專(zhuān)利名稱(chēng)：一種來(lái)自深海宏基因組的l-蛋氨酸裂解酶基因及其表達(dá)產(chǎn)物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域和基因工程領(lǐng)域，涉及了一種來(lái)自深海環(huán)境的新基 因，尤其是一種來(lái)自深海宏基因組的能產(chǎn)生L-蛋氨酸Y -裂解酶活性的新基因，獲得了新 基因的克隆，構(gòu)建了工程大腸桿菌并獲得表達(dá)產(chǎn)物。 L-蛋氨酸 γ-裂解酶(L-methionine γ-lyase，簡(jiǎn)稱(chēng) MGL 或 METase)，是一種 5’ -磷酸吡哆醛(PLP)依賴(lài)型的多功能酶。它主要催化L-蛋氨酸的Y-消去反應(yīng)，生成 甲硫醇、氨和α-丁酮酸，該酶還能催化L-半胱氨酸和硫代L-半胱氨酸的β-消去反應(yīng) 以及L-甲硫氨酸和L-半胱氨酸及它們的衍生物的Y，β -取代反應(yīng)。MGL催化L-蛋氨酸 Y-消去的反應(yīng)方程式(參見(jiàn) Ilya V. Manukhov et. al. Journal of Bacteriology. 2005, 187 3889-3893)。 MGL主要在微生物中發(fā)現(xiàn)，包括細(xì)菌和某些原生動(dòng)物。1951年首次在Escherichia coli中首次發(fā)現(xiàn)能夠代謝L-蛋氨酸的酶，最初并命名為“蛋氨酸酶”(methionase)，隨后
幾十年間又陸續(xù) 艮道了從 Pseudomonas putida( = ovalis) > Clostridium sporogenes、 Aeromonas sp、 Citrobacter intermedius、 Brevibacteriumlinens、 Trichomonas vaginalis、Porphyromonas gingival is 細(xì)胃禾口 Hi t亥 · Entamoeba histolytica 禾口
Trichomonas vaginalis中發(fā)現(xiàn)了 MGL，其中的一些已經(jīng)進(jìn)行了酶的純化和性質(zhì)的測(cè)定 (Tomoaki Takakura et. al. AnalyticalBiochemistry 327 :233_240，2004 ；夏立亮等，生 物技術(shù)通報(bào)，10 :70-74，2009)。 近年來(lái)，在癌癥治療的新方法研究中發(fā)現(xiàn)，多種癌細(xì)胞生 長(zhǎng)需要大量的L-蛋氨酸，即具有L-蛋氨酸依賴(lài)性(Hoffman RM & Erbe Rff. , Proc Natl Acad Sci USA, 73 1523-1527,1976) 通過(guò)輸入外源MGL來(lái)消耗腫瘤組織的L-蛋氨酸， 使癌細(xì)胞不能分裂并停滯于細(xì)胞分裂期的S/G2后期，因此達(dá)到治療的目的(HofTmanRM & Jacobsen SJ. Proc Natl Acad Sci USA 77 :7306_7310，1980 ；Kokkinakis DM. et. al. Br J Cancer 75 =779-788,1997)。研究還表明利用帶有MGL基因的腺病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)癌細(xì)胞，導(dǎo)致 selenomethionine生成methylselenol，后者產(chǎn)生的氧化壓力使細(xì)胞色素C釋放而激活細(xì) 胞凋亡(K. Miki et al. Cancer Research 61 :6805_6810，2001)。 此外，MGL作為一個(gè)多功能酶，能夠?qū)Χ喾N底物起催化作用，并且因此作為一 種檢測(cè)試劑在臨床檢測(cè)中具有重要意義；應(yīng)用MGL檢測(cè)各種環(huán)境中蛋氨酸和/或同
背景技術(shù)：
methanethiol (i-ketobutyrate ammonia
