專利名稱：編碼狂犬病毒糖蛋白的基因片段及用此片段制備狂犬病毒糖蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及可用于狂犬疫苗或其他診斷試劑的狂犬病毒糖蛋白。更具體說，本發(fā)明涉及編碼狂犬病毒糖蛋白的基因片段，通過表達(dá)所述基因片段而制備的重組的狂犬病毒糖蛋白，以及制備所述狂犬病毒糖蛋白的方法。
狂犬病是人類已知的最古老的疾病之一，對于人類和其他哺乳動(dòng)物都是一種相當(dāng)危險(xiǎn)的傳染性疾病，它在所有感染此疾病的哺乳動(dòng)物中都能導(dǎo)致100%的死亡率。
日本具有下述有利條件的優(yōu)越性即它是一個(gè)島國，并已經(jīng)對狗類實(shí)施了狂犬病預(yù)防措施(狗類是這種人類疾病的主要攜帶者)，而且每年都進(jìn)行預(yù)防性注射。其結(jié)果是，此疾病已在1957年被成功地根除了。從那以后的約30年內(nèi)，日本在根除狂犬病方面在世界上具有很高的地位，也就是說，沒有發(fā)生所述疾病。然而，狂犬病仍然流行于世界，日本只不過是根除了狂犬病的一個(gè)相當(dāng)罕見的例子。根據(jù)世界衛(wèi)生組織1982年的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，狂犬病在越南、泰國、菲律賓、印度、巴西、厄瓜多爾及類似國家流行很盛，并估計(jì)僅在印度一個(gè)國家，每年就有多達(dá)50，000人死于狂犬病。而且即使在日本，狂犬病問題也并未完全解決，對于去外國的游客(尤其是東南亞)來說，注射狂犬病疫苗仍是一種很重要的預(yù)防性接種。
回顧一下狂犬病疫苗的發(fā)展歷史將會(huì)發(fā)現(xiàn)，狂犬病疫苗的發(fā)展首先起于法國巴斯德研究所的減毒疫苗，其次是由哺乳動(dòng)物腦制備的失活疫苗及其部分純化的疫苗，進(jìn)一步是利用哺乳動(dòng)物或鳥類的培養(yǎng)細(xì)胞通過細(xì)胞培養(yǎng)制備的疫苗。但所有這些疫苗都是第一代疫苗，并仍然具有安全及生產(chǎn)率等方面的問題。
Nishigahara菌株衍生物是一種適于制備動(dòng)物和人疫苗的病毒株，它對于當(dāng)代日本的狂犬病根除作出了巨大貢獻(xiàn)。此病毒株是通過修改巴氏固定的狂犬病疫苗而制備的，后者是由法國巴斯德研究所制備的。也就是說，由于巴氏固定的狂犬病毒在兔中傳代時(shí)的潛伏期為5至6天，Kondo等人(JapanMnistryofAgricultureandForestry，NishigaharaAnimalPlagueResearchInstitute)將此病毒分別在小豚鼠和兔中培養(yǎng)了大約90代，所得到的固定病毒的潛伏期縮短至3至4天，這在當(dāng)時(shí)是最短的(JuekiChosashoKenkyuHokoku，AnimalPlagueResearchInstituteStudyReport，第1期，1918年8月出版)。
迄今已知的其他典型的狂犬病毒包括ERA株、CVS株、PV株等等。已經(jīng)證實(shí)，這些狂犬病毒結(jié)構(gòu)相同，都是由五種蛋白質(zhì)即L、G、N、M1和M2構(gòu)成。在這些病毒的構(gòu)成蛋白中，已知G蛋白是一種制備疫苗的有效物質(zhì)(Wiktor等人，J.Immunol.110269-276，1973)。近年來，已經(jīng)制備了針對狂犬病毒每種構(gòu)成蛋白的單克隆抗體，從而能夠在還未確定的狂犬病毒株之間進(jìn)行比較。Flamand等人(J.Gen.Virol.48105-109，1980)比較了若干狂犬病毒產(chǎn)生中和性抗體的能力，并比較了單克隆抗體對于與G蛋白相關(guān)的感染的預(yù)防作用，結(jié)果表明，G蛋白中至少存在有14個(gè)抗原決定簇，而且，通過這些反應(yīng)型的比較能夠使狂犬病毒株相互區(qū)別。此后，許多研究者利用一系列針對N蛋白的單克隆抗體，研究了由世界各地分離的街道狂犬病毒的抗原性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在許多情況下，病毒的抗原性與分離它的地區(qū)或動(dòng)物有關(guān)。由這些事實(shí)可產(chǎn)生一個(gè)嚴(yán)重問題，即僅僅一株疫苗不大可能預(yù)防全世界的狂犬病。然而，本發(fā)明的狂犬疫苗是由Nishigahara株產(chǎn)生的，而如上所述日本已經(jīng)根除狂犬病這一事實(shí)已證明了這一菌株的優(yōu)越性。
