專利名稱：一種狂犬病毒疫苗增效蛋白及編碼該蛋白的基因和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種狂犬病毒疫苗增效蛋白及編碼該蛋白的基因和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
狂犬病是當(dāng)前威脅人類健康的一種比較嚴(yán)重的急性傳染病，人類患者一旦被病畜咬傷而發(fā)病，死亡率高達(dá)95%以上。當(dāng)前我國(guó)狂犬病形勢(shì)也相當(dāng)嚴(yán)峻，發(fā)病率居世界第二位，僅次于印度。通過(guò)注射狂犬病毒疫苗預(yù)防狂犬病的感染是當(dāng)前控制狂犬病發(fā)病的重要途徑。但是目前狂犬病毒疫苗的免疫效果在人群中存在較大差異，且注射后體內(nèi)狂犬病毒抗體的滴度上升到具有保護(hù)效力的滴度所需要的時(shí)間較長(zhǎng)，不足以在病毒潛伏期內(nèi)產(chǎn)生足夠的抗體以抵抗狂犬病毒的感染和發(fā)病。因此尋找能夠有效增強(qiáng)狂犬病毒疫苗免疫源性的分子作為佐劑是解決該問(wèn)題的一個(gè)重要途徑。采用基因工程原理，應(yīng)用原核(如大腸桿菌)表達(dá)系統(tǒng)或真核(如酵母、哺乳動(dòng)物細(xì)胞等)表達(dá)系統(tǒng)克隆表達(dá)某種蛋白是獲取大量該蛋白的最為有效的方法。將其與狂犬病毒疫苗一同免疫動(dòng)物，再用ELISA方法測(cè)定動(dòng)物體內(nèi)狂犬病毒特異性抗原的抗體效價(jià)，可以很方便地觀察到該蛋白是否能夠增強(qiáng)狂犬病毒疫苗的免疫效果，從而推斷該蛋白在狂犬病毒疫苗領(lǐng)域是否具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種狂犬病毒疫苗的增效蛋白及編碼該蛋白的基因，并提供表達(dá)該蛋白的方法和應(yīng)用。本發(fā)明提供的狂犬病毒疫苗的增效蛋白(記為SBP)，其核苷酸序列為SEQ. ID. NO. 1所示，具有如下功能特征①可與狂犬病毒疫苗親和，測(cè)得親和常數(shù)可達(dá) 1. 16 XlOVmol ；②與狂犬病毒疫苗注射動(dòng)物或人體，可以縮短達(dá)到保護(hù)效力的抗體滴度的時(shí)間，提高免疫應(yīng)答效率和強(qiáng)度。本發(fā)明還提供編碼所述狂犬病毒疫苗的增效蛋白的基因，其氨基酸序列為SEQ. ID. NO. 2 所示。通過(guò)基因工程改造，本發(fā)明還獲得了一系列同源性達(dá)80%以上的具有對(duì)狂犬病毒疫苗有增效功能的序列。具體包含以下序列
1、通過(guò)體外擴(kuò)增拼接或DNA人工合成得到若干具有和SBP同樣免疫增效功能的基因序列，基因序列號(hào)為SEQ. ID. NO. 3— SEQ. ID. NO. 5，經(jīng)過(guò)修飾的蛋白序列SEQ. ID. NO. 6、SEQ. ID. NO. 7。2、通過(guò)定點(diǎn)突變、基因重組等手段獲得了幾種具有更強(qiáng)親和力免疫增效功能的蛋白序列SEQ. ID. NO. 8、SEQ. ID. NO. 9。3、通過(guò)各種方法獲得的與上述基因或蛋白質(zhì)序列(SEQ. ID. NO. 1— SEQ. ID. NO. 9) 同源性達(dá)80%以上并具有與狂犬病毒疫苗高度親和性及對(duì)狂犬病毒疫苗具有顯著增效功能的序列，上述序列統(tǒng)稱為SBI^s。將上述DNA序列/片段直接克隆到PBV220或其它原核表達(dá)載體，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)獲得重組蛋白；也可將上述表達(dá)片段克隆到真核表達(dá)載體如pEGFP-Nl、pICZ α (a, b, c)等在哺乳細(xì)胞和酵母中表達(dá)。