一種豬偽狂犬病毒的抑制細(xì)胞系的制作方法
【專利說明】-種豬偽狂犬病毒的抑制細(xì)胞系
[0001 ]
技術(shù)領(lǐng)域： 本發(fā)明提供了一種豬偽狂犬病毒的抑制細(xì)胞系，可用于制備無偽狂犬病毒感染的細(xì)胞 或動物模型，同時(shí)提供了相應(yīng)的制備方法，屬于細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
[0002]
【背景技術(shù)】： 偽狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)是發(fā)生于家豬和野豬的病毒病，在世界上的大 部分地區(qū)呈地方性流行。牛、羊、貓、狗等家畜和野生哺乳動物都是易感染動物。另外，有文 獻(xiàn)報(bào)道，該病毒還可W感染人類。
[0003] PRV屬于瘤診病毒科，與感染人類的單純瘤疹病毒(HSV)親緣關(guān)系較近。該病毒的 化30基因編碼DNA復(fù)制酶亞基，且其基因序列在瘤診病毒科的病毒中保守性較強(qiáng)。因此， 化30基因可W作為瘤診病毒科病毒的預(yù)防及治療的祀基因。另外，目前國內(nèi)外關(guān)于豬偽狂 犬病毒的抑制細(xì)胞系的研究尚沒有報(bào)道。
[0004]

【發(fā)明內(nèi)容】
： 本發(fā)明公開了一種豬偽狂犬病毒的抑制細(xì)胞系，該細(xì)胞可W顯著抑制偽狂犬病毒的感 染，可用于制備無偽狂犬病毒感染的細(xì)胞或動物模型； 本發(fā)明還提供了豬偽狂犬病毒的抑制細(xì)胞系的制備方法，適用于人工制備該細(xì)胞系； 本發(fā)明提供的一種豬偽狂犬病毒的抑制細(xì)胞系，其特征在于： 該細(xì)胞含有化s9核酸內(nèi)切酶系統(tǒng)和祀向PRV的化30基因的sgRNA;該細(xì)胞感染PRV后，該 sgRNA可W特異結(jié)合到化30基因的特定位點(diǎn)上，并準(zhǔn)確地引導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的化s9核酸內(nèi)切酶系 統(tǒng)將化30基因特異切斷，導(dǎo)致化30基因不能表達(dá)，從而達(dá)到抑制病毒復(fù)制的目的； 本發(fā)明公開了一種真核表達(dá)載體PX459-PRV，用于構(gòu)建上述的豬偽狂犬病毒抑制細(xì)胞 系； 本發(fā)明構(gòu)建的真核表達(dá)載體PX459-PRV是在PX459載體的基礎(chǔ)上，插入人工合成的DNA 片段而成； 本發(fā)明公開的PX459-PRV上插入的人工合成的DNA片段可W在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄為sgRNA，且 該sgRNA可W特異地與PRV的化30基因的特定位點(diǎn)結(jié)合； 本發(fā)明公開的人工合成的DNA序列為： sgP民V-F3:5-caccgtgccgccgcagtagaccgt-3， sgPRV-民3:5-aaacacggtctactgcggcggcac-3; 本發(fā)明所述豬偽狂犬病毒的抑制細(xì)胞系的制備方法，包括W下步驟： 1. 人工合成DNA片段 sgP民V-F3:5-caccgtgccgccgcagtagaccgt-3， SgPRV-民3:5-aaacacggtctactgcggcggcac-3; 2. 真核表達(dá)載體PX459-PRV的構(gòu)建 將上述合成的DNA片段經(jīng)過退火后，連接到真核表達(dá)載體PX459的相應(yīng)酶切位點(diǎn)上，構(gòu) 建成真核表達(dá)載體PX459-PRV; 3. 豬偽狂犬病毒抑制細(xì)胞系的建立 將上述構(gòu)建的真核表達(dá)載體PX459-PRV用Fsp I酶切線性化，轉(zhuǎn)染到ΡΚ-15細(xì)胞中，對經(jīng) 抗性篩選獲得的陽性細(xì)胞進(jìn)行鑒定，對鑒定正確的陽性細(xì)胞進(jìn)行凍存； 3.1載體線性化：提取PX459-PRV質(zhì)粒，用Fsp I酶切，然后乙醇沉淀，用無菌dd出0溶 解； 3.2 轉(zhuǎn)染：將線性化的載體按照 TurboFect? transfection reagent (Thermo Fisher Scientific, USA)說明書轉(zhuǎn)染ΡΚ-15細(xì)胞，5 % C〇2，37 °C培養(yǎng)； 3.3細(xì)胞系的獲得:上述轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞用化ro篩選8-10天后，獲得抗性細(xì)胞； 4.豬偽狂犬病毒抑制細(xì)胞系的鑒定 對上述化ro篩選獲得的陽性細(xì)胞，用IFA方法進(jìn)行鑒定，即得到豬偽狂犬病毒的抑制細(xì) 胞系，并命名為PX459-PRV-i細(xì)胞。