3型半胱氨酸含量的方法已經(jīng)在美國(guó)授予專(zhuān)利(US Patent 5885767 (1999，3)-Methods and compositions for quantitating L-homocysteine and/orl-methionine in a solution) 在食品工業(yè)中MGL可以使蛋氨酸等成分直接產(chǎn)生甲硫醇類(lèi)物質(zhì)因而用于改 進(jìn)食品風(fēng)味(Fdlix Amarita. et. al. , Applied andEnvironmental Microbiology, 70 7348-7354,2004)。MGL還可以用于重要生化藥物α-氨基丁酸的生物合成。由于蛋氨酸裂解酶具有重要應(yīng)用前景，需要對(duì)該酶進(jìn)行規(guī)?；苽洹＠米匀?分離的菌株或其突變株進(jìn)行酶的制備，酶的產(chǎn)量極低，難以實(shí)現(xiàn)有效益的規(guī)模生產(chǎn)；目前 主要傾向應(yīng)用基因工程的菌株進(jìn)行酶的制備。Y. Tan等將來(lái)自Pseudomonas putida的 L-methionine α -deamino- y -mercaptomethane-lyase (艮口 METase 或 MGL)基因連接至丨J 含有T7RNA聚合酶啟動(dòng)子的表達(dá)載體pT7-7上，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21 (DE3)中進(jìn)行表達(dá)， 表達(dá)產(chǎn)物中重組MGL約占可溶性總蛋白的10% (Yuying Tan et. al. Protein Expression and Purification 9 :233_245，1997)。 Tomoaki Takakura ^ [=| Pseudomonas putida 的METase (即MGL)基因用含有trc啟動(dòng)子的載體構(gòu)建成表達(dá)質(zhì)粒pMGLTrc03，在大腸桿菌 JM109中表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物中重組METase占可溶性總蛋白的比例高達(dá)43% (TomoakiTakakura et. al. , Appl Microbiol Biotechnol, 70 183-192, 2006) 這些工作為該酶的研究和應(yīng)用 提供酶的來(lái)源。在國(guó)內(nèi)，馬百坤、王紅兵報(bào)道了將陰道毛滴蟲(chóng)蛋氨酸裂解酶基因克隆到大 腸桿菌的研究(馬百坤，王紅兵醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2008，21 (4) :353-359)，李朝輝和田長(zhǎng)富 通過(guò)化學(xué)合成手段獲得一個(gè)假單胞菌(Pseudomonas putida)的MGL酶基因，并初步試驗(yàn)其 在大腸桿菌表達(dá)(李朝輝，田長(zhǎng)富昆明醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，NO 6,157, 2009) 0陰道毛滴蟲(chóng)的MGL 酶和假單胞菌的MGL酶基因在國(guó)外也已經(jīng)被克隆研究。本發(fā)明涉及的是一個(gè)來(lái)自深海宏基因組文庫(kù)的基因，該基因最大的可能是來(lái)自 Idiomarina屬的海洋細(xì)菌，該屬細(xì)菌在2000年才由Ivanova等人發(fā)現(xiàn)并提出建立新屬 (Ivanova, Ε. P. et al. Int. J. Syst. Evo 1. Microbiol. 50 (Pt2) :901_907，2000)，分子分類(lèi)表 明該屬微生物代表了明顯不同的進(jìn)化路線(xiàn)，2004年該屬一個(gè)種I. Ioihiensis的基因組被 測(cè)定(Hou，S. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101 18036-18041，2004)，從基因組信息發(fā) 現(xiàn)該微生物的能量主要來(lái)源是氨基酸代謝而非一般微生物能量來(lái)源的糖代謝，這樣該屬微 生物具有明顯特殊性。我們已經(jīng)從深海宏基因組一個(gè)大片段克隆子中發(fā)現(xiàn)一個(gè)36Kb長(zhǎng)的 深海DNA片段，測(cè)序表明所含35個(gè)閱讀框(基因)的序列與已知的海洋細(xì)菌Idiomarina 相應(yīng)基因有最高的相似性。該片段含有多個(gè)重要的氨基酸代謝有關(guān)基因，很多基因與已知 基因的相似性都較低，本申請(qǐng)涉及的基因mgl就是來(lái)自該克隆片段；海洋基因尤其來(lái)自深 海的基因往往與陸生生物的基因有較大差別。