豬偽狂犬病病毒疫苗組合物及其制備方法和應用
【專利說明】
[0001] 本申請為專利申請201410519314. 2的分案申請，原案申請日為2014年9月30日， 發(fā)明名稱為豬偽狂犬病病毒疫苗組合物及其制備方法和應用。
技術領域
[0002] 本發(fā)明屬于獸用生物制品領域，具體地涉及豬偽狂犬病毒的疫苗組合物及其制備 方法，以及將所述免疫抗原用于制備預防和/或治療與豬偽狂犬病毒相關疾病和由豬偽狂 犬病毒導致的感染的組合物的應用。
【背景技術】
[0003] 偽狂犬病，又稱Aujeszky氏病，是由皰疹病毒科（Herpesviridae)α亞科中的豬 皰疹病毒I型（Suidherpesviruslstrain)所引起的豬、牛、羊等多種家畜、家禽和野生動 物的一種以發(fā)熱、奇癢（除豬外）及腦脊髓炎為主癥的急性傳染病。豬的偽狂犬病在我國 廣泛存在，危害嚴重，是制約規(guī)?；i場生產(chǎn)的主要疫病之一。它能引起妊娠母豬流產(chǎn)、死 胎或木乃伊胎和仔豬出現(xiàn)神經(jīng)癥狀、麻痹，死亡率高。PRV具有較強的泛嗜性、神經(jīng)嗜性及潛 伏感染特性，在外周神經(jīng)系統(tǒng)可以長期潛伏感染，當潛伏病毒被激活變成有感染力的病毒， 被潛伏感染的宿主就會發(fā)病。
[0004] 豬PRV只有一個血清型，通常認為毒株的交叉保護力很強，但目前仍存在仔豬注 射商品化疫苗后發(fā)生典型豬偽狂犬病，例如長時間體溫升高，精神沉郁，食欲減退，出現(xiàn)呼 吸道和/或神經(jīng)癥狀。突出表現(xiàn)為任何年齡的豬都會感染，可在豬群水平傳播，潛伏期短 (1~2天），發(fā)病率在10%~100%之間，發(fā)病豬死亡率在10%~100%之間（仔豬死亡率 可高達100%)，感染后可引起豬只高熱（40~42°C，持續(xù)3日以上），呼吸困難，腹瀉，喘， 咳嗽，打噴嚏，后肢麻痹，犬坐，突然倒地，抽搐，側臥不起，角弓反張，泳狀劃水，最后衰竭而 死，并可引起種公豬精液質量下降，懷孕母豬流產(chǎn)（高達35% )，早產(chǎn)，死胎，弱仔（弱仔14 日齡前全部死亡）等繁殖障礙癥狀?，F(xiàn)有技術的疫苗免疫豬只后不能完全抵抗野毒攻擊， 依然會出現(xiàn)高熱，精神沉郁，食欲下降或廢絕等癥狀，感染率超過80 %，發(fā)病率超過30 %， 死亡率在10%~20%之間?，F(xiàn)有技術還沒有疫苗能夠解決針對豬偽狂犬變異株引起的偽 狂犬病。
[0005] 本發(fā)明首次通過將豬偽狂犬病毒gB蛋白與gD蛋白組合使用，針對豬偽狂犬變異 株引起的偽狂犬病有著較好的保護作用，，通過免疫效力比較試驗，意外發(fā)現(xiàn)，兩種蛋白組 合使用，協(xié)同刺激機體免疫反應，有效降低了免疫劑量，大大降低了免疫成本。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術缺陷，提供一種預防和/或治療豬偽狂犬病毒感 染的疫苗組合物，該疫苗組合物包含兩種豬偽狂犬病毒免疫保護性抗原和佐劑。本發(fā)明提 供的預防和/或治療豬偽狂犬病毒感染的疫苗組合物包含的兩種豬偽狂犬病毒免疫抗原 為gB蛋白與gD蛋白。
[0007] 本發(fā)明的第一方面是一種豬偽狂犬病病毒疫苗組合物，所述的疫苗組合物包括免 疫量的gB蛋白、gD蛋白和佐劑。
[0008] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式，在本發(fā)明的疫苗組合物中，所述的gB蛋白蛋白 序列為SEQIDN0. 3 ;所述的gD蛋白蛋白序列為SEQIDN0. 4。
