一種檢測(cè)偽狂犬病毒ge基因的lamp檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物檢測(cè)領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及一種檢測(cè)偽狂犬病毒gE基因的 LAMP檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 偽狂犬病毒（PseudorabiesVirus，PRV)屬于痕疼病毒科，甲型痕疼病毒亞科，豬 皰疹病毒I型，線狀雙股DNA病毒。PRV對(duì)外界環(huán)境的抵抗力較強(qiáng)，在55°C50min、80°C3min 或100°C瞬間才能將其殺滅。PRV能感染多種動(dòng)物，其中，豬是PRV的主要貯存宿主及疫源 動(dòng)物。豬偽狂犬病毒通常引起妊娠母豬繁殖功能障礙和初生仔豬神經(jīng)癥狀，仔豬感染率和 死亡率可高達(dá)100%。近年來(lái)，已有50多個(gè)國(guó)家相繼報(bào)道了該病的發(fā)生，有分析表明該病的 流行在全球呈上升趨勢(shì)。目前，我國(guó)也有多個(gè)省份的豬場(chǎng)發(fā)現(xiàn)了由PRV引起的一系列疾病， 這對(duì)我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。隨著規(guī)?；B(yǎng)豬的不斷發(fā)展和強(qiáng)毒株的出現(xiàn)，PRV 的流行日益嚴(yán)重，因此，對(duì)PRV快速而又準(zhǔn)確的檢測(cè)對(duì)進(jìn)一步開(kāi)展偽狂犬病毒的致病性、疫 苗免疫、診斷及分子生物學(xué)等研究具有重大意義。
[0003] 目前，對(duì)PRV的抗原檢測(cè)主要依賴聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerasechain reaction，PCR)，抗體檢測(cè)主要依賴酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA)。PCR反應(yīng)和ELISA試驗(yàn)是 檢測(cè)偽狂犬病毒的常規(guī)方法，也是目前基層普遍使用的方法。
[0004]PCR反應(yīng)一種分子生物學(xué)技術(shù)，通過(guò)它可以在體外2-3小時(shí)內(nèi)，把少至幾拷貝的特 定模板DNA擴(kuò)增到原先的幾百萬(wàn)倍。其原理是先將雙鏈DNA解鏈為單鏈，引物遂與之結(jié)合， 根據(jù)堿基互補(bǔ)原則向下延伸，即可復(fù)制得到兩分子拷貝，如此不斷循環(huán)下去。PCR不僅可以 用于基因克隆和序列分析，因?yàn)樗鼣U(kuò)增放大的特點(diǎn)，在疾病診斷中也得到廣泛應(yīng)用。這項(xiàng)對(duì) 分子生物學(xué)意義重大的技術(shù)1983年由Mullis發(fā)明，經(jīng)過(guò)幾十年的發(fā)展，已成為實(shí)驗(yàn)室最常 規(guī)有效的實(shí)用技術(shù)。只是，PCR必須依靠昂貴的儀器才能得以實(shí)施，整個(gè)循環(huán)過(guò)程耗時(shí)數(shù)小 時(shí)，這對(duì)于許多條件受限的基層養(yǎng)殖戶是難以承受的，同時(shí)也無(wú)法滿足快速診斷的需要。
[0005]ELISA試驗(yàn)是基于免疫酶技術(shù)發(fā)展起來(lái)的，一種對(duì)于受檢標(biāo)本的抗原或抗體進(jìn)行 定性和定量分析的生物技術(shù)。同樣地，ELISA技術(shù)也存在操作復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)等缺點(diǎn)，難以在 基層養(yǎng)殖戶推廣。
[0006] 2000年，Notomi等[1]研發(fā)出一種新型核酸擴(kuò)增技術(shù)--環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增 (Loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)。LAMP是一種可對(duì)核酸進(jìn)行高效擴(kuò)增 并廣泛應(yīng)用于疫病快速檢測(cè)的新型檢測(cè)方法，它是在具有鏈置換活性的BstDNA聚合酶作 用下，利用能識(shí)別目的基因上6個(gè)獨(dú)立區(qū)段的4條引物，即正向內(nèi)側(cè)引物（forwardinner primer,FIP)、正向外側(cè)引物（forwardouterprimer,F3)、反向內(nèi)側(cè)引物（backwardinner primer,BIP)、反向外側(cè)引物（backwardouterprimer,B3)，在60~65°C等溫條件下高效 特異地?cái)U(kuò)增目的基因。2002年，Nagamine[2]等在此基礎(chǔ)上添加了 2條環(huán)狀引物：上游環(huán)狀 引物（LF)和下游環(huán)狀引物（LB)，環(huán)引物的增加提高了反應(yīng)速度，縮短了反應(yīng)時(shí)間。應(yīng)用 LAMP技術(shù)，只需在60~65°C等溫條件下水浴60min即可完成目的基因的擴(kuò)增。與PCR相 比，LAMP擁有諸多優(yōu)勢(shì)，特別是整個(gè)檢測(cè)過(guò)程僅需要水浴鍋、紫外燈這類簡(jiǎn)單的設(shè)備，適合 現(xiàn)場(chǎng)使用，且檢測(cè)時(shí)間也大大縮短。