迄今為止，已經(jīng)報(bào)導(dǎo)了一些利用基因重組技術(shù)表達(dá)狂犬病毒蛋白的試驗(yàn)，尤其是G蛋白。例如，L.T.Lawence等人(Vaccine84203-208，冷泉港實(shí)驗(yàn)室編)報(bào)導(dǎo)，一個(gè)編碼狂犬病毒ERA株糖蛋白的基因被導(dǎo)入大腸桿菌(EscherichiaColi)的表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)，結(jié)果雖然糖蛋白基因在大腸桿菌中得到了表達(dá)，但由于宿主細(xì)胞是大腸桿菌而未發(fā)生糖基化作用，因此沒有得到能作為有效免疫原的抗原。E.Yelverton等人(Science219614-619，1983)也報(bào)導(dǎo)了一個(gè)利用大腸桿菌表達(dá)狂犬病毒糖蛋白的實(shí)驗(yàn)。此報(bào)導(dǎo)沒有給出任何已得到有效抗原的結(jié)果。此后，如日本專利公開(PCT)500949/1986所報(bào)導(dǎo)，在真核細(xì)胞如酵母或動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行了G蛋白表達(dá)的嘗試。雖然此報(bào)導(dǎo)描述了糖基化G蛋白的表達(dá)，但它沒有給出任何用動(dòng)物進(jìn)行的免疫測試的結(jié)果。
正如上面的報(bào)導(dǎo)所指出，雖然成功地進(jìn)行了G蛋白本身的表達(dá)，但從應(yīng)用的觀點(diǎn)看來，目前還未發(fā)展出一種利用這些G蛋白的有效的狂犬疫苗。
在這種情況下，本發(fā)明者通過應(yīng)用基因重組技術(shù)進(jìn)行了充分研究，企圖發(fā)展出一種比第一代傳統(tǒng)的狂犬疫苗更為安全有效的狂犬病毒疫苗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過本發(fā)明的基因重組技術(shù)能夠得到所的狂犬糖蛋白，所述技術(shù)是指，克隆編碼由Nishigahara株產(chǎn)生的狂犬病毒G蛋白的cDNA，將克隆的互補(bǔ)DNA(cDNA)插入真核細(xì)胞的表達(dá)載體中，以在真核細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。根據(jù)該方法，所需的狂犬病毒糖蛋白能在真核細(xì)胞中很好地表達(dá)。并且還證實(shí)了所表達(dá)的糖蛋白是一種有效疫苗。根據(jù)本發(fā)明利用基因重組技術(shù)制備狂犬病毒糖蛋白的方法，所需的糖蛋白是在胞質(zhì)的局部進(jìn)行表達(dá)，而不與轉(zhuǎn)化細(xì)胞的細(xì)胞膜結(jié)合，對所需糖蛋白進(jìn)行有效的表達(dá)時(shí)，幾乎不影響轉(zhuǎn)化細(xì)胞的代謝，而且能夠很容易地純化蛋白質(zhì)。這樣得到的本發(fā)明的糖蛋白不僅能與具有狂犬病毒中和活性的單克隆抗體發(fā)生反應(yīng)，還能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生這樣的抗體，它具有在用所述糖蛋白免疫的動(dòng)物體內(nèi)中和狂犬病毒的活性。因此，已證實(shí)本發(fā)明的糖蛋白可用于制備疫苗或診斷試劑。


圖1顯示了編碼本發(fā)明者克隆的狂犬病毒G蛋白的結(jié)構(gòu)基因順序和與之相接的基因順序，以及由此推導(dǎo)出的氨基酸順序。
圖2顯示了在狂犬G-cDNA的制備中腺苷酸串的去除。
圖3顯示了以COS細(xì)胞作為宿主的表達(dá)載體，pSVL-N913的構(gòu)建。
圖4顯示了COS細(xì)胞形態(tài)變化的照片，其中，COS細(xì)胞中表達(dá)的狂犬G蛋白由熒光反應(yīng)顯示。
圖5顯示了酵母表達(dá)載體pAMN913的構(gòu)建。
本發(fā)明所用的狂犬病毒株如前所述產(chǎn)生于Nishigahara株，后者通過在兔中傳代保存，到目前已傳了2000多代(下面稱為“N.HL株”)。
本發(fā)明編碼狂犬病毒G蛋白的基因片段(G-cDNA)是一個(gè)含有1575堿基對的基因片段，它在圖1所示的堿基對中始于起始密碼ATG，一直到終止密碼TGA，或是一個(gè)含有與其等同的基因順序的基因片段，或是一個(gè)含有部分該基因的基因，它基本上編碼上述基因片段中的抗原決定簇。
