與京海黃雞腹脂性狀顯著相關(guān)的特異SNPs分子標(biāo)記及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于家禽育種領(lǐng)域，具體為根據(jù)基于第二代測序和簡化基因組測序的特異 性位點(diǎn)擴(kuò)增片段測序（SpecificLocusAmplifiedFragmentSequencing,SLAF-seq)技術(shù) 對京海黃雞全基因組進(jìn)行測序，利用生物信息學(xué)對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，獲得大量的特異單 鏈核苷酸多態(tài)性（SingleNucleotidePolymorphism,SNPs)分子標(biāo)記，將得到的SNPs與京 海黃雞腹脂性狀進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，從而開發(fā)出1個與京海黃雞腹脂性狀顯著相關(guān)的 SNPs標(biāo)記，利用生物信息學(xué)方法分析得到1個影響京海黃雞腹脂性狀的重要候選基因。這 些SNPs標(biāo)記和候選基因不僅為京海黃雞腹脂性狀的分子標(biāo)記輔助選擇提供了重要的理論 與素材基礎(chǔ)以及育種新思路，還為其他動物物種分子標(biāo)記的開發(fā)提供了重要借鑒。
【背景技術(shù)】
[0002] 優(yōu)質(zhì)雞是具有中國特色的地方品種肉雞，其肉質(zhì)鮮美，風(fēng)味獨(dú)特，被廣大消費(fèi)者所 喜愛，肌肉的風(fēng)味與脂肪含量密切相關(guān)。肉雞脂肪主要沉積在皮下、內(nèi)臟（主要為腹脂、腸 胃周圍脂肪）以及肌肉與骨骼等部位，其中腹脂是脂肪沉積的主要部位。從養(yǎng)殖角度考慮， 腹脂和肌內(nèi)脂肪直接影響肉雞的屠宰性狀和肉質(zhì)性狀。其中，腹脂主要影響屠宰性狀，腹脂 過多會造成肉雞過肥，從而生產(chǎn)性能下降。因此，有必要對雞腹脂性狀進(jìn)行遺傳改良，雖然 過去幾十年來采用傳統(tǒng)育種方法對腹脂性狀的遺傳改良取得了顯著的效果，然而腹脂性狀 為復(fù)雜數(shù)量性狀，受諸多基因的控制，如今，傳統(tǒng)育種方法已很難對腹脂性狀取得較大的遺 傳進(jìn)展。目前，一種新的育種新方法逐漸在動物育種領(lǐng)域得到應(yīng)用，即全基因組關(guān)聯(lián)分析 (Genome-wideAssociationStudy,GWAS)。全基因組關(guān)聯(lián)分析旨在從全基因組范圍內(nèi)尋找 與性狀關(guān)聯(lián)的SNPs，得到的SNPs可用于分子標(biāo)記輔助選擇。京海黃雞是在長期開展我國地 方雞種質(zhì)資源調(diào)查、評價與保護(hù)的基礎(chǔ)上，經(jīng)多年連續(xù)攻關(guān)成功培育而成的我國目前唯一 通過國家畜禽遺傳資源委員會審定的具有小型、優(yōu)質(zhì)、早熟和抗逆四大特點(diǎn)的雞新品種，京 海黃雞的育成，即采用了常規(guī)育種方法，又采用了分子輔助選擇方法，是雞育種中理論與實(shí) 踐相結(jié)合的一個范例。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明利用SLAF-seq技術(shù)在京海黃雞全基因組范圍內(nèi)獲得了 90961個SNPs標(biāo) 記，結(jié)合全基因組關(guān)聯(lián)分析獲得了 1位于2號染色體上與京海黃雞腹脂性狀顯著相關(guān)的特 異性SNPs標(biāo)記，生物信息學(xué)分析獲得了 1影響京海黃雞腹脂性狀的候選基因。
[0004] 本發(fā)明所述與京海黃雞腹脂性狀顯著相關(guān)的特異分子標(biāo)記，是rs317160657,位于 14號染色體12246236bp處，突變類型為C/T突變，產(chǎn)生三種基因型，分別為AA、BB和AB。