[0007] 本研究選擇提取臨床樣本DNA，目的是為了更好的切合實(shí)際，滿足養(yǎng)殖戶的實(shí)際需 要，對(duì)日后在基層中的實(shí)際推廣有著重大的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明首先涉及一種用于快速檢測(cè)豬偽狂犬病病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增 (Loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)引物組，所述引物組的序列結(jié)構(gòu)為：
[0009]正向外引物（F3):ACGAGCCCCGCTTCCA
[0010]反向外引物（B3):AGATGCAGGGCTCGTACA
[0011]正向內(nèi)引物（FIP) :AGACCACGCGCGCGGCATCAG-CTTCCACTCGCAGCTCTTCT
[0012] 反向內(nèi)引物（BIP) :GAGAACTTCACCGCCACGCT-CGTAGTACAGCAGGCACCG。
[0013] 所述的LAMP引物具有高度特異性，能夠在擴(kuò)增模板DNA濃度為10~101(：個(gè)拷貝 數(shù)/每ul時(shí)，有效擴(kuò)增豬偽狂犬病毒基因。
[0014] 本發(fā)明還涉及所述的LAMP引物組在制備檢測(cè)豬偽狂犬病毒的試劑盒中的應(yīng)用。
[0015] 本發(fā)明還涉及使用所述的LAMP引物組在檢測(cè)豬偽狂犬病毒中的應(yīng)用，所述應(yīng)用 包括如下步驟：
[0016] 步驟（1)提取病料血清中的病毒DNA;
[0017] 步驟⑵使用所述LAMP引物在LAMP反應(yīng)體系中擴(kuò)增病毒DNA;
[0018] 步驟⑶LAMP反應(yīng)結(jié)果檢測(cè)。
[0019] 所述的步驟（1)的具體方法為：
[0020] 1)取病料血清500yL于1.5mL離心管。向離心管中加入10%SDS溶液50yL，而 后加入蛋白酶K(20mg/mL) 10yL，混勻后置56°C水浴1. 5-2h。
[0021] 2)加入200yLTris平衡酚，充分混勻溶液，置高速離心機(jī)中4°C12000rpm離心 15min〇
[0022] 3)取上清液于一新1. 5mL離心管中，加入Tris平衡酚和氯仿各200yL，充分混 勾，4°C12000rpm離心 15min。
[0023] 4)取上清液于一新離心管中，加入氯仿200yL，充分混勾，4°C12000rpm離心 15min〇
[0024] 5)取上清液于一新離心管中，加入2倍上清液體積的已_20°C預(yù)冷的無(wú)水乙醇，于 冰箱-20°C靜置20min后，4°C12000rpm離心15min，棄掉上清液，此時(shí)會(huì)發(fā)現(xiàn)管底附著有透 明粘性沉淀。
[0025] 6)向離心管中加入lmL70%乙醇沖洗沉淀表面和管壁，4°C7500rpm離心5min，棄 掉乙醇，用吸水紙吸走余下液體。
[0026] 7)加入20yL滅菌水將沉淀溶解，置于-20 °C保存?zhèn)溆谩?br>[0027] 所述步驟（2)的具體方法為：
[0028] (1) 25yL的LAMP反應(yīng)體系成分如下：
[0029]1)BstDNA聚合酶（8U/yL)，lul;
[0030] 2)lOXThermoPol緩沖液（100mMKC1，100mM(NH4)S04, 200mMTris-HCl，20mM MgS04, 1%TritonX-100),2. 5ul；
[0031] 3)步驟⑴獲得的DNA樣品，2ul;
[0032]4)MgS04 (lOOnmol/yL)，lul、Betaine(5ymol/yL)，5ul;
[0033]5)dNTP(25mmol/uL)，5ul;
[0034] 6)BIP&FIP引物（40uM)，2ul、F3&B3 引物（lOuM)，0? 25ul
[0035] 7)余量為滅菌超純水。
[0036](2)反應(yīng)溫度控制在65°C，擴(kuò)增40-60min(優(yōu)選為60min)，80°C5min終止反應(yīng)。
[0037] 所述步驟（3)的具體方法為：
[0038] 1)瓊脂糖凝膠電泳、或2)SYBRGreenI染色法、或3)瞬時(shí)離心法；
[0039] 所述的瓊脂糖凝膠電泳法為：
[0040] 取5iiL擴(kuò)增產(chǎn)物于1. 5%瓊脂糖凝膠中電泳，置凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果；
[0041] 所述的SYBRGreenI染色法為：
[0042] 向反應(yīng)管中加入1yLSYBRGreenI核酸染料，觀察溶液顏色變化；
[0043] 所述的瞬時(shí)離心法為：
[0044] 在反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行瞬時(shí)離心，通過(guò)有無(wú)沉淀判斷反應(yīng)結(jié)果。
[0045] 本發(fā)明還涉及所述的LAMP引物組制備的檢測(cè)豬偽狂犬病毒的試劑盒，所述的試 劑盒包括：
[0046] (1)所述的LAMP引物組；
[0047] (2)擴(kuò)增靶標(biāo)DNA所需必要的擴(kuò)增制劑，所述的擴(kuò)增制劑包括但不限于，DNA聚合 酶，DNTP，以及用于DNA擴(kuò)增的鹽溶液；