運(yùn)用Ni-NTA agarose、交聯(lián)有SPA、ConA、mAb等的親和柱進(jìn)行純化， 最終得到純化的目的蛋白。本發(fā)明的核苷酸序列為SEQ. ID. NO. 1的蛋白可作為狂犬病毒疫苗佐劑。該蛋白與狂犬病毒疫苗具有高親和性，與狂犬病毒(抗原)疫苗聯(lián)用可顯著加速狂犬病毒(抗原)抗體產(chǎn)生的時(shí)間，提高疫苗的免疫效果，提高動(dòng)物體內(nèi)保護(hù)性抗體滴度，可用于在動(dòng)物受病毒侵染后應(yīng)急防治保護(hù)。本發(fā)明的氨基酸序列為SEQ. ID. NO. 2的蛋白可作為狂犬病毒疫苗佐劑。通過(guò)重組表達(dá)與SBP具有80%以上同源性的蛋白，包括和其他抗原成分(如各種蛋白多肽)的融合、聚合、混合等各種聯(lián)合方式一起使用，產(chǎn)生協(xié)同增效作用的有效形式。該蛋白對(duì)狂犬病毒疫苗親和性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果用不同稀釋度的疫苗液體(1:5、 1 10、1 20、1 40、1 80)包被96孔酶標(biāo)板，孵育后加入SBP作為一抗，抗人IgG為二抗進(jìn)行 ELISA反應(yīng)，測(cè)得的OD值與未加入SBP的結(jié)果進(jìn)行對(duì)照，觀察SBP與狂犬病毒疫苗的親和性。結(jié)果證明SBP與狂犬病毒具有極強(qiáng)的親和力，親和常數(shù)Ka>107L/mol。該蛋白對(duì)狂犬病毒疫苗免疫效果的影響將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為試驗(yàn)組和對(duì)照組。以小鼠為例，按常規(guī)方法用狂犬病毒疫苗免疫小鼠，皮下注射。在免疫后的第12、20、觀、42天從小鼠尾靜脈取血，分離血清。用ELISA方法測(cè)定小鼠體內(nèi)抗狂犬病毒抗體的滴度。SPSS軟件分析試驗(yàn)組和對(duì)照組的差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)該蛋白可以明顯增強(qiáng)小鼠體內(nèi)抗體的滴度，即該蛋白可以增強(qiáng)狂犬病毒疫苗的免疫效果。由此可見(jiàn)，該蛋白對(duì)狂犬病毒疫苗具有極強(qiáng)的親和性，利用該蛋白可以增強(qiáng)狂犬病毒疫苗的免疫原性，可降低狂犬病毒抗體在體內(nèi)達(dá)到保護(hù)性作用滴度的時(shí)間，有利于體內(nèi)在短時(shí)間內(nèi)生成具有保護(hù)性的狂犬病毒抗體。因此可將其作為一種狂犬病毒疫苗的增效分子即佐劑而應(yīng)用于狂犬病毒疫苗領(lǐng)域，提高現(xiàn)有狂犬病毒疫苗的效力，降低狂犬病的發(fā)病率和致死率。


圖1該蛋白對(duì)狂犬病毒疫苗的親和性。圖2該蛋白對(duì)Balb/c小鼠抗狂犬病毒抗體效價(jià)的影響。
具體實(shí)施例方式一、基因序列的獲得與改造
通過(guò)人工合成、體外基因擴(kuò)增拼接的方式對(duì)SBP基因序列進(jìn)行修飾或同義突變，獲得多種和SBP具有相同功能的基因序列(SEQ. ID. NO. 3_5)。例如，在該cDNA的N或C端引入 6 Xhis purification tag 和腸激酶酶切位點(diǎn) DDDDK，6 Xhis purification tag 有利于目的融合蛋白的親和純化，腸激酶酶切位點(diǎn)可以使純化的融合蛋白在腸激酶的作用下切除掉 6 Xhis tag 禾口 DDDDK。根據(jù)SBP和HBsiVg三維互作模式，特別是靜電分布狀態(tài)的分析結(jié)果，采用點(diǎn)突變和基因重組的方法對(duì)SBP進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造(如V3D，T8D)，獲得具有強(qiáng)化免疫增效功能的蛋白序列(SEQ. ID. NO. 8-9)。二、基因工程表達(dá)和純化目的蛋白