[0005] 本發(fā)明還公開了京海黃雞14號染色體12246236bp位點(diǎn)作為與京海黃雞腹脂性狀 顯著相關(guān)的特異分子標(biāo)記的應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明進(jìn)一些步公開了包含上述特異SNPs標(biāo)記rs317160657的整聯(lián)蛋白重復(fù)蛋 白3(ITFG3)基因，位于14號染色體12244056-12262838bp，長18782bp。可作為京海黃雞 腹脂重的候選基因。用于擴(kuò)增上述rs317160657SNPs標(biāo)記位點(diǎn)的引物序列如SEQIDN0:1 和SEQIDNO:2 所示。
[0007] 本發(fā)明所述的SNPs標(biāo)記獲取自400只京海黃雞核心群，樣本容量大，可靠性和準(zhǔn) 確性高，不僅可用于京海黃雞腹脂多少的檢測，還可用于京海黃雞腹脂性狀的遺傳改良，為 京海黃雞腹脂性狀的分子標(biāo)記輔助選擇提供了重要的理論和素材基礎(chǔ)。
[0008] 本發(fā)明所述的1候選基因分別包含上述SNPs，其為影響京海黃雞腹脂性狀的重要 基因，為控制腹脂性狀主效基因的篩選奠定了基礎(chǔ)。
[0009] 本發(fā)明利用SLAF-seq技術(shù)開發(fā)與京海黃雞腹脂性狀顯著相關(guān)的SNPs標(biāo)記，具有 通量高、重復(fù)性好、精度高等特點(diǎn)，為雞乃至其他物種SNPs標(biāo)記的開發(fā)提供了成功案例。
【附圖說明】
[0010] 圖1是京海黃雞腹脂重全基因組關(guān)聯(lián)分析的QQ-Plot圖。
[0011] 圖2是京海黃雞腹脂重全基因組關(guān)聯(lián)分析的曼哈頓圖。
【具體實(shí)施方式】
[0012] 實(shí)施例1
[0013] 1?試驗(yàn)材料
[0014] 400只京海黃雞核心群母雞獲取自江蘇省南通市京海黃雞育種場，60日齡翅靜脈 采血1. 5ml，-20°C備用。43周齡屠宰分割，稱取腹脂重，腹脂重描述性統(tǒng)計結(jié)果見表1。
[0015] 表1京海黃雞腹脂重描述性統(tǒng)計
[0016]
[0017] 2.SLAF-seq技術(shù)方案設(shè)計
[0018]京海黃雞基因組DNA(多 6〇Ong)使用Dzup(Blood)GenomicDNAIsolation Reagent(上海生工生物工程有限公司）試劑盒提取，稀釋至50-100yg/iiL。利用 SLAF-seq技術(shù)對400只京海黃雞進(jìn)行分型，具體方法如下：首先，利用酶切位點(diǎn)預(yù)測軟 件SLAF-Predict(Biomarker，Beijing，China)，根據(jù)原雞（Gallusgallus)基因組序列 的GC含量、重復(fù)序列以及基因特點(diǎn)預(yù)測酶切位點(diǎn)，設(shè)計標(biāo)記開發(fā)方案，確定酶切方案、切 膠范圍、測序量等以其分子標(biāo)記開發(fā)的密度、均勻性，從而確保達(dá)到預(yù)期的實(shí)驗(yàn)?zāi)康?。?后，按照預(yù)先設(shè)計好的酶切方案，使用Haelll內(nèi)切酶（NewEnglandBiolabs)酶切消化 基因組DNA，酶切后的片段在37°C條件下，使用克列諾片段（NEB)和dATP對末端添加一 個單核苷酸A堿基末端，使之與雙標(biāo)記標(biāo)簽測序接頭（PAGE純，LifeTechnologies)相 連。使用稀釋后的酶切-連接DNA樣本、dNTP、Q5高保真DNA聚合酶進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR 引物：AATGATACGGCGACCACCGA(SEQIDN0:3)和CAAGCAGAAGACGGCATACG(SEQIDN0:4) (PAGE純，LifeTechnologies)，PCR產(chǎn)物使用AgencourtAMPureXP玻璃珠（Beckman Coulter,HighWycombe,UK)純化并收集，用瓊脂糖凝膠電泳對收集后的片段大小進(jìn)行選 擇，具體為切膠 500_800bp的片段，使用QIAquickGelExtractionKit(QIAGEN)回收，切 膠回收的產(chǎn)物建庫后使用IlluminaHiSeqTM2000進(jìn)行測序。測序產(chǎn)生的雙端序列使用SO