專利名稱：利用逆轉(zhuǎn)錄定量實(shí)時(shí)PCR(RT-qPCR)技術(shù)檢測、區(qū)分和定量T細(xì)胞群體的方法
利用逆轉(zhuǎn)錄定量實(shí)時(shí)PCR(RT-qPCR)技術(shù)檢測、區(qū)分和定量T細(xì)胞群體的方法本發(fā)明涉及用于檢測、區(qū)分和定量T細(xì)胞群體的方法，包括下述步驟:a)使第一等份的個(gè)體體液與至少一種抗原接觸，其中所述體液含有抗原呈遞細(xì)胞(APC)和T細(xì)胞，b)將所述第一等份與至少一種抗原溫育一段確定的時(shí)間，c)通過利用逆轉(zhuǎn)錄定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR)檢測所述第一等份中以及未與所述至少一種抗原溫育過的第二等份的個(gè)體體液中由特定T細(xì)胞群體中的T細(xì)胞誘導(dǎo)的至少第一種APC標(biāo)志物來檢測和區(qū)分T細(xì)胞群體，和d)通過確定檢測到的第一等份的APC標(biāo)志物與第二等份的比例來檢測和定量T細(xì)胞群體；還涉及用于實(shí)施該方法的試劑盒。T細(xì)胞通過協(xié)調(diào)免疫應(yīng)答以及藉由多種直接和間接效應(yīng)物功能控制和消滅病原體和腫瘤細(xì)胞，在抗微生物感染和腫瘤疾病的免疫防御復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)中扮演關(guān)鍵角色。對(duì)復(fù)雜的T細(xì)胞功能的干擾可能導(dǎo)致自身攻擊性T細(xì)胞的錯(cuò)誤活化，同時(shí)引發(fā)嚴(yán)重的自身免疫病如多發(fā)性硬化(MS)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)和青少年糖尿病(I型糖尿病)。理論上，T細(xì)胞在表型上呈現(xiàn)很大的異質(zhì)性以及廣譜的效應(yīng)物功能。因此，基于表面蛋白CD4和CD8的表達(dá)，可以將T細(xì)胞大致分類為CD4陽性T細(xì)胞(T輔助細(xì)胞(Th))和⑶8陽性細(xì)胞毒T細(xì)胞(CTL)。⑶4+T細(xì)胞在 免疫防御的活化、極化(polarization)和協(xié)調(diào)中扮演關(guān)鍵角色。CD4+T細(xì)胞由于它們的T細(xì)胞受體與位于抗原呈遞細(xì)胞(APC)表面上的加載有肽的II類MHC分子的特異性相互作用而被活化，隨后藉由細(xì)胞-細(xì)胞接觸和/或各種信使分子(例如細(xì)胞因子、趨化因子)的分泌來控制B細(xì)胞的抗體產(chǎn)生(免疫應(yīng)答的體液分支)以及CTL的活化(免疫應(yīng)答的細(xì)胞分支)?；谔卣餍员砻娴鞍椎谋磉_(dá)和標(biāo)志物細(xì)胞因子的產(chǎn)生，可以將⑶4+T細(xì)胞細(xì)分為T輔助細(xì)胞I (Th-1)、T輔助細(xì)胞2 (Th-2)、和T輔助細(xì)胞17(Th-17)。Th-1細(xì)胞以細(xì)胞因子IFN-Y與TNF-α的產(chǎn)生以及轉(zhuǎn)錄因子T_bet的表達(dá)為特征。Th-1細(xì)胞通過刺激巨噬細(xì)胞、⑶4TD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞、⑶4+⑶8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞、以及天然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)和NKT細(xì)胞的活化和分化來支持高效的細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答的發(fā)動(dòng)。Th-2以細(xì)胞因子IL-4、11^-5、11^6、11^-10和11^-13的分泌以及轉(zhuǎn)錄因子64了4-3的產(chǎn)生為特征，并且支持8細(xì)胞中抗體(免疫系統(tǒng)的體液分支)的產(chǎn)生以及類別改變。Th-17細(xì)胞以細(xì)胞因子IL-17、TNF-α、GM-CSF和IL-6的產(chǎn)生為特征，且似乎在風(fēng)濕性自身免疫病中起關(guān)鍵作用。除了 Th-l、Th-2和Th-17細(xì)胞之外另一種CD4+T細(xì)胞群體被定義為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，其在免疫應(yīng)答的弱化、口服免疫耐受以及自身免疫病的預(yù)防中起重要作用。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可細(xì)分為CD4+CD25+CTLA4+天然調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(T-reg)以及Th-3和Tr-1細(xì)胞，后兩者以細(xì)胞因子TGF-β (Th_3細(xì)胞)或IL-1O (Tr-1細(xì)胞)的產(chǎn)生為特征。在與感染了微生物和寄生物的細(xì)胞和組織以及腫瘤細(xì)胞的對(duì)抗中，CTL通過直接效應(yīng)物機(jī)制，諸如釋放細(xì)胞毒性物質(zhì)(例如穿孔蛋白、顆粒酶)和觸發(fā)凋亡來破壞所述細(xì)胞和組織，從而起關(guān)鍵作用。此外，通過分泌免疫刺激性細(xì)胞因子(IFN-Y , TNF-a , IL-15)和趨化因子(ΜΙΡ1 a，MIPl β，Rantes)以及多種可溶性抗病毒因子(IFN-α，IFN-β, IFN- δ，CAF)，CTL表現(xiàn)更多的，在某種程度上說非常特異性的效應(yīng)物功能，此類功能非常高效地有助于對(duì)病原體復(fù)制和擴(kuò)散的限制。此外，其他細(xì)胞毒性T細(xì)胞群體已經(jīng)得到描述，此類群體展現(xiàn)⑶4+⑶8+表型(⑶4+CD8暗，⑶4暗⑶8亮或⑶4htD8hi)。因此，T細(xì)胞是獲得性免疫系統(tǒng)防止和控制微生物，尤其是病毒誘導(dǎo)的疾病，以及識(shí)別和破壞腫瘤細(xì)胞的一種重要的保護(hù)性機(jī)制。特定的T細(xì)胞的活化、極化和調(diào)節(jié)是藉由APC的嚴(yán)格控制而調(diào)控的，并且實(shí)質(zhì)上由APC的亞型及成熟水平、抗原攝取和呈遞的機(jī)制、以及相應(yīng)免疫原的固有性質(zhì)所定義。由此，免疫原的劑量和定位，以及免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)的濃度，確定是否產(chǎn)生由Th-l、Th-2或Th-17介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，或者是否誘導(dǎo)耐受。專職性APC，諸如樹突細(xì)胞(DC)、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，以及B細(xì)胞，特異性地識(shí)別病原體和腫瘤細(xì)胞，攝取它們，并將它們的片段與I類及II類MHC分子一起呈遞給T細(xì)胞，從而在天然免疫系統(tǒng)和獲得性免疫系統(tǒng)之間的接合點(diǎn)上占據(jù)關(guān)鍵位置。此外，皮膚的成纖維細(xì)胞、胸腺和甲狀腺的上皮細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、胰腺β細(xì)胞、以及血管內(nèi)皮細(xì)胞可充當(dāng)非專職性APC。另外，當(dāng)前的研究顯示T細(xì)胞也可以充當(dāng)APC。這些APC T細(xì)胞是由于與APC，特別是 DC (Sokke Umeshappa et al.(2009), J.Virol.182:193-206)接觸，MHC I 類和II類分子以及共刺激分子如CD80，CD40配體(CD40L)，0X40配體(0X40L)，以及4-1BB配體(4-1BBL, TNFSF9)發(fā)生細(xì)胞間轉(zhuǎn)移而產(chǎn)生的。對(duì)于APC成功刺激T細(xì)胞而言，需要三種獨(dú)立的信號(hào):藉由T細(xì)胞受體(TCR)特異性識(shí)別加載有肽的MHC分子(信號(hào)I)、基于APC以及T細(xì)胞的共刺激分子與它們的配體的相互作用(信號(hào)2)、以及T細(xì)胞極化性細(xì)胞因子，諸如IFN- Y、IL-12、IL_4、IL-6和TGF-β (信號(hào)3)的存在。細(xì)胞外的可溶性蛋白質(zhì)通常藉由外源性抗原加工途徑而被降解，所產(chǎn)生的肽以與MHC-1I分子復(fù)合的形式被呈遞在APC的表面上。與MHC II類分子復(fù)合的肽被⑶4+Τ細(xì)胞(Τ輔助細(xì)胞)所識(shí)別。與之對(duì)照的是，細(xì)胞質(zhì)蛋白質(zhì)的降解藉由內(nèi)源性加工途徑來發(fā)生，導(dǎo)致所產(chǎn)生的表位被呈遞在MHC I類分子上。這些肽/MHC-1復(fù)合物被轉(zhuǎn)運(yùn)到APC表面，在那里它們被呈遞給細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)。雖然MHC I類分子上呈遞的表位大多數(shù)來源于內(nèi)源蛋白質(zhì)而與MHC-1I分子復(fù)合的肽大多來源于外源蛋白質(zhì)，這種區(qū)別不是絕對(duì)的。例如，多種外源存在的免疫原，如微粒結(jié)構(gòu)、多種病毒顆粒、免疫復(fù)合物及脂蛋白，通過抗原呈遞的內(nèi)源加工途徑中的一種稱為交叉呈遞(cross presentation)的機(jī)制而最終出現(xiàn)在MCH I分子上。對(duì)于幼稚T細(xì)胞的特異性活化而言，除了識(shí)別加載有肽的MHC分子(信號(hào)I)之外，還需要第二種共刺激信號(hào)(信號(hào)2)。這是由多種基于APC和T細(xì)胞的共刺激配體與它們的受體相互作用而觸發(fā)的。TNF/TNF受體超家族以及免疫球蛋白超家族的成員屬于共刺激分子的最重要的代表。在沒有共刺激信號(hào)的條件下T細(xì)胞變成無反應(yīng)性。無反應(yīng)性(anergy)是T細(xì)胞不擴(kuò)增并且不對(duì)抗原起反應(yīng)的狀況。APC上共刺激信號(hào)的表達(dá)主要是藉由外源刺激因素，諸如病原體或受創(chuàng)傷組織的成分，以及細(xì)胞因子來控制的。APC的活化和成熟導(dǎo)致促炎癥性以及T細(xì)胞極化性細(xì)胞因子，以及共刺激分子(CD80、CD86和CD40)的表達(dá)，從而急劇增加APC的活化細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的能力。TCR的特異性抗原識(shí)別以及與共刺激分子的相互作用誘導(dǎo)對(duì)病原體和疾病特異性的幼稚T細(xì)胞的靶向性活化和增殖。這伴隨著IL-2分泌的增加和CD40配體的表達(dá)，它們在后續(xù)的其他特異性T細(xì)胞亞群的活化和擴(kuò)增中起重要作用。Th-1或Th-2效應(yīng)物細(xì)胞中活化T細(xì)胞極化的發(fā)生依賴于APC的成熟水平、占優(yōu)勢地位的細(xì)胞因子環(huán)境、以及相應(yīng)抗原的固有性質(zhì)和劑量。急性微生物感染過程中特異性T細(xì)胞應(yīng)答的發(fā)動(dòng)通常分三步進(jìn)行:在效應(yīng)期(effctor phase)中，抗原特異性幼稚T細(xì)胞通過與加載有抗原的APC接觸而被活化,導(dǎo)致該特異性T細(xì)胞的急劇擴(kuò)增、效應(yīng)物功能的產(chǎn)生、以及活化的效應(yīng)物T細(xì)胞在感染部位的浸潤。該效應(yīng)期通常持續(xù)1-2周的時(shí)間，直到病原體被消滅。在隨后的收縮期(contractionphase)中，該期持續(xù)數(shù)周，所產(chǎn)生的效應(yīng)物T細(xì)胞中90%死亡。只有少數(shù)抗原特異性T細(xì)胞存活并分化為長期持續(xù)存在的記憶T細(xì)胞。在記憶期(memory phase)中，這些記憶T細(xì)胞在身體中以相對(duì)穩(wěn)定的細(xì)胞數(shù)持續(xù)存在許多年。這些記憶T細(xì)胞在重新與它們的抗原接觸后能夠很快重新活化并發(fā)揮它們的效應(yīng)物功能。為了避免針對(duì)機(jī)體自身蛋白質(zhì)和組織的不期望的免疫反應(yīng)，通過克隆刪除(無反應(yīng)性)將自身反應(yīng)性T細(xì)胞預(yù)先消除或滅活。結(jié)果是對(duì)機(jī)體的自身結(jié)構(gòu)，如蛋白質(zhì)、細(xì)胞、組織和器官的抗原特異性耐受。在自身免疫病中，這些保護(hù)性機(jī)制被抑制或者發(fā)育不足。有若干信息提示自身免疫病是藉由天然的“易感性”(遺傳傾向)，結(jié)合環(huán)境影響諸如微生物感染、妊娠，或者由于機(jī)體的自身結(jié)構(gòu)與病原體和外來組織特異性多肽的相似性，即所謂分子擬態(tài)(molecular mimicry),而獲得的。除此之外，活化T細(xì)胞還在慢性病毒感染以及移植組織和器官的排斥中起核心作用。T細(xì)胞的表型、頻度、特異性、功能性、活化狀態(tài)是獲取關(guān)于疾病現(xiàn)有狀態(tài)或已經(jīng)克服的疾病的信息的高效策略。此外，這些方法對(duì)于在治療性或預(yù)防性接種中、以及在慢性炎癥、自身免疫病以及在移植排斥中T細(xì)胞的數(shù)目和功能性診斷性檢測中監(jiān)控(監(jiān)測)特異性T細(xì)胞應(yīng)答是非常重要的。在過去數(shù)十年中已經(jīng)開發(fā)出了不同的T細(xì)胞檢測技術(shù)，它們大致可以分為兩類。第一組方法依賴于使用肽-MHC多聚體，諸如四聚體(BeckmanCoulter)、五聚體(Proimmune)JP streptameres (IBA)來直接鑒定和定量多肽特異性T細(xì)胞。這種方法容許測定具有已知的MHC限制性的表位特異性T細(xì)胞。用這種方法分析T細(xì)胞的功能性是不可能的。這導(dǎo)致使用MHC多聚體常規(guī)監(jiān)測疾病或病原體特異性T細(xì)胞的最重要的限制，因?yàn)镸HC/肽多聚體是對(duì)表位以及HLA特異性的。因此，在具有不同HLA分型的受試者中對(duì)病原體及疾病特異性T細(xì)胞進(jìn)行全面監(jiān)測需要使用范圍寬泛的一系列不同的肽/MHC多聚體，導(dǎo)致成本高昂。此外，這些肽/MHC多聚體目前僅對(duì)于有限的一系列MHC分子可用。另一種用于測定特異性T細(xì)胞的方法依賴于使用加載有肽的HLA分子，其連接于綠色熒光蛋白(GFP)。T細(xì)胞受體對(duì)這些復(fù)合物的表位特異性識(shí)別和結(jié)合導(dǎo)致GFP標(biāo)記的肽的內(nèi)化，從而使得相應(yīng)的CTL可視(Tomaru etal.(2003), Nat Med.9:469)。與之相對(duì)的，監(jiān)測特異性T細(xì)胞的“功能性”方法依賴于在離體狀態(tài)下用刺激物抗原刺激含有T細(xì)胞和APC的患者材料，然后通過多種檢測系統(tǒng)檢測特定的再活化T細(xì)胞中的成熟過程，諸如增殖、標(biāo)志物細(xì)胞因子的產(chǎn)生。特異性CD4+T細(xì)胞的檢測通常是通過如下實(shí)現(xiàn)的:用長度為15-25個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)、多肽或肽刺激含有APC或T細(xì)胞的患者樣品，諸如肝素化全血或分離的血液外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC);以及通過測定特征性標(biāo)志物細(xì)胞因子的產(chǎn)生或T細(xì)胞增殖來檢測特異性T細(xì)胞活化。細(xì)胞因子檢測通過例如流式細(xì)胞術(shù)方法，諸如胞內(nèi)細(xì)胞因子染色和細(xì)胞因子分泌測定法，以及ELISpot或ELISA技術(shù)來進(jìn)行。T細(xì)胞增殖的測定可以通過例如5’ -溴脫氧尿嘧啶(BrdU)-或羧基熒光素二乙酸酯琥珀酰亞胺酯(CSFE)增殖測定法來測定。相比之下，特異性⑶8+T細(xì)胞(CTL)的檢測通常是通過用長度為8-16個(gè)氨基酸的短肽刺激含有APC和T細(xì)胞的患者樣品來進(jìn)行的。此外，可以通過用可在APC細(xì)胞內(nèi)表達(dá)T細(xì)胞的祀結(jié)構(gòu)的重組病毒或細(xì)菌進(jìn)行感染，然后通過流式細(xì)胞法，諸如胞內(nèi)細(xì)胞因子染色或通過分別使用ELISpot或ELISA技術(shù)，測定由抗原特異性T細(xì)胞產(chǎn)生的標(biāo)志物細(xì)胞因子(通常是INF- Y )，從而特異性地檢測CTL。作為替代，可以利用51鉻釋放測定法，或者使用適當(dāng)?shù)姆欠派湫苑椒?，諸如乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性測定(例如來自Clontech者)，來進(jìn)行CTL的特異性檢測。這些可用的技術(shù)容許測定疾病或病原體特異性⑶4+或⑶8+記憶T細(xì)胞，但對(duì)于檢測僅在疾病的活動(dòng)期中瞬時(shí)出現(xiàn)的活化T輔助細(xì)胞則不適用或者適用性非常有限。⑶4+T細(xì)胞在活動(dòng)的微生物感染和疾病進(jìn)展中瞬時(shí)活化。這里，瞬時(shí)活化暗示著T細(xì)胞僅在確定的、相當(dāng)短的一段時(shí)間內(nèi)存在。因此，活化的T輔助細(xì)胞是活動(dòng)疾病事件檢測的重要對(duì)象。需要盡可能顯著的檢測測定法來在診斷活動(dòng)性感染性疾病和自身免疫病的語境中準(zhǔn)確地測定活化T細(xì)胞。然而，對(duì)于某些需要區(qū)分活化和非活化T細(xì)胞的應(yīng)用，例如急性微生物感染和再活化中活化T細(xì)胞的檢測，或者在疑似多發(fā)性硬化或I型糖尿病的病例中對(duì)活化的自身攻擊性T細(xì)胞的檢測，基于記憶T細(xì)胞的體外再活化的方法不能使用或者僅能非常有限地使用。迄今為止可用于檢測活化CD4+T細(xì)胞的方法目前僅顯示較低的靈敏度，因此是不利的。該低靈敏度的原因之一是由于病原體或疾病特異性活化CD4+T細(xì)胞是直接被檢測的，并且通常在患者材料中僅少量存在。但是，可用的特異性活化T細(xì)胞的數(shù)量稀少阻礙了亦可滿足診斷需要的可靠而明晰的檢測，因?yàn)檫@些迄今為止可用的方法的檢測限經(jīng)常被壓低。因此，當(dāng)前可用于檢測抗原特異性活化T輔助細(xì)胞的方法通常依靠例如對(duì)活化T細(xì)胞表面上瞬時(shí)表達(dá)的蛋白質(zhì)的流式細(xì)胞術(shù)測定。屬于此類蛋白質(zhì)的具體有CD40配體和CD25蛋白。然而，CD40配體很難用流式細(xì)胞術(shù)檢出，因?yàn)榭贵w的結(jié)合會(huì)導(dǎo)致CD40配體內(nèi)化。相比之下，CD25蛋白可能不僅出現(xiàn)于活化的T輔助細(xì)胞上，還出現(xiàn)在調(diào)節(jié)性T細(xì)胞上，因此其對(duì)于可靠地區(qū)分這兩種T輔助細(xì)胞亞群而言是不適合的。此外，HLA-DR與CD69的表達(dá)增強(qiáng)，以及CD27的表達(dá)減少也是活化T細(xì)胞的標(biāo)志。這里，對(duì)活化的抗原特異性T細(xì)胞的檢測要求在特異性重刺激后進(jìn)行平行標(biāo)志物檢測以便:確定特異性，例如通過使用特異性四聚體、五聚體或streptamer ;表型,例如通過測定特征性表面標(biāo)志物,和/或T細(xì)胞活化，例如藉由標(biāo)志細(xì)胞因子的產(chǎn)生。迄今為止已知的方法的另一個(gè)劣勢是，通過ELISA、ELISpot或FACS技術(shù)是不可能的，原因是標(biāo)志物蛋白質(zhì)的膜定位、細(xì)胞內(nèi)囊泡中預(yù)形成的標(biāo)志物蛋白質(zhì)的存在，以及可用的抗體與細(xì)胞蛋白的高度非特異反應(yīng)性。因此對(duì)于這樣的方法存在需求，其容許檢測、區(qū)分和定量細(xì)菌、病毒、寄生物或自身抗原所活化的特異性T細(xì)胞群體，從而能夠?qū)⑦@些T細(xì)胞群體歸屬于特定的疾病和疾病階段。因此，本發(fā)明要解決的問題是提供容許定性、靈敏且定量地檢測特異性T細(xì)胞群體的病原體或疾病特異性T細(xì)胞的方法。本發(fā)明要解決的另一個(gè)問題是提供容許在特異性T細(xì)胞(諸如抗原特異性幼稚T細(xì)胞、活化T細(xì)胞和記憶T細(xì)胞)之間進(jìn)行區(qū)分，作為不同的特異性T細(xì)胞群體的方法。此外，本發(fā)明要解決的另一個(gè)問題是提供一種用于實(shí)施檢測活動(dòng)病原體特異性感染和疾病事件的方法的試劑盒，其依靠對(duì)活化的病原體或疾病特異性T細(xì)胞的間接檢測。本發(fā)明另一個(gè)要解決的問題是提供一種用于實(shí)施對(duì)活動(dòng)的和潛伏的感染和疾病事件的鑒別診斷的方法的試劑盒，其依靠對(duì)活化的病原體或疾病特異性T細(xì)胞的間接檢測以及它們與幼稚T細(xì)胞及記憶T細(xì)胞的區(qū)別。本發(fā)明的問題由權(quán)利要求中定義的主題所解決。下面的附圖的目的在于說明本發(fā)明。

