǎn)克隆到PUC57 (GenScript公司)。插入片段通過KpnI/ NotI酶切從pUC57質(zhì)粒中釋放，并被克隆到 KpnI/Notl 酶切的 pTREtight 載體中(Clontech)。BHK-Tet-Off預(yù)制細(xì)胞用pTREtight-NSmGnGc，以及通過潮霉素或嘌呤霉素促使選擇被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的線狀標(biāo)記物轉(zhuǎn)染。在無多西環(huán)素(DOX)存在的情況下，通過使克隆體生長來選擇產(chǎn)生目的蛋白的克隆體。在選定合適的克隆體后，細(xì)胞在DOX的存在下生長，并且用FP-T7感染。在恢復(fù)后，上述細(xì)胞用PUC57-L和pUC57-S-eGFP感染。在恢復(fù)后，細(xì)胞的培養(yǎng)基被不含DOX的培養(yǎng)基替換，導(dǎo)致NSm、Gn和Ge的表達(dá)以及RVFV復(fù)制子顆粒的形成。實(shí)施例5生產(chǎn)2009大流行甲型豬源流感病毒(HlNl)的重組可溶性多聚體HA的RVFV復(fù)制子顆粒。合成寡核 苷酸MSC-1和寡核苷酸MSC-2。寡核苷酸MCS-1和寡核苷酸MCS-2的退火導(dǎo)致雙鏈DNA分子，該雙鏈DNA分子含有NcoI和XbaI突出部分以及其它的Spe1、Xho1、Bgl1、NotI限制位點(diǎn)。
寡核苷酸MCSl:5，-CATGGACTAGTCTCGAGGCTAGCAGATCTGCGGCCGCT-3’寡核苷酸MCS2: 5，-CTAGAGCGGCCGCAGATCTGCTAGCCTCGAGACTAGTC-3 ’通過Ncol/Xbal酶切從pUC57-S_eGFP中除去eGFP基因(圖7F)，并且MCS連接子連接至該載體，產(chǎn)生PUC57-S-MCS。以下列出的序列(序列CD5-HA-GCN4-ST)編碼甲型流感病毒/加利福尼亞/04/2009 (HlNl)的人類密碼子優(yōu)化的可溶性紅細(xì)胞凝聚素胞外域(sHA，氨基酸17至522)。在GenScript公司合成該序列。通過編碼N-終端0)5信號肽的序列接入(precede)HA基因，并且隨后接入編碼C-終端人工GCN4終端域的序列(GCN4-pII，Harbury等人.1993.Science262:1401-1407)以及用于親和純化的 Streptavidin-標(biāo)簽(Strep)。在 Bosch 等人 2010.J.Virol.84:10366-10374 中描述了該構(gòu)建體。為了產(chǎn)生包括CD5-sHA-GCN4-pII的載體，用 Nhel/Xbal 酶切 pUC57_S_MCS，并且將NheI/Xba酶切的HA-GCN4-ST序列克隆至該質(zhì)粒，產(chǎn)生pUC57-S-HA-GCN4_ST。隨后，通過以下寡核苷酸的退火引入⑶5序列:寡核苷酸CD5-1:5，-CTAGTATGCCCATGGGGTCTCTGCAACCGCTGGCCACCTTGTACCTGCTGGGGATGCTGGTCGCTTCCGTG-3，寡核苷酸 CD5-2:5’ -CTAGCACGGAAGCGACCAGCATCCCCAGCAGGTACAAGGTGGCCAGCGGTTGCAGAGACCCCATGGGCATA-3，CD5 連接子連接至 Spel/Nhel 酶切的 pUC57-S-HA-GCN4_ST，產(chǎn)生PUC57-S-CD5-HA-GCN4-ST。BHK-GnGc細(xì)胞用FP-T7感染。在恢復(fù)后，細(xì)胞用pUC57_L、PUC57-S-CD5-HA-GCN4-ST和pCAGGS-NSmGnGc轉(zhuǎn)染，基本如實(shí)施例1例示。細(xì)胞傳代后,重復(fù)轉(zhuǎn)染。如通過IPMA測定的，重復(fù)上述過程直至單層的所有細(xì)胞表達(dá)⑶5-HA-GCN4-ST蛋白。測定這些細(xì)胞的培養(yǎng)基中的HA-GCN4-ST的量。為了建立高水平的NSmGnGc蛋白，在細(xì)胞系中再次引入質(zhì)粒pCAGGS-NSmGnGc，得到含有S-CD5-HA-GCN4-ST基因的復(fù)制子顆粒。該復(fù)制子顆粒用于小鼠中的接種/挑戰(zhàn)試驗(yàn)以建立抗致死HlNl挑戰(zhàn)的防護(hù)有效性。序列CD5-HA-GCN4-ST核苷酸1-69 (下劃線標(biāo)出的)編碼⑶5序列核苷酸70-1590編碼HA胞外域核苷酸1591-1713(下劃線標(biāo)出的)編碼GCN4域核苷酸1714-1737編碼Str印標(biāo)簽atgcccatggggtctctgcaaccgctggccaccttgtacctgctggggatgctggtcgctMPM GSLQPLATLYLLGMLVA
tccgtgctagcagacaccctgtgcatcggctaccacgccaacaacagcaccgacaccgtgS V L A D T LC IG Y H AN N STDTVgacaccgtgctggagaagaacgtgaccgtgacccacagcgtgaacctgctggaggacaagDT V LE K N V T V T H S V N LLEDKcacaacggcaagctgtgcaagctgcgcggcgtggctccactgcacctgggcaagtgcaac