1、原核表達(dá)。在該CDNA的N端引入6Xhispurification tag和腸激酶酶切位點(diǎn) DDDDK0將這一完整的DNA克隆到pBV220原核表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。 挑取陽(yáng)性單克隆于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)并進(jìn)行溫度誘導(dǎo)發(fā)酵首先在37 C，250rpm培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌至0D_=0. 5^0. 6，然后迅速升溫至42°C開(kāi)始誘導(dǎo)發(fā)酵5小時(shí)。發(fā)酵結(jié)束后離心收集菌體，裂解菌體以提取包涵體，包涵體粗純后用Ni-NTA agarose柱親和純化，經(jīng)透析復(fù)性后最終得到目的蛋白。用Western和ELISA實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證所獲得的蛋白正是所需要的目的蛋白；
2、酵母真核表達(dá)。將上述基因克隆到真核表達(dá)載體PlCZα (hb，c)轉(zhuǎn)化畢赤酵母 (GS115)，在BMMY培養(yǎng)基中進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)，重組蛋白可經(jīng)交聯(lián)有SPA、ConA、mAb的親和柱和離子交換柱等分離純化，最后得到了較高純度的目的蛋白；
3、真核細(xì)胞表達(dá)。將上述基因序列及其改造后的序列克隆到pEGFP-Nl等哺乳細(xì)胞表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，經(jīng)RPMI-1640完全培養(yǎng)基中大量培養(yǎng)，收獲細(xì)胞并在不損害蛋白活性的前提下裂解細(xì)胞，經(jīng)Ni-NTA agarose柱及經(jīng)交聯(lián)有SPA、ConA, mAb的親和柱親和純化，獲得高活性的目的蛋白。三、SBP蛋白對(duì)狂犬病毒疫苗效果的影響評(píng)價(jià)
1、該蛋白對(duì)狂犬病毒疫苗親和性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果用不同稀釋度的疫苗液體(1:5、1:10、 1 20、1 40、1 80)包被96孔酶標(biāo)板，孵育后加入SBP作為一抗，抗人IgG為二抗進(jìn)行ELISA 反應(yīng)，測(cè)得的OD值與未加入SBP的結(jié)果進(jìn)行對(duì)照，觀察SBP與狂犬病毒疫苗的親和性。結(jié)果證明SBP與狂犬病毒具有極強(qiáng)的親和力，親和常數(shù)Ka>107L/mol。2、蛋白對(duì)狂犬病毒疫苗免疫效果的影響將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為試驗(yàn)組和對(duì)照組。以小鼠為例，按常規(guī)方法用狂犬病毒疫苗免疫小鼠，皮下注射。在免疫后的第12、20、觀、42天從小鼠尾靜脈取血，分離血清。用ELISA方法測(cè)定小鼠體內(nèi)抗狂犬病毒抗體的滴度。SPSS軟件分析試驗(yàn)組和對(duì)照組的差異。結(jié)果(圖1、圖2)發(fā)現(xiàn)，SBP與狂犬病毒疫苗具有極強(qiáng)的親和作用。實(shí)驗(yàn)小鼠在免疫后14天左右抗體效價(jià)達(dá)到了 8000，而對(duì)照組在免疫14天后抗體仍未產(chǎn)生。在免疫后20 天，實(shí)驗(yàn)組的小鼠抗體效價(jià)達(dá)到了 10000，而對(duì)照組的抗體僅為4000。以上結(jié)果說(shuō)明SBP蛋白能夠通過(guò)增強(qiáng)與狂犬病毒疫苗的親和力而上調(diào)小鼠體內(nèi)抗狂犬病毒抗體的能力，可以增強(qiáng)狂犬病毒疫苗的免疫效果。四、具體應(yīng)用