圖1顯示了(A)迄今為止使用的依照現(xiàn)有技術(shù)的技術(shù)的原理和(B)根據(jù)本發(fā)明的特異性T細(xì)胞檢測方法的技術(shù)的原理。圖2顯示在離體預(yù)活化的ESAT-6/CFP-10特異性T細(xì)胞與具有潛伏結(jié)核病的血液供體的PBMC的共培養(yǎng)物中具有胞內(nèi)可檢測的4-1BBL蛋白的B細(xì)胞的數(shù)目的點(diǎn)圖，其中所述共培養(yǎng)物用或者不用ESAT-6/CFP-10融合蛋白刺激。將體外擴(kuò)增的預(yù)活化的ESAT-6/CFP-10特異性T輔助細(xì)胞與自體PBMCl:1混合，并在存在或不存在10 μ g/ml ESAT-6/CFP-10的條件下共培養(yǎng)18h。在最后16h中用布雷菲德菌素A抑制蛋白質(zhì)分泌。通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行B細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)4-1BBL的檢測。圖3是顯示在加載有ESAT-6/CFP-10的PBMC中，與未加載的PBMC相比，與自體體外擴(kuò)增的預(yù)活化ESAT-6/CFP-10特異性T輔助細(xì)胞共培養(yǎng)后通過RT-qPCR測定的4-1BBLmRNA的相對(duì)增加的圖。將具有潛伏結(jié)核分枝桿菌感染的患者的新鮮分離的PBMC與10 μ g/ml ESAT-6/CFP-10溫育12小時(shí)，然后與離體擴(kuò)增的自體ESAT-6/CFP-10特異性T輔助細(xì)胞以1:1的比例共培養(yǎng)。以ESAT-6/CFP-10特異性Th細(xì)胞與未加載的PBMC的共培養(yǎng)物作為陰性對(duì)照。在標(biāo)示的時(shí)間點(diǎn)收集刺激樣品，并通過RT-qPCR測定在特異性刺激的細(xì)胞培養(yǎng)物中相對(duì)于未刺激的細(xì)胞培養(yǎng)物中4-1BBL mRNA表達(dá)的相對(duì)增加。根據(jù)2_ΔΔ&1*法分析RT-qPCR數(shù)據(jù)，其中用GAPDH作為參比基因，并用未刺激的對(duì)照作為校準(zhǔn)物。圖4是顯示通過RT-qPCR測定的、加載有ESAT-6/CFP-10的PBMC中相對(duì)于未加載的PBMC中4-1BBL mRNA產(chǎn)生的相對(duì)增加與抗原特異性的活化ESAT-6/CFP-10特異性T輔助細(xì)胞的數(shù)目的關(guān)聯(lián)的圖。將具有潛伏結(jié)核分枝桿菌的供體的IxlO6個(gè)新鮮分離的PBMC與遞增數(shù)目的離體擴(kuò)增的ESAT-6/CFP-10特異性T輔助細(xì)胞在10 μ g/ml ESAT-6/CFP-10的存在下一起培養(yǎng)。以自體PBMC和預(yù)活化ESAT-6/CGP-10特異性Th細(xì)胞的未刺激共培養(yǎng)物作為對(duì)照。在標(biāo)示的時(shí)間點(diǎn)收集2xl05個(gè)細(xì)胞，并通過RT-qPCR測定在特異性刺激的細(xì)胞中相比于未刺激的細(xì)胞4-1BBL mRNA濃度的相對(duì)增加。根據(jù)2_Δ Δε<1方法分析RT-qPCR的數(shù)據(jù)，其中用GAPDH作為參比基因，并用未刺激的對(duì)照作為校準(zhǔn)物。圖5: (A)顯示:通過RT-qPCR測定的、在加載有和未加載ESAT_6/CFP_10的PBMC中由于與離體預(yù)活化的自體ESAT-6/CFP-10特異性T輔助細(xì)胞共培養(yǎng)4-1BBL mRNA產(chǎn)生的相對(duì)增加的圖。在存在及不存在10 μ g/mlESAT-6/CFP-lO的條件下將具有潛伏結(jié)核病的供體的IxlO6個(gè)新鮮分離的PBMC與50000個(gè)離體預(yù)活化的ESAT-6/CFP-10特異性T輔助細(xì)胞共培養(yǎng)。在標(biāo)示的時(shí)間點(diǎn)移出2Χ105個(gè)細(xì)胞，離心沉降，并在液氮中冷凍。通過RT-qPCR測定在特異性刺激的細(xì)胞培養(yǎng)物中相比于未刺激的細(xì)胞培養(yǎng)物中4-1BBL mRNA的相對(duì)增加。根據(jù)2_Δ "Cq方法分析RT-qPCR的數(shù)據(jù)，其中用GAPDH作為參比基因，并用未刺激的對(duì)照作為校準(zhǔn)物。(B)顯示:通過RT-qPCR測定的、加載有或未加載ESAT-6/CFP-10的PBMC與離體預(yù)活化的自體ESAT-6/CFP-10特異性T輔助細(xì)胞共培養(yǎng)的過程中IFN- y mRNA產(chǎn)生的相對(duì)增加的圖。在存在及不存在10 μ g/ml ESAT-6/CFP-10的條件下將具有潛伏結(jié)核病的供體的IxlO6個(gè)新鮮分離的PBMC與50000個(gè)離體預(yù)活化的ESAT-6/CFP-10特異性T輔助細(xì)胞共培養(yǎng)。在標(biāo)示的時(shí)間點(diǎn)移出2 X IO5個(gè)細(xì)胞，離心沉降，并通過RT-qPCR測定在特異性刺激的細(xì)胞培養(yǎng)物中相比于未刺激的細(xì)胞培養(yǎng)物中IFN-YmRNA的相對(duì)增加。根據(jù)2_一方法分析RT-qPCR的數(shù)據(jù)，其中用GAPDH作為參比基因，并用未刺激的對(duì)照作為校準(zhǔn)物。圖6顯示通過RT-qPCR技術(shù)測定的活化Th細(xì)胞對(duì)4-1BBL mRNA合成的誘導(dǎo)的抗原特異性的圖。與擴(kuò)增珠子預(yù)活化的非ESAT-6/CFP-10特異性T細(xì)胞比較，預(yù)活化的ESAT-6/CFP-10特異性T細(xì)胞在用ESAT-6/CFP-10刺激過的細(xì)胞培養(yǎng)物中相對(duì)于未刺激的細(xì)胞培養(yǎng)物顯示顯著改善的誘導(dǎo)4-lBBLmRNA產(chǎn)生的能力。在存在和不存在10 μ g/ml ESAT-6/CFP-10的條件下將用擴(kuò)增珠子非特異性活化的以及特異性預(yù)活化的ESAT-6/CFP-10特異性Th細(xì)胞與自體PBMC共培養(yǎng)，其中使用不同數(shù)目的T細(xì)胞和IxlO6個(gè)新鮮分離的PBMC。在標(biāo)示的時(shí)間點(diǎn)分別移出2xl05個(gè)細(xì)胞，離心沉降，并通過RT-qPCR定量4-1BBL mRNA的相對(duì)量。根據(jù)2_Λ w方法分析RT-qPCR的數(shù)據(jù)，其中用GAPDH作為參比基因，并用未刺激的對(duì)照作為校準(zhǔn)物。圖7顯示另一幅通過RT-qPCR技術(shù)測定的活化Th細(xì)胞對(duì)4-lBBLmRNA合成的誘導(dǎo)的抗原特異性的圖。預(yù)活化的ESAT-6/CFP-10特異性T細(xì)胞僅在經(jīng)ESAT-6/CFP-10刺激的細(xì)胞培養(yǎng)物中、而不在經(jīng)EBV BZLFl或CMV pp65蛋白刺激的細(xì)胞培養(yǎng)物中誘導(dǎo)4-1BBLmRNA產(chǎn)生的增加的誘導(dǎo)。將具有頑固性結(jié)核分枝桿菌感染的供體的IxlO6個(gè)PBMC與大約70，000 個(gè)預(yù)活化的 ESAT-6/CFP-10 特異性 Th 細(xì)胞在 10 μ g/ml ESAT-6/CFP-10、EBVBZLF1或CMV pp65的存在下共培養(yǎng)。預(yù)活化T細(xì)胞與PBMC的未經(jīng)刺激的共培養(yǎng)物作為另一對(duì)照。在每一情況下，在標(biāo)示的時(shí)間點(diǎn)從樣品移出2xl05個(gè)細(xì)胞，并在RT-qPCR中定量4-1BBLmRNA的相對(duì)含量。根據(jù)2_δ "Cq方法分析RT-qPCR的數(shù)據(jù)，其中使用GAPDH作為參比基因，使用未刺激的對(duì)照作為校準(zhǔn)物。圖8顯示了通過RT-qPCR技術(shù)測定的活化Th細(xì)胞中4-1BBL mRNA合成誘導(dǎo)的抗原特異性的另一幅圖。預(yù)活化的ESAT-6/CFP-10特異性Th細(xì)胞、EBV BZLFl特異性Th細(xì)胞、和CMV pp65特異性Th細(xì)胞僅在用它們分別的靶抗原刺激過的共培養(yǎng)物中顯示增加的4-1BBL mRNA產(chǎn)生誘導(dǎo)。(A)至(C)顯示了通過RT-qPCR測定的，在加載有(A)結(jié)核分枝桿菌 ESAT-6/CFP-10、(B)CMV pp65、及(C)EBV BZLVl 的 PBMC 中，CMV pp65、EBV BZLF1、以及結(jié)核分枝桿菌ESAT-6/CFP-10特異性Th細(xì)胞的4-lBBL_mRNA合成的誘導(dǎo)。在每一情況下，將IxlO6個(gè)/ml的PBMC與大約70，000個(gè)離體擴(kuò)增的pp65、BZLF1、及ESAT-6/CFP-10特異性Th細(xì)胞在存在(以及不存在，作為對(duì)照)分別10 μ g/ml的ESAT-6/CFP-10、(B)pp65、或(C)BZLFl的條件下共培養(yǎng)。在標(biāo)示的時(shí)間點(diǎn)從樣品移出2xl05個(gè)細(xì)胞，分離總RNA并轉(zhuǎn)錄成cDNA，并通過RT-qPCR確定4-1BBL mRNA的相對(duì)含量。根據(jù)2_Δ Δε<1方法進(jìn)行分析，使用GAPDH作為參比基因，未刺激的對(duì)照作為校準(zhǔn)物。圖9顯示如下的圖:如RT-qPCR測定的，通過使用MHC-1阻斷性抗體(W6/32)本發(fā)明的RTT方法的靈敏度增加。將未加載的PBMC或加載有10 μ g/ml EBV BZLFl的PBMC與體外預(yù)活化的BZLFl-特異性Th細(xì)胞在存在和不存在10 μ g/ml MHC-1阻斷性抗體W6/32的條件下共培養(yǎng)。在標(biāo)示的時(shí)間點(diǎn)移出2xl05個(gè)細(xì)胞，純化RNA并使用RT-qPCR技術(shù)分析。根據(jù)2_“Cq方法分析RT-qPCR的數(shù)據(jù)，其中使用GAPDH作為參比基因。圖10在㈧至(E)中顯示了 如下的圖 與⑶具有潛伏結(jié)核分枝桿菌感染的供體、(C)具有經(jīng)過治療的TB感染的供體、以及(A)健康供體相比，(D)具有活動(dòng)結(jié)核病的供體展現(xiàn)在經(jīng)過特異性刺激的PBMC中相比于未刺激的PBMC的4-1BBL mRNA產(chǎn)生的相對(duì)誘導(dǎo)的可測量的增加。從(A)三名未感染結(jié)核分枝桿菌的健康供體(ρ012，ρΟΙΟ, p008)、(B)三名具有潛伏結(jié)核感染的健康供體(p009，p006，p005)，(C)三名在檢查之前最近6個(gè)月內(nèi)由于活動(dòng)結(jié)核病而經(jīng)過藥物治療的供體(p013，p014，p003)，以及(D)三名在病因性治療開始之前或剛開始之后具有活動(dòng)結(jié)核病的供體(p001，p004，p007)的新鮮分離的肝素化全血分離PBMC，并在有或無10 μ g/ml ESAT-6/CFP-10存在的條件下溫育。(E)作為對(duì)照，對(duì)選定的供體 HIV 血清陰性供體的 PBMC 用 10 μ g/ml HIVp24 殼體蛋白(p005, p008, p007, p006, p003)或牛血清白蛋白(POOI)進(jìn)行刺激。在標(biāo)示的時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞，并通過RT-qPCR測定經(jīng)刺激和未經(jīng)刺激的細(xì)胞中4-1BBL的表達(dá)。結(jié)果用2_ΔΔ&1方法分析。使用GAPDH作為參比基因。圖11在㈧至(C)中顯示了如下的圖:結(jié)核菌素pro刺激的㈧具有活動(dòng)結(jié)核病的供體的PBMC，與(B)具有潛伏結(jié)核分枝桿菌感染的供體的PBMC或(C)健康供體的PBMC相比，顯示特異性刺激的PBMC中與未刺激的PBMC相比的4-1BB mRNA產(chǎn)生的相對(duì)誘導(dǎo)增加。將㈧具有活動(dòng)TB的供體、⑶具有潛伏TB的供體、以及(C)未感染結(jié)核分枝桿菌的供體的IxlO6個(gè)新鮮分離的PBMC/ml分別用10 μ g/ml ESAT-6/CFP-10或結(jié)核菌素PI3D刺激，或者作為陽性對(duì)照用I μ g/ml PMA/伊屋諾霉素刺激。在標(biāo)示的時(shí)間點(diǎn)移出0.5xl06個(gè)細(xì)胞并保存在_80°C。從細(xì)胞分離總RNA并轉(zhuǎn)錄成cDNA，并用RT-qPCR定量4-1BBL mRNA的含量。分析根據(jù)2_“CQ方法進(jìn)行，使用GAPDH作為參比基因，用未刺激的對(duì)照作為校準(zhǔn)物。圖12在(A)和⑶中顯示了如下的圖:通過RT-qPCR測定的、在健康志愿者的PBMC中，在(A)中用lyg/ml PMA/伊屋諾霉素，或⑶中用PGE2/α -⑶40刺激后，與未刺激對(duì)照相比4-1BBL mRNA產(chǎn)生的非特異性誘導(dǎo)。將健康志愿者的新鮮分離的PBMC分別與
1μ g/ml PMA/伊屋諾霉素(A)或5 μ g/mL PGE2與2 μ g/mL a -CD40⑶溫育。在標(biāo)示的時(shí)間點(diǎn)移出0.5χ106個(gè)細(xì)胞，離心沉降，并保存在_80°C直至進(jìn)一步使用。從細(xì)胞分離總RNA并轉(zhuǎn)錄成cDNA。然后在RT-qPCR中測定4-1BBL cDNA的量。分析根據(jù)2_Δ Δ&1方法進(jìn)行，使用GAPDH作為參比基因，用未刺激的對(duì)照作為校準(zhǔn)物。圖13顯示了如下的圖:不同的參比基因?qū)νㄟ^RT-qPCR測量的經(jīng)過ESAT-6/CFP-10刺激的共培養(yǎng)物中相對(duì)于未經(jīng)刺激的共培養(yǎng)物4-lBBLmRNA產(chǎn)生的測得的相對(duì)增加的影響；其中所述共培養(yǎng)物是ESAT-6/CFP-10特異性活化T細(xì)胞與具有頑固結(jié)核病的供體的自體PBMC的共培養(yǎng)物。將具有頑固結(jié)核病的供體的新鮮分離的PBMC與預(yù)活化的ESAT-6/CFP-10特異性Th細(xì)胞在存在或不存在10 μ g/ml ESAT-6/CFP-10蛋白質(zhì)的條件下溫育。在標(biāo)示的時(shí)間點(diǎn)移出0.5xl06個(gè)細(xì)胞，離心沉降并保存在-80°C直到進(jìn)一步使用。從細(xì)胞分離總RNA并轉(zhuǎn)錄成cDNA。然后通過RT-qPCR測定4-lBBLcDNA的含量。分析根據(jù)2_ΔΔ&1方法進(jìn)行，使用GAPDH、huPO和PBGD作為參比基因，用未刺激的對(duì)照作為校準(zhǔn)物。圖14顯示用于鑒定對(duì)RTT方法合適的參比基因的實(shí)時(shí)PCR的擴(kuò)增圖。在y軸上，對(duì)于一個(gè)樣品一式三份地示例性展示了 7種潛在的參比基因在4種刺激條件下(未刺激、結(jié)核菌素(PPD)、ESAT6/CFP10、PMA/伊屋諾霉素)的定量循環(huán)(Cq)。放大的部分顯示12個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)中每一個(gè)的刺激條件的序列。在X軸上標(biāo)示了在96孔板上的平板位置。18S:真核18S核糖體RNA; ALAS:氨基乙酰丙酸，delta-，合酶I ;GAPDH:甘油醛_3_磷酸脫氫酶；CTSB:葡糖醛酸糖苷酶，beta ；HMBS:羥甲基膽色烷合酶；HPRT1:次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶I ;1no:伊屋諾霉素；PMA:佛波醇-12-肉豆蘧酸酯-13-乙酸酯；ΡΗ):結(jié)核菌素PH) ；RPLPO:核糖體蛋白質(zhì)，大，PO ;TAF1A:TATA盒結(jié)合蛋白(TBP)-相關(guān)因子，RNA聚合酶I，A，48kDa ；unstim:未刺激的。圖15顯示在活動(dòng)感染或潛伏感染的TB患者、以及接種了 BCG的健康志愿者或未接種BCG的健康志愿者的樣品中在用結(jié)核菌素pro刺激之后與相應(yīng)的未刺激樣品相比，RTT標(biāo)志物基因4-1BBL(又稱TNFSF9)相對(duì)表達(dá)的增加。數(shù)值相對(duì)于參比基因TAFlA(2_ΔΔ&1)標(biāo)準(zhǔn)化。每份樣品5χ106個(gè)PBMC在B細(xì)胞培養(yǎng)基中用10 μ g/ml結(jié)核菌素PH)刺激。活動(dòng):具有活動(dòng)結(jié)核病的患者；潛伏:具有潛伏結(jié)核病的患者；BCG:卡介苗，抗結(jié)核病減毒活疫苗。圖16顯示了不同細(xì)胞培養(yǎng)基對(duì)在用結(jié)核菌素pro刺激之后與未刺激的樣品相比在具有潛伏TB的患者及健康志愿者的PBMC中IFN-Y (又稱IFNG)的表達(dá)信號(hào)的相對(duì)增加(針對(duì)TAFlA標(biāo)準(zhǔn)化)的影響。使用了 B細(xì)胞培養(yǎng)基(BZM+)、無IL-4的B細(xì)胞培養(yǎng)基(BZM-)、無血清 UltraCULTURE 培養(yǎng)基(Ultra) (LONZA)，以及的 AM V 培養(yǎng)基(AMV)(Invitrogen)。圖17顯示了不同的細(xì)胞培養(yǎng)基對(duì)在用結(jié)核菌素pro刺激之后與未刺激的樣品相比在具有潛伏TB的患者以及健康志愿者的PBMC中4-1BBL(又稱TNFSF9)的表達(dá)信號(hào)的相對(duì)增加(針對(duì)TAFlA標(biāo)準(zhǔn)化)的影響。使用了 B細(xì)胞培養(yǎng)基(BZM+)、無IL-4的B細(xì)胞培養(yǎng)基(BZM-)、無血清 UltraCULTURE 培養(yǎng)基(Ultra) (LONZA)，以及 AM V 培養(yǎng)基(AMV)(Invitrogen)。圖18顯示了在三重(triplex) qPCR樣品(左)中，與相應(yīng)的二重(duplex)反應(yīng)(右)相比，對(duì)TNFSF9和IFNG表達(dá)的相對(duì)增加進(jìn)行同時(shí)檢測的結(jié)果(針對(duì)作為參比基因的TAFlA標(biāo)準(zhǔn)化)。Unst.:未刺激的；PH):結(jié)核菌素PPD ；PMA:佛波醇-12-肉豆蘧酸酯_13_乙
酸酯/伊屋諾霉素。圖19顯示在健康志愿者和具有潛伏TB的患者的樣品中用結(jié)核菌素PPC刺激之后與相應(yīng)的未刺激樣品相比基因FCGR1ABC，CXCL9, CXCL10, CXCLll的表達(dá)的相對(duì)增加。實(shí)時(shí)qPCR使用SYBR綠系統(tǒng)進(jìn)行。各基因和個(gè)體分別作圖在x軸上。y軸顯示表達(dá)(2Λ&1)的相對(duì)增加。BCG:卡介苗，抗結(jié)核病減毒活疫苗，CXCL9至11:趨化因子(C-X-C基序)配體9至
11；FCGR1ABC:Fc Y 受體 1A, B, C。在本發(fā)明的語境下，“T細(xì)胞群體”理解為具有特定表型的T細(xì)胞的確定集團(tuán)。依據(jù)本發(fā)明的T細(xì)胞群體尤其是幼稚T細(xì)胞、活化T細(xì)胞、以及記憶T細(xì)胞。在本發(fā)明的語境中術(shù)語“T細(xì)胞”理解為指T淋巴細(xì)胞，諸如分別指⑶4+T細(xì)胞或⑶8+T細(xì)胞、或⑶4+T細(xì)胞和⑶8+T細(xì)胞的混合物。這里，⑶4+T細(xì)胞類群涵蓋T輔助細(xì)胞，諸如T輔助I (Th-1)細(xì)胞、T輔助2 (Th-2)細(xì)胞、T輔助17 (Th-17)細(xì)胞、⑶4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)，、Trl細(xì)胞和T輔助3 (Th_3)細(xì)胞。⑶8+T細(xì)胞類群包括⑶4TD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞和顯示⑶4+CD8+表型的T細(xì)胞(⑶4+⑶8 ,⑶4 ⑶8胃或⑶4htD8hi).
