基于宏基因組學(xué)的病毒感染檢測及鑒定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明涉及病毒的檢測與鑒定，具體涉及一種基于宏基因組學(xué)和高通量測序的病 毒檢測鑒定技術(shù)。
【背景技術(shù)】：
[0002] 隨著人類經(jīng)濟和社會的不斷發(fā)展，人類的活動范圍越來越大，與野生動物的接觸 越來越密切、越來越頻繁，野生動物攜帶的病毒直接或通過媒介如蚊子、蜱等傳致人的風(fēng)險 越來越大，構(gòu)成了人類新發(fā)傳染病的70%左右。這些新發(fā)傳染病如2003年中國發(fā)生的非 典、2007 -2010年中國發(fā)生的新布尼亞病毒導(dǎo)致的疫情、2014年在西非肆虐的埃博拉疫情、 2015年由中東傳致韓國的MERS，給病毒感染的檢測鑒定技術(shù)提出了極大的挑戰(zhàn)。由于這 些新發(fā)傳染病的病原體往往是未知病原，與已知病原的同源性很低，傳統(tǒng)的檢測方法如基 于已知病毒核酸序列建立的PCR技術(shù)、基于已知病毒組分建立的血清學(xué)技術(shù)等通常都會失 靈。這給新發(fā)傳染病的及時防控帶來了極大的負面影響。
[0003] 基于PCR或者血清學(xué)的技術(shù)都需要預(yù)先已知病毒的信息，或者是核酸序列，或者 是病毒的關(guān)鍵組分，這些技術(shù)特點嚴重限制了它們在新發(fā)傳染病病原體檢測上的應(yīng)用。另 外一項有希望用于新發(fā)傳染病病原體檢測的技術(shù)是在特點的培養(yǎng)基或細胞上對病原體進 行培養(yǎng)，然后提取核酸進行基因組測序。但是這一技術(shù)因為三個缺點其應(yīng)用受到嚴重限制。 首先，培養(yǎng)基或細胞類型的選擇是個難題。由于對新發(fā)傳染病病原體的認識非常有限甚至 是空白，所以應(yīng)用這一技術(shù)進行新發(fā)傳染病病原體的檢測幾乎完全是靠運氣。選對了培養(yǎng) 基或細胞類型，可以得到正確的檢測結(jié)果。選錯了培養(yǎng)基或細胞類型就會得到陰性結(jié)果。這 一選擇難題嚴重影響了這一檢測方法的靈敏度。其次，活的病原體的培養(yǎng)對生物安全防護 水平提出了很高的要求。例如，2003年非典是由SARS冠狀病毒導(dǎo)致的，需要達到生物安全 三級（P3)防護水平才能開展病毒培養(yǎng)實驗。2014年西非的埃博拉病毒需要生物安全四級 (P4)的防護水平。而具備這些生物安全防護水平的實驗室非常有限，嚴重限制了這一技術(shù) 的廣泛應(yīng)用。第三，從培養(yǎng)到提取核酸再到基因組測序整個實驗流程耗時長，不能滿足傳 染病防控的需求。
[0004] 鑒于上述檢測技術(shù)的局限性，發(fā)明新的快速、靈敏、準確、方便的病原體檢測技術(shù) 勢在必行。針對傳染病防控的這一特殊需求，我們發(fā)明了一套基于宏基因組學(xué)的病毒檢測 鑒定技術(shù)體系。該體系不需要培養(yǎng)病原體，對生物安全防護水平要求低，不限于特定的病 毒種類，可適用于所有已知的和未知遠緣的病毒的檢測，不限于單一病毒的檢測，也可用于 病毒混合感染的檢測，對樣本的需求量低，檢測時間短，檢測靈敏，結(jié)果可靠，給出的信息全 面。盡管這套技術(shù)體系針對傳染病的防控而發(fā)明，但其應(yīng)用不限于傳染病的防控，可以進一 步拓展到其他方面如臨床樣本的精準醫(yī)學(xué)分析、動植物樣本的微生物組成分析等等。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種基于宏基因組學(xué)的病毒檢測方法。