[0009] 優(yōu)選地，本發(fā)明提供的預防和/或治療豬偽狂犬病毒感染的疫苗組合物包含的豬 偽狂犬病毒免疫抗原gB蛋白氨基酸序列如SEQIDN0 :3所示。
[0010] 優(yōu)選地，本發(fā)明提供的預防和/或治療豬偽狂犬病毒感染的疫苗組合物包含的豬 偽狂犬病毒免疫抗原gB蛋白核苷酸序列如SEQIDN0 :1所示。
[0011] 優(yōu)選地，本發(fā)明提供的預防和/或治療豬偽狂犬病毒感染的疫苗組合物包含的豬 偽狂犬病毒免疫抗原gD蛋白氨基酸序列如SEQIDN0 :4所示。
[0012] 優(yōu)選地，本發(fā)明提供的預防和/或治療豬偽狂犬病毒感染的疫苗組合物包含的豬 偽狂犬病毒免疫抗原gD蛋白核苷酸序列如SEQIDN0 :2所示。
[0013] 術語"gB蛋白"又稱"gB糖蛋白"，
[0014] 術語"gD蛋白"又稱"gD糖蛋白"，是豬偽狂犬病病毒進行感染必需的結構蛋白，是 成熟的病毒粒子囊膜表面的主要糖蛋白之一，也稱為"gp50蛋白"。
[0015] 本發(fā)明提供的預防和/或治療豬偽狂犬病毒感染的疫苗組合物包含的豬偽狂犬 病毒免疫抗原gB蛋白、gD蛋白還可以是與其功能衍生物基本相同的氨基酸序列的多肽。
[0016] 術語"佐劑"指加入到本發(fā)明的組合物中以增加組合物的免疫原性的物質。已知 的佐劑包括，但不限于：油佐劑，水溶性佐劑，鋁鹽佐劑，細胞因子佐劑。
[0017] 本發(fā)明所用術語"油佐劑"又稱"油性佐劑"或"油乳佐劑"，是由包括植物油、動 物油、礦物油中的一種或幾種組成，用于延緩免疫原在機體內的存留時間，使之持續(xù)緩慢釋 放，增強巨噬細胞的吞噬與殺菌能力。
[0018] 本發(fā)明所用術語"水溶性佐劑"又稱"水基佐劑"或"水佐劑"，是一種聚合物水溶 性分散體，用于提高水溶性疫苗的功效和安全性，可以由高分子量聚丙烯酸類合成聚合物 組成。
[0019] 本發(fā)明所用術語"鋁鹽佐劑"，又稱"鋁膠佐劑"或"鋁佐劑"，包括氫氧化鋁佐劑和 磷酸鋁佐劑，其主要功能為緩釋，但同時具有對免疫細胞的激活作用。將抗原和氫氧化鋁或 磷酸鋁混合注射，能夠使抗原保存在注射部位，具有抗原緩釋和非特異免疫刺激作用。
[0020] 本發(fā)明所用術語"細胞因子佐劑"，包括IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、 IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、INF-γ、GM-CSF、TNF-α、TNF-β、TCA-3 等，又稱"細胞因子" 或"細胞素"，是活體宿主細胞分泌的通過擴散、細胞間接觸或血液循環(huán)到達宿主其他細胞， 在體液中以極低濃度發(fā)揮作用的一類非免疫球蛋白、局部天然蛋白或糖蛋白，也是一類由 機體活化的免疫細胞和某些非免疫細胞產(chǎn)生、分泌，能調節(jié)細胞生長、分化，與造血、炎癥反 應、免疫應答反應和創(chuàng)傷愈合等密切相關的高活性多功能小分子蛋白的統(tǒng)稱，可以刺激或 抑制免疫功能，在免疫應答中促進細胞發(fā)育分化、調節(jié)細胞生理功能和細胞間信息傳遞，在 免疫系統(tǒng)中起著非常重要的調控作用。
[0021] 本發(fā)明實施例中使用了油佐劑中的一種206佐劑。