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供了一種新的海洋L-蛋氨酸Y -裂解酶基因及其產(chǎn)物。本發(fā)明所述的一種來(lái)自深海宏基因組的L-蛋氨酸裂解酶基因，其核苷酸序列如 SEQ IDNO. 1所示。該基因的大小為1281bp。進(jìn)一步，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明所述的L-蛋氨酸裂解酶基因的重組表達(dá)載體。進(jìn)一步，本發(fā)明提供了用所述的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞所得的轉(zhuǎn)化體。優(yōu)選地，所述的轉(zhuǎn)化體為重組工程菌菌株E. coli Pmet，保存于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC NO =M 209255。本發(fā)明還提供了由根據(jù)本發(fā)明所述的轉(zhuǎn)化體表達(dá)的L-蛋氨酸裂解酶，其分子量 為46 46. 5kDa，序列推導(dǎo)的理論等電點(diǎn)為5. 28，催化L-蛋氨酸裂解的最適反應(yīng)溫度為 60°C，最適反應(yīng)pH為9. 5。本發(fā)明所述的L-蛋氨酸裂解酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示，共426個(gè)氨基酸。本發(fā)明所述的L-蛋氨酸Y-裂解酶基因與已有報(bào)道的L-蛋氨酸Y-裂解酶基 因相比，區(qū)別在于本基因是從約2000米深海沉積物宏基因組fosmid文庫(kù)中篩選得到 的，該基因序列經(jīng)搜索比對(duì)國(guó)際數(shù)據(jù)庫(kù)(NCBI)的結(jié)果顯示與已知的海洋細(xì)菌Idiomarina loihiensis L2TR的相應(yīng)基因有最高的一致性Identities = 786/1183 (66% )，但核苷酸 序列的差異達(dá)34% ；由該基因核苷酸序列翻譯的氨基酸序列也與Idiomarina loihiensis L2TR或 Idiomarina baltica 的 MGL有最高一致性Identities = 264/391 (67% )，但氨基 酸序列差異達(dá)33%。因此，本發(fā)明提供了新的L-蛋氨酸Y-裂解酶基因以及相應(yīng)的L-蛋 氨酸Y-裂解酶蛋白。本發(fā)明首先從南海約2000米深海沉積物提取制備總DNA，然后用該DNA以及 fosmid載體和大腸桿菌構(gòu)建了宏基因組文庫(kù)，從文庫(kù)數(shù)萬(wàn)個(gè)克隆子中挑選一個(gè)約含36kb 外源DNA片段的克隆子進(jìn)行測(cè)序研究，應(yīng)用GeneMark hmm2. 4程序在線(xiàn)對(duì)其序列進(jìn)行分析 預(yù)測(cè)，該克隆子含35個(gè)完整的0RF(開(kāi)放閱讀框)和2個(gè)不完整的0RF。在該克隆子序列 分析中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與L-蛋氨酸Y-裂解酶基因最相似的基因(稱(chēng)mgl)，將該基因連接到 原核表達(dá)載體PET 32a并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)菌株，獲得了轉(zhuǎn)化體，所得轉(zhuǎn)化體能產(chǎn) 生過(guò)量的重組蛋白，該蛋白產(chǎn)物能分解L-蛋氨酸，產(chǎn)生丁酮酸等產(chǎn)物，即具有L-蛋氨酸 Y-裂解酶活性。本發(fā)明所得的含mgl基因的轉(zhuǎn)化體菌株命名為E coli Pmet(保藏號(hào)為 CCTCC NO =M 209255)。經(jīng)用NCBI網(wǎng)站的BLASTX工具比對(duì)，所克隆的mgl基因與海洋細(xì)菌 Idiomarina loihiensis L2TR 的 L-蛋氨酸 Y -裂解酶(Methioninegamma-Iyase)的基因 序列有最高的一致性(66% )。鑒于原始克隆的36kb片段中的絕大部分基因序列(88% ) 也都與Idiomarina屬基因具有最高相似性，因此推斷本發(fā)明所克隆的基因mgl最有可能來(lái) 源于Idiomarina屬海洋細(xì)菌，或者來(lái)自未被報(bào)道相關(guān)基因的其它與Idiomarina屬相近的 微生物。