選地80 %同源性，或甚至更優(yōu)選地90 %同源性，或最優(yōu)選地95 %同源性。
[0035] 在本文中術語"同源性"還包括與參比序列相同或類似，同時提供任何氨基酸的簡 單替換/修飾?？梢杂肂LAST-P(基本局部排比檢索工具），本領域技術人員公知的程序進 行該方面的同源性檢索。對于相應的核酸序列，同源性涉及在本領域中已知的BLASTX和 BLASTN程序。
[0036] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式，在本發(fā)明的疫苗組合物中，所述的豬偽狂犬病 病毒抗原gB蛋白為序列SEQIDN0. 3編碼的豬偽狂犬病病毒gB蛋白，述的豬偽狂犬病病 毒抗原gD蛋白為序列SEQIDN0. 4編碼的gD蛋白。
[0037] 所述"載體"意指重組DNA或RNA質(zhì)粒、噬菌體或病毒，其包含要在體內(nèi)或體外遞 送至靶細胞的異源多核苷酸。異源多核苷酸可包含目的序列以用于預防或治療的目的，可 選地，其為表達盒的形式。載體不需要能夠在最終的靶細胞或受試者中復制。術語"載體" 包括用于克隆載體，也包括病毒載體。
[0038] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式，在本發(fā)明的疫苗組合物中所述的疫苗組合物， 其特征在于，所述的新城疫病毒為弱毒株，優(yōu)選地，所新城疫病毒為新城疫病毒LaSota株。
[0039] 新城疫病毒LaSota株購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。
[0040] 本發(fā)明的另一方面是一種制備所述疫苗組合物的方法，所述的方法包括：1)制備 gB蛋白和gD蛋白抗原的步驟；以及2)按比例混合抗原，加入佐劑，乳化的步驟。
[0041] 本發(fā)明的另一個目的是提供一種治療和/或預防豬偽狂犬病毒相關疾病或感染 的疫苗組合物的制備方法，包括：
[0042] (1)制備gB蛋白和gD蛋白抗原；
[0043] (2)按比例混合抗原，加入佐劑，乳化。
[0044] 抗原的制備可以通過本領域技術人員已知的多種方法進行，包括基因工程手段， 例如通過包含本發(fā)明多核苷酸的克隆或表達載體。術語"載體"涉及被設計用于轉(zhuǎn)導/轉(zhuǎn) 染一種或多種細胞類型的多核苷酸構(gòu)建體。載體可以是，例如"克隆載體"，其被設計用于分 離、增殖和復制插入的核苷酸；"表達載體"，其被設計用于在宿主細胞中表達核苷酸序列； 或"病毒載體"，其被設計用于生產(chǎn)重組病毒或病毒樣顆粒；或"穿梭載體"，其包含不只一 種類型的載體的性質(zhì)。適合制備本發(fā)明豬偽狂犬病毒抗原的公眾可獲得的載體包括質(zhì)粒、 腺病毒、桿狀病毒、酵母桿狀病毒、植物病毒、腺伴隨病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒、單純皰疹病毒、 α病 毒、慢病毒等，還可以獲得構(gòu)建這樣的載體的方法。本發(fā)明豬偽狂犬病毒抗原的制備還包括 通過人工合成的方式來實現(xiàn)。
[0045] 本發(fā)明的另一方面是一種制備所述疫苗組合物的方法，其特征在于，所述的方法 包括：1)重組所述新城疫病毒基因組全長cDNA載體的步驟；2)重組表達所述新城疫病毒 NP、P、L基因表達載體的步驟；3)重組表達所述豬偽狂犬病病毒抗原基因到所述新城疫病 毒基因組全長cDNA重組載體的步驟；以及4)將所述表達所述豬偽狂犬病病毒抗原的新城 疫病毒基因組全長cDNA重組載體和表達所述新城疫病毒NP、P、L基因重組載體共同轉(zhuǎn)染細 胞，進行病毒振救的步驟。