利用常規(guī)的基因克隆技術(shù)，例如利用Gubler和Hoffman的方法(Gene25263-269，1983)，由狂犬病毒N.HL株能夠克隆到本發(fā)明的G-cDNA。本發(fā)明者已以大腸桿菌DH5α/pUC-N913寄存了一株大腸桿菌，它含有的質(zhì)粒中摻入有狂犬病毒N.HL株的G-cDNA，它是根據(jù)布達(dá)佩斯條約以“FERMBP-1613”寄存于日本工業(yè)科技署的發(fā)酵研究所。根據(jù)圖1所示的堿基對，本發(fā)明的G-cDNA也可利用DNA合成儀(如AppliedBiosystemCo.，Ltd.制造的381A型)合成所需的1575堿基對或其必需部分而制備。G-cDNA能被摻入適當(dāng)?shù)妮d體中，然后導(dǎo)入真核細(xì)胞中，以在胞質(zhì)中表達(dá)所需的狂犬病毒G蛋白。
為了表達(dá)本發(fā)明的G-cDNA，可利用真核細(xì)胞作為宿主細(xì)胞。這種真核細(xì)胞包括酵母、來自哺乳類的動(dòng)物細(xì)胞或來自昆蟲細(xì)胞的培養(yǎng)細(xì)胞。表達(dá)體系的構(gòu)建可如下述進(jìn)行首先構(gòu)建適于所用的宿主細(xì)胞的表達(dá)載體，然后將表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，以產(chǎn)生所需要的能表達(dá)G蛋白的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。對于使用酵母細(xì)胞和培養(yǎng)細(xì)胞作為宿主細(xì)胞的兩種情況，下面都將給出詳細(xì)說明。
如果用酵母細(xì)胞作為宿主細(xì)胞，則所述的G-cDNA最好摻入穿梭載體中，該載體既攜帶有酵母基因又有大腸桿菌基因，并進(jìn)一步攜有合適的啟動(dòng)子區(qū)。這種穿梭載體是一種質(zhì)粒，它含有酵母的復(fù)制原點(diǎn)(例如2μori和/或arsl等)、酵母中的選擇標(biāo)記基因、來自酵母的啟動(dòng)子區(qū)、大腸桿菌的復(fù)制原點(diǎn)(例如來自pBR322的Ori等)和大腸桿菌中的選擇標(biāo)記基因等。此處提及的酵母中的選擇標(biāo)記是指一種產(chǎn)生氨基酸如亮氨酸、組氨酸或色氨酸的基因。大腸桿菌中的選擇標(biāo)記是指氨芐青霉素、卡那霉素、四環(huán)素或氯霉素的抗性基因。來自酵母的啟動(dòng)子區(qū)是指能在酵母細(xì)胞中作用的表達(dá)調(diào)控區(qū)。這種優(yōu)選的啟動(dòng)子區(qū)包括(例如)可阻遏的酸性磷酯酶(PH05)啟動(dòng)子、戊二醛-3-磷酸脫氫酶(GAP-DH)啟動(dòng)子等。這種穿梭載體的優(yōu)選實(shí)例有含有酸性磷酯酶表達(dá)調(diào)控區(qū)(啟動(dòng)子)的pAM82(參見US4，778，761)及其等同物。作為宿主的優(yōu)選酵母細(xì)胞包括，但不限于，釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)AH22(FERMBP-312)等。
可以利用常規(guī)的轉(zhuǎn)化方法(Ito等，J.Bacteriol.153163-168，1983)用上述適于酵母的表達(dá)載體(穿梭載體)轉(zhuǎn)化酵母，以得到能夠表達(dá)所需G蛋白的轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞。
如果利用培養(yǎng)細(xì)胞作為宿主，則用G-cDNA取代SV40病毒的部分基因，以產(chǎn)生能在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中表達(dá)G蛋白的重組病毒，然后將重組病毒與輔助病毒一起導(dǎo)入宿主細(xì)胞中以產(chǎn)生所需的G蛋白。另外一種方法是，使能夠在宿主細(xì)胞中以質(zhì)粒狀態(tài)生長的病毒的部分基因(例如乳頭狀瘤病毒等)與G-cDNA連接，然后將連接產(chǎn)物導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，以產(chǎn)生質(zhì)粒狀態(tài)的能表達(dá)G蛋白的表達(dá)所需基因的細(xì)胞。進(jìn)一步，如果將G-cDNA摻入大腸桿菌的質(zhì)粒中，并在所述G-cDNA的上游連接來自高等動(dòng)物的病毒或啟動(dòng)子，然后將其導(dǎo)入培養(yǎng)細(xì)胞中，則能在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中表達(dá)摻入宿主染色體中的G-cDNA。這種質(zhì)粒也可以使用市售可得的質(zhì)粒，例如pSVL載體(Pharmacia生產(chǎn))。
可以下述方式處理這樣制備的表達(dá)G蛋白的轉(zhuǎn)化體，以便純化所需的G蛋白。
