旋轉(zhuǎn)掃描的實時熒光定量pcr檢測系統(tǒng)的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及臨床分子診斷、檢驗檢疫、刑偵、農(nóng)林牧副漁、食品安全以及科學(xué)教育等的DNA片段擴(kuò)展與檢測。
【背景技術(shù)】
[0002]聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain react1n, PCR)是一種體外核酸定量，即DNA片段在體外特異性地擴(kuò)增。由高溫變性、低溫退火及適溫延伸等幾步反應(yīng)組成一個周期，循環(huán)進(jìn)行，使目的DNA得以迅速擴(kuò)增，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡便、省時等特點，是基因擴(kuò)增技術(shù)的一次重大革新。PCR技術(shù)可將極微量的靶DNA特異地擴(kuò)增上百萬倍，從而大大提高對DNA分子的分析和檢測能力。
[0003]定量熒光PCR技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針或相應(yīng)的熒光染料實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。
[0004]一般來講，定量熒光PCR儀是實時檢測PCR反應(yīng)的儀器，有兩個功能模塊:保證PCR、反應(yīng)進(jìn)行的熱循環(huán)儀和熒光實時檢測系統(tǒng)。這樣一臺儀器主要由樣品載臺、基因擴(kuò)增熱循環(huán)組件、微量熒光檢測光學(xué)系統(tǒng)、微電路控制系統(tǒng)、計算機(jī)及應(yīng)用軟件組成。其中基因擴(kuò)增熱循環(huán)組件工作原理與傳統(tǒng)基因擴(kuò)增儀大致相同，分別采用空氣加熱、壓縮機(jī)制冷、半導(dǎo)體加熱制冷等工作方式。熒光檢測系統(tǒng)主要有由熒光激發(fā)部件、光路、熒光檢測部件、控制系統(tǒng)組成。常用的熒光激發(fā)光源有兩種:鹵鎢燈和LED ;熒光檢測元件常用兩種方式:光電倍增管和制冷CXD相機(jī)。
[0005]目前主流實時PCR的工作模式按照激發(fā)與探測的位置關(guān)系分類有以下三種。
[0006](a)底部檢測模式需要在金屬塊底部加工通孔，并且采用多孔的半導(dǎo)體加熱制冷片，但是器件加工難度大，成本高；多孔的半導(dǎo)體加熱制冷片的功率和能量分布的不均勻，造成升降溫速度慢。
[0007](b)側(cè)面檢測模式由于底部封閉，可以采用成熟的大功率半導(dǎo)體加熱制冷片，升降溫速度快，擴(kuò)增效率高，但是需要在金屬塊中放置光纖，光纖頭容易被污染，難以清潔和維護(hù)；由于側(cè)壁開口擴(kuò)增反應(yīng)試管接收的熱能分布不均勻，一定程度升降溫速度和內(nèi)部的反應(yīng)進(jìn)行，表現(xiàn)在熒光強(qiáng)度下降。
[0008](C)傳統(tǒng)的頂部檢測模式，加熱制冷模塊封閉，可以采用成熟的大功率半導(dǎo)體加熱制冷片，升降溫速度快，擴(kuò)增效率高，采用二維電機(jī)驅(qū)動掃描激發(fā)檢測頭或者制冷CCD進(jìn)行檢測。二維電機(jī)驅(qū)動掃描，速度慢，機(jī)電結(jié)構(gòu)復(fù)雜；采用制冷CCD，速度快，但是由于器件本省特性導(dǎo)致穩(wěn)定性差、成本高、故障率高。
[0009]實時PCR儀按照采用的探測器種類可以分類為點探測器(如光電倍增管或者雪崩二極管)和二維面陣列探測器(如制冷CCD相機(jī))。采用點探測器需要二維掃描，速度慢，但性能參數(shù)占優(yōu)，如信噪比高、動態(tài)范圍大等。采用二維面陣列探測器一般無需掃描，檢測速度快，但是性能相對不足。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]針對現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷和不足，本發(fā)明的目的在于提供一種快速、準(zhǔn)確、方便、檢測靈敏度高、精度與重復(fù)精度高的旋轉(zhuǎn)掃描的實時PCR檢測系統(tǒng)。
[0011]一種旋轉(zhuǎn)掃描的定量熒光PCR檢測系統(tǒng)，該檢測系統(tǒng)包括熒光檢測裝置、光源激發(fā)裝置、熱循環(huán)模塊裝置、光信號傳輸裝置四大部分。
[0012]具體而言，熒光檢測裝置包括步進(jìn)電機(jī)1、電機(jī)固定盤2、光纖固定盤3、光路選通旋轉(zhuǎn)片保護(hù)環(huán)4、光路選通旋轉(zhuǎn)片5、濾光片固定盤6，濾光片固定盤6上設(shè)有可插放及換取濾光片7的孔，用以完成多種波長信號檢測；
[0013]步進(jìn)電機(jī)I的輸出軸通過光纖固定盤3、光路選通旋轉(zhuǎn)片保護(hù)環(huán)4與光路選通旋轉(zhuǎn)片5相連；步進(jìn)電機(jī)I安裝在電機(jī)固定盤2上；光路選通旋轉(zhuǎn)片5與光纖固定盤3、光路選通旋轉(zhuǎn)片保護(hù)環(huán)4均無接觸；所述電機(jī)固定盤2、光纖固定盤3、光路選通旋轉(zhuǎn)片保護(hù)環(huán)4、濾光片固定盤6均固定在底座8上。