[0006] 本發(fā)明所述的檢測方法，包括樣本制備、高通量測序、生物信息學(xué)分析、結(jié)果復(fù)核 等四個步驟。
[0007] 具體的，本發(fā)明所述的檢測方法，包括以下步驟：
[0008] (1)樣本制備：基于微量、痕量待檢測樣本富集、提取病毒核酸構(gòu)建可用于高通量 測序的核酸庫；
[0009] (2)高通量測序：設(shè)定輔助基于宏基因組學(xué)技術(shù)的病毒感染檢測的內(nèi)參、對照；
[0010] (3)生物信息學(xué)分析：本系統(tǒng)的主體部分，從高通量測序數(shù)據(jù)中準確分析樣本中 的物種組成，包括遠緣未知的病毒組成。
[0011] (4)結(jié)果復(fù)核：綜合多方面信息，對生物信息學(xué)分析結(jié)果就行遴選、復(fù)核。
[0012] 一.樣本制備
[0013]其中，步驟（1)所述樣本制備：針對微量（彡1ml)、痕量（彡lul)待檢測樣本，本 發(fā)明采用了一套訂制的聚合酶鏈反應(yīng)（PCR，PolymeraseChainReaction)擴增技術(shù)制備高 通量測序所需的核酸文庫。
[0014] 具體地，步驟（1)所述樣本制備部分包括以下八個步驟：病毒滅活、樣本定量、病 毒純化、背景消除、提取核酸、合成互補DNA(cDNA，complementaryDNA)、等比例擴增、核酸 純化。
[0015] 第一步，病毒滅活：樣本要根據(jù)疑似病毒的種類和樣本的特點采取通用的或特異 的病毒滅活方法進行滅活。這一步不僅充分保障了實驗人員的人身安全，而且簡便有效地 降低了病毒檢測任務(wù)對生物安全防護水平的要求，同時也充分保留了病毒的遺傳信息。
[0016] 第二步，樣本定量：對樣本總量、樣本所含病毒載量、病毒核酸量進行初步測定和 估計，從而為后續(xù)實驗步驟制定詳細計劃。
[0017] 第三步，病毒純化：通過超速離心將病毒顆粒進行富集純化，從而提高病毒序列在 最后結(jié)果中所占的比例。
[0018] 第四步，背景消除：在提取病毒核酸前將宿主的DNA和RNA利用DNA酶和RNA酶進 行充分消化。
[0019] 第五步，提取核酸：提取病毒核酸，主要提取病毒的核糖核酸。
[0020] 第六步，合成CDNA:將第五步提取出來的病毒核糖核酸轉(zhuǎn)化成更穩(wěn)定更易保存的 cDNA〇
[0021] 第七步，等比例擴增：基于聚合酶鏈反應(yīng)（PCR)將第六步獲得的cDNA進行用隨機 引物進行擴增，直到滿足下一步高通量測序所要求的上樣量。這一步是可選步驟。如果第 六步獲得的cDNA量足夠進行高通量測序，則直接進入高通量測序環(huán)節(jié)。
[0022] 第八步，核酸純化：純化第六步或第七步獲得的病毒核酸用于后續(xù)的高通量測序。
[0023] 二.高通量測序
[0024] 其中，步驟2所述高通量測序：根據(jù)病毒檢測的需求，人工合成序列已知、數(shù)量已 知的核酸序列作為樣本核酸庫的內(nèi)參；對序列已知并與樣本檢測平行進行的對照核酸庫進 行測序。
[0025] 具體地，步驟（2)所述高通量測序包括三個步驟：構(gòu)建高通量測序文庫、高通量測 序、將圖像測序信號轉(zhuǎn)換為核酸序列信息。為提高基于高通量測序的病毒檢測技術(shù)的準確 性，我們在高通量測序文庫構(gòu)建這一步增加了我們設(shè)計的內(nèi)參樣本，以衡量病毒核酸在樣 本中的豐度；與樣本測序平行，我們增加了對照樣本同時進行高通量測序，以評價整個檢測 系統(tǒng)的平穩(wěn)運行，同時為最后結(jié)果復(fù)核部分提供重要的背景信息。
[0026] 三?生物信息學(xué)分析
[0027] 其中，步驟3所述生物信息學(xué)分析包括以下8個單元：