[0022] 適用于本發(fā)明的組合物的佐劑的量優(yōu)選地是有效量。所述"有效量"是指佐劑在 同本發(fā)明抗原聯(lián)合施用時在宿主中發(fā)揮它們的免疫學作用而言必須或足夠的而不導致過 度副作用所必需量。待施用的佐劑的精確的量將根據(jù)因素如所用的成分和治療的疾病的類 型，待治療的動物的類型和年齡，施用的方式，以及組合物中的其它成分而變化。
[0023] 在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種治療和/或預防豬偽狂犬病毒感染的疫苗組 合物，由豬偽狂犬病毒免疫抗原gB蛋白、gD蛋白和206佐劑組成。
[0024] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式，在本發(fā)明的疫苗組合物中，所述的gB蛋白含量 為 25-100μg/ml;gD蛋白含量為 25-100μg/ml。
[0025] 作為本發(fā)明的一種最優(yōu)選實施方式，在本發(fā)明的疫苗組合物中，所述的gB蛋白含 量為50μg/ml;gD蛋白含量為50μg/ml。
[0026] 本發(fā)明的組合物的成分或組分的量優(yōu)選地是治療有效量。所述治療有效量是指在 組合物施用的宿主中發(fā)揮它們的免疫學作用而不導致過度副作用所必需量。所用的成分 和待施用的組合物的精確的量將根據(jù)因素如治療的疾病的類型，待治療的動物的類型和年 齡，施用的方式，以及組合物中的其它成分而變化。
[0027] 優(yōu)選地，對于動物豬而言，本發(fā)明疫苗組合物gB蛋白抗原有效量為25-100μg/ ml;gD蛋白抗原有效量為25-100μg/ml。
[0028] 更優(yōu)選地，所述疫苗組合物gB蛋白抗原有效量為50μg/ml;gD蛋白抗原有效量為 50μg/ml〇
[0029] 本發(fā)明的另一方面是一種豬偽狂犬病病毒疫苗組合物，所述的疫苗組合物包括重 組新城疫病毒-豬偽狂犬病病毒載體以及佐劑。
[0030] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式，在本發(fā)明的疫苗組合物中，所述的重組新城疫 病毒-豬偽狂犬病病毒載體包含一種或多種異源多核苷酸，其編碼一種或多種豬偽狂犬病 病毒抗原、多肽或其變體，其中，所述的豬偽狂犬病病毒抗原包括gB蛋白、gD蛋白。
[0031] 術語"功能衍生物"指具有與完整蛋白/肽序列的生物活性基本類似的功能生物 活性的蛋白/肽序列。換言之，其優(yōu)選地指當將所述功能衍生物施用于動物時，基本上保留 了激發(fā)免疫應答，如針對豬偽狂犬病毒株攻擊的保護性反應的能力的多肽或其片段。
[0032] 術語"片段"指這樣的多核苷酸序列，其是人工構建（例如通過化學合成）或通過 將天然產(chǎn)物裂解成多個小片段（使用限制性內切酶，或機械剪切）構建的本發(fā)明核酸的分 離的部分，或通過PCR、DNA聚合酶或本領域公知的任何其他聚合技術合成的核酸的部分， 或通過本領域技術人員公知的重組核酸技術在宿主細胞中表達的核酸部分。
[0033] 如本文一般理解和使用，"功能性片段"指編碼與完整核酸序列的生物活性基本相 似的功能生物活性的核酸序列。換言之，在本發(fā)明的上下文中，其優(yōu)選地指基本上保留了編 碼這樣的多肽/蛋白質能力的核酸或其片段，所述多肽/蛋白質當施用于動物時，激發(fā)針對 豬偽狂犬病毒攻擊的免疫應答，和更優(yōu)選地保護性反應。
[0034] 當指氨基酸序列時，"基本上相同"可以理解為本發(fā)明的多肽優(yōu)選地具有這樣的氨 基酸序列，其與SEQIDNO:3-4中所示的序列的部分或全部具有至少70%同源性，或甚至 優(yōu)