本發(fā)明還提供了所述的L-蛋氨酸裂解酶的制備方法，包括以下步驟培養(yǎng)用包含 如權(quán)利要求3所述的轉(zhuǎn)化體，誘導(dǎo)表達(dá)并回收所表達(dá)的具有催化L-蛋氨酸裂解活性的蛋 白產(chǎn)物。優(yōu)選地，所述的制備方法中，誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)，誘導(dǎo)溫度為20°C ；誘導(dǎo)劑為IPTG，其終濃 度為0. ImM ；誘導(dǎo)時(shí)間為14小時(shí)。本發(fā)明獲得的具有催化L-蛋氨酸裂解活性的蛋白產(chǎn)物，其特征是分子量(單 體)為461^^，催化蛋氨酸裂解反應(yīng)的最適溫度為601，最適反應(yīng)？!1為9.5。綜合各種特 征，該蛋白與已報(bào)道的L-蛋氨酸-γ -裂解酶有明顯不同(表1)。表1.不同來(lái)源蛋氨酸-Y-裂解酶的比較*
權(quán)利要求
一種來(lái)自深海宏基因組的L 蛋氨酸裂解酶基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
2.包含如權(quán)利要求1所述的基因的重組表達(dá)載體。
3.用如權(quán)利要求2所述的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞所得的轉(zhuǎn)化體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的轉(zhuǎn)化體，為重組工程菌菌株E.coli Pmet，保存于中國(guó)典型培 養(yǎng)物保藏中心，保減號(hào)為CCTCC NO =M 209255。
5.由根據(jù)權(quán)利要求3所述的轉(zhuǎn)化體表達(dá)的L-蛋氨酸裂解酶，其分子量為46 46. 5kDa，序列推導(dǎo)的理論等電點(diǎn)為5. 28，催化L-蛋氨酸裂解的最適反應(yīng)溫度為60°C，最適 反應(yīng)pH為9. 5。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的L-蛋氨酸裂解酶，其氨基酸序列如SEQID NO. 2所示。
7.如權(quán)利要求5所述的L-蛋氨酸裂解酶的制備方法，其特征在于，包括以下步驟培 養(yǎng)用包含如權(quán)利要求3所述的轉(zhuǎn)化體，誘導(dǎo)表達(dá)并回收所表達(dá)的具有催化L-蛋氨酸裂解活 性的蛋白產(chǎn)物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)，誘導(dǎo)溫度為20°C；誘導(dǎo) 劑為IPTG，其終濃度為0. ImM ；誘導(dǎo)時(shí)間為14小時(shí)。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的L-蛋氨酸裂解酶的用途，包括用于制備治療癌癥的藥物的應(yīng)用；用于制備檢測(cè)環(huán)境中蛋氨酸和/或同型半胱氨酸含量的檢測(cè)試劑的應(yīng)用；用于制備改進(jìn)食品風(fēng)味的制試劑的應(yīng)用；以及用于合成α-氨基丁酸的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種來(lái)自深海環(huán)境的新基因，尤其是一種來(lái)自深海宏基因組的能產(chǎn)生L-蛋氨酸γ-裂解酶活性的新基因，獲得了新基因的克隆，構(gòu)建了工程大腸桿菌并獲得表達(dá)產(chǎn)物。本發(fā)明所述的一種來(lái)自深海宏基因組的L-蛋氨酸裂解酶基因，該基因大小為1281bp，序列如SEQ ID NO.1所示，編碼426個(gè)氨基酸，序列如SEQ ID NO.2所示；蛋白分子量為46.024kDa，等電點(diǎn)為5.28。本發(fā)明首次克隆得到了深海L-蛋氨酸γ-裂解酶基因，并首次分析了其產(chǎn)物及摸索出重組基因工程大量制備該酶蛋白的方法，能獲得足夠用于產(chǎn)業(yè)應(yīng)用的酶蛋白。
文檔編號(hào)C12N15/60GK101962651SQ201010109028
公開(kāi)日2011年2月2日 申請(qǐng)日期2010年2月5日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月5日
發(fā)明者周世寧, 李慧賢, 陸勇軍, 黃雅麗 申請(qǐng)人:中山大學(xué)