首先，在適合所用細(xì)胞的條件下用培養(yǎng)基培養(yǎng)所得到的轉(zhuǎn)化體，以在轉(zhuǎn)化體的胞質(zhì)中產(chǎn)生所需G蛋白。如果使用酵母細(xì)胞作為宿主細(xì)胞，則通過物理處理如超聲處理、用玻璃珠處理、或用MantonGaulin(APV-GAULIN、INC、USA，MS18-8TBS)處理(并也可以伴隨化學(xué)處理如表面活性劑處理)來破碎收集的細(xì)胞。如果用培養(yǎng)細(xì)胞作為宿主細(xì)胞，則無需進(jìn)行如酵母那樣的強(qiáng)處理，只需用表面活性劑處理就能洗脫在胞質(zhì)中產(chǎn)生的G蛋白。使這樣得到的溶菌液通過離心等方法去除宿主細(xì)胞沉淀，然后利用抗狂犬G蛋白抗體進(jìn)行親和層析，以方便地純化出所需G蛋白。通過常規(guī)的純化方法能夠進(jìn)行進(jìn)一步純化，例如離子交換層析、密度梯度離心或各種親和層析，從而能使蛋白質(zhì)高度純化，達(dá)到可作為疫苗使用的純化度。
本發(fā)明的狂犬病毒G-cDNA、通過其表達(dá)而制備的重組G蛋白和表達(dá)系統(tǒng)與先有技術(shù)相比較具有如下幾點(diǎn)特征(1)糖蛋白(G蛋白)cDNA的堿基順序迄今為止，已經(jīng)報(bào)導(dǎo)了好幾種狂犬病毒cDNA的堿基順序，其中，狂犬病毒構(gòu)成蛋白中成熟G蛋白的cDNA包含1515個(gè)堿基對，編碼505個(gè)氨基酸。將本發(fā)明中狂犬病毒N.HL株的G-cDNA堿基順序與ERA株、CVS株和PV株的相比較表明，本發(fā)明G-cDNA的堿基順序與其中的任何一個(gè)都不同，此差別在Asn-X-Thr(Ser)順序部分(估計(jì)是發(fā)生糖基化的部位)尤其明顯。表1總結(jié)了此差別。
表1菌株從N端起的氨基酸號碼37158204247319465480N·HLOXXOOXOERAOXXOOOXCVSOXOXOXOPVOOXOOOXO能夠進(jìn)行糖基化的位點(diǎn)X不能進(jìn)行糖基化的位點(diǎn)對于糖基化的重要性了解還不清楚，但認(rèn)為它參與了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或穩(wěn)定性。事實(shí)上，活體中的許多蛋白如生理活性物質(zhì)和血清蛋白都是糖蛋白。雖然糖基化信號順序的存在并不一定意味著糖基化的形成，但此順序非?？赡軈⑴c了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或穩(wěn)定性。如果說，糖基化信號順序參與了蛋白質(zhì)的功能(即生物活性)，則因此可以說，對糖基化位點(diǎn)進(jìn)行比較與比較完整cDNA的同源性是同等重要的。
(2)在動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞系統(tǒng)中的表達(dá)型將本發(fā)明的表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞中，例如COS細(xì)胞，然后利用多克隆抗體(用狂犬病毒G蛋白免疫動(dòng)物而制備)和單克隆抗體(具有中和狂犬病毒的活性)檢測狂犬病毒G蛋白的表達(dá)位點(diǎn)。
結(jié)果，按照用本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)，在胞質(zhì)中檢測到了G蛋白顆粒，而在細(xì)胞膜上沒有。迄今為止，還從未報(bào)導(dǎo)過在動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)狂犬病毒G蛋白時(shí)有這種現(xiàn)象，因此，本發(fā)明的上述表達(dá)類型是相當(dāng)新穎的。關(guān)于水泡性口炎病毒(VSV)(它與狂犬病毒一樣屬于Rhabdoviridae)，Rose等人以與本發(fā)明表達(dá)系統(tǒng)同樣的方式構(gòu)建了VSV的G蛋白cDNA，并報(bào)告了其表達(dá)類型(Cell30753-762，1982)。根據(jù)此報(bào)導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中表達(dá)的特異抗原與細(xì)胞膜連接在一起。這一現(xiàn)象表明，本發(fā)明中G蛋白的定位是基于本發(fā)明G-cDNA的特異功能。