[0028] 病原數(shù)據(jù)庫構(gòu)建系統(tǒng)：從公共生物信息數(shù)據(jù)庫中下載并整理病原體（包括病毒但 不限于病毒）和宿主相關(guān)的核酸、蛋白質(zhì)的序列信息、結(jié)構(gòu)信息、進化信息；
[0029] 高通量測序數(shù)據(jù)質(zhì)量控制系統(tǒng)：對高通量測序數(shù)據(jù)進行質(zhì)量控制，包括剔除不合 格序列、剪切不合格序列、修正不合格序列等部分；
[0030] 宿主序列去除系統(tǒng)：將高通量測序數(shù)據(jù)中與宿主基因組、轉(zhuǎn)錄組高度同源的序列 去除；
[0031] 宏基因組學(xué)拼接系統(tǒng)：將短的、多的高通量測序序列拼接成長的、少的疊連群 (Contig)序列，特別是將短肽拼接為長的蛋白質(zhì)序列進而進行病毒檢測是本發(fā)明的一大特 色；
[0032] 序列比對搜索系統(tǒng)：將高通量測序序列或疊連群（Contig)序列與病原數(shù)據(jù)庫進 行比對搜索，找出與查詢序列相似或高度同源的數(shù)據(jù)庫條目；
[0033] 物種信息映射系統(tǒng)：根據(jù)序列比對搜索結(jié)果確定查詢序列的物種來源；
[0034] 物種組成分析系統(tǒng)：根據(jù)物種信息映射的結(jié)果分析樣本中的物種組成；
[0035] 多樣本物種組成高級分析系統(tǒng)：對多個樣本的物種組成進行高級分析如比較相似 性、尋找共同物種組成、尋找差異物種組成、尋找生物標記物等。
[0036] 具體地，步驟（3)所述生物信息學(xué)分析包括病原數(shù)據(jù)庫構(gòu)建系統(tǒng)、高通量測序數(shù) 據(jù)質(zhì)量控制系統(tǒng)、宿主序列去除系統(tǒng)、宏基因組學(xué)拼接系統(tǒng)、序列比對搜索系統(tǒng)、物種信息 映射系統(tǒng)、物種組成分析系統(tǒng)、多樣本物種組成高級分析系統(tǒng)共8個單元組成。這8個功能 單元各司其職共同構(gòu)成了整個生物信息學(xué)分析流程。
[0037] 第一，病原數(shù)據(jù)庫構(gòu)建系統(tǒng)從公共生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫中提取病原體（不限于病 毒）和宿主的序列信息、結(jié)構(gòu)信息、進化信息，然后將這些信息按照信息種類、物種類別整 理成多個宿主數(shù)據(jù)庫、病原體數(shù)據(jù)庫和不同組合的綜合庫，以供后續(xù)序列比對搜索系統(tǒng)使 用。目前參考的公共生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫包括美國生物技術(shù)信息中心NCBI(http://WWW. ncbi.nlm.nih.gov/)、歐洲生物信息學(xué)研究院EBI(http://www.ebi.ac.uk/)、歐洲的基 因組注釋數(shù)據(jù)庫ENSEMBL(http://www.ensembl.org/index.html)、歐洲的蛋白質(zhì)總庫 UNIPROT(http://www.uniprot.org/)、蛋白質(zhì)家族數(shù)據(jù)庫PFAM(http://pfam.xfam.org/)、 RNA家族數(shù)據(jù)庫RFAM(http: //rfam.xfam.org/)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫](http: //www. rcsb.org/pdb