在本發(fā)明的語境中，“幼稚T細(xì)胞”(naive T cell)理解為這樣的T細(xì)胞，其展現(xiàn)特定抗原特異性，但尚未首次接觸其抗原。幼稚T細(xì)胞，如CD4+T細(xì)胞，在其表面上展現(xiàn)例如CD45RA作為其標(biāo)志物。在本發(fā)明的語境中，“活化T細(xì)胞”理解為這樣的T細(xì)胞，其在首次抗原攻擊之前的幼稚狀態(tài)的基礎(chǔ)上藉由通過T細(xì)胞受體的首次抗原接觸而被刺激。T細(xì)胞受體識(shí)別MHC分子上呈遞的肽,導(dǎo)致所謂的T細(xì)胞受體交聯(lián)(Crosslinking)。T細(xì)胞活化的另一個(gè)先決條件是第二種信號(hào)，該信號(hào)由共刺激分子與它們在APC上以及T細(xì)胞上的配體之間的相互作用所介導(dǎo)。這種活化導(dǎo)致T細(xì)胞內(nèi)部的信號(hào)級(jí)聯(lián)，最終導(dǎo)致增殖以及各種效應(yīng)物功能的發(fā)生。此外，活化的T細(xì)胞以瞬時(shí)表達(dá)⑶40配體、4-1BB、⑶69和/或⑶25等特征性表面分子為特征。幼稚T細(xì)胞在與專職性抗原呈遞細(xì)胞表面上的抗原初次接觸后向活化T細(xì)胞的活化又被稱為“初始化”(priming)。術(shù)語“活化T細(xì)胞”與術(shù)語“效應(yīng)物T細(xì)胞”同義，還包括通過與其抗原重新接觸而在體內(nèi)被特異性再活化的記憶T細(xì)胞。在本發(fā)明的語境中，“記憶T細(xì)胞”理解為這樣的T細(xì)胞，其已經(jīng)有過特異性抗原接觸。記憶T細(xì)胞以特殊的表面標(biāo)記物如⑶45R0、⑶44和L-選擇蛋白為特征。在本發(fā)明的語境中，術(shù)語“抗原呈遞細(xì)胞”(APC)理解為指能夠攝取多肽，對(duì)它們進(jìn)行加工，并將所述多肽的片段(所謂的表位)與MHC I和MHC II蛋白組合呈遞給免疫系統(tǒng)。術(shù)語“抗原呈遞細(xì)胞”尤其包含所謂的專職抗原呈遞細(xì)胞，諸如樹突細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、非專職APC，諸如B細(xì)胞，還有血管內(nèi)皮細(xì)胞、皮膚的成纖維細(xì)胞、胸腺或者甲狀腺的上皮細(xì)胞，腦的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、胰腺的β細(xì)胞，以及血管內(nèi)皮細(xì)胞。非專職性APC只有在被細(xì)胞因子如IFN- Y活化之后才表達(dá)與T細(xì)胞相互作用所必需的I類和II類MHC分子。此外，T細(xì)胞也可充當(dāng)APC。這些APC T細(xì)胞是由于與APC，尤其是樹突細(xì)胞(DC)接觸，MHCI類和II類分子以及共刺激分子例如CD80，CD40配體(CD40L)，0X40配體(0X40L)和4-1ΒΒ配體(4-1BBL，TNFSF9)發(fā)生細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移而產(chǎn)生的。在本發(fā)明的語境下，“APC的標(biāo)志物”和“Τ細(xì)胞的標(biāo)志物”分別理解為RNA或DNA，或者核酸片段。此外，“APC的標(biāo)志物”和“Τ細(xì)胞的標(biāo)志物”分別還理解為肽、寡肽、或蛋白質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明，考慮活化的T細(xì)胞特異性識(shí)別APC上與MHC分子形成復(fù)合物的抗原后，APC中標(biāo)志物的表達(dá)可檢測地增加或減少。因此，根據(jù)本發(fā)明，考慮APC的標(biāo)志物被活化T細(xì)胞的抗原特異性相互作用所誘導(dǎo)，并變得能夠被檢測和定量。在本發(fā)明的語境中，標(biāo)志物的“誘導(dǎo)”理解為該標(biāo)志物的表達(dá)的變化。當(dāng)標(biāo)志物是核酸時(shí)，“誘導(dǎo)”根據(jù)本發(fā)明理解為例如基因的mRNA的產(chǎn)生增加或減少。此外，“誘導(dǎo)”根據(jù)本發(fā)明理解為基因的調(diào)節(jié)，例如通過甲基化的調(diào)節(jié)。此外，在本發(fā)明的語境中“被誘導(dǎo)”理解為蛋白質(zhì)的表達(dá)增加或減少。此處，蛋白質(zhì)的表達(dá)可以發(fā)生在細(xì)胞上以及細(xì)胞中，即胞內(nèi)。在本發(fā)明的語境中“抗原”特別理解為蛋白質(zhì)、多肽或肽?？乖绕涫沁@樣的多肽序列，其被APC攝取、加工，且其片段(即所謂的表位)，在MHC分子上被呈遞給T細(xì)胞。抗原尤其還是這樣的肽，其與MHC —起被呈遞給T細(xì)胞。此外，抗原理解為編碼多肽的表達(dá)質(zhì)粒、DNA、或 RNA。
如本文所用的術(shù)語“表達(dá)質(zhì)?！被颉氨磉_(dá)載體”是指人工創(chuàng)建的用于在細(xì)胞中導(dǎo)入并表達(dá)核酸的構(gòu)建體。表達(dá)載體為例如細(xì)菌質(zhì)粒和MIDGES，源自病毒的質(zhì)粒，噬菌粒、粘粒、細(xì)菌噬菌體、或人工產(chǎn)生的核酸諸如人工染色體。載體還可以還有一種或多種選擇標(biāo)記。在本發(fā)明的語境中術(shù)語“多肽”理解為氨基酸的任何長度的聚合物。短語“多肽”還包括下列術(shù)語:靶表位、表位、肽、寡肽、蛋白質(zhì)、多聚蛋白質(zhì)、以及多肽的聚集物。此外，表述“多肽”還涵蓋這樣的多肽，其展現(xiàn)翻譯后修飾諸如糖基化、乙酰化、磷酸化、氨基乙?；⒁约邦愃频男揎?。此外，表達(dá)“多肽”理解為還指這樣的多肽，其展示一種或多種氨基酸類似物，例如非天然氨基酸；具有替代的鍵連以及其他本領(lǐng)域已知的修飾的多肽，無論其是否為天然存在的或來自非天然來源的。如本文所用的術(shù)語“表位”指多肽的一部分，其展現(xiàn)抗原性性質(zhì)，并且例如充當(dāng)T細(xì)胞或免疫球蛋白的識(shí)別位點(diǎn)。根據(jù)本發(fā)明，表位是例如多肽的被免疫細(xì)胞識(shí)別的那些部分，所述的免疫細(xì)胞諸如例如CD4+T輔助細(xì)胞、CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞、CD4+CD8 細(xì)胞毒性T細(xì)胞、⑶56+CD8+以及⑶56XD57+⑶8+NKT細(xì)胞或⑶4+⑶25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。表位可包含3個(gè)或更多個(gè)氨基酸。通常，表位由至少5-7個(gè)氨基酸組成，或者，更常見的是，由8-11個(gè)氨基酸組成，或由多于11個(gè)氨基酸組成，或由多于20個(gè)氨基酸組成，較少見的是甚至由多于30個(gè)氨基酸組成。在本發(fā)明的語境中“逆轉(zhuǎn)錄定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，RT-qPCR”理解為這樣的方法，其基于常規(guī)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。此外，RT-qPCR除了允許擴(kuò)增之外，還允許對(duì)靶mRNA的定量。為此目的，從與抗原溫育過的要檢查的材料分離總RNA，并且作為比較從未經(jīng)刺激的材料或者與無關(guān)的抗原溫育的材料分離總RNA，然后在后續(xù)的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中將總RNA轉(zhuǎn)錄成cDNA。然后在qPCR中通過使用特異性引物將靶序列擴(kuò)增。對(duì)于靶序列的定量可以使用數(shù)種方法。最簡單的定量方法是使用插層熒光染料，例如SYBR綠或EVA綠。這些染料自行插入到特定產(chǎn)物的延伸過程中產(chǎn)生的雙鏈DNA分子中。檢測總是在延伸結(jié)束時(shí)通過檢測熒光染料激發(fā)后的發(fā)射光來進(jìn)行。隨著PCR產(chǎn)物量的增加更多的染料被摻入，從而熒光信號(hào)增加。定量的另一種可能性是使用序列特異性探針。有水解(TaqMan)或雜交(Light-Cycler)探針。水解探針在5’末端標(biāo)記有熒光染料，在3’末端標(biāo)記有所謂的淬滅物。由于在空間上與報(bào)道染料接近，淬滅物導(dǎo)致熒光信號(hào)的淬滅，并且在延伸期中在互補(bǔ)DNA的合成過程中被切去。一旦在延伸結(jié)束時(shí)用光源激發(fā)熒光染料，則釋放特定波長的光，該光可以被檢測。雜交探針系統(tǒng)由兩個(gè)探針組成，這兩個(gè)探針彼此相鄰地結(jié)合靶序列。兩個(gè)探針均用熒光染料標(biāo)記。用光源激發(fā)第一探針的5’末端的第一熒光染料。然后發(fā)出的光通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)被轉(zhuǎn)移給第二探針的3’末端的第二熒光染料。由此染料被激發(fā)，從而發(fā)射出特定波長的光，該光可以被檢測。如果在靶序列的互補(bǔ)鏈的延伸過程中第一探針被聚合酶所降解，F(xiàn)RET不再會(huì)發(fā)生，然后熒光信號(hào)減少。與前述的方法相對(duì)照的是，這里定量總是發(fā)生在延伸過程的開始。經(jīng)常使用的熒光染料是例如Fluophorl，F(xiàn)luorphor2，氨基香豆素，氟化熒光素，Cy3，Cy5，銪，鋱，B0DIPY，丹磺酰，萘(naphtalene)，釕，四甲基羅丹明，6_羧基熒光素出-FAM)，VIC，YAK，羅丹明和德克薩斯紅(Texas Red)。經(jīng)常使用的淬滅物為例如TAMRA , 6-羧基四甲基羅丹明，甲基紅，或黑暗淬滅劑(dark quencher)。術(shù)語“實(shí)時(shí)”是指在PCR的每個(gè)循環(huán)中，即在“實(shí)時(shí)”中的具體測量。所謂的靶序列的增加在此與熒光在循環(huán)與循環(huán)之間的增加相關(guān)。在一次運(yùn)行(通常由數(shù)個(gè)循環(huán)組成)結(jié)束時(shí)，然后在PCR的指數(shù)期基于所得的熒光信號(hào)進(jìn)行定量。這里，擴(kuò)增的測量通常通過Cq(定量循環(huán))值來完成，Cq值描述突光第一次上升到顯著高于背景突光的循環(huán)。一方面測定靶核酸的Cq值，一方面測定參比核酸的Cq值。這樣就可能確定靶序列的絕對(duì)或相對(duì)拷貝數(shù)。在本發(fā)明的語境中，表達(dá)參比基因可以理解為mRNA水平上，以及基因組DNA水平上的序列。這些也可以是在依照本發(fā)明的刺激條件下非轉(zhuǎn)錄活性的，或者它們對(duì)應(yīng)于基因組的非編碼DNA區(qū)域。根據(jù)本發(fā)明，參比基因也可以是添加到靶基因樣品的DNA或RNA。參比基因的最高標(biāo)準(zhǔn)是其在刺激過程中不被改變，也不被本發(fā)明方法的條件改變。因此可以將實(shí)驗(yàn)結(jié)果相對(duì)于不同樣品中使用的模板的量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。因此參比基因容許確定靶基因的相對(duì)表達(dá)。參比基因的實(shí)例有甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、huP0 (人酸性蛋白O)、膽色素原脫氨酶(PBGD)、β-肌動(dòng)蛋白、或微管蛋白。在本發(fā)明的一個(gè)目的中設(shè)想提供一種檢測、區(qū)分和定量T細(xì)胞群體的方法，包括下述步驟:a)使第一等份的個(gè)體體液與至少一種抗原接觸，其中所述體液含有抗原呈遞細(xì)胞(APC)和T細(xì)胞，b)將所述第一等份與所述至少一種抗原溫育一段確定的時(shí)間，c)通過利用逆轉(zhuǎn)錄定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR)檢測所述第一等份中以及未與所述至少一種抗原溫育過的第二等份的個(gè)體體液中由特定T細(xì)胞群體中的T細(xì)胞誘導(dǎo)的至少第一種APC標(biāo)志物來檢測和區(qū)分T細(xì)胞群體，和d)通過確定檢測到的第一等份的APC標(biāo)志物與第二等份的比例來檢測和定量T細(xì)胞群體。根據(jù)本發(fā)明，因此設(shè)想對(duì)特定T細(xì)胞群體的T細(xì)胞的檢測、區(qū)分和定量是通過利用RT-qPCR來檢測和相對(duì)定量未經(jīng)刺激的和/或未經(jīng)特異性刺激的以及經(jīng)特異性刺激的細(xì)胞培養(yǎng)物樣品的至少一種APC標(biāo)志物而實(shí)施的。本發(fā)明的方法設(shè)想，檢測和定量之所以可能，特別是因?yàn)榛罨腡細(xì)胞通過反饋機(jī)制而對(duì)抗原呈遞細(xì)胞(APC)的成熟起貢獻(xiàn)。在本發(fā)明的語境中，這種反饋機(jī)制也成為逆向T細(xì)胞技術(shù)(reverse T cell technology (RTT))。由此，抗原特異性的活化T細(xì)胞，尤其是T輔助細(xì)胞，通過藉由TCR識(shí)別加載有肽的MHC分子且同時(shí)T細(xì)胞與APC進(jìn)一步相互作用的介導(dǎo)，誘導(dǎo)例如(但不限于)下述的活化:多種作為APC標(biāo)志物的基因的啟動(dòng)子，mRNA分子的增加的產(chǎn)生，以及這些標(biāo)志物蛋白質(zhì)的增加的表達(dá)。由于這些成熟過程，APC獲得增加的刺激病原體特異性或疾病特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞以及低親和力T輔助細(xì)胞的能力。因此根據(jù)本發(fā)明考慮特異性T細(xì)胞群體的T細(xì)胞，諸如活化T細(xì)胞的檢測可以通過藉由APC標(biāo)志物的間接檢測來進(jìn)行。不拘于任何理論，根據(jù)本發(fā)明考慮，由于APC與抗原的溫育，APC在其表面上將該抗原的片段與MHC II類或I類分子一起呈遞給活化T細(xì)胞。由此發(fā)生活化T細(xì)胞對(duì)呈遞有抗原的APC的結(jié)合。由于這種特異性的T細(xì)胞-APC相互作用，APC受到特異性刺激。作為這種特異性刺激的結(jié)果，APC中發(fā)生標(biāo)志物的誘導(dǎo)。通過逆轉(zhuǎn)錄定量PCR (RT-qPCR)測定經(jīng)過特異性刺激的APC中的標(biāo)志物，容許對(duì)以特異性T細(xì)胞群體形式存在的活化T細(xì)胞的檢測、區(qū)分和定量。
本發(fā)明的方法容許對(duì)特異性T細(xì)胞群體的T細(xì)胞的(諸如幼稚T細(xì)胞、活化T細(xì)胞或記憶T細(xì)胞)的靈敏、可靠的檢測。該方法的靈敏度尤其是由于這樣的事實(shí)，即T細(xì)胞在APC中誘發(fā)以多數(shù)mRNA拷貝等形式存在的標(biāo)志物的刺激。此外，有討論稱有可能更大數(shù)目的APC被T細(xì)胞刺激，從而T細(xì)胞從一個(gè)APC “跳躍”到另一個(gè)?？偟恼f來這導(dǎo)致信號(hào)增強(qiáng)，從而增強(qiáng)本發(fā)明方法的靈敏度。因此本發(fā)明的方法使得特異性T細(xì)胞群體的檢測和區(qū)分成為可能，并從而尤其容許將活化T細(xì)胞與記憶T細(xì)胞區(qū)別。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所收集的實(shí)時(shí)PCR數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化使用固定的參比值來進(jìn)行，該參比值不受實(shí)驗(yàn)條件的影響，以實(shí)現(xiàn)精確的基因表達(dá)定量。為此目的，還測量參比基因的表達(dá)以便實(shí)施數(shù)量的相對(duì)比較。根據(jù)本發(fā)明，設(shè)想為了測定APC的標(biāo)志物，提供第一等份和第二等份的個(gè)體體液。在本發(fā)明的語境中，“提供”理解為暗示某一等份的體液已經(jīng)存在于容器中。根據(jù)本發(fā)明，“提供”也可以意味著等份的體液是從患者直接提供的，例如通過采取血樣。本發(fā)明的方法設(shè)想用至少一種抗原刺激所述第一等份，而第二等份保持為未刺激的。因此總的來說，設(shè)想第一等份和第二等份除了與抗原接觸之外是相同的。因此，所述第二未刺激的等份充當(dāng)某種校準(zhǔn)物。定量因此相對(duì)于校準(zhǔn)物進(jìn)行。對(duì)于標(biāo)志物的測定和定量，設(shè)想用第一經(jīng)刺激的等份中的標(biāo)志物的量除以第二未刺激的等份中的標(biāo)志物的量。因此檢出第一刺激等份中的標(biāo)志物的量相對(duì)于校準(zhǔn)物(即第二未刺激的等份)的η-倍差異。本發(fā)明的方法是完全在離體狀態(tài)下實(shí)施的方法。本發(fā)明的方法相對(duì)于已知可用方法的優(yōu)勢之處是容許以更高的靈敏度、速度、以及實(shí)驗(yàn)過程的可靠性來檢測活化的T輔助細(xì)胞。此外，本發(fā)明的方法尤其容許區(qū)別以及鑒別測定活化的T細(xì)胞與記憶T細(xì)胞。在活動(dòng)的微生物感染期間，并且特別是在自身免疫疾病和腫瘤疾病的過程中可靠地檢測活化T細(xì)胞的顯著困難之一是由于循環(huán)中存在的疾病和病原體特異性活化T細(xì)胞的數(shù)目非常低。T細(xì)胞通過在淋巴器官中與加載有抗原的APC接觸而被活化，增殖并然后通過血液或淋巴遷移到感染或疾病的部位，它們通常留在該部位并發(fā)揮它們的效應(yīng)物功能。本發(fā)明基于T細(xì)胞可誘導(dǎo)性組分的檢測；Τ細(xì)胞可誘導(dǎo)性組分諸如這樣的RNA分子或蛋白質(zhì):在與活化T細(xì)胞的抗原特異性接觸后它們在APC中的產(chǎn)生發(fā)生可測量的調(diào)節(jié)，即增加、減少或調(diào)整。APC或含APC的培養(yǎng)物中T細(xì)胞誘導(dǎo)的成熟過程的測定通過先前已知的方法進(jìn)行，使用多種蛋白檢測方法，如FACS、ELISpot或ELISA檢測用表達(dá)載體特異性刺激過的細(xì)胞培養(yǎng)物中以蛋白質(zhì)的形式存在的標(biāo)志物。然而發(fā)現(xiàn)這些方法對(duì)于診斷應(yīng)用中對(duì)活化T細(xì)胞的可靠檢測而言適用性有限或者不適用。已知T細(xì)胞可誘導(dǎo)性標(biāo)志物分子在許多不同疾病和微生物感染中在不同的細(xì)胞群體中表達(dá)，因此，要檢查的受試者或患者個(gè)體展現(xiàn)有時(shí)差異強(qiáng)烈、并且在某種程度上說已經(jīng)非常高的這些標(biāo)志物蛋白的基礎(chǔ)表達(dá)水平。