除了將表達(dá)產(chǎn)物釋放至培養(yǎng)基中的系統(tǒng)以外，外源基因的表達(dá)系統(tǒng)可分為兩種類型，即表達(dá)產(chǎn)物在胞質(zhì)中局部進(jìn)行表達(dá)的系統(tǒng)和表達(dá)產(chǎn)物在表達(dá)后定位于細(xì)胞膜上的系統(tǒng)。一般說來，如果表達(dá)產(chǎn)物與細(xì)胞膜相結(jié)合，則宿主細(xì)胞易受到生長抑制，而且，在純化與細(xì)胞膜結(jié)合的蛋白時(shí)(糖蛋白)，由于細(xì)胞膜成分與所需蛋白結(jié)合在一起，所需蛋白的質(zhì)量或產(chǎn)率受到很大影響。本發(fā)明的狂犬病毒G蛋白表達(dá)系統(tǒng)能夠在胞質(zhì)中表達(dá)所需蛋白，因此不存在上述的表達(dá)效率和純化等問題，從而能夠高效率地表達(dá)和純化所需蛋白。
(3)通過表達(dá)的G蛋白生產(chǎn)中和性抗體如果一種外源基因如本發(fā)明所用酵母細(xì)胞或培養(yǎng)細(xì)胞通過基因重組技術(shù)得到了表達(dá)，則表達(dá)的肽段即使能夠與所需肽段(抗原)的抗體反應(yīng)(即表現(xiàn)出對抗體的抗原性)，它有時(shí)也可能不具有適于進(jìn)行生物制備的性質(zhì)。這可能依賴于是否對肽段進(jìn)行了修飾，使得它在宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)譯后表現(xiàn)出生物活性。如前所述，E.Yelverton等人已成功地用大腸桿菌表達(dá)了狂犬G蛋白基因，并證實(shí)產(chǎn)生的蛋白能與針對狂犬G蛋白的抗體反應(yīng)，但據(jù)報(bào)道他們用產(chǎn)生的蛋白對動(dòng)物免疫后不能產(chǎn)生任何抗體。估計(jì)其主要原因是在大腸桿菌中缺乏修飾過程，例如糖基化作用。與此相似，如果使用真核細(xì)胞如酵母或培養(yǎng)細(xì)胞，在許多情況下可能產(chǎn)生同樣的表達(dá)產(chǎn)物的生物活性問題。估計(jì)有多種因素與此相關(guān)，包括表達(dá)肽段對于宿主細(xì)胞的效應(yīng)、為表現(xiàn)出固有生物活性的表達(dá)肽段的修飾等等。換言之，它受到導(dǎo)入宿主細(xì)胞以進(jìn)行表達(dá)的編碼所需肽段的大量結(jié)構(gòu)基因的精細(xì)調(diào)控。與此相反，將本發(fā)明的G-cDNA導(dǎo)入真核細(xì)胞以進(jìn)行表達(dá)時(shí)，所產(chǎn)生的G蛋白不僅能與G蛋白的抗體反應(yīng)，當(dāng)它作為疫苗注入動(dòng)物體后還能誘導(dǎo)產(chǎn)生具有狂犬病毒中和活性的抗體，這一點(diǎn)已在豚鼠的免疫試驗(yàn)中得到證實(shí)。進(jìn)一步來看，比較它與來自狂犬病毒的純化G蛋白的免疫原性時(shí)，兩種蛋白表現(xiàn)出同樣水平的免疫原性。這些結(jié)果表明，本發(fā)明的G蛋白作為疫苗是足夠有效的，并提示包含有本發(fā)明G蛋白的疫苗將為在發(fā)展中國家和周圍其他國家中根除狂犬病作出貢獻(xiàn)，而這種疫苗通過基因重組技術(shù)能夠廉價(jià)而大量地制備。
本發(fā)明的特征在于，能夠以定位于胞質(zhì)中的狀態(tài)表達(dá)狂犬病毒G蛋白，而不與細(xì)胞膜結(jié)合，并且，這樣得到的狂犬G蛋白能夠誘導(dǎo)針對狂犬病毒的中和性抗體。
下述實(shí)例進(jìn)一步說明本發(fā)明，但它們并不限制本發(fā)明。
在實(shí)例中，除非特別指出，采用下列試劑和方法。
酶和化學(xué)試劑所用限制酶和修飾酶分別得自Takara Shuzo Co.Ltd.和Toyobo Co.Ltd.。至于α-32P-dCTP，采用Amasham產(chǎn)品(產(chǎn)品號PB 10385，800 Ci/mmol)。
DNA的切割、修飾和連接每種酶的使用都在小冊子“用于基因工程研究的Takara試劑”和“基因工程研究的Toyobo綜合目錄”中給出的條件下進(jìn)行。每種酶的反應(yīng)完成以后，根據(jù)《分子克隆》(T.Maniatis，p458-459，1982)的方法進(jìn)行苯酚處理和氯仿處理，然后通過乙醇沉淀收集DNA。利用Takara連接藥盒(TakaraShuzoCo.Ltd.，目錄號6021)并根據(jù)所附說明進(jìn)行DNA連接反應(yīng)。同樣利用此藥盒和根據(jù)所附說明在DNA末端加上人工接頭。
通過瓊脂糖電泳收集DNA片段根據(jù)《分子克隆》的方法(T.Maniatis，P150-163，1982)進(jìn)行DNA的瓊脂糖電泳。尤其在從瓊脂糖凝膠中提取特殊DNA片段時(shí)，使用一種低膠凝的瓊脂糖(BIO-RAD，目錄號162-0017)，并同樣根據(jù)《分子克隆》的方法(T.Maniatis，p170，1982)收集此片段。