[0014]熒光檢測裝置的底座8上設(shè)有與PMT保護(hù)裝置9探測窗口對應(yīng)的孔，使得PMT探測窗口對準(zhǔn)光纖輸出端聚焦器25 ;步進(jìn)電機(jī)I旋轉(zhuǎn)帶動光路選通旋轉(zhuǎn)片5選通特定通路，以使該光路導(dǎo)通，其中的熒光信號通過濾光片7濾除雜光使特定有效波長傳輸?shù)絇MT保護(hù)裝置9中，PMT保護(hù)裝置9將接收到的光信號轉(zhuǎn)化，被電信號輸出給后期處理電路進(jìn)行信號處理。
[0015]光源激發(fā)裝置包括耦合筒固定裝置11、耦合筒12 ;所述耦合筒12固定在耦合筒固定裝置11上，耦合筒12在耦合筒固定裝置11上為4X4均勻布置的陣列方式；耦合筒12內(nèi)安裝有聚焦裝置，光纖光源端準(zhǔn)直器24及LED陣列13分別位于聚焦裝置的像面焦點處及物面焦點處；在LED陣列13背部安裝有光源散熱器10。
[0016]熱循環(huán)模塊裝置包括自上而下裝置成一體的可插放多個試管的多孔反應(yīng)池15、反應(yīng)池固定裝置16、加熱制冷片17、反應(yīng)池制冷散熱器19、反應(yīng)池制冷散熱風(fēng)扇20 ;反應(yīng)池15與反應(yīng)池固定裝置16連接，反應(yīng)池固定裝置16與加熱制冷片17連接，加熱制冷片17與反應(yīng)池制冷散熱器19連接，反應(yīng)池制冷散熱器19與反應(yīng)池制冷散熱風(fēng)扇20連接；熱循環(huán)模塊裝置固定在導(dǎo)軌21上，熱循環(huán)模塊可沿導(dǎo)軌21滑動，以改變熱循環(huán)模塊沿水平方向的位置；多孔防揮發(fā)熱蓋升降裝置18與多孔防揮發(fā)加熱蓋14連接，以改變多孔防揮發(fā)加熱蓋14豎直方向的位置；
[0017]通過調(diào)節(jié)導(dǎo)軌21、多孔防揮發(fā)熱蓋升降裝置18使得多孔防揮發(fā)加熱蓋14上的孔位與反應(yīng)池15的孔相對應(yīng)；反應(yīng)池15與加熱制冷片17之間具有傳熱介質(zhì)，例如導(dǎo)熱固化膠或?qū)嵯嘧儾牧匣驅(qū)崾龋磻?yīng)池固定裝置16上兩側(cè)的內(nèi)扣結(jié)構(gòu)使反應(yīng)池15、加熱制冷片17、反應(yīng)池制冷散熱器19緊密連接；
[0018]該發(fā)明檢測裝置中，光信號通過光纖傳輸?shù)?；光信號傳輸裝置包括多模Y型光纖22、光纖公共端聚焦器23、光纖光源端聚焦器24、光纖輸出端聚焦器25 ;多模Y型光纖22的端口分別為光纖公共端聚焦器23、光纖光源端聚焦器24、光纖輸出端聚焦器25。
[0019]光纖公共端聚焦器23插入多孔防揮發(fā)熱蓋14的孔中，調(diào)整光纖公共端聚焦器23的聚焦焦點位于多孔反應(yīng)池15每個反應(yīng)池中心處、光纖輸出端聚焦器24焦點與耦合筒12中有聚焦裝置的焦點重合。
[0020]光纖光源端聚焦器25插入光纖固定盤3對應(yīng)的孔中，其聚焦器焦點位于PMT保護(hù)裝置9探測窗口中心。
[0021]本發(fā)明采用成熟的大功率半導(dǎo)體加熱制冷片實現(xiàn)PCR反應(yīng)的溫度循環(huán)，升降溫速度快，擴(kuò)增效率高。
[0022]本發(fā)明與現(xiàn)有實時PCR裝置相比，具有以下優(yōu)點。
[0023]本發(fā)明可克服傳統(tǒng)突光定量PCR米取二維掃描方式獲得各試管的突光信號的缺點與不足:1.儀器掃描機(jī)械結(jié)構(gòu)復(fù)雜，定位精度與重復(fù)定位精度不同，操作繁瑣，空間體積大，不利于小型化。2、一次檢測中，對于不同試管的檢測精度不同。在進(jìn)行掃描中，電機(jī)帶動光纖準(zhǔn)直頭運(yùn)動，由于對準(zhǔn)每一個試管定位精度不相同，以及光纖準(zhǔn)直頭的震動會影響熒光信號的探測精度，造成一個檢測時，不同試管的檢測精度不同相同。3、不同檢測批次之間的精度不同。由于定位精度與重復(fù)定位精度不同，各個反應(yīng)批次中相同位置的試管的檢測，也不相同。4、檢測時間長，二維掃描，光纖位置需要復(fù)位，時間長。
【附圖說明】
[0024]圖1旋轉(zhuǎn)掃描的實時熒光定量PCR檢測系統(tǒng)。
[0025]圖2為光路選通裝置結(jié)構(gòu)裝配圖。
[0026]圖3為光路選通裝置零件示意圖。
[0027]圖4為光源激發(fā)裝置示意圖。
[0028]圖5為熱循環(huán)模塊裝置示意圖。
[0029]圖中:1、步進(jìn)電機(jī)，2、電機(jī)固定盤，3、光纖固定盤，4、光路選通旋轉(zhuǎn)片保護(hù)環(huán)，5、光路選通旋轉(zhuǎn)片，6、濾光片固定盤，7、濾光片，8、底座，9、PMT保護(hù)裝置，10、光源散熱器，11、耦合筒固定裝置，12、耦合筒，13,LED陣列，14、多孔防揮發(fā)加熱蓋，15、多孔反應(yīng)池，16、反應(yīng)池固定裝置，17、加熱制冷片，18多孔防揮