此外，APC經(jīng)常已經(jīng)含有較大量的預(yù)先形成的，即已經(jīng)表達(dá)的標(biāo)志物分子，它們的存在與活化T輔助細(xì)胞的抗原特異性刺激無關(guān)。此夕卜，活化的T輔助細(xì)胞通常僅分別刺激一個(gè)(one)或少數(shù)個(gè)APC，其中在細(xì)胞水平上僅能實(shí)現(xiàn)有限的靈敏度增加。由于這些已知的情況，迄今為止人們推測，通過在蛋白質(zhì)水平上檢測活化T細(xì)胞所刺激的APC中的特異性標(biāo)志物來可靠地測定活化T細(xì)胞是不可能在診斷上可靠的規(guī)模上實(shí)現(xiàn)的。令人驚訝的是，可顯示本發(fā)明的方法能夠通過測定例如作為APC中的標(biāo)志物的mRNA分子的T細(xì)胞誘導(dǎo)的產(chǎn)生來實(shí)施。由于前述的關(guān)于特定標(biāo)志物分子的差異表達(dá)的困難，本發(fā)明的在RNA水平上對(duì)APC的標(biāo)志物的檢測容許對(duì)抗原特異性活化T細(xì)胞的可靠且靈敏的測定必須視為是預(yù)料不到的。例如，活化T細(xì)胞與APC的接觸誘導(dǎo)非常高量的mRNA分子的產(chǎn)生，這導(dǎo)致標(biāo)志物的強(qiáng)烈擴(kuò)增，從而導(dǎo)致本發(fā)明的方法的靈敏度顯著增加。然而，迄今為止對(duì)于使用APC中的T細(xì)胞可誘導(dǎo)標(biāo)志物，例如mRNA分子的產(chǎn)生，作為手段來檢測活化的抗原特異性T細(xì)胞作為活動(dòng)疾病事件的標(biāo)志存在根本性的技術(shù)偏見。這些技術(shù)偏見特別是基于這樣的事實(shí)，即APC中的特異性標(biāo)志物在個(gè)體之間顯示波動(dòng)性非常大的基礎(chǔ)表達(dá)。然而，為了確定對(duì)于有意義的測試結(jié)果而言可靠的閾值水平，對(duì)這些波動(dòng)進(jìn)行補(bǔ)償是必不可少的。這些技術(shù)偏見在本發(fā)明的方法中得以克服，尤其是通過下述手段:通過檢測用至少一種抗原刺激的第一等份的個(gè)體體液和未經(jīng)刺激的第二等份的個(gè)體體液中的APC標(biāo)志物，并確定所述第一等份相對(duì)第二等份的比例，檢測標(biāo)志物表達(dá)的相對(duì)增加。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中設(shè)想一種方法，其中在步驟c)中額外地在所述第一和第二等份中檢測至少第二種標(biāo)志物，其中所述第二種標(biāo)志物是T細(xì)胞本身的被誘導(dǎo)的標(biāo)志物，并且步驟d)包括通過確定所述第一等份中檢測到的所述第一種APC標(biāo)志物及第二種T細(xì)胞標(biāo)志物相對(duì)于第二等份的比來檢測和定量T細(xì)胞群體。根據(jù)本發(fā)明，設(shè)想對(duì)于這種方法，將幼稚T細(xì)胞、活化T細(xì)胞和記憶T細(xì)胞區(qū)分為個(gè)別的T細(xì)胞群體成為可能。由此本發(fā)明提供了在特定的疾病中進(jìn)行鑒別診斷的可能性。例如，對(duì)于結(jié)核性疾病，有可能通過這種鑒別診斷將具有活動(dòng)的疾病并同時(shí)需要治療的患者、具有潛伏感染而無特別的治療需要的患者、以及健康個(gè)體區(qū)分開來。這種鑒別診斷通過檢測第一種和第二種標(biāo)志物而得以實(shí)現(xiàn)。這里，第一種標(biāo)志物是APC的T細(xì)胞誘導(dǎo)的標(biāo)志物。這種標(biāo)志物只有在活動(dòng)的疾病事件過程中才被誘導(dǎo)。第二種標(biāo)志物是T細(xì)胞自身的標(biāo)志物。該第二種標(biāo)志物是在方法樣品中的活化和記憶T細(xì)胞的存在下形成的。在本發(fā)明的又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中設(shè)想一種方法，其中所述方法在步驟a)中進(jìn)一步包含步驟a’)使所述第二等份接觸至少一種抗原，并且在步驟b)中還包含步驟b’)將所述第二等份與抗原溫育一段確定的時(shí)間，其中步驟b’)中的這段時(shí)間與步驟b)中的這段時(shí)間不同；此外，包含步驟c’ )通過RT-qPCR檢測第一和第二等份中的第一種標(biāo)志物來檢測和區(qū)分T細(xì)胞群體，以取代步驟c)；以及步驟d)。在本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，設(shè)想步驟b’)中溫育的時(shí)間段是O分鐘。在本發(fā)明的另一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中所述時(shí)間段是O至60分鐘，更優(yōu)選O至45分鐘，更優(yōu)選O至30分鐘，更優(yōu)選O至20分鐘，更優(yōu)選O至15分鐘，更優(yōu)選O至10分鐘，特別優(yōu)選O至5分鐘。根據(jù)本發(fā)明，設(shè)想所述第二等份與抗原接觸的時(shí)間段與所述第一等份的溫育的時(shí)間段相比顯著更短，乃至所謂的“零樣品”，即持續(xù)時(shí)間為O分鐘。因此，設(shè)想在所述第二等份的溫育期間內(nèi)尚未有標(biāo)志物形成，或者到那時(shí)為止只有非常低量的標(biāo)志物存在。根據(jù)本發(fā)明尤其設(shè)想步驟b’)中的時(shí)間顯著短于步驟b)中的時(shí)間。由此，根據(jù)本發(fā)明，步驟b’ )中第二等份與抗原的溫育僅在數(shù)秒乃至持續(xù)O分鐘的時(shí)間段的范圍內(nèi)發(fā)生，或者至少發(fā)生的時(shí)間不長。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，設(shè)想所述第二等份在步驟a’ )中與無關(guān)抗原接觸，并在步驟b’)中與無關(guān)抗原溫育。根據(jù)本發(fā)明，無關(guān)抗原理解為這樣的抗原:個(gè)體不具有針對(duì)該抗原的活化或記憶T細(xì)胞。這樣的無關(guān)抗原可以是例如白蛋白或者HIV血清陰性人體中的HIV蛋白。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中設(shè)想一種方法，其中步驟c’ )包括通過檢測所述第一種標(biāo)志物和第二種標(biāo)志物來檢測和區(qū)分T細(xì)胞群體。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中設(shè)想一種方法，其中將所述體液的等份分離成僅含APC的等份A和含有T細(xì)胞的等份B，且其中步驟a)包括步驟al)使等份A接觸至少一種抗原，以及后續(xù)的步驟a2)使接觸過所述至少一種抗原的所述等份A接觸等份B。根據(jù)本發(fā)明，考慮在添加T細(xì)胞之前首先用抗原加載APC。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選設(shè)想含有T細(xì)胞的等份B還含有未加載的APC，即未有在先抗原接觸的APC。根據(jù)本發(fā)明，設(shè)想T細(xì)胞群體含有幼稚T細(xì)胞、活化T細(xì)胞或記憶T細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，設(shè)想T細(xì)胞群體的T細(xì)胞是CD4+T細(xì)胞，尤其是Th-1細(xì)胞，Th-2細(xì)胞，Th-17細(xì)胞，⑶4+⑶25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，Th_3細(xì)胞，⑶8+T細(xì)胞，尤其是⑶4TD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞，⑶4+CD8+T細(xì)胞，⑶161+NKT細(xì)胞和/或多種T細(xì)胞的混合物。根據(jù)本發(fā)明還優(yōu)選設(shè)想所述體液是血液，腦脊液，淋巴、心包液、支氣管灌洗液、骨髓抽吸物、淋巴組織懸液或純化的PBMC群體。在本發(fā)明的語境中，“淋巴組織”理解為淋巴結(jié)、脾、扁桃體、以及胃腸道粘膜的淋巴組織，例如派伊爾氏淋巴結(jié)，呼吸器官以及尿道的淋巴組織。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，設(shè)想所述體液還包含另一分別的(Separated)APC群體。此外，根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選以所謂的棕黃層作為體液。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，設(shè)想所述抗原是肽、寡肽、多肽、蛋白質(zhì)、RNA 或 DNA。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗原是表達(dá)質(zhì)粒。根據(jù)本發(fā)明，還優(yōu)選抗原是寡肽、多肽、蛋白質(zhì)、RNA或DNA的片段、切割產(chǎn)物或碎片。根據(jù)本發(fā)明，設(shè)想抗體優(yōu)選為來自細(xì)菌、病毒、植物、動(dòng)物、真菌或寄生物的抗原。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，設(shè)想抗原是下述的多肽:巨細(xì)胞病毒(CMV)、埃巴二氏病毒(EBV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、細(xì)小病毒B19、水痘帶狀皰疹病毒(VZV)、痘苗病毒、腺病毒、JC-和BK-病毒、甲、乙、丙型流感病毒、結(jié)核分枝桿菌、疏螺旋體屬、弓形蟲(Toxoplasma gondii)或曲霉(aspergilli)、或腫瘤或自身抗原。根據(jù)本發(fā)明，抗原優(yōu)選是來自具有對(duì)人致病的性質(zhì)的病毒的抗原。下面給出了此類抗原的依照本發(fā)明的實(shí)例。該列表在本發(fā)明的語境中不應(yīng)視為限制性的，而應(yīng)該僅視為實(shí)例。脊髓灰質(zhì)炎病毒、柯薩奇病毒、埃可病毒、腸病毒、鼻病毒、正粘病毒，尤其是甲、乙、丙型流感病毒，副粘病毒，尤其是副流感病毒，腮腺炎病毒，麻疹病毒，呼吸道合胞病毒(RS-病毒)，冠狀病毒屬，黃病毒，尤其是黃熱病病毒、登革熱病毒、日本乙型腦炎病毒、蜱傳腦炎(TBE)病毒、丙型肝炎病毒(HCV)、披膜病毒類，尤其是α-病毒和風(fēng)疹病毒、布尼亞病毒類，尤其是布尼亞病毒、漢坦病毒、尼羅河病毒、白蛉病毒屬、和番爺斑萎病毒屬，generaviruses,風(fēng)疹病毒、狂犬病毒、沙粒病毒，尤其是淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒(LCMV)和拉沙熱病毒、胃腸炎病毒，尤其是輪狀病毒、腺病毒、嵌杯樣病毒屬、星狀病毒、冠狀病毒屬、逆轉(zhuǎn)錄病毒，尤其是甲型、乙型、丙型和丁型逆轉(zhuǎn)錄病毒，慢病毒，尤其是人免疫缺陷病毒I型(HIV-1)和2型(HIV-2)，猿免疫缺陷病毒(SIV)，貓免疫缺陷病毒(FIV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)，泡沫病毒、人T細(xì)胞白血病病毒I型(HTLV-1)和2型(HTLV-2)、細(xì)小病毒，尤其是細(xì)小病毒B19和腺伴隨病毒(AAV)，乳多空病毒，尤其是乳頭瘤病毒屬、進(jìn)行性多灶性白質(zhì)腦病(PML)的病毒，BK-病毒，腺病毒，皰疹病毒，尤其是單純皰疹病毒I型(HSV-1)和-2型(HSV-2)，水痘帶狀皰疹病毒(VZV)、巨細(xì)胞病毒(CMV)和埃巴二氏病毒(EBV)，人類皰疹病毒6、7和8(HHV6、7和8)，肝炎病毒，尤其是甲型肝炎病毒(HAV)，乙型肝炎病毒(HBV)，丙型肝炎病毒(HCV)，丁型肝炎病毒(HDV)，戊型肝炎病毒(HEV)，和庚型肝炎病毒(HGV)，以及輸血轉(zhuǎn)染的病毒(TTV)和痘病毒，尤其是正痘病毒屬，諸如人痘病毒，痘苗病毒，牛痘病毒，和副痘病毒。此外，多肽可以源自少見病、亞急性病或慢性病的病毒病原體，尤其是馬爾堡病毒和埃博拉病毒，以及博爾納病毒屬。根據(jù)本發(fā)明，所述抗原特別優(yōu)選是人免疫缺陷病毒(HIV)的多肽，例如gpl20, gpl60,pl7,p24, Pr55gag,聚合酶(Pol),逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)和 nef。此外，根據(jù)本發(fā)明所述抗原特別優(yōu)選為埃巴二氏病毒(EBV)的多肽，諸如EBNA1、EBNA2、EBNA3A、EBNA3B(EBNA4)、EBNA3C(EBNA-6)BZLF1、BMLF1、BMRF1、BHRF1、BARFO、BRLF1、BI，LF4、gp85、gpll0、gp220/350、VCA pl50、EBNA_LB、LMPl 和 LMP2 (例如編集于 Khanna etal.(2000)、Annu.Rev> Microbiol.54:19-48 中)。此外，根據(jù)本發(fā)明所述抗原特別優(yōu)選為巨細(xì)胞病毒(CMV)的多肽，諸如UL123 (IEl)、UL122 (IE-2)、UL83 (pp65)、UL82、HL99、UL28、UL33、UL37、US3、UL94、UL16、UL55(gB)、UL85、UL25、US18、UL45 和 UL32(ppl50)(例如編集于 Crough et al.(2009)ClinMicrobiol Rev.22:76-98 中的)。此外，根據(jù)本發(fā)明，所述抗原特別優(yōu)選為水痘帶狀皰疹病毒(VZV)的多肽，諸如ORFl, 0RF4, 0RF10, ORF14, 0RF29, 0RF62 和 0RF68(gE)。此外，根據(jù)本發(fā)明，所述抗原特別優(yōu)選為乙肝病毒的多肽，諸如HBsAg和HBcAg。此外，根據(jù)本發(fā)明，所述抗原特別優(yōu)選為腺病毒的多肽，諸如AdV5六位體蛋白質(zhì)。此外，根據(jù)本發(fā)明，所述抗原優(yōu)選為如下表所列的對(duì)動(dòng)物致病的抗原。該列表在本發(fā)明的語境中不應(yīng)視為限制性的，而應(yīng)視為僅為示例。馬麻疹病毒(EMP)，小RNA病毒，尤其是腸病毒，口瘡病毒及口蹄疫(FMD)的病原體，水泡性口炎病毒，副粘病毒，尤其是麻疹病毒，禽副粘病毒，痘病毒，尤其是山羊痘病毒屬，布尼亞病毒，呼腸孤病毒，尤其是環(huán)狀病毒屬，黃病毒，尤其是痕病毒(pestiviruses),正粘病毒，尤其是甲型流感病毒，皰疫病毒，尤其是α皰疹病毒，狂犬病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒，尤其是慢病毒和C型逆轉(zhuǎn)錄病毒，披膜病毒類，彈狀病毒，雙RNA病毒,冠狀病毒,和嵌杯樣病毒屬。例如，國際病毒分類學(xué)委員會(huì)(InternationalCommittee on TaxonomyofViruses (ICTV))編集上當(dāng)前描述的病毒的綜合列表，該列表可以通過互聯(lián)網(wǎng)訪問(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi mode=Undef&name=Viruses&lfl=3&srchmode=l&keep=l&unlock)。
此外，根據(jù)本發(fā)明，所述抗原優(yōu)選是細(xì)菌的抗原。根據(jù)本發(fā)明，特別優(yōu)選的是人致病性細(xì)菌的抗原。下面列出了依照本發(fā)明的此類細(xì)菌的例子。該列表在本發(fā)明的語境中不應(yīng)視為限制性的，而應(yīng)視為僅為示例。葡萄球菌屬、鏈球菌屬、腸球菌屬、奈瑟氏菌屬、腸桿菌科，尤其是大腸桿菌(E.coli)，包括對(duì)嬰兒致病的大腸桿菌菌株(EPEC)，腸聚集性大腸桿菌菌株(EAggEC),克雷伯氏菌屬，腸桿菌屬，沙雷氏菌屬，變形桿菌屬，朽1檬酸桿菌屬和傷寒沙門氏菌(typhoid Salmonella)、腸炎沙門氏菌(Enteritis Salmonella)、志賀氏菌屬，耶爾森氏菌屬，弧菌屬，尤其是霍亂弧菌和愛爾托弧菌(Vibrio ElTor)，假單胞菌屬，伯克霍爾德氏菌屬，Stenotrophomas,不動(dòng)桿菌屬,彎曲桿菌屬，螺桿菌屬，尤其是幽門螺桿菌，嗜血桿菌屬，博德特氏菌屬，軍團(tuán)菌屬，利斯特氏菌屬，布魯氏菌屬，弗朗西絲氏菌屬，丹毒絲菌屬，棒狀桿菌屬，芽孢桿菌屬，梭菌屬，擬桿菌屬，普雷沃氏菌屬，卟啉單胞菌屬，棱桿菌屬，厭氧螺菌屬，棍狀 厭氧菌屬，厭氧弧菌屬，丁酸弧菌屬，蜈蟻菌屬(Centripedia),脫硫單胞菌屬，偶蹄形菌屬，絲狀桿菌屬，纖毛菌屬(Leprotricha),巨單胞菌屬，光崗菌屬，立克菌屬，塞巴魯?shù)戮鷮?，月單胞菌屬，琥珀酸弧菌屬，琥珀酸單胞菌屬，替策氏菌屬，分枝桿菌屬，尤其是結(jié)核分枝桿菌，非典型分枝桿菌(MOTT)和麻風(fēng)分枝桿菌，諾卡氏菌屬，密螺旋體屬，尤其是蒼白密螺旋體和品他病密螺旋體，疏螺旋體屬，尤其是廣義博氏疏螺旋體，嘎氏疏螺旋體，阿氏疏螺旋體，B.valaisiana, B.1usitaniae和B.spielmani/A14S和回歸熱疏螺旋體，鉤端螺旋體屬，立克次氏體屬，柯克斯氏體屬，埃里希氏體屬，巴爾通氏體屬，支原體屬，尤其是肺炎支原體和人型支原體，脲原體屬，放線菌(Actinomyceta),衣原體屬。此外，根據(jù)本發(fā)明，所述抗原可優(yōu)選源自其他醫(yī)學(xué)上相關(guān)的細(xì)菌，諸如Tropheryma，巴斯德菌屬，布蘭漢氏球菌屬，鏈桿菌屬，螺菌屬，和加德納菌屬。此外，根據(jù)本發(fā)明，所述抗原更優(yōu)選為結(jié)核分枝桿菌的多肽，諸如CFP-10, ESAT-6, TB7.7，TB37.6和MPT63或多肽混合物，例如結(jié)核菌素PPD。此外，根據(jù)本發(fā)明，所述抗原特別優(yōu)選為疏螺旋體屬物種的多肽，諸如VlsE、p58 (OppA-2)、BBK32、pl4、p20(BBQ03)、p21_24 (OspC)、p37_38 (FlaA)、p41 (Flagellin、FlaB)、pl9(OspE)、pl8、Crasp3>BBA36、BB0323、p26 (OspF)、p28(OspD)、p30、p39、(BmpA)、P60-65 (共有抗原，Hsp60)、p83_100、pl7 (0spl7)、p31_32 (OspA)和 p34 (Osp B)，或疏螺旋體屬脂質(zhì)或疏螺旋體屬菌株的裂解物。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗原是對(duì)動(dòng)物致病的細(xì)菌的抗原。下面列出了依照本發(fā)明的此類細(xì)菌的例子。該列表在本發(fā)明的語境中不應(yīng)視為限制性的，而應(yīng)視為僅為示例。支原體屬，芽孢桿菌屬，尤其是炭疽芽孢桿菌，布魯氏菌屬，分枝桿菌屬，尤其是結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌，彎曲桿菌屬，三毛滴蟲屬，鉤端螺旋體屬，立克次氏體屬，沙門氏菌屬，梭菌屬，放線桿菌屬，衣原體屬(Clamydia),棘球蝴，利斯特氏菌屬，耶爾森氏菌屬，棒狀桿菌屬和弗蘭西絲氏菌屬。