[0048] (3)用于檢測(cè)所需的檢測(cè)制劑，所述的檢測(cè)制劑優(yōu)選為，核酸熒光顯色劑。
【附圖說(shuō)明】
[0049] 圖1.LAMP體系優(yōu)化反應(yīng)時(shí)間的結(jié)果，M.Marker(DL-2000) ;N.空白對(duì)照；1-5.LAMP 反應(yīng)時(shí)間 40,45, 50, 55,60min。
[0050] 圖2.LAMP反應(yīng)體系特異性的結(jié)果（電泳檢測(cè)），M.Marker(DL-2000); M' ?Marker(DL-5000) ;N?空白對(duì)照；1，2.PRVDNA;3.PCV2DNA;4.PPVDNA。
[0051 ] 圖3.LAMP反應(yīng)體系特異性的結(jié)果（紫外熒光檢測(cè)），N?空白對(duì)照；1，2.PRVDNA; 3.PCV2DNA;4.PPVDNA。
[0052] 圖4.PCR反應(yīng)體系的電泳結(jié)果圖，M.Marker(DL-2000) ;N.空白對(duì)照；1，2.PRV DNA〇
[0053] 圖5.LAMP反應(yīng)體系SYBRGreenI可視化結(jié)果，N?空白對(duì)照；1，2.PRVDNA。
[0054] 圖6.LAMP反應(yīng)體系肉眼觀察的可視化結(jié)果，N.空白對(duì)照；1，2.PRVDNA.
[0055] 圖7. LAMP反應(yīng)體系的靈敏度結(jié)果，M. Marker (DL-2000);N.空白對(duì)照；1. IX 101Q 拷貝/每管；2. IX 109拷貝/每管；3. IX 108拷貝/每管；4. IX 107拷貝/每管；5. IX 106 拷貝/每管；6. IX 105拷貝/每管；7. IX 104拷貝/每管；8. IX 103拷貝/每管；9. IX 102 拷貝/每管；10. 1 X 101拷貝/每管；11. 1 X 10°拷貝/每管。
[0056] 圖8.LAMP反應(yīng)體系的臨床病料檢測(cè)結(jié)果，（a)莒縣病料PCR; (b)萊陽(yáng)病料PCR; (c) 8 份病料的LAMP結(jié)果，M.Marker(DL-2000) ;N?空白對(duì)照；1，2, 3?莒縣病料；1，2, 3, 4, 5. 萊陽(yáng)病料。
【具體實(shí)施方式】
[0057] 材料與方法
[0058] 1. 1毒株（病料）與試劑
[0059]豬偽狂犬病毒病料來(lái)自山東某大型豬場(chǎng)，豬圓環(huán)病毒II型（PCV2)、豬細(xì)小病毒 (PPV)均由山東省畜禽疫病防治及繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存提供；BstDNA聚合酶（大片段）購(gòu) 自美國(guó)NewEnglandBiolabs公司，Betaine購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司，MgS04購(gòu)自美 國(guó)Amresco公司，TaqDNA聚合酶購(gòu)自Fermentas中國(guó)公司，SYBRGreenI核酸染料、Tris 平衡酚購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；dNTP、DNAMarkerDL-2000、蛋白酶K均購(gòu)自寶生物 工程（大連）有限公司；其他試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。
[0060] 1. 2主要儀器
[0061] CHA-S恒溫振蕩器（常州國(guó)華電器有限公司）、生物安全柜（蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空 氣技術(shù)有限公司）、D-37520型高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Heraeus公司）、超純水系統(tǒng)（美國(guó) Millipore公司）、NanoDrop 2000微量紫外分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）、梯度PCR儀（美國(guó)Bio-rad公司）、DK-8D型電熱恒溫水槽（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限 公司）、DYY-2穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（北京市六一儀器廠）、凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Alpha Innotech 公司）、紫外透射反射分析儀（上?？等A生化儀器制造廠）。
[0062] 實(shí)施例1引物的設(shè)計(jì)與合成
[0063] 根據(jù)登錄于GenBank的PRV的gE基因保守序列，應(yīng)用生物學(xué)軟件進(jìn)行序列比對(duì)， 應(yīng)用PrimerExplorerV3 軟件（http://primerexplorer.jP/e/)設(shè)計(jì)了 2 對(duì)LAMP引物， 包括1對(duì)外引物（F3/B3)和1對(duì)內(nèi)引物（FIP/BIP)。弓丨物序列如表1所示：
[0064] 表1 LAMP和PCR引物序列 [00651
[0066]aF3,forw