[000引IFA實(shí)驗(yàn)過程為:將PK-15細(xì)胞鋪于24孔細(xì)胞培養(yǎng)皿中；細(xì)胞長滿單層W后，將細(xì)胞 培養(yǎng)液棄掉，各孔分別用200PBS清洗3遍;之后，各孔分別加入200 |xL 80 %冷丙酬，放置-20 °C固定過夜;然后，將冷丙酬棄掉，各孔分別用200 .|_匯PBS清洗3遍，將Flag化g Antibody RalAit polyclonal(武漢Ξ鷹)進(jìn)行1:500稀釋(稀釋液為PBS+10 % FBS)后，各孔分別加入 200 μL^，于37°C恒溫箱中解育2.5 h;棄掉一抗，各孔分別用200 PBS清洗4遍，然后各 孔分別加入200 ;鴻FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG化+L)(1:1000稀釋，稀釋液為PBS+10 % FBS)， 于37°C恒溫培養(yǎng)箱中解育1 h;棄掉二抗，各孔分別用200 pLPBS清洗4遍，最后用巧光顯微 鏡觀察。
[0006] 本發(fā)明的積極效果在于:制備的豬偽狂犬病毒的抑制細(xì)胞系含有化s9核酸內(nèi)切酶 系統(tǒng)和祀向PRV的化30基因的sgRNA。該細(xì)胞對PRV的感染具有顯著的抑制作用?？捎糜谥苽?無偽狂犬病毒感染的細(xì)胞或動物模型，在臨床、實(shí)驗(yàn)室研究上具有廣闊的應(yīng)用前景。
[0007]
【附圖說明】： 圖1.真核表達(dá)載體PX459-PRV制備流程圖； 圖2.豬偽狂犬病毒的抑制細(xì)胞的巧光結(jié)果圖； 圖3.豬偽狂犬病毒的抑制細(xì)胞抑制PRV基因組拷貝數(shù)效果圖； 圖4.豬偽狂犬病毒的抑制細(xì)胞抑制PRV的TCIC50效果圖； 圖5.豬偽狂犬病毒的抑制細(xì)胞抑制PRV感染的IFA效果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0008] W下實(shí)施例證明本發(fā)明的效果，下列實(shí)施例旨在進(jìn)一步舉例描述本發(fā)明，而不是 W任何方式限制本發(fā)明。在不背離本發(fā)明的精神和原則的前提下，對本發(fā)明所作的本領(lǐng)域 普通技術(shù)人員容易實(shí)現(xiàn)的任何改動或改變都將落入本發(fā)明的權(quán)利要求范圍之內(nèi)。
[0009] 實(shí)施例1 真核表達(dá)載體PX459-PRV的構(gòu)建 1合成DNA片段 S邑PRV-F3:5-cacc邑t邑CC邑CC邑ca邑ta邑acc邑t-3, S邑PRV-R3:5-aaacac邑邑tctact邑C邑邑C邑邑cac-3。
[0010] 2實(shí)驗(yàn)過程(參照圖1) 1) PX459-PRV的構(gòu)建：用化s I酶切PX459載體，回收載體片段;將上述人工合成的DNA 片段退火后與回收的PX459載體片段連接。
[0011] 2)轉(zhuǎn)化將上述連接后的載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌D冊曰，獲得陽性菌株。
[0012] 3結(jié)果測序鑒定，成功構(gòu)建了PX459-PRV。
[0013] 4結(jié)論成功構(gòu)建了用于制備豬偽狂犬病毒的抑制細(xì)胞的表達(dá)質(zhì)粒PX459-PRV。
[0014] 實(shí)施例2 豬偽狂犬病毒的抑制細(xì)胞的制備 1 質(zhì)粒 PX459-PRV。
[0015] 2 細(xì)胞 PK-15細(xì)胞。
[0016] 3實(shí)驗(yàn)過程 1)載體線性化:提取PX459-PRV質(zhì)粒，用Fsp I酶切，然后乙醇沉淀，用無菌dd出0溶解。
[0017] 2)轉(zhuǎn)染：將線性化的載體按照TurboFect ? transfection reagent (Thermo Fisher Scientific, USA)說明書轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞，5 % C〇2，37 °C培養(yǎng)。
[0018] 3)細(xì)胞系的獲得：上述轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞用化ro篩選8-10天后，獲得抗性細(xì)胞;采用 IFA法進(jìn)行鑒定。
[0019] 4)陽性細(xì)胞的鑒定:對上述化ro篩選獲得的陽性細(xì)胞，用IFA方法進(jìn)行鑒定，得到 豬偽狂犬病毒的抑制細(xì)胞系，并命名為PX459-PRV-i細(xì)胞。
[0020] IFA實(shí)驗(yàn)過程為:將PK-15細(xì)胞鋪于24孔細(xì)胞培養(yǎng)皿中；細(xì)胞長滿單層W后，將細(xì)胞 培