當(dāng)前描述的細(xì)菌的綜合列表可在互聯(lián)網(wǎng)上http://www.ncb1.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi mode=Root 訪問。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗原是真菌抗原。在本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中所述抗原源自對(duì)人類致病的真菌。下面列出了依照本發(fā)明的此類真菌的例子。該列表在本發(fā)明的語境中不應(yīng)視為限制性的，而應(yīng)視為僅為示例。酵母，尤其是假絲酵母屬，隱球菌屬，Malassetia,絲孢綱(Hyphomycetes),尤其是曲霉屬，Trichphyton,小孢子菌屬，和表皮癬菌屬(Epidermophyton),雙態(tài)性真菌,尤其是組織胞漿菌屬(Histoplasma),芽生菌屬(Blastomyces),球抱子菌屬(Coccidioides),副球抱子菌屬(Paracoccidioides),抱子絲菌屬(Sporothrix),和肺囊蟲屬(Pneumocystis)。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中所述抗原是寄生物的抗原。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中所述抗原源自對(duì)人類致病的寄生物。下面列出了依照本發(fā)明的此類寄生物的例子。該列表在本發(fā)明的語境中不應(yīng)視為限制性的，而應(yīng)視為僅為示例。原生動(dòng)物，諸如錐蟲屬、利什曼原蟲屬、毛滴蟲屬(Trichomona),賈第蟲屬、阿米巴原蟲(Amoebae)、痕原蟲、弓形體屬、隱孢子原蟲(Cryptosporidia)、微孢子目(Microsporidia)。吸蟲綱(Trematoda),諸如血吸蟲屬(Schistosoma),以及多節(jié)絳蟲亞綱，諸如絳蟲和棘球蝴，以及線蟲綱(Nematoda),諸如鞭蟲屬，毛線蟲屬，類圓線蟲屬，鉤蟲屬(Ancyclostoma),板口線蟲屬，蟯蟲屬，蛔蟲和絲蟲目。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中所述抗原是對(duì)動(dòng)物致病的寄生物的多肽。下面列出了依照本發(fā)明的此類對(duì)動(dòng)物致病的寄生物的例子。該列表在本發(fā)明的語境中不應(yīng)視為限制性的，而應(yīng)視為僅為示例。原生動(dòng)物，尤其是原單胞菌(Protomonas),雙滴蟲(Diplomonas)，Polymastigidia,阿米巴原蟲，弓形體屬和球蟲類(Coccisidia),微抱子門(Microspora),螺蟲(Helminthes),吸蟲綱(Trematora),多節(jié)絳蟲亞綱(Cestoda)和線蟲綱。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，設(shè)想所述抗原是腫瘤抗原或自身抗原。在本發(fā)明的語境中，“自身抗原”理解為這樣的抗原，其顯示肽片段形式的結(jié)構(gòu)，代表身體自身的結(jié)構(gòu)。在存在對(duì)此類自身抗原展現(xiàn)反應(yīng)性的T細(xì)胞的情況下，自身免疫疾病的存在是可能的。自身抗原又稱自體抗原(selfantigens)或自身免疫抗原(autoimmune antigens)。在本發(fā)明的語境中，設(shè)想可以通過與腫瘤相關(guān)抗原或自身免疫抗原一起溫育來檢測分別指示腫瘤疾病或自身免疫疾病的活化的T細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗原是人類腫瘤抗原。根據(jù)本發(fā)明，特別優(yōu)選的是前列腺特異性抗原(PSA)、HER-2/neu，黏蛋白-1，過表達(dá)的野生型p53以及顯示點(diǎn)突變的P53，MAGE抗原和CEA (癌胚抗原).
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗原是自身免疫抗原。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的是多發(fā)性硬化(MS)的自身免疫抗原，諸如髓鞘堿性蛋白(MBP)，髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(MOG)、髓鞘蛋白脂質(zhì)蛋白(PLP)、髓磷脂、MBP/PLP融合蛋白(MP4)、少突膠質(zhì)細(xì)胞的髓鞘相關(guān)堿性蛋白(M0BP)，少突膠質(zhì)細(xì)胞特異性蛋白(OSP)、髓鞘相關(guān)糖蛋白(MAG)以及糖蛋白PO、外周髓鞘蛋白22 (PMP-22/PAS-1I)、pl70k/SAG(施旺細(xì)胞膜糖蛋白)、少突膠質(zhì)細(xì)胞髓鞘糖蛋白(OMgp)、施旺細(xì)胞髓鞘蛋白(SMP)、轉(zhuǎn)醛醇酶、SlOOP、α B晶體蛋白、2’，3’-環(huán)核苷酸3’磷酸二酯酶(CNP)，睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNF)和膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)。此外，根據(jù)本發(fā)明，I型糖尿病(青少年糖尿病)的自身免疫抗原,諸如胰島素B、前胰島素(PPI)、酪氨酸磷酸酶ΙΑ-2，谷氨酸脫羧酶65 (GAD65)，熱休克蛋白Hsp60，胰島細(xì)胞蛋白 ICA69，IGRP，cd4，嗜鉻粒蛋白 A(ChgA)(另見 Velthuis et al.(2010) Diabetes)是優(yōu)選的。在本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗原選自下組:PSA、HER-2/neu、黏蛋白-1、MAGE、CEA、髓鞘堿性蛋白(MBP)、髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(MOG)、髓鞘蛋白脂質(zhì)蛋白(PLP)、髓磷脂、胰島素 B、前胰島素原、IA-2、GAD65、Hsp60、ESAT-6, CFP-10, TB7.7、TB37.6、MPT63、結(jié)核菌素 PPD、pl4、0spC、p37_38 (FlaA)、p41、0spE、0spF、0spD、p39、0spl7、OspA、OSP B、Pr55gag、p24、pl7、POL、RT、nef、pp65、IEl、IE2、BZLFl、EBNA3、EBNA2、EBNA6、BMLF1、EBNA1、0RF1、0RF4、PRF62、0RF68、HBsAg、HBcAg 和 AdV5。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗原選自含有T輔助細(xì)胞的表位的多肽。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，設(shè)想用于步驟a)中接觸和步驟b)中溫育的時(shí)間段為O小時(shí)至72小時(shí)，優(yōu)選4、6或8小時(shí)。此外，設(shè)想優(yōu)選的是，步驟a)和/或步驟b)中的所述時(shí)間段為O小時(shí)至72小時(shí)，優(yōu)選4、6或8小時(shí)。此外，優(yōu)選根據(jù)本發(fā)明步驟a)和/或步驟b)中的所述時(shí)間段為O至48小時(shí)，更優(yōu)選O至36小時(shí)，更優(yōu)選O至34小時(shí)，更優(yōu)選O至32小時(shí)，更優(yōu)選O至30小時(shí)，更優(yōu)選O至28小時(shí)，更優(yōu)選O至26小時(shí)，更優(yōu)選O至24小時(shí)，更優(yōu)選O至22小時(shí)，更優(yōu)選O至20小時(shí)，更優(yōu)選O至18小時(shí)，更優(yōu)選O至16小時(shí)，更優(yōu)選O至15小時(shí)，更優(yōu)選O至14小時(shí)，更優(yōu)選O至12小時(shí)，更優(yōu)選O至10小時(shí)，更優(yōu)選O至9小時(shí),更優(yōu)選O至8小時(shí),更優(yōu)選O至7小時(shí),更優(yōu)選O至6小時(shí),更優(yōu)選O至5小時(shí),更優(yōu)選O至4小時(shí),更優(yōu)選O至3小時(shí),更優(yōu)選O至2小時(shí),且更優(yōu)選O至I小時(shí)。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中步驟a)和/或步驟b)中的所述時(shí)間段為O至60分鐘，更優(yōu)選O至50分鐘，更優(yōu)選O至40分鐘，更優(yōu)選O至30分鐘，更優(yōu)選O至20分鐘，更優(yōu)選O至15分鐘，更優(yōu)選O至10分鐘且更優(yōu)選O至5分鐘。根據(jù)本發(fā)明，還設(shè)想優(yōu)選的是所述第一種APC標(biāo)志物和第二種T細(xì)胞標(biāo)志物是核酸或蛋白質(zhì)，尤其是RNA、DNA、核酸片段、肽或肽片段，并且通過與所述至少一種抗原接觸和溫育而被誘導(dǎo)。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，設(shè)想所述APC標(biāo)志物為4-1BB配體(4-1BBL)，0X40 配體(0X40L)，TNFSF (CD70)，B7.1 (CD80)，B7.2 (CD86) ,FcyRIII (CD16)，F(xiàn)CYRII (⑶32), Fe Y RI (⑶64)或TNF/TNF-受體和/或免疫球蛋白超家族的另一個(gè)代表或CXCL家族的成員，例如CXCL9，CXCL10, CXCLll或趨化因子(C-C基序)配體家族的成員，例如 CCL2, CCL7, CCL8, CCLlO 或 ILlRN0在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，設(shè)想所述T細(xì)胞標(biāo)志物為IFN-β、INF_ Y、TNF-α 、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL_13、GM_CSF、TGF-β 、MIPla、MIPlb、4_lBB、CD25、穿孔蛋白和/或顆粒酶。此外，根據(jù)本發(fā)明，設(shè)想所述T細(xì)胞標(biāo)志物是由活化的T細(xì)胞或再活化的記憶T細(xì)胞產(chǎn)生的另一種細(xì)胞因子或趨化因子。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的標(biāo)志物尤其是這樣的核酸:在T細(xì)胞對(duì)APC的表位特異性識(shí)別后所述APC中該核酸的產(chǎn)生天然地可檢測地增加。這類作為本發(fā)明的APC標(biāo)志物的核酸的例子有 4-1BB 配體(4-1BBL)及 0X40 配體(0X40L)的 mRNA 分子(Oshima et al.1997, J.1mmunol.159, 3838-3848; denHaan and Bevan; 2000，PNAS97, 12950-12952)。此外，根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的是共刺激蛋白B7.1 (⑶80)、B7.2 (⑶86)、以及Fas配體(FasL)、以及其他TNF/TNF受體家族和免疫球蛋白超家族的蛋白、以及各種Fe-受體及細(xì)胞因子和趨化因子的mRNA分子。此外，根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的是任何這樣的多肽的核酸，該多肽在APC中的產(chǎn)生由于活化的T細(xì)胞特異性識(shí)別APC的表面上與MHC蛋白一起呈遞的多肽而可檢測地增加或減少。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，設(shè)想步驟c)和d)中的檢測和定量還通過PCR、定量 PCR(qPCR)、微陣列、FACS、ELISpot 和 / 或 ELISA 來實(shí)施。
本發(fā)明的另一個(gè)目的涉及一種用于實(shí)施本發(fā)明方法的試劑盒，包括至少一種抗原和用于擴(kuò)增所述第一種標(biāo)志物的弓I物對(duì)。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述試劑盒還包括用于擴(kuò)增所述第二種標(biāo)志物的引物對(duì)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述試劑盒還包括用于擴(kuò)增參比基因的引物對(duì)。此外，根據(jù)本發(fā)明，如果該試劑盒含包含探針和細(xì)胞培養(yǎng)基則是優(yōu)選的。在依照本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述試劑盒還包括RNA穩(wěn)定化試劑，RT主預(yù)混物(RT-master mix)、qPCR主預(yù)混物、陽性對(duì)照、和陽性試劑。根據(jù)本發(fā)明，“陽性對(duì)照”理解為確定量的待擴(kuò)增的標(biāo)志物DNA。根據(jù)本發(fā)明，“陽性試劑”理解為這樣的試劑，其即使在沒有活化T細(xì)胞存在時(shí)也能非特異性地刺激所述APC的標(biāo)志物。本發(fā)明的“陽性試劑”的例子有PMA/伊屋諾霉素或活化性抗CD40抗體與前列腺素E2 (PGE2)的組合。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，設(shè)想所述試劑盒還包括這樣的引物，其容許通過PCR、qPCR或微陣列來檢測所述APC的標(biāo)志物。下面通過下述的實(shí)施例來例示本發(fā)明。這些實(shí)施例應(yīng)該是為本發(fā)明的具體實(shí)施方案而不應(yīng)視為限制性。為了建立用于檢測、區(qū)分和定量特異性T細(xì)胞群體(諸如活化T細(xì)胞)的方法，分析了抗原呈遞細(xì)胞(APC)中T細(xì)胞誘導(dǎo)的成熟過程。為此目的，開發(fā)了一種基于加載有抗原的APC與離體擴(kuò)增的活化的抗原特異性T輔助細(xì)胞的共培養(yǎng)物的細(xì)胞培養(yǎng)模型。在該模型系統(tǒng)中(i)未加載的APC或加載有無關(guān)抗原的APC與預(yù)活化的抗原特異性T輔助細(xì)胞的共培養(yǎng)物和(ii)加載有抗原的APC與非特異性活化的T細(xì)胞或具有對(duì)無關(guān)抗原的特異性的活化的T輔助細(xì)胞的共培養(yǎng)物充當(dāng)陰性對(duì)照。該系統(tǒng)中，通過使用逆轉(zhuǎn)錄定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR)對(duì)特異性活化的及未活化的培養(yǎng)物樣品中的標(biāo)志物mRNA產(chǎn)生進(jìn)行比較性定量，來檢測抗原特異性T輔助細(xì)胞(Th細(xì)胞)。a)抗原特異性Th細(xì)胞的離體擴(kuò)增為了生成ESAT-6/CFP-10-特異性的活化Th細(xì)胞，將具有潛伏的結(jié)核分枝桿菌感染的供體的CD4+T細(xì)胞在體外擴(kuò)增3-4周時(shí)間。為此目的，將供體的血液抽取到肝素化注射器中，用PBSi (不含二價(jià)離子的磷酸鹽緩沖鹽水，Lonza)稀釋，然后使用Pancoll (PanBiotech) 20°C,800x g密度梯度離心30min根據(jù)血細(xì)胞的密度來分離血細(xì)胞。然后從梯度分離出PBMC，并使用PBS55W 300x glOmin洗滌兩次。然后使用MACS技術(shù)(⑶4+T細(xì)胞分離試劑盒II，Miltenyi)分離CD4+T細(xì)胞，并在完全R5培養(yǎng)基(RPMI1640 (Pan Biotech), 5%人AB血清(從AB血型供體的血液產(chǎn)生)，1%青霉素/鏈霉素(PAN Biotech))中培養(yǎng)，每周一次用加載有 ESAT-6/CFP-10 融合蛋白(AGLindner, Institute for medical Microbiologyand Hygiene, University HospitalRegensburg)的自體 APC(成熟樹突細(xì)胞，PBMC)以 1:3的比例(Th細(xì)胞:APC)進(jìn)行刺激。為此目的，在完全R5培養(yǎng)基中，37°C含5%C02的濕潤氣氛下用10 μ g/ml的ESAT-6/CFP-10融合蛋白、IxlO7細(xì)胞/ml的濃度，加載APC3小時(shí)(h)，并進(jìn)行30Gy的Y輻射，然后將它們與分離的Th細(xì)胞一起培養(yǎng)。為了 Th細(xì)胞的最優(yōu)增殖，向培養(yǎng)物中加入50U/mL的重組IL-2 (Proleukin S，Novartis)。每周一次通過用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器檢測總活細(xì)胞數(shù)來測定Th細(xì)胞的增殖。同樣每周一次通過檢測用加載有ESAT-6/CFP-10的經(jīng)輻射的PBMC進(jìn)行刺激后INF- Y和CD40L陽性細(xì)胞的數(shù)量來測定培養(yǎng)物的特異性。為此目的，將擴(kuò)增培養(yǎng)物的Th細(xì)胞以1:1的比例與新鮮分離的自體PBMC在37°C 5%C02、且存在lOyg/ml ESAT-6/CFP-10的條件下溫育6小時(shí)。溫育2小時(shí)后，加入布雷菲德菌素A來消除來自細(xì)胞的細(xì)胞因子釋放。分別使用每次用I μ g/ml PMA/伊屋諾霉素刺激的樣品，以及未刺激的樣品作為陽性和陰性對(duì)照。向每個(gè)刺激樣品中加入I μ g/ml共刺激性單克隆抗-⑶49d和抗-⑶28抗體。溫育之后接著是一個(gè)洗滌步驟。為此目的，向細(xì)胞中加入9mlPBS55，并在4°C 300x g將細(xì)胞離心8分鐘。棄去上清并將細(xì)胞重懸于回流液(reflux)中。然后分別用5μ I的下列熒光團(tuán)綴合的抗體標(biāo)記表面分子:抗CD3別藻藍(lán)蛋白-H7(BD)，抗CD4別藻藍(lán)蛋白(BD)，抗CD8多甲藻黃素葉綠素蛋白(BD)。表面染色在暗處室溫下進(jìn)行20min。然后洗滌細(xì)胞，并在PBS無中用500 μ 12%多聚甲醛(PFA) (Sigma Aldrich)在暗處室溫固定細(xì)胞lOmin。