H N G KL C K L R G V A P LH LGKCNattgctggatggatcctgggaaacccagagtgcgagagcctgagcaccgccagcagctgg
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CgcgaggagatcgacggcgtgaagctcgagttaattaagcgcatgaagcagatcgaggacREE IDGVKLE L IK R MK QIEDaagatcgaagagatcgagtccaagcagaagaagatcgagaacgagatcgcccgcatcaagKIEEIESKQK K I ENEIAR IKAagattaagctggtgccgcgcggcagcctcgagtggagccacccgcagttcgagaagtgaK I KLVPRGS L EffSHPQFEK-實(shí)施例6哺乳動物的細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞的RRP感染以及RRP的生產(chǎn)為了證實(shí)其他哺乳動物細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞是否可被RRP感染，人類胚胎腎293細(xì)胞(HEK293T)，果蠅S2細(xì)胞和白紋伊蚊C6/36細(xì)胞以m.0.1.為I被RRP感染。值得注意的是，利用對BHK細(xì)胞測定的滴度來計(jì)算m.ο.1.。這個(gè)試驗(yàn)證實(shí):哺乳動物細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞可很容易地被RRP感染，雖然在昆蟲細(xì)胞中的報(bào)告基因表達(dá)明顯更低(圖11A)。在哺乳動物細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞中的eGFP的表達(dá)分別在感染后(hpi)的42或72小時(shí)最佳(圖11)。接下來，我們感興趣的是:確定HEK293T細(xì)胞是否可用于RRP的生產(chǎn)。為此，BHK細(xì)胞和HEK293T細(xì)胞以3的m.0.1被RRP感染。三天后，將細(xì)胞播種在6孔板中，并用pCAGGS-NSmGnGc轉(zhuǎn)染。三天后，收集上清液，并獲得RRP滴度為:對于BHK細(xì)胞為10E7 (107)TCID50/ml，和對于HEK293T細(xì)胞為10E6.5 (106 5) TCID50/ml。該結(jié)果證實(shí)，野生型BHK細(xì)胞和HEK293T細(xì)胞通過將RRP感染與pCAGGS-NSmGnGc質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染組合可用于生產(chǎn)RRP。實(shí)施例7RRP在病毒中和測試(VNT)中的應(yīng)用用來自之前試驗(yàn)性地被35/74病毒感染的羔羊的血清進(jìn)行傳統(tǒng)的VNT和使用RRP代替活病毒的新型的VNT (RaPid VNT)。為了確認(rèn)RVFV-特異性抗體的存在，在VNT分析之前，通過recN RVFV ELISA(BDSL，埃爾郡蘇格蘭，UK)分析血清。如前所述進(jìn)行傳統(tǒng)的VNT(deBoer等人，2010.疫苗28:2330-2339)。對于RaPid VNT，在96孔板中于補(bǔ)充有5 % FBS、4% TPBU % MEM NEAAU % pen/strep的50 μ I GMEM中制備血清稀釋液。在50 μ I的體積中含有 200RRP的生長培養(yǎng)基被加入該血清稀釋液，并且在室溫下培養(yǎng)1.5h。隨后，向各個(gè)孔中加入含有40000 BHK細(xì)胞的50 μ I的生長培養(yǎng)基?？装逵?7°C和5% CO2下培養(yǎng)。36 至 48 小時(shí)后，使用 Spearman-Karher 方法計(jì)算中和滴度。(Arch Exp Path Pharmak162:480-483 ；Spearman(1908).Br J Psychol 2:227-242)。
權(quán)利要求