質(zhì)粒的提取和純化如果要從轉(zhuǎn)化的大腸桿菌中提取和純化大量質(zhì)粒，應(yīng)采用《分子克隆》所述的堿性法(T.Maniatis，P90-91，1982)。為了從大量轉(zhuǎn)化的大腸桿菌中選擇出用所需質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的集落，首先根據(jù)下述的集落雜交法選擇所需的陽性克隆。根據(jù)《分子克隆》的方法(T.Maniatis，P368，1982)，從該克隆中提取和純化少量質(zhì)粒，然后用合適的限制酶切割，并通過瓊脂糖電泳進(jìn)行分析。
集落雜交和空斑雜交利用缺口轉(zhuǎn)譯藥盒(BRL，目錄號8160SB)和生物素-11-UTP(BRL，目錄號9507SA)并根據(jù)藥盒所附的說明由G-cDNA片段制備探針。根據(jù)Fujita等人SaiboKogaku(CellEngineer-ing4(10)893-900，1985)的條件進(jìn)行集落雜交和空斑雜交。
實(shí)例1G-cDNA的制備(1)RNA的提取倉鼠肺細(xì)胞(HmLu細(xì)胞)于37℃下培養(yǎng)48小時(shí)，然后用狂犬病毒H·HL株以0.2moi(感染復(fù)數(shù))進(jìn)行感染。48小時(shí)以后，根據(jù)《分子克隆》的方法(T.Maniatis，P196，1982)從細(xì)胞中提取完整RNA。
通過分光光度計(jì)的定量測定(260nm處的1.0吸光度相當(dāng)于40μg/ml)，每一旋管中的狂犬病毒感染細(xì)胞產(chǎn)生1.5mgRNA。為了證實(shí)這樣得到的RNA未被切斷，用2μgRNA根據(jù)P.Tomas(Proc.N.A.S.775201-5205，1980)的方法進(jìn)行電泳。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)RNA都是28s或18s的核糖體RNA，由于核糖體RNA并不分解，估計(jì)其中含有的少量G-mRNA也未被切斷。
將根據(jù)P.Tomas的方法電泳過的RNA轉(zhuǎn)移至硝化纖維素濾膜上(Schleicher & Schuell BA 85)，利用32P標(biāo)記的狂犬病毒HEP-Flury株的G-cDNA片段作為探針在硝化纖維素膜上進(jìn)行雜交(Northern印跡轉(zhuǎn)移)。結(jié)果，在一同進(jìn)行電泳的由未經(jīng)病毒感染的HmLu細(xì)胞中提取的RNA的泳道中未觀察到條帶，而在由病毒感染的細(xì)胞中提取的RNA的泳道中，在大約2.2Kbp處及分子量更大一些的地方觀察到一些條帶。在本文的后面，用此由病毒感染的細(xì)胞中提取的RNA進(jìn)行cDNA的合成。
(2)狂犬病毒H·HL株G蛋白cDNA的克隆根據(jù)Gubler和Hoffman的方法(Gene 25263-269，1983)進(jìn)行cDNA的合成，也就是說，利用寡聚dT12-18(Phar-macia產(chǎn)品)作為引物、5μg由病毒感染細(xì)胞提取的RNA作為模板以及逆轉(zhuǎn)錄酶(莫洛尼氏鼠白血病毒轉(zhuǎn)錄酶，BRL產(chǎn)品)合成單鏈的cDNA。然后，用大腸桿菌RNA酶H在與這樣合成的單鏈cDNA鏈雜交的RNA鏈中導(dǎo)入一個(gè)缺口以制備RNA鏈，然后用這樣制備的RNA作為引物使用大腸桿菌聚合酶I合成雙鏈cDNA。得到的雙鏈cDNA通過下述兩種方法克隆。
方法1利用Takara連接藥盒，并根據(jù)該藥盒所附的說明書，使兩端都加有pSalI人工接頭的雙鏈cDNA與克隆載體pUC19反應(yīng)(16℃30分鐘)，該載體已預(yù)先用限制酶SalI切斷，并去掉了其5′端的磷酸基團(tuán)。將得到的產(chǎn)物導(dǎo)入市售可得的DH5α感受態(tài)細(xì)胞中〔F-，end A1，hsdR17(rk-，mk+)，supE44，thi-1，λ-recA1，gyr96，rel A1，φ80dlacZ△M15〕。然后，大約3，000個(gè)這樣得到的克隆用狂犬病毒HEP-Flury株G-cDNA片段作為探針進(jìn)行集落雜交。結(jié)果有一個(gè)克隆顯色，將它定名為“pUC-RNSL”。用“G蛋白表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建”中所述相同的方法處理此cDNA，然后導(dǎo)入COS細(xì)胞和酵母表達(dá)系統(tǒng)中。