再經(jīng)過一個(gè)洗滌步驟后，在用于透化細(xì)胞的10 μ 12%皂苷(Carl Roth)存在下，在PBS無中用I μ I抗IFN- Y -熒光素異硫氰酸酯(BD)和10 μ I抗⑶40L R-藻紅蛋白(BD)在暗處室溫進(jìn)行對(duì)細(xì)胞內(nèi)INF-γ和細(xì)胞內(nèi)⑶40L的染色30min。然后用含0.1%皂苷的PBS55洗滌細(xì)胞兩次，將細(xì)胞重懸在300 μ I含1%PFA的PBS55中。在FACS CANTO II流式細(xì)胞計(jì)(BD)中分析經(jīng)染色的細(xì)胞。為此目的首先根據(jù)前散射光和側(cè)散射光分離細(xì)胞群體。然后針對(duì)淋巴細(xì)胞群體分析它們的CD3表達(dá)。然后對(duì)所有CD3+細(xì)胞分析它們的CD4和⑶8蛋白表達(dá)。然后針對(duì)⑶4+T細(xì)胞分析它們的IFN- Y和⑶40L表達(dá)。為此目的，根據(jù)IFN- Y和⑶40L的表達(dá)來測定活化的ESAT-6/CFP-10特異性T輔助細(xì)胞的百分比(數(shù)據(jù)未顯示)。在擴(kuò)增培養(yǎng)物中，可觀察到T輔助細(xì)胞的持續(xù)增殖，該增殖伴隨著ESAT-6/CFP-10特異性Th細(xì)胞的增加。因此，在3_4周后，在擴(kuò)增培養(yǎng)物中可以產(chǎn)生5至18%的特異性Th細(xì)胞。按照與前文所述的實(shí)驗(yàn)步驟類似的實(shí)驗(yàn)步驟，分別使用EBV-和CMV-血清陽性供體的血液樣品來進(jìn)行EBV-(BZLFl)和CMV-(pp65)特異性Th細(xì)胞的生成和表征。b)離體預(yù)活化的ESAT-6/CFP-10特異性Th細(xì)胞與新鮮制備的加載用ESAT-6/CFP-10融合蛋白的自體PBMC的共培養(yǎng)。將新鮮制備的具有潛伏結(jié)核病的供體的PBMC在B細(xì)胞培養(yǎng)基(Iscove氏改良的 Dulbecco 氏培養(yǎng)基(IMDM) (Lonza)，10% 人 AB 血清，6ng/ml IL-4 (Mi ltenyi Biotech),50ng/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白(Roche)，5 μ g/ml胰島素(Roche))中以1:1比例與總細(xì)胞數(shù)為IxlO6細(xì)胞/ml的所述擴(kuò)增培養(yǎng)的離體預(yù)活化的ESAT-6/CFP-10特異性Th細(xì)胞在存在或不存在10 μ g/ml ESAT-6/CFP-10融合蛋白的條件下共培養(yǎng)。將細(xì)胞在37°C 5%C02中溫育10h，其中在不同時(shí)間點(diǎn)(例如O ;0.5;1;2;3;4;6;8和IOh后)每次移出2xl05個(gè)細(xì)胞的樣品。將這些迅速離心，棄去上清，然后將離心沉淀立即在液氮中冷凍。將樣品保存在_80°C直到進(jìn)一步處理。預(yù)先在一個(gè)新鮮制備的PBMC與自體離體預(yù)活化的Th細(xì)胞的共培養(yǎng)物中，在用ESAT-6/CFP-10刺激之后隨時(shí)間分析Th細(xì)胞表面上的活化標(biāo)志物⑶40L的存在。這些分析顯示特異性地體外再刺激的Th細(xì)胞在它們的表面上展現(xiàn)瞬時(shí)CD40L表達(dá)，其中在與加載抗原的APC共培養(yǎng)6小時(shí)之后可以觀察到最高數(shù)目的表達(dá)CD40L的細(xì)胞(數(shù)據(jù)未顯示)。c)利用RT-qPCR定暈PBMC中的4-1BBL mRNA作為抗原特異性活化Th細(xì)胞的間接麗使用peqLab peqGOLD總RNA試劑盒(peqLab),從細(xì)胞樣品分離總RNA。使用peqGOLD DNA酶I消化試劑盒(peqLab)去除DNA污染。將總RNA溶出于60 μ l DEPC水(1L蒸餾水加Iml焦碳酸二乙酯(Sigma))中；37°C溫育lh，然后121°C高溫蒸汽滅菌15min。
為了逆 轉(zhuǎn)錄(RT-PCR)成cDNA，將10 μ I溶出的RNA與10 μ I RT-PCR主預(yù)混物混合。RT-PCR主預(yù)混物含有溶于DEPC水的50mM緩沖液A (TaqMan 1000RXN Go I d與緩沖液 A(Applied Biosystems), 5mM MgCl2 (TaqManlOOORXN Gold 與緩沖液 A (AppliedBiosystems))，2.5mM 隨機(jī)化六聚體引物(MWG Operons/Eurof ins), 5mM dNTP, 2.5U/ μ IMuLV 逆轉(zhuǎn)錄酶(Applied Biosystems), IU/ μ I RNA 酶抑制劑(Applied Biosystems)。逆轉(zhuǎn)錄為 23°C 15min、95°C 5min、42°C 30min，使用 PTC_200Peltier 熱循環(huán)儀(MJResearch)進(jìn)行。然后將24 μ I qPCR主預(yù)混物(50mM緩沖液A, 6.875mMMgCl2, 0.308 μ M4-1BBL正向引物 GAGGGTCCCGAGCTTTCG，Biomers,在 SEQ ID NO:1 中顯示；0.308 μ M41BBL 反向引物GCCCATCGATCAGCAGAAC, Biomers,在 SEQ ID NO: 2 中顯示；0.2525 μ M41BBL 探針 FAM-CCACCAGCTGCGCAAACATGC-TMR, TIB Molbiol,在 SEQ ID NO: 3 中顯示；0.308 μ M GAPDH 正向弓丨物 GAAGGTGAAGGTCGGAGTC, Biomers,在 SEQ ID NO: 4 中顯示；0.308 μ MGAPDH 反向引物GTAAACCATGTAGTTGAGGTC, Biomers,在 SEQ IDNO: 5 中顯示；0.2525 μ M GAPDH 探針 YAK-TCATTGATGGCAACAATATCCACT-TMR, TIB Molbiol,由 SEQ IDN0:6 所示；0.003125U/μ I TaqGold聚合酶(溶于DEPC水)與6 μ I產(chǎn)生的cDNA混合。qPCR的溫度曲線包括一步95°C 10分鐘，然后50個(gè)由95°C 15s和60°C Imin組成的循環(huán)；qPCR用St印OnePlus實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(AppliedBiosystems)來進(jìn)行。組成型表達(dá)4-1BBL mRNA的THP-1細(xì)胞作為陽性對(duì)照和參比。在測試中以與樣品相同的方式處理它們。然后，使用類似地預(yù)先擴(kuò)增的甘油醛3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為參比基因根據(jù)下面的公式進(jìn)行4-1BBL mRNA的相對(duì)定量:R=2^Δε<1Λ Λ Cq=[(Cq4_lBBL(S) - Cq GAPDH(S)]-[(Cq4_lBBL(NK) - CqGAPDH(NK)]結(jié)果以經(jīng)刺激的樣品的標(biāo)志物mRNA產(chǎn)生與相應(yīng)的陰性對(duì)照(已經(jīng)預(yù)先用GAPDH標(biāo)準(zhǔn)化)的比例來給出。對(duì)于每個(gè)樣品，分析一式三份進(jìn)行。這些分析顯示，與未加載的PBMC相比，與加載有ESAT-6/CFP-10蛋白的自體PBMC共培養(yǎng)的ESAT-6/CFP-10特異性預(yù)活化Th細(xì)胞顯示了可測量的4-1BBL mRNA產(chǎn)生增加(圖3)。實(shí)施例2:加載有ESAT-6/CFP-10蛋白的PBMC的共培養(yǎng)物中4-1BB配體mRNA產(chǎn)生的誘導(dǎo)與離體擴(kuò)增的ESAT-6/CFP-10蛋白特異性Th細(xì)胞的數(shù)目之間的關(guān)聯(lián)如實(shí)施例1a)項(xiàng)下所述將潛伏感染了結(jié)核分枝桿菌的受試者的ESAT-6/CFP-10特異性Th細(xì)胞離體擴(kuò)增，然后如實(shí)施例1中b)項(xiàng)下所述與新鮮制備的自體PBMC共培養(yǎng)。在該過程中，在半對(duì)數(shù)濃度系列(濃度梯級(jí):0、117、370、1170、3700、11700、37000、117000個(gè)預(yù)活化的Th細(xì)胞/I X IO6個(gè)PBMC)中滴定與I X IO6個(gè)PBMC共培養(yǎng)的ESAT-6/CFP-10特異性Th細(xì)胞的數(shù)目。在0;0.5;1;2;3;4;6;8和10小時(shí)溫育后，移出2 X IO5個(gè)細(xì)胞，300g離心沉降5min，將沉淀物立即冷凍在液氮中。將細(xì)胞保存在_80°C直到進(jìn)一步使用。根據(jù)實(shí)施例Ic)項(xiàng)下的規(guī)程分離總RNA，并在RT-qPCR中對(duì)其分析4-1BBL mRNA產(chǎn)生。在這些分析中可以觀察到預(yù)活化的ESAT-6/CFP-10特異性Th細(xì)胞的數(shù)目與標(biāo)志物(4-1BBL mRNA的增加的產(chǎn)生)的信號(hào)強(qiáng)度有清楚的相關(guān)性(圖4)。實(shí)施例3:在未刺激的PBMC、用ESAT-6/CFP-10刺激過的PBMC以及自體離體預(yù)活化的結(jié)核分枝桿菌ESAT-6/CFP-10特異性Th細(xì)胞的共培養(yǎng)物中4-1BBL及IFN- y mRNA產(chǎn)生的誘導(dǎo)如實(shí)施例1a)項(xiàng)下所述離體擴(kuò)增潛伏感染結(jié)核分枝桿菌的患者的ESAT-6/CFP-10特異性Th細(xì)胞，然后如實(shí)施例1b)項(xiàng)下所述將其與新鮮制備的自體PBMC共培養(yǎng)。在該過程中將50，000個(gè)離體預(yù)活化的ESAT-6/CFP-10特異性Th細(xì)胞與I X IO6個(gè)PBMC共培養(yǎng)。在0-32小時(shí)的時(shí)間段內(nèi)每隔2小時(shí)從培養(yǎng)樣品中移出2X105個(gè)細(xì)胞，300x g離心沉降5分鐘，然后立即將沉降物在液氮中冷凍。將細(xì)胞保存在_80°C直到進(jìn)一步使用。根據(jù)實(shí)施例1c)項(xiàng)下的規(guī)程分離總RNA，并在RT-qPCR中對(duì)其分析4-1BBL mRNA的產(chǎn)生。此外，同樣地如實(shí)施例1c)項(xiàng)下所述分析細(xì)胞 因子IFN- Y (其在APC與特異性T細(xì)胞的抗原特異性接觸之后由T細(xì)胞釋放)的mRNA的產(chǎn)生。為此目的，使用下述引物探針系統(tǒng)，其中同樣使用GAPDH作為參比基因:IFN-Y 正向引物 GTGGAGACCATCAAGGAAGACAT，Biomers,由 SEQ ID NO: 7 所示;IFN- Y 反向引物 GGCGACAGTTCAGCCATCA，Biomers，由 SEQ ID 勵(lì):8所示；正^^ 探針 FAM-TTCATGTATTGCTTTGCGTTGGACATTCAA-TMR，由 SEQ ID NO:9 所示。在結(jié)核分枝桿菌潛伏感染的人中，結(jié)核分枝桿菌特異性Th細(xì)胞存在于PBMC混合物中，還部分地展現(xiàn)對(duì)ESAT-6/CFP-10的特異性。與之相對(duì)照的是，活化的ESAT-6/CFP-10特異性Th細(xì)胞在急性病期間瞬時(shí)出現(xiàn)，然后僅見于PBMC混合物中。通過滴定將離體預(yù)活化的ESAT-6/CFP-10特異性Th細(xì)胞加入PBMC來模擬急性結(jié)核分枝桿菌感染。這些分析顯示，除了 4-lBBLmRNA的產(chǎn)生的增加之外，在離體預(yù)活化的ESAT-6/CFP-10特異性Th細(xì)胞與具有潛伏結(jié)核病的供體的自體PBMC的共培養(yǎng)物中還可檢測到IFN-YmRNA的相對(duì)增加(圖5A 和 5B)。實(shí)施例4:在加載有ESAT-6/CFP-10PBMC的PBMC與ESAT-6/CFP-10特異性活化的Th細(xì)胞或非特異性地預(yù)活化的Th細(xì)胞的共培養(yǎng)物中4-1BBL mRNA產(chǎn)生的誘導(dǎo)為了驗(yàn)證RTT方法的抗原特異性，將具有潛伏結(jié)核病的供體的PBMC在有和沒有ESAT-6/CFP-10蛋白存在下用預(yù)活化的ESAT-6/CFP-10特異性活化Th細(xì)胞或與對(duì)ESAT-6/CFP-10非特異性的活化Th細(xì)胞進(jìn)行刺激，并在不同的時(shí)間點(diǎn)使用RT-qPCR技術(shù)測定ESAT-6/CFP-10刺激過的細(xì)胞培養(yǎng)物中相比于未刺激的細(xì)胞培養(yǎng)物4-1BBL產(chǎn)生的相對(duì)增力口。為此目的，如實(shí)施例1a)項(xiàng)下所述的那樣分離Th細(xì)胞，并將如此獲得的Th細(xì)胞與可商購的T細(xì)胞擴(kuò)增珠子(Dynabeads，Invitrogen)按2:1的比例在R5培養(yǎng)基中在37°C、5%C02濕潤氣氛下一起培養(yǎng)14天。通過用流式細(xì)胞術(shù)監(jiān)測CD40L的表達(dá)來測定T細(xì)胞的活化。該分析證明，在用擴(kuò)增珠子刺激14天后，超過40%的Th細(xì)胞在它們的表面上展現(xiàn)CD40L(數(shù)據(jù)未顯示)。然后將I X IO6個(gè)新鮮制備的自體PBMC/ml在存在和不存在10μ g/mlESAT-6/CFP-10的條件分別與0，210, 6636或66360個(gè)離體預(yù)刺激的ESAT-6/CFP-10特異性Th細(xì)胞(如實(shí)施例1a)項(xiàng)下所述產(chǎn)生的)或非特異性活化的Th細(xì)胞(如實(shí)施例1b)項(xiàng)下所述產(chǎn)生的)共培養(yǎng)。在0;0.5;1;2;3;4;6和8小時(shí)之后分別從共培養(yǎng)物移出2X IO5個(gè)細(xì)胞，并如實(shí)施例1c)下所述在RT-qPCR中對(duì)其分析4-1BBL mRNA的產(chǎn)生。這些實(shí)驗(yàn)顯示 預(yù)活化的ESAT-6/CFP-10特異性Th細(xì)胞的數(shù)目與4-1BB1表達(dá)在特異性刺激的共培養(yǎng)物樣品中相對(duì)于未刺激的共培養(yǎng)物樣品的相對(duì)增加之間的直接相關(guān)性。相比之下,在與非特異性預(yù)活化的Th細(xì)胞的共培養(yǎng)物樣品中可以觀察到4-1BBL mRNA產(chǎn)生的相對(duì)增幅顯著降低(圖6)。
實(shí)施例5:來自選定的結(jié)核分枝桿菌_、EBV-、以及CMV-陽性供體的PBMC與離體預(yù)活化的結(jié)核分枝桿菌-、ESAT-6/CFP-10-、EBV BZLF1-、或CMV pp65_特異性Th細(xì)胞在存在和不存在ESAT-6/CFP-10、BZLFl或pp65的條件下的共培養(yǎng)物中4-1BBL mRNA產(chǎn)生誘導(dǎo)的特異性在另一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，分析了是否(i)用結(jié)核分枝桿菌ESAT-6/CFP-10、EBVBZLF1和CMV pp65蛋白質(zhì)本身加載PBMC可誘導(dǎo)4-1BBL mRNA的非特異性活化，以及是否(ii)RTT標(biāo)志物的誘導(dǎo)由于APC以抗原特異性的方式與活化Th細(xì)胞的相互作用而發(fā)生。為此目的，通過使用具有結(jié)核分枝桿菌潛伏感染的EBV-和CMV-血清陽性供體的分離的Th細(xì)胞如實(shí)施例Ia)項(xiàng)下所述離體擴(kuò)增和預(yù)活化。然后將70000個(gè)離體擴(kuò)增的T輔助細(xì)胞在存在和不存在10 μ g/ml ESAT-6/CFP-10, BZLF-1或pp65的條件下分別與1x10共培養(yǎng)。在溫育O; 0.5; I; 2; 3; 4; 6; 8和10小時(shí)之后，分別從共培養(yǎng)物中移出2 X IO5個(gè)細(xì)胞，300x g離心沉降5分鐘，并立即將沉降物在液氮中冷凍。細(xì)胞保存在_80°C直到進(jìn)一步使用。根據(jù)實(shí)施例1c)項(xiàng)下的規(guī)程分離總RNA，并使用RT-qPCR技術(shù)對(duì)其分析4-1BBL mRNA產(chǎn)生。這些分析證明，用各種刺激物抗原刺激含有APC的PBMC不引發(fā)4-1BBL mRNA的非特異性活化。此外，這些分析證明，APC中4-1BBL mRNA產(chǎn)生的增加僅在活化Th細(xì)胞與APC的抗原特異性接觸之后發(fā)生。如果將結(jié)核分枝桿菌特異性Th細(xì)胞與自體PBMC共培養(yǎng)，它們只有在ESAT-6/CFP-10存在下引發(fā)4-1BBL mRNA產(chǎn)生的誘導(dǎo)，而在BZLFl或pp65存在下，或無抗原存在下則不然(圖7和8a)。除此之外，體外預(yù)活化的BZLFl-和pp65_特異性Th細(xì)胞分別僅在那些已經(jīng)加載了各個(gè)活化T細(xì)胞的相應(yīng)的靶結(jié)構(gòu)的自體PBMC的培養(yǎng)物中才誘導(dǎo)了 4-1BBL mRNA的產(chǎn)生增加(圖8b和8c)此外，所實(shí)施的分析提示，4-1BBL mRNA誘導(dǎo)的效率與PBMC中存在的抗原特異性CTL的數(shù)目成逆相關(guān)。在TB患者的血液中通常能找到的ESAT-6/CFP-10特異性CTL極少，而在CMV血清陽性，尤其是EBV血清陽性的受試者中，分別有顯著比例，或者主要比例的現(xiàn)有記憶T細(xì)胞可歸于細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)亞群。在ESAT-6/CFP-10特異性的預(yù)活化Th細(xì)胞與加載有ESAT-6/CFP-10的PBMC的共培養(yǎng)物中可觀察到最強(qiáng)的4-1BBL活化，而在BZLFl特異性的預(yù)活化Th細(xì)胞與加載有BZLFl的PBMC的共培養(yǎng)物中可觀察到最低的4-1BBL活化。該現(xiàn)象可以用特異性CTL對(duì)給出信號(hào)的APC的裂解來解釋。實(shí)施例6:阻斷性抗MHCl類抗體的添加對(duì)加載有BZLFl的PBMC與離體活化的BZLFl特異性Th細(xì)胞的共培養(yǎng)物中4-1BB配體mRNA的誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)結(jié)核分枝桿菌感染主要由Th細(xì)胞控制。此外，細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)也通過識(shí)別和破壞被病原體侵染的細(xì)胞而在與病原體的對(duì)抗中起作用。在特定的感染中，例如在埃巴二氏病毒(EBV)感染中，CTL是主要的T細(xì)胞群體。在本發(fā)明的方法中，基于所謂的反向T細(xì)胞技術(shù)(reverse T cell technology, RTT), CTL也可能識(shí)別和破壞加載有病原體特異性結(jié)構(gòu)的APC，甚至在它們表達(dá)APC的標(biāo)志物，RTT標(biāo)志物之前。這樣一來，可能的釋放信號(hào)的APC數(shù)目降低，從而測試的靈敏度降低。為了考察細(xì)胞毒性T細(xì)胞對(duì)RTT方法的靈敏度的影響，在存在和不存在MHC-1阻斷性抗體(10 μ g/ml) (HLA ABC抗體，批號(hào)MCA81EL;克隆W6/32AbD Serotec)的條件下，進(jìn)行與體外預(yù)活化的BZLFl特異性Th細(xì)胞(如實(shí)施例1a)項(xiàng)下所述產(chǎn)生)與用BZLFl加載的自體PBMC的共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，如實(shí)施例1b)項(xiàng)所述。由于抗體結(jié)合抗原呈遞細(xì)胞上的MHC-1分子，阻止CTL對(duì)所述細(xì)胞的識(shí)別，結(jié)果不發(fā)生對(duì)加載有蛋白的APC的殺滅。將I X IO6個(gè)細(xì)胞/ml在BZM中共培養(yǎng)，其中每I X IO6個(gè)PBMC使用70000個(gè)BZLFl特異性預(yù)活化的Th細(xì)胞。在0，I, 2，3，4，6，8和IOh的時(shí)間點(diǎn)每份樣品分別移出