1.一種用于產(chǎn)生重組布尼亞病毒復(fù)制子顆粒的方法，所述方法包括: A)將生長培養(yǎng)基提供給真核細(xì)胞； BI)將T7聚合酶提供給所述真核細(xì)胞； B2)將布尼亞病毒(NSm)GnGc蛋白提供給所述真核細(xì)胞； B3)將對布尼亞病毒L基因組片段進(jìn)行編碼的載體提供給所述真核細(xì)胞，所述布尼亞病毒L基因組片段側(cè)翼有T7啟動子和核酶序列的cDNA ； B4)將對布尼亞病毒S基因組片段的至少一部分進(jìn)行編碼的載體提供給所述真核細(xì)胞，所述布尼亞病毒S基因組片段包括N基因和3’ UTR和5’ UTR,且側(cè)翼有T7啟動子和核酶序列的cDNA ;以及，可選的 B5)將包括布尼亞病毒M基因組片段的載體提供給所述真核細(xì)胞，從所述布尼亞病毒M基因組片段，GnGc編碼區(qū)已經(jīng)功能性失活，該基因組片段的cDNA側(cè)翼有T7啟動子和核酶的 cDNA ； C)產(chǎn)生能夠從所述生長培養(yǎng)基中分離出來的重組布尼亞病毒復(fù)制子顆粒； 其中，步驟B1、B2、B3、B4、B5的順序是任意的，這些步驟中的部分或者全部可以同時(shí)進(jìn)行。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其中，通過用禽痘病毒感染所述真核細(xì)胞來將所述T7聚合酶提供給所述真核細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1至2中 任一項(xiàng)所述的方法，其中，通過用轉(zhuǎn)導(dǎo)所述布尼亞病毒(NSm)GnGc蛋白的重組副粘病毒感染所述真核細(xì)胞，來將布尼亞病毒(NSm)GnGc蛋白提供給所述真核細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的方法，其中，通過用轉(zhuǎn)導(dǎo)所述布尼亞病毒(NSm)GnGc蛋白的重組副粘病毒感染所述真核細(xì)胞，并且選擇所述重組副粘病毒持久存在的細(xì)胞，來將布尼亞病毒(NSm)GnGc蛋白提供給所述真核細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的方法，其中，通過用提供布尼亞病毒(NSm)GnGc蛋白的條件表達(dá)的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染或感染所述真核細(xì)胞，來將布尼亞病毒(NSm)GnGc蛋白提供給所述真核細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述布尼亞病毒L基因組片段和/或S基因組片段，和/或當(dāng)存在時(shí)，M基因組片段，包括外源基因。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的方法，其中，外源基因存在于M微型基因組、L微型基因組或S微型基因組上。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述真核細(xì)胞為哺乳動物細(xì)胞，優(yōu)選 BHK-21。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述布尼亞病毒為裂谷熱病毒。
10.一種重組布尼亞病毒復(fù)制子顆粒，包括: 布尼亞病毒L基因組片段； 布尼亞病毒S基因組片段或包括至少N基因和3’ UTR和5’ UTR的布尼亞病毒S基因組片段的部分；以及，可選的 布尼亞病毒M基因組片段，從所述布尼亞病毒M基因組片段，GnGc編碼區(qū)已經(jīng)功能性失活。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的重組布尼亞病毒復(fù)制子顆粒，其中，所述布尼亞病毒L基因組片段和/或S基因組片段，和/或當(dāng)存在時(shí)，M基因組片段，包括外源基因。
12.根據(jù)權(quán)利要求10或11所述的重組布尼亞病毒復(fù)制子顆粒，其中，所述布尼亞病毒為裂谷熱病毒。
13.一種用于生產(chǎn)布尼亞病毒復(fù)制子顆粒的方法，所述方法包括: A)將生長培養(yǎng)基提供給真核細(xì)胞； B)將布尼亞病毒(NSm)GnGc蛋白提供給所述真核細(xì)胞； C)用根據(jù)權(quán)利要求10至12中任一項(xiàng)所述的重組布尼亞病毒復(fù)制子顆粒感染所述真核細(xì)胞。
14.根據(jù)權(quán)利要求10至12中任一項(xiàng)所述的重組布尼亞病毒復(fù)制子顆粒，作為藥劑的應(yīng)用。
15.一種包括根據(jù)權(quán)利要求10至12中任一項(xiàng)所述的重組布尼亞病毒復(fù)制子顆粒的疫苗。`
全文摘要
本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)有感染性的布尼亞病毒復(fù)制子顆粒的方法。這些布尼亞病毒復(fù)制子顆粒是安全的且能夠在生物安全防護(hù)裝置外使用。本發(fā)明進(jìn)一步涉及重組的布尼亞病毒復(fù)制子顆粒以及這些重組的布尼亞病毒復(fù)制子顆粒的應(yīng)用。
文檔編號C12N7/00GK103209706SQ201180045281
公開日2013年7月17日 申請日期2011年9月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月20日
發(fā)明者J·A·郭特卡斯, 羅伯特斯·雅各布斯·瑪麗亞·莫爾曼 申請人:農(nóng)業(yè)研究基金會