傳統(tǒng)的狂犬病毒疫苗往往不能在短時(shí)間內(nèi)提高體內(nèi)抗體的滴度，從而不能很好地在狂犬病毒潛伏期內(nèi)提供足夠的抗體水平以抵抗病毒的侵染。本發(fā)明提供的這種狂犬病毒疫苗增效蛋白能夠在短時(shí)期內(nèi)顯著提高小鼠體內(nèi)狂犬病毒抗體的滴度水平，明顯增強(qiáng)狂犬病毒疫苗的免疫效果，因此，可將其用于狂犬病毒疫苗佐劑的開(kāi)發(fā)。在注射狂犬病毒疫苗的同時(shí)，注射一定量的該蛋白，能夠增強(qiáng)狂犬病毒疫苗的免疫原性，在短時(shí)間內(nèi)增加體內(nèi)抗狂犬病毒抗體的效價(jià)，從而提高疫苗的免疫效率，并減少狂犬病毒疫苗的用量和注射次數(shù)。
權(quán)利要求
1.一種狂犬病毒疫苗增效蛋白，其特征在于核苷酸序列為SEQ. ID. NO. 1。
2.一種編碼如權(quán)利要求1所述狂犬病毒疫苗增效蛋白的基因，其特征在于氨基酸序列為 SEQ. ID. NO. 2。
3.一種具有與權(quán)利要求1所述狂犬病毒疫苗增效蛋白同樣功能的蛋白，其特征在于核苷酸序列為 SEQ. ID. NO. 3— SEQ. ID. NO. 5 之一所示。
4.一種經(jīng)過(guò)修飾的蛋白序列，其特征在于氨基酸序列為SEQ. ID. NO. 6或SEQ. ID. NO. 7 所示。
5.一種表達(dá)如權(quán)利要求1所述的狂犬病毒疫苗增效蛋白的方法，其特征在于具體步驟為將基因序列克隆到原核表達(dá)載體PBV220轉(zhuǎn)化大腸桿菌，或真核表達(dá)載體PlCZ α ( i，b，C)轉(zhuǎn)化畢赤酵母(GS115)，或pEGFP-Nl哺乳細(xì)胞表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)和純化，獲得一系列高純度的目的蛋白。
6.如權(quán)利要求1所述蛋白作為狂犬病毒疫苗佐劑的應(yīng)用。
7.如氨基酸序列為SEQ.ID. NO. 2的蛋白基因作為狂犬病毒疫苗佐劑的應(yīng)用。
全文摘要
發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種狂犬病毒疫苗增效蛋白及編碼該蛋白的基因和應(yīng)用。將該蛋白的cDNA用基因工程方法克隆至原核細(xì)胞、真核(酵母、動(dòng)物、植物)細(xì)胞表達(dá)由該cDNA編碼的蛋白。該蛋白與狂犬病毒疫苗具有高親和性，與狂犬病毒(抗原)疫苗聯(lián)用可顯著加速狂犬病毒(抗原)抗體產(chǎn)生的時(shí)間，提高疫苗的免疫效果，提高動(dòng)物體內(nèi)保護(hù)性抗體滴度。本發(fā)明的蛋白可以用作狂犬病毒疫苗的佐劑，用于開(kāi)發(fā)高效快速的增效型狂犬病毒疫苗，以達(dá)到在動(dòng)物受病毒侵染后應(yīng)急防治保護(hù)作用。
文檔編號(hào)C12N15/63GK102286068SQ201110203440
公開(kāi)日2011年12月21日 申請(qǐng)日期2011年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月20日
發(fā)明者朱乃碩, 胡曉波 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)