2X IO5個(gè)細(xì)胞，離心沉降，并立即冷凍于液氮中。將樣品保存在_80°C直到進(jìn)一步使用。然后在RT-qPCR中分析4-lBBLmRNA的含量，如實(shí)施例1中c)項(xiàng)下所述。通過使用MHC-1阻斷性抗體，有可能在這些實(shí)驗(yàn)中顯著增加BZLFl特異性Th細(xì)胞與加載有BZLFl的PBMC的共培養(yǎng)物中4-1BBL mRNA的誘導(dǎo)(圖9)。實(shí)施例7:對(duì)具有活動(dòng)和潛伏結(jié)核病的患者、以及健康供體的PBMC中4-1BB配體mRNA產(chǎn)生的特異性誘導(dǎo)的分析，以便間接檢測活化Th細(xì)胞為了闡明本發(fā)明的方法，即RTT方法，是否能用于鑒定具有活動(dòng)結(jié)核病的患者，以及用于將他們與潛伏結(jié)核病和健康供體區(qū)別，從(i)未感染結(jié)核分枝桿菌的健康供體(ρ012、ρΟΙΟ、p008) ；(ii)具有潛伏結(jié)核病的健康供體(p009、p006、p005) ；(iii)在分析前最近6個(gè)月內(nèi)因?yàn)榛顒?dòng)結(jié)核病接受過藥物治療的供體(p013、p014、p003);以及(iv)在病因性治療開始之前或剛開始之后具有活動(dòng)結(jié)核病的供體(p001、p004、p007)各三人采取血液到肝素化注射器中，從中新鮮分離出PBMC。然后分別將I X IO6個(gè)細(xì)胞/mL與10 μ g/mLESAT-6/CFP-10在37°C、5%C02條件下在濕潤氣氛中溫育。此外，將選定的供體的PBMC與對(duì)照抗原，HIV p24(殼體蛋白)(健康:p008 ;潛伏:p005和p006 ;處理的:p003 ;活動(dòng)的:P007和pOOl)或牛血清白蛋白(pOOl)溫育，或者作為另一陰性對(duì)照，在沒有任何抗原的存在下溫育。在溫育0.5;1;2;3;4;6;8和10小時(shí)后分別取出2X IO5個(gè)細(xì)胞，離心沉降并立即在液氮中冷凍。將細(xì)胞保存在_80°C直到進(jìn)一步加工。如實(shí)施例1c)項(xiàng)下所述，然后在RT-qPCR中分析4-1BBL mRNA的含量。顯示在健康供體的PBMC中用ESAT-6/CFP-10刺激未導(dǎo)致4-lBBLmRNA的誘導(dǎo)(圖1Oa)。類似地，在結(jié)核分枝桿菌潛伏感染的受試者的PBMC中(圖1Ob)或在分析之前6個(gè)月由于活動(dòng)性結(jié)核病而接受了藥物治療的受試者的PBMC中(圖10c)，無法測量到4-1BBLmRNA的誘導(dǎo)。只有在病因性治療開始之前或開始之后不久急性發(fā)病的受試者的PBMC中才有可能在用ESAT-6/CFP-10刺激之后觀察到4-1BBL mRNA在特異性刺激的細(xì)胞培養(yǎng)物中相比于未刺激的細(xì)胞培養(yǎng)物有顯著增加的誘導(dǎo)(圖1Od)。用無關(guān)抗原BSA和p24刺激PBMC同樣未導(dǎo)致4-1BBL mRNA的增加的誘導(dǎo)(圖1Oe)。實(shí)施例8:在具有急性和潛伏結(jié)核病的供體以及具有結(jié)核菌素PPD的健康受試者的PBMC中4-1BBL mRNA產(chǎn)生的誘導(dǎo)為了考察通過使用更寬的抗原譜能夠增加急性結(jié)核病患者的PBMC中4-1BBLmRNA的誘導(dǎo)，從具有急性和潛伏結(jié)核病的患者，以及健康供體分別取血到肝素化注射器中，并從中新鮮分離PBMC。然后將I X IO6個(gè)細(xì)胞/mL與10 μ g/mL ESAT-6/CFP-10或結(jié)核菌素PPD(Statens Serum Institut, Denmark)在濕潤氣氛中37°C、5%C02條件下溫育。此外，將等份的PBMC在無抗原條件下溫育作為陰性對(duì)照，以及分別與I μ g/mL佛波醇_12_肉豆蘧酸酯-13-乙酸酯(PMA) (Sigma Aldrich)和伊屋諾霉素(Sigma Aldrich)溫育，作為 4-1BBLmRNA產(chǎn)生誘導(dǎo)能力的陽性對(duì)照。在溫育0、2、4、6、8、和10小時(shí)后移出2X IO5個(gè)細(xì)胞，離心沉降并立即在液氮中冷凍。將細(xì)胞冷凍在_80°C直到進(jìn)一步處理。如實(shí)施例1中c)項(xiàng)下所述，然后在RT-qPCR中分析4-1BBL mRNA的含量。可以顯示，用結(jié)核菌素pro刺激在具有急性結(jié)核病的患者的PBMC中引發(fā)的4-1BBLmRNA產(chǎn)生誘導(dǎo)比ESAT-6/CFP-10高許多倍(圖11a，上圖)。同時(shí)，在潛伏感染的受試者以及健康受試者的PBMC中在用結(jié)核菌素PPD以及用ESAT-6/CFP-10刺激之后均未能觀察到顯著增加的4-1BBL mRNA產(chǎn)生誘導(dǎo)(圖1lb和11c，上圖)。此外，在所有三個(gè)受試者的用PMA/伊屋諾霉素刺激的PBMC等份中，與未刺激的PBMC等份相比，可以觀察到4-lBBLmRNA產(chǎn)生的顯著增加，從而證明了所述PBMC產(chǎn)生這種RTT標(biāo)志物的功能(圖lla-c，下圖)。實(shí)施例9:在健康供體的PBMC中用PMA/伊屋諾霉素或PGE2/抗CD40的組合刺激之后4-1BB配體表達(dá)的誘導(dǎo)的時(shí)間過程為了鑒定本發(fā)明的RTT方法用于檢測活化T細(xì)胞的陽性對(duì)照，考察了 PMA/伊屋諾霉素或PGE2/抗⑶40的組合是否引發(fā)4-1BBL mRNA表達(dá)的非特異性誘導(dǎo)，并且引發(fā)的強(qiáng)度如何。為此目的，將健康供體的I X IO6個(gè)PBMC/mL分別與I μ g/mL PMA及伊屋諾霉素、或者5 μ g/mL PGE2 (AlexisBiochemicals)及 2yg/mL CD40-抗體(LEAF-抗 CD40; Biozol)的組合溫育。用未經(jīng)刺激的PBMC作為陰性對(duì)照。在溫育0、2、4、6、8、和10小時(shí)后移出5X105個(gè)細(xì)胞，離心沉降并立即在液氮中冷凍。將細(xì)胞冷凍在_80°C直到進(jìn)一步使用。如實(shí)施例1中c)項(xiàng)下所述，然后在RT-qPCR中分析4-1BBL mRNA的含量。這些分析顯示，PMA和伊屋諾霉素(圖12a)是比PGE2與⑶40抗體的組合(圖12b)顯著更高效的4-1BBL mRNA產(chǎn)生的非特異性誘導(dǎo)物。實(shí)施例10:使用不同的參比基因在未經(jīng)刺激以及經(jīng)ESAT-6/CFP-10刺激的體外預(yù)活化結(jié)核分枝桿菌特異性Th細(xì)胞與自體PBMC的共培養(yǎng)物中4-1BBL mRNA產(chǎn)生的相對(duì)誘導(dǎo)的比較性測定為了鑒定出本發(fā)明的RTT方法的合適的參比基因，通過使用相應(yīng)的引物/探針系統(tǒng)擴(kuò)增了實(shí)施例3所述的cDNA樣品中的參比基因GAPDH、huPO和PB⑶，以便將4-1BBL mRNA的量標(biāo)準(zhǔn)化。為此目的，根據(jù)實(shí)施例1c)項(xiàng)下所描述的RT-qPCR條件使用了用于擴(kuò)增這些基因的引物/探針系統(tǒng)。為此目的使用了下述引物/探針系統(tǒng):huPO 正向引物 GTGGTGCTGATGGGCAAGA, Biomers,由 SEQ ID NO: 10 所示；huP0 反向引物 GCAGCAGTTTCTCCAGAGCTG，Biomers,由 SEQ ID NO: 11 所示；huP0探針 FAM-ACCATGATGCGCAAGGCCATCC-TMR，TIB Molbiol，由 SEQ ID NO: 12 所示；ΡΒ( 正向引物 CCAGCTCCCTGCGAAGAG, Biomers,由 SEQ ID NO: 13 所示;PBGD 反向引物CACTGAACTCCTGCTGCTCG, Biomers,由 SEQ ID NO: 14 所示；ΡΒ( 探針 FAM-CCCAGCTGCAGAGAAAGTTCCCGC-TMR, TIB Molbiol,由 SEQ ID NO: 15 所示。該分析根據(jù) 2_ΔΔ&1 方法進(jìn)行，使用GAPDH、huPO和PB⑶作為參比基因，未刺激的對(duì)照作為校準(zhǔn)物。這些分析揭示4-1BBL mRNA的含量可以用所有三種參比基因標(biāo)準(zhǔn)化而不會(huì)顯著影響最后的結(jié)果(圖13)。雖然用三種參比基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化時(shí)可以觀察到誘導(dǎo)4-1BBL mRNA的強(qiáng)度的差異，但趨勢是近似的。實(shí)施例11:通過流式細(xì)胞術(shù)在ESAT-6/CFP-10加載的PBMC以及離體擴(kuò)增的ESAT-6/CFP-10特異性Th細(xì)胞的共培養(yǎng)物中測定4-1BB配體表達(dá)將體外擴(kuò)增的活化ESAT-6/CFP-10特異性Th細(xì)胞(如實(shí)施例1中a)項(xiàng)所述產(chǎn)生)以1:1與自體PBMC混合，并在有和無重組ESAT-6/CFP-10存在下以I X IO6個(gè)細(xì)胞/ml在R5中共培養(yǎng)28h。在最后26h中用布雷菲德菌素A抑制蛋白質(zhì)分泌。然后根據(jù)實(shí)施例1中a)項(xiàng)下的規(guī)程細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記4-1BBL在B細(xì)胞中的蛋白表達(dá)，再通過流式細(xì)胞術(shù)測定。表面染色使用5μ I抗CD19R-藻紅蛋白花青7(PeCy7) (BD)的胞內(nèi)染色使用20 μ I抗
4-1BBL PE(BD)這些分析顯示，未刺激的B細(xì)胞已經(jīng)顯示非常高含量的細(xì)胞內(nèi)存在的4-1BBL ;因此在用ESAT-6/CFP-10刺激之后無法檢測到蛋白質(zhì)水平上的4-1BBL表達(dá)的進(jìn)一步誘導(dǎo)(圖2)。這些分析證明，在蛋白質(zhì)水平上檢測T細(xì)胞誘導(dǎo)的成熟過程只有當(dāng)使用流式細(xì)胞術(shù)或ELISA和ELISpot技術(shù)時(shí)方有可能并且受到限制，這是由于RTT標(biāo)志物含量是可變的，而且從某種程度上說非常高。實(shí)施例12:用于RTT方法的用于標(biāo)準(zhǔn)化RT-aPCR的參比基因的鑒定。在不同反應(yīng)混合物中表達(dá)水平的非由細(xì)胞中的表達(dá)的生物學(xué)改變所造成的變化需要加以校正。為了鑒定適于在RTT方法中用于分析臨床樣品的參比基因，在三種不同條件下刺激了不同受試者組的PBMC樣品，并將參比基因的RT-qPCR結(jié)果與相應(yīng)的未刺激樣品進(jìn)行比較。對(duì)兩名TB活動(dòng)感染的患者、一名TB潛伏感染的患者、以及一名健康受試者和一名健康的BCG接種受試者的肝素鈉血液樣品進(jìn)行處理。為此目的，如實(shí)施例1a)項(xiàng)下所述分離PBMC。然后，將每6ml樣品6xl06個(gè)PBMC在B細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行刺激。用ESAT-6/CFP-1O (10 μ g/ml)、結(jié)核菌素PPDdOy g/ml)刺激、或者用PMA/伊屋諾霉素非特異性地刺激(分別(in each case) I μ g/ml),在濕潤氣氛中37°C、5%C02條件下進(jìn)行6h時(shí)間。溫育之后300x glOmin離心沉降細(xì)胞，棄去上清，用RLT緩沖液(QIAGEN)和1%β巰基乙醇溶解離心沉淀，然后馬上在液氮中冷凍。根據(jù)制造商的說明用RNeasy小提試劑盒(QIAGEN)分離RNA,包括在柱上進(jìn)行DNA酶消化。用QIAGEN的QuantiTect逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA合成。使用定制latjlVlan 基因表達(dá)陣列96孔快速平板(GeneExpression Array96_Well FastPlates) (Applied Biosystems)和 TaqMan 快速通用主預(yù)混物(Fast Universal MasterMix) (Applied Biosystems)根據(jù)制造商的說明實(shí)施qPCR。良好適用于RT-qPCR的參比基因的表達(dá)水平在所有適用的實(shí)驗(yàn)條件下，以及在本文中考慮的刺激之下，都應(yīng)該保持恒定。此外，參比基因的表達(dá)水平應(yīng)當(dāng)與靶基因的表達(dá)水平相應(yīng)。同樣，qPCR效率應(yīng)該與靶基因的相似。對(duì)于所有五個(gè)樣品，比較并分析了結(jié)果。結(jié)果描繪于圖14。對(duì)于不同的刺激條件，RTT標(biāo)志物基因TNFSF9和IFNG的表達(dá)在Cq20和Cq30之間檢出(未顯示)。由于在所有刺激條件下的恒定表達(dá)，由于表達(dá)水平在Cq28-Cq29,并且由于與靶基因之一的RT-qPCR效率相似(未顯示)，因此基因TAFlA和HMBS作為RTT標(biāo)志物4-1BBL (又稱TNFSF9)以及IFN- Y (又稱IFNG)的RNA的參比基因是合適的。對(duì)于具有更高表達(dá)的備選標(biāo)志物，HPRTl或RPLPO可以視為合適的參比基因。因此總的來說，在這些分析中可以鑒定出數(shù)種合適的參比基因，它們的表達(dá)水平在所有實(shí)驗(yàn)條件下保持恒定?；赗TT標(biāo)志物基因TAFlA的表達(dá)水平，HMBS可以用作用于低表達(dá)的參比基因，HPRTl可用作用于中等表達(dá)的參比基因，或者RPLPO可用作用于高表達(dá)的參比基因。對(duì)于標(biāo)志物TNFSF9和IFNG，TAFlA適合用作參比基因。實(shí)施例13:在來自不同受試者的結(jié)核菌素PH)刺激的PBMC中，相比于未刺激的樣品測定4-1BBL (又稱TNFSF9)的表達(dá)，以確定RTT標(biāo)志物的背景表達(dá)，并確定用于區(qū)分具有活動(dòng)TB感染的患者與正常人的閾值對(duì)21名受試者的血液樣品實(shí)施本發(fā)明的RTT方法，以便獲得關(guān)于RTT標(biāo)志物4-1BBL(又稱TNFSF9)在健康受試者以及具有潛伏TB的患者中的平均背景表達(dá)的信息。為此目的，如實(shí)施例1中a)項(xiàng)下所述分離PBMC。對(duì)每份樣品將5xl06個(gè)PBMC在B細(xì)胞培養(yǎng)基中、在有和無10 μ g/ml結(jié)核菌素PPD存在下、37°C、5%C02濕潤氣氛中溫育6h時(shí)間。刺激以一式二份進(jìn)行，且獨(dú)立地進(jìn)行處理。溫育后離心沉降細(xì)胞，在含40mM DTT的RLT緩沖液(QIAGEN GmbH,Hilden,Germany)中裂解,并將裂解物立即冷凍于液氮中。根據(jù)制造商的說明用RNeasy小提試劑盒(QIAGEN)分離RNA，包括在柱 上進(jìn)行DNA酶消化。分別使用I μ gRNA利用QuantiTect逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(QIAGEN)按照制造商的說明進(jìn)行cDNA合成。qPCR使用I μ I cDNA,總反應(yīng)體積10 μ I,使用Applied Biosystems的TiK]MaT 快速通用主預(yù)混物。主預(yù)混物具有下述組成:300nM TNFSF9正向引物GAGGGTCCCGAGCTTTCG，由SEQ ID NO:1所示；300nM TNFSF9 反向引物 GCCCATCGATCAGCAGAAC，由 SEQ ID NO: 2 所示；200nM TNFSF9探針 FAM CCACCAGCTGCGCAAACATGC-TMR,由 SEQ ID NO: 3 所示；Ix TaqMan' 快速通用 PCR主預(yù)混物，Ix TaqMan 基因表達(dá)測定TAFlA VIC染料標(biāo)記的MGB探針(引物限定的)(Applied Biosystems)。qPCR的溫度曲線包括95。C變性20s，然后40個(gè)由95。C3s和60。C30s 組成的循環(huán)。qPCR 在 StepOnePlus 實(shí)時(shí) PCR 系統(tǒng)(Applied Biosystems)上進(jìn)行。對(duì)于21個(gè)樣品，分別來自兩次獨(dú)立刺激的比較性Cq分析(2_ΛΛ&1)結(jié)果的平均值示于圖15。這些分析顯示，對(duì)于具有潛伏TB的受試者、健康個(gè)體、以及BCG接種的健康個(gè)體，RTT標(biāo)志物TNFSF9的表達(dá)在刺激后的相對(duì)增加均低于或最多為2倍，而活動(dòng)感染的TB患者顯示表達(dá)增加多于2倍。因此，可以確定初步的閾值為2_λλ&1=2.0。因此該RTT方法可能分別區(qū)分活動(dòng)感染的TB患者,與健康個(gè)體或潛伏TB的受試者。實(shí)施例14:使用替代的部分合成的無血清培養(yǎng)基改進(jìn)IFN- Y (又稱IFNG)的表達(dá)為了研究使用替代的細(xì)胞培養(yǎng)基是否可增加IFN-Y (又稱IFNG)信號(hào)，測試了數(shù)種部分合成的培養(yǎng)基。常規(guī)使用的B細(xì)胞培養(yǎng)基含有IL-4，其可能導(dǎo)致IFNG信號(hào)的抑制。此外，該培養(yǎng)基含有自制的AB血清，這意味著無法最優(yōu)地保持標(biāo)準(zhǔn)條件，即質(zhì)量無變異的恒定條件。