方法2根據(jù)Nagata等人，JikkenIgaku(ExperimentalMedicine4(8)87-92，1986)所述的方法，首先用EcoRI-甲基化酶處理雙鏈cDNA(0.5μg)，使EcoRI切割位點(diǎn)甲基化，然后在DNA的兩端加上pEcoRI人工接頭。為了克隆此DNA，根據(jù)說明書中給出的程序，使此DNA與用EcoRI切割的λgt10手臂(來自STRATAGENE)(GT10)進(jìn)行連接。然后，利用得自STRATAGENE的體外包裝提取物(商品名Gigapackpuls，STRATAGENE產(chǎn)品)和所附的VCS258宿主細(xì)胞或C600hfl，通過體外包裝法克隆G-cDNA?？偣驳玫酱蠹s350，000個(gè)克隆。在每個(gè)平皿上放置7，000個(gè)克隆，進(jìn)行空斑雜交后產(chǎn)生21個(gè)陽性克隆。
(3)pRNSL完整堿基順序的測定為了制備G-cDNA片段，將pRNSL(20μg)用限制性酶SalI(50單位)在所附的緩沖液中于37℃下消化4小時(shí)。通過1%的低膠凝瓊脂糖電泳將得到的DNA分成兩種片段，提取并回收相應(yīng)于2.1Kbp的G-cDNA片段。
(a)為了使此G-cDNA片段進(jìn)一步分離，G-cDNA片段(每種0.1μg)分別用識別四堿基的限制性酶HaeⅢ、RsaI、AluI、TagI或Sau3AI切割成6、5、6、9或7種片段。在這些G-cDNA片段中，用HaeⅢ、RsaI或AluI切割的片段與用SmaI切割的M13mp18連接，或與用SmaI和SalI二者切斷的M13mp19連接，TagI片段與用AccI切斷的M13mp18連接，Sau3AI片段與用BamHI或用BamHI和SalI二者切斷的M13mp19連接，這些連接都利用Takara連接藥盒進(jìn)行。
pUC-RNSL用限制性酶KpnI和BamHI切斷。利用Takara的千堿基缺失藥盒(目錄號6030)及所附的說明使切斷的pUC-RNSL從BamHI切割位點(diǎn)起發(fā)生缺失，以制備出具有不同缺失度G-cDNA，然后用SalI切割。利用Takara連接藥盒，使這樣得到的G-cDNA與用SmaI和SalI二者切斷的M13mp18連接。
根據(jù)《Toyobo說明手冊》的方法，用上述方法(a)和(b)中處理的DNA轉(zhuǎn)化JM101感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化過程和下述的提取純化單鏈DNA過程都根據(jù)ToyoboM13克隆藥盒(目錄號M13-001)和其中的“說明手冊”進(jìn)行。利用ToyoboM13測序藥盒(目錄號M13-003)和BRL電泳裝置(S2型，目錄號1105)及所附的說明書，根據(jù)BRL測序凝膠電泳系統(tǒng)測定這樣得到的單鏈DNA的順序。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，pRNSL含有2，123個(gè)堿基對(bp)，其中含有1，575bp的可譯框，它編碼包括524個(gè)氨基酸的狂犬病G蛋白(參見圖1)。
作為順序測定的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在5′端含有一串32個(gè)腺苷酸。如果將克隆的G-cDNA連接在SV40晚期區(qū)啟動(dòng)子或酵母酸性磷酯酶啟動(dòng)子的下游，則此腺苷酸串可能對其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生強(qiáng)烈抑制。因此，以下述方式去掉此腺苷酸串。首先，將pUC-RNSL(2μg)用限制性酶PstI于37℃切割2小時(shí)。得到的DNA通過Takara核酸酶Bal31-S(目錄號2510A)于30℃消化2分鐘，反應(yīng)在下述組合物中進(jìn)行DNA(用PstI切斷)23μl5×Bal31緩沖液(＊)6μlBal31S(2單位/ml)1μl(＊)5×Bal31緩沖液100mM Tris-HCl，3M NaCl，60mM CaCl2，60mM MgCl2，5mM EDTA然后，利用Takara連接藥盒，在上述核酸酶Bal31消化的DNA兩端加上pSalI人工接頭(ToyoboSAL-801，2μg)。將該DNA用限制性酶SalI進(jìn)行充分切割，然后進(jìn)行低膠凝瓊脂糖電泳。在大約2.1Kbp處切下一個(gè)DNA寬帶并收集DNA。利用連接藥盒通過使DNA與用限制酶SalI切斷的pUC19連接而克隆收集的DNA，然后用連接物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞(得自BRL，目錄號8263SA)。
根據(jù)ToyoboM13克隆藥盒(目錄號M13-001)和所附“說明手冊”，測定這樣得到的克隆的5′端堿基順序(參見圖2)。在它們之中，用N9-13作為G蛋白cDNA以下述方式導(dǎo)入COS細(xì)胞和酵母的表達(dá)系統(tǒng)中。含有此基因片段的質(zhì)粒已經(jīng)以摻入大腸桿菌中的狀態(tài)，以大腸桿菌DH5α/pUC-N913，根據(jù)布達(dá)佩斯條約以“FERMBP-1631”寄存于日本工業(yè)科技署的發(fā)酵研究所。