[0046] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式，在本發(fā)明的疫苗組合物制備方法中，轉(zhuǎn)染細胞 為BHK細胞。也可選用本領域公知的培育新城疫病毒的其他細胞系細胞。
[0047] 本發(fā)明的另一方面是所述的疫苗組合物在制備預防和/或治療豬偽狂犬病病毒 相關疾病或由豬偽狂犬病病毒導致的感染的藥物中的應用。
[0048] 本發(fā)明的另一個目的在于提供包含豬偽狂犬病毒免疫抗原gB蛋白、gD蛋白或其 功能衍生物基本相同的氨基酸序列的多肽在用于預防和/或治療豬偽狂犬病毒相關疾病 或感染的組合物和/或方法中的應用。
[0049] 術語"預防"指通過給予根據(jù)本發(fā)明的疫苗組合物抑制豬偽狂犬感染或推遲疾病 發(fā)作的所有行為。術語"治療"指通過給予根據(jù)本發(fā)明的疫苗組合物使豬偽狂犬病病毒感 染引起的癥狀減輕或轉(zhuǎn)好的所有行為。
[0050] 術語"保護性反應"意為在動物中預防豬偽狂犬病毒相關疾病或由豬偽狂犬病毒 導致的感染的發(fā)作或減輕存在的這樣的疾病的嚴重性。
[0051] 本發(fā)明涉及的豬偽狂犬病毒多肽，其有利地激發(fā)動物中的保護性反應。具體地，本 發(fā)明涉及的多肽包含與其功能衍生物基本相同的氨基酸序列。
[0052] 本發(fā)明的另一個目的是提供一種疫苗組合物在制備治療和/或預防豬偽狂犬病 毒相關疾病或感染的藥物的應用。
[0053] 本文所用的術語"豬偽狂犬病病毒相關疾病"用于指由豬偽狂犬病毒感染引起的 疾病。它的例子包括發(fā)病仔豬表現(xiàn)出明顯的神經(jīng)癥狀、昏睡、嗚叫、嘔吐、拉稀、體溫升高，一 旦發(fā)病，懷孕母豬可發(fā)生流產(chǎn)、產(chǎn)木乃伊胎兒或死胎或繁殖障礙，但不限于此。
[0054] 本文所用的術語"豬偽狂犬病病毒相關疾病"可以進一步用于指表現(xiàn)為任何年齡 的豬都會感染，可在豬群水平傳播，潛伏期短（1~2天），發(fā)病率在10 %~100 %之間，發(fā)病 豬死亡率在10%~100%之間（仔豬死亡率可高達1〇〇%)，感染后可引起豬只高熱（40~ 42°C，持續(xù)3日以上），呼吸困難，腹瀉，喘，咳嗽，打噴嚏，后肢麻痹，犬坐，突然倒地，抽搐， 側(cè)臥不起，角弓反張，泳狀劃水，最后衰竭而死，并可引起種公豬精液質(zhì)量下降，懷孕母豬流 產(chǎn)（高達35%)，早產(chǎn)，死胎，弱仔（弱仔14日齡前全部死亡）等繁殖障礙癥狀，但不限于 此。上述癥狀與現(xiàn)有技術中感染了普通豬偽狂犬病病毒后產(chǎn)生的癥狀差異在于：感染了后 會造成感染后成年豬（體重在50kg以上豬）可引起豬只高熱（40~42°C，持續(xù)3日以上）， 呼吸困難，腹瀉，喘，咳嗽，打噴嚏，后肢麻痹，犬坐，突然倒地，抽搐，側(cè)臥不起，角弓反張，泳 狀劃水，最后衰竭而死；新生及4周齡以內(nèi)的仔豬突然發(fā)病，發(fā)生大批死亡，死亡率達90% 以上；發(fā)病仔豬主要表現(xiàn)為體溫上升達41°C以上，食欲廢絕，伴有明顯的神經(jīng)癥狀和腹瀉； 斷奶前后仔豬主要為呼吸系統(tǒng)癥狀，表現(xiàn)呼吸困難、咳嗽、流鼻涕等。
[0055] 本發(fā)明具有以下突出的優(yōu)點：
[0056] (1)本發(fā)明疫苗組合物可通過基因工程手段或人工合成手段對疫苗組合物的組分 進行大量合成表達，不僅耗時短，還可便于大規(guī)模生產(chǎn)；
[0057] (2)本發(fā)明豬偽狂犬病毒疫苗組合物中多免疫原性抗原的組合可誘導產(chǎn)生協(xié)同的 免疫效果，不僅免疫效果良好，還進一步降低了免疫使用量，降低了免疫成本；