使用三名具有潛伏TB的受試者以及3名健康個(gè)體的血液樣品實(shí)施了本發(fā)明的方法。為此目的如實(shí)施例1a)項(xiàng)下所述分離了 PBMC。對(duì)每份樣品將5χ106個(gè)PBMC在2.5ml不同的細(xì)胞培養(yǎng)基中分別在有或無10 μ g/ml結(jié)核菌素PPD的存在下在37°C、5%C02的濕潤氣氛中溫育6h。測試了下列培養(yǎng)基:B細(xì)胞培養(yǎng)基(BZM+)，B細(xì)胞培養(yǎng)基無IL-4(BZM_)，無血清 UltraCULTURE 培養(yǎng)基(Ultra) (LONZA)和 AM V 培養(yǎng)基(AMV) (Invitrogen)。細(xì)胞裂解、RNA提取、cDNA合成和qPCR均如實(shí)施例13描述進(jìn)行。評(píng)估了 IFNG和4-1BBL (又稱TNFSF9)的表達(dá)增加(見圖16和圖17)。IFNG的主預(yù)混物具有下述組成:300nM IFNG正向引物 GTGGAGACCATCAAGGAAGACAT (Biomers)，由 SEQ ID NO: 7 所示；300nM IFNG 反向引物 GGCGACAGTTCAGCCATCA(Biomers)，由 SEQ ID NO:8 所示；200nM IFNG 探針 FAM-TTCATGTATTGCTTTGCGTTGGACATTCAA-TMR(TIB MOLB10L)，由 SEQ ID N0:9 所示；Ix TaqMan 快速通用PCR主預(yù)混物，Ix TaqMan 基因表達(dá)測定TAFlA VIC探針標(biāo)記的MGB探針(探針限定的)(AppliedBiosystems)。TNFSF9的主預(yù)混物具有下述組成:300nM TNFSF9正向引物 GAGGGTCCCGAGCTTTCG(Biomers)，由 SEQ ID NO:1 所示；300nMTNFSF9 反向引物GCCCATCGATCAGCAGAAC (Biomers)，由 SEQ ID 勵(lì):2所示；20011]\1 TNFSF9 探針 FAM-CCACCAGCTGCGCAAACATGC-TMR(TIB MOLBIOL)，由 SEQ ID N0:3 所示；lx TaqMan 怏速通用 PCR 主預(yù)混物，Ix TaqMan 基因表達(dá)測定TAFlA VIC探針標(biāo)記的MGB探針(探針限定的)(AppliedBiosystems)。qPCR的溫度曲線包括95°C變性20s，然后40個(gè)由95°C 3s和60°C 30s組成的循環(huán)。qPCR 在 StepOnePlus 實(shí)時(shí) PCR 系統(tǒng)(Applied Biosystems)上進(jìn)行。在Ultra⑶LTURE 和AM V培養(yǎng)基中刺激后IFNG表達(dá)(2_Δ Δε<1)的相對(duì)增加顯著強(qiáng)于常規(guī)的ΒΖΜ+。從B細(xì)胞培養(yǎng)基中去除IL-4(BZM_)沒有導(dǎo)致信號(hào)增強(qiáng)(圖16)。對(duì)于在Ultra⑶LTURE 中的刺激，在潛伏TB患者的樣品和健康受試者的樣品中檢測不到TNFSF9表達(dá)的相對(duì)增加。相比之下，在AM V培養(yǎng)基中的刺激導(dǎo)致分別相比于B細(xì)胞培養(yǎng)基和Ultra⑶LTURE 培養(yǎng)基的強(qiáng)的TNFSF9RNA表達(dá)的非特異性誘導(dǎo)(圖17)。這些分析顯示，培養(yǎng)基的選擇對(duì)于RTT標(biāo)志物基因的相對(duì)表達(dá)可能具有強(qiáng)的影響。使用LONZA的無血清Ultra⑶LTURE 培養(yǎng)基導(dǎo)致潛伏TB受試者的樣品中在RTT標(biāo)志物基因TNFSF9的恒定背景表達(dá)下IFNG信號(hào)的顯著增強(qiáng)。實(shí)施例15:使用三重qPCR同步檢測兩種RTT標(biāo)志物基因且同時(shí)針對(duì)參比基因標(biāo)準(zhǔn)化為了本發(fā)明RTT方法的簡化和改善實(shí)施性能，同時(shí)為了擴(kuò)展本發(fā)明RTT方法的應(yīng)用范圍，開發(fā)了一種三重RT-qPCR，其容許在一個(gè)反應(yīng)樣品中同時(shí)檢測RTT標(biāo)志物4-1BBL (又稱TNFSF9)以及用于檢測潛伏TB感染的標(biāo)志物IFN- Y (又稱IFNG)，并且還容許使用參比基因來將信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)化。如實(shí)施例12所述按照本發(fā)明的方法處理具有潛伏TB的受試者的樣品。qPCR用I μ lcDNA，總反應(yīng)體積為10 μ I，使用TaqMan 快速通用PCR主預(yù)混物(FastUniversal PCR Master Mix) (Applied Biosystems)來進(jìn)行。主預(yù)混物具有下面的組成:150nM TNFSF9 正向引物GAGGGTCCCGAGCTTTCG (Biomers),如 SEQ ID 勵(lì):1所示；150碰TNFSF9 反向引物 GCCCATCGATCAGCAGAAC(Biomers),由 SEQ ID NO:2 所示；200nMTNFSF9 探針 FAM-CCACCAGCTGCGCAAACATGC-BBQ(TIB MOLB10L),由 SEQ ID 勵(lì):3所示；30011]\1 IFNG 正向引物 GTGGAGACCATCAAGGAAGACAT (Biomers)，如 SEQ ID NO: 7 所示；300nM IFNG 反向引物GGCGACAGTTCAGCCATCA(Biomers)，由 SEQ ID 勵(lì):8所示；20011]\1 IFNG Sonde BoTMR-TTCATG
TATTGCTTTGCGTTGGACATTCAA-BBQ(TIB MOLB10L)，由 SEQ ID NO:9所示；Ix TaqMan 快速
通用PCR主預(yù)混物，Ix TaqMan .基因表達(dá)測定TAFlA VIC染料標(biāo)記的MGB探針(引物限定的)(Applied Biosystems)。qPCR的溫度曲線包括95°C變性20s，然后40個(gè)由95°C 3s和 60°C 30s 組成的循環(huán)。qPCR 在 StepOnePlus 實(shí)時(shí) PCR 系統(tǒng)(Applied Biosystems)上進(jìn)行。在圖18中描繪了對(duì)于具有潛伏性TB的受試者的一個(gè)樣品的比較性Cq分析(2_λλ&1)的結(jié)果。給出的是三重qPCR的結(jié)果(左)以及作為比較的相應(yīng)二重qPCR的結(jié)果(右)。該二重qPCR的樣品是如實(shí)施例14中所述制備的。這些比較性分析顯示，在多重反應(yīng)中檢測RTT標(biāo)志物，同時(shí)利用參比基因?qū)?shù)值標(biāo)準(zhǔn)化，在理論上是可能的。實(shí)施例16:兩名受試者的結(jié)核菌素pro刺激的PBMC中與未刺激樣品比較其他本發(fā)明RTT方法的標(biāo)志物基因的表達(dá)的測定為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明RTT方法的更高的靈敏度，使用SYBR綠系統(tǒng)進(jìn)行RT-qPCR測試了其他標(biāo)志物基因。為此目的，分別根據(jù)如實(shí)施例12中描述的本發(fā)明的方法處理潛伏TB患者以及健康受試者的樣品。qPCR以1μ lcDNA，總反應(yīng)體積20 μ 1，使用Brilliant III 超快速 SYBR 綠 QPCR 主預(yù)混物(Brilliant III Ultra-Fast SYBR GreenQPCR Master Mix, Agilent Technologies 產(chǎn))進(jìn)行。主預(yù)混物具有下列組成:300nM正向引物，300nM反向引物，IxBrilliant III超快速SYBR綠QPCR主預(yù)混物，300nM參比染料。使用下列引物對(duì):FCGR1A/B/C正向引物GAAGGGGTGCACCGGAA(TIBMOLBIOL)，由 SEQ ID NO:16 所示;FCGR1A/B/C 反向引物 CTCACGGGGAGCAAGTGG(TIB MOLBIOL)，由 SEQ ID NO: 17 所示；CXCL9 正向引物 GAGTGCAAGGAACCCCAGTAGT，由 SEQ ID NO: 18所示；CXCL9 反向引物 GGTGGATAGTCCCTTGGTTGGT，由 SEQ ID NO: 19 所示；CXCLlO正向引物 TCCACGTGTTGAGATCATTGC，由 SEQ ID NO:20 所示；CXCLlO 反向引物TCTTGATGGCCTTCGATTCTG,由 SEQ ID NO:21 所示；CXCLll 正向引物 CAAGGCTTCCCCATGTTCA，由 SEQ ID NO: 22 所示；CXCLl I 反向引物 CCCAGGGCGTATGCAAAGA，由 SEQ ID NO: 23 所示(所有CXCL引物均來自 Theresa Knoblach 的博士論文，2010,DasCytomegalievirus IEl-Proteinals Regulator des humanen Transkriptoms undZielstruktur RNAi—basierterTherapiestrategien, University of Regensburg)。qPCR 的溫度曲線包括 95。C 變性 3 分鐘，40個(gè)由95°C 5s和60。。IOs組成的循環(huán)。qPCR在St印OnePlus實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(AppliedBiosystems)上進(jìn)行。圖19中給出了兩個(gè)樣品的比較性Cq分析(2Λ&1)的結(jié)果。本項(xiàng)對(duì)潛伏TB感染患者和健康個(gè)體分別的經(jīng)刺激和未刺激的樣品的比較分析提示這些基因可能適合作為檢測潛伏TB疾病的標(biāo)志物。
權(quán)利要求
1.一種用于檢測、區(qū)分和定量T細(xì)胞群體的方法，包括下述步驟: a)使第一等份的個(gè)體體液與至少一種抗原接觸，其中所述體液含有抗原呈遞細(xì)胞(APC)和T細(xì)胞， b)將所述第一等份與所述至少一種抗原溫育一段特定的時(shí)間， c)通過利用逆轉(zhuǎn)錄定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR)檢測所述第一等份中以及未與所述至少一種抗原溫育過的第二等份的個(gè)體體液中由特定T細(xì)胞群體中的T細(xì)胞誘導(dǎo)的至少第一種APC標(biāo)志物來檢測和區(qū)分T細(xì)胞群體，和 d)通過確定檢測到的第一等份的APC標(biāo)志物與第二等份的比例來檢測和定量T細(xì)胞群體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中在步驟c)中還在所述第一等份和第二等份中檢測至少第二種標(biāo)志物，其中所述第二種標(biāo)志物是T細(xì)胞自身的被誘導(dǎo)的標(biāo)志物，并且步驟d)包括通過確定所述第一等份中檢測到的第一種APC標(biāo)志物與第二種T細(xì)胞標(biāo)志物相對(duì)于第二等份的比例來檢測和定量T細(xì)胞群體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中所述方法在步驟a)中進(jìn)一步包含步驟a’)將所述第二等份接觸至少一種抗原，并且在步驟b)中還包含步驟b’)將所述第二等份與抗原溫育一段特定的時(shí)間，其中步驟b’)中的所述一段時(shí)間與步驟b)中的所述一段時(shí)間不同；此夕卜，包含步驟c ’ )通過RT-qPCR檢測第一和第二等份中的第一種標(biāo)志物來檢測和區(qū)分T細(xì)胞群體，以取代步驟c);并包含步驟d)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的方法，其中步驟c’)包括通過檢測所述第一種和第二種標(biāo)志物來檢測和區(qū)分所述T細(xì)胞群體。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的方法，其中將所述體液等份分成僅含APC的等份A和含有T細(xì)胞的等份B，且其中步驟a)包括步驟al)使等份A接觸至少一種抗原，以及后續(xù)的步驟a2)使接觸過所述至少一種抗原的等份A接觸等份B。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的方法，其中所述T細(xì)胞群體含有幼稚T細(xì)胞、活化T細(xì)胞或記憶T細(xì)胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的方法，其中所述T細(xì)胞群體的T細(xì)胞是CD4+T細(xì)胞，Th-1細(xì)胞，Th-2細(xì)胞，Th-17細(xì)胞，CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，Th_3細(xì)胞，CD8+T細(xì)胞，CD4TD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞，⑶4+⑶8+T細(xì)胞，⑶161+NKT細(xì)胞和/或多種T細(xì)胞的混合物。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的方法，其中所述體液是血液，腦脊液，淋巴、心包液、支氣管灌洗液、骨髓抽吸物、淋巴組織懸液或純化的PBMC群體。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的方法，其中所述抗原是肽、寡肽、多肽、蛋白質(zhì)、RNA或DNA。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的方法，其中所述抗原是細(xì)菌、病毒、植物、動(dòng)物、真菌或寄生物的抗原。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的方法，其中所述抗原選自下組:PSA、HER-2/neu、黏蛋白-1、MAGE、CEA、髓鞘堿性蛋白(MBP)、髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(MOG)、髓鞘蛋白脂質(zhì)蛋白(PLP)、髓磷脂、胰島素 B、前胰島素原、IA-2、GAD65、Hsp60、ESAT-6、CFP-10, TB7.7、TB37.6、MPT63、結(jié)核菌素 PPD、VlsE, p58 (BBQ03)、pl4、p21_24 (OspC)、p37_38 (FlaA)、p41、pl9 (OspE)、pl8、Crasp3> BB0323、p26 (OspF)、p28 (OspD)、p30、p39 (BmpA)、p60_65 (共有抗原，Hsp60)、p83-100、pl7 (Ospl7)、p31_32 (OspA)、p34 (Osp B)、疏螺旋體屬脂質(zhì)、疏螺旋體屬菌株裂解物、？1'55卿424417、？01^、1 1\1^^邛口65、比1、比2、821^138嫩3』8嫩2』8嫩6、BMLF1、EBNA1、0RF1、0RF4、PRF62、0RF68、HBsAg, HBcAg 和 AdV5。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)的方法，其中用于步驟a)中接觸和步驟b)中溫育的一段時(shí)間為O小時(shí)至72小時(shí)，優(yōu)選4、6、或8小時(shí)。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的方法，其中所述第一種APC標(biāo)志物和第二種T細(xì)胞標(biāo)志物分別是核酸或蛋白質(zhì)，尤其是RNA、DNA、核酸片段、肽或肽片段，并且通過與所述至少一種抗原接觸和溫育而被誘導(dǎo)。
14.根據(jù)權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)的方法，其中所述APC標(biāo)志物為4-1BB配體(4-1BBL)、0X4 0 配體(0X40L)、TNFSF (CD70)、B7.1 (CD80)、B7.2 (CD86)、Fe Y RIII (CD16)、FcyRII (CD32), Fe y RI (CD64)或TNF/TNF-受體和/或免疫球蛋白超家族的其他代表。
15.根據(jù)權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)的方法，其中所述T細(xì)胞標(biāo)志物為IFN-β、INF-Y、TNF- a、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL_13、GM_CSF、TGF-β、MIPla、MIPlb、4_lBB、CD25、穿孔蛋白和/或顆粒酶。
16.根據(jù)權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)的方法，其中步驟c)和d)中的檢測和定量還通過PCR、定量 PCR(qPCR)、微陣列、FACS、ELISpot 和 / 或 ELISA 來實(shí)施。
17.用于實(shí)施根據(jù)權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的方法的試劑盒，其包括抗原和用于擴(kuò)增所述標(biāo)志物的引物對(duì)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于檢測、區(qū)分和定量T細(xì)胞群體的方法，包括下述步驟a)使第一等份的個(gè)體體液與至少一種抗原接觸，其中所述體液含有抗原呈遞細(xì)胞(APC)和T細(xì)胞，b)將所述第一等份與所述至少一種抗原溫育一段特定的時(shí)間，c)通過利用逆轉(zhuǎn)錄定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR)檢測所述第一等份中以及未與所述至少一種抗原溫育過的第二等份的個(gè)體體液中由特定T細(xì)胞群體中的T細(xì)胞誘導(dǎo)的至少第一種APC標(biāo)志物來檢測和區(qū)分T細(xì)胞群體，和d)通過確定檢測到的第一等份的APC標(biāo)志物與第二等份的比例來檢測和定量T細(xì)胞群體。本發(fā)明還涉及用于實(shí)施該方法的試劑盒。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103109191SQ201180044913
公開日2013年5月15日 申請日期2011年9月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月17日
發(fā)明者L.黛摩爾, K.瑙曼, K.施羅姆斯, S.巴拉巴斯 申請人:洛菲厄斯生物科學(xué)有限責(zé)任公司