[0058] (3)本發(fā)明疫苗組合物可有效保護豬只抵抗豬偽狂犬病毒的感染，提供了一種完 善預防和/或治療豬偽狂犬病毒感染的途徑，避免了傳統(tǒng)活疫苗毒力返強及散毒風險的發(fā) 生，對于凈化豬偽狂犬病毒有著積極的現(xiàn)實意義。
【附圖說明】
[0059] 圖1為gB基因PCR擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果，從左至右各泳道分別為：MarkerDL5000、 gB基因PCR擴增產(chǎn)物、抽提陰性對照PCR擴增產(chǎn)物、PCR陰性對照；
[0060] 圖2為gD基因PCR擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果，從左至右各泳道分別為：MarkerDL5000、 抽提陰性對照PCR擴增產(chǎn)物；3 :PCR陰性對照；4 :gD基因PCR擴增產(chǎn)物；
[0061] 圖3為pFastBac/HBM-TOPO-gB酶切鑒定結(jié)果，從左至右各泳道分別為：Marker 01^5000;2-5泳道$?38七83(：/耶1-1'(^〇18 11111和出11(1111酶切鑒定結(jié)果；
[0062] 圖4為pFastBac/HBM-TOPO-gD酶切鑒定結(jié)果，從左至右各泳道分別為：Marker 01^5000;2-4泳道$?38七83(：/耶1-1'(^〇1〇11111和出11(1111酶切鑒定結(jié)果 ；
[0063] 圖5為Bacmid-gB和Bacmid-gDPCR鑒定結(jié)果，從左至右各泳道分別為：Marker DL5000、Bacmid-gBPCR鑒定、Bacmid-gDPCR鑒定、BacmidPCR陰性對照；
[0064] 圖 6 為vNDV-PRV-gB-gD構(gòu)建示意圖。
[0065] 序列表中：
[0066] 序列1為PRVHN1201株gB蛋白的核苷酸序列；
[0067] 序列2為PRVHN1201株gD蛋白的核苷酸序列；
[0068] 序列3為PRVHN1201株gB蛋白的氨基酸序列；
[0069] 序列4為PRVHN1201株gD蛋白的氨基酸序列。
【具體實施方式】
[0070] 下面結(jié)合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述更 為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領域技術人 員應該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術方案的細節(jié)和形式進 行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
[0071] 實施例1豬偽狂犬病毒gB、gD蛋白的制備
[0072] 1.豬偽狂犬病毒gB、gD基因的擴增
[0073] 在生長良好的PK15細胞上接種PRVHN1201病毒或其不同代次的培養(yǎng)物，該不同 代次的培養(yǎng)物為5-35代以內(nèi)的培養(yǎng)物，收獲病毒后用TAKARA公司MiniBESTViralRNA/ DNAExtractionKitVer. 3· 0試劑盒提取PRV基因組DNA。取1μ1基因組DNA作為模板， 分別利用gB、gD特異性引物：
[0078] 進行PCR擴增，利用TAKARA的高保真酶PtkneST_AR@:HSDNAPolymerasewith GCBuffer，gB擴增條件為：94°C3min;98°C10s，68°C3min，30c