實(shí)例2糖蛋白在作為宿主的動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)(1)COS細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建為了分離插在pUC－N913中的G蛋白cDNA，用限制酶SalI切割pUC－N913使之分兩個(gè)片段。根據(jù)《分子克隆》的方法(T.Maniatis,p170,1982),通過低膠凝瓊脂糖凝膠電泳得到G－cDNA片段。
用市售可得的pSVL(pharmacia產(chǎn)品，目錄號27－4509－01)作為表達(dá)載體。為了將G－cDNA摻入表達(dá)載體啟動(dòng)子的下游，用限制酶XhoI切斷載體，并去掉其5′端的磷酸。然后用Takara連接藥盒使pSVL與N9－13G－cDNA連接，并用此連接物感染HB101感受態(tài)細(xì)胞。
利用上面“質(zhì)粒的提取和純化”及“集落雜交和空斑雜交”中所述的方法，選擇在SV40晚期區(qū)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄方向摻有N9－13G－cDNA的連接物，利用細(xì)胞轉(zhuǎn)染藥盒(Cell phect Transfec-tion Kit,得自pharmacla，目錄號17-0595-01),，用這種連接物之一pSVL-N913(圖3)感染COS細(xì)胞。
(2)cos細(xì)胞中G蛋白表達(dá)的證實(shí)使來自非洲青猴腎的SV40轉(zhuǎn)化細(xì)胞(cos-1，得自Dainippon Pharmaceutical Co,Ltd.,目錄號09－1650)在CO2保溫器中于37℃培養(yǎng)24小時(shí)，使含有10％小牛血清的MEM培養(yǎng)基中的細(xì)胞濃度達(dá)到105細(xì)胞／ml。培養(yǎng)24小時(shí)以后，去掉培養(yǎng)基，細(xì)胞用0.01MPBS洗滌一次。在細(xì)胞中滴加DEAE－葡聚糖溶液(50μg/ml，100μl)和G蛋白表達(dá)載體pSVL－N913(0.5μg)的混合物，使之在室溫下放置15分鐘以感染細(xì)胞。然后，細(xì)胞用不含血清的MEM培養(yǎng)基洗滌，并在常規(guī)條件下(37℃，5%CO2保溫器)培養(yǎng)48小時(shí)。
然后，為了證實(shí)這樣得到的細(xì)胞已經(jīng)表達(dá)了G蛋白，根據(jù)“UirusugakuJikkenho(病毒學(xué)實(shí)驗(yàn))”(NationalInstituteofHealth，alumniassociationed.，p297-329)中所述的間接熒光抗體技術(shù)觀察細(xì)胞。也就是說，在DNA感染48小時(shí)后，去掉培養(yǎng)上清液，通過滴加丙酮進(jìn)行預(yù)處理，以防止所需抗原的脫落或洗脫。將預(yù)處理過的細(xì)胞與作為初級抗體的單克隆抗體(具有中和活性)在室溫下反應(yīng)10分鐘。用0.01MPBS洗滌后，使細(xì)胞與用熒光色素FITC(熒光異硫氰酸酯)標(biāo)記的抗鼠IgG(FITC-RbxMouseIgG(H+2)，ZYMED產(chǎn)品，目錄號61-6511)反應(yīng)。反應(yīng)后的細(xì)胞用0.01MPBS洗滌，并在熒光顯微鏡下觀察。圖4顯示了這樣觀察到的COS細(xì)胞的熒光反應(yīng)。結(jié)果證實(shí)，COS細(xì)胞中表達(dá)的G蛋白是以顆粒形式在胞質(zhì)中表達(dá)的，而不是處于與細(xì)胞膜結(jié)合的狀態(tài)。
實(shí)例3糖蛋白在作為宿主的酵母細(xì)胞中表達(dá)(1)酵母表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建為了分離插在pUC-N913中的G蛋白cDNA，用限制酶SalI切割pUC-N913使之分成兩個(gè)片段。通過低膠凝瓊脂糖凝膠電泳得到一個(gè)G-cDNA片段。另一方面，用限制性酶XhoI切割酵母表達(dá)載體pAM82(參見美國專利4，778，761)。然后，根據(jù)《分子克隆》所述方法(T.Maniatis，p133-134)，用堿性磷酯酶(Boeringer產(chǎn)品，產(chǎn)品號703023)去掉5′端的磷酸。然后用Takara連接藥盒使此載體與N9-13連接，并用此連接物感染大腸桿菌HB101感受態(tài)細(xì)胞。用G-cDNA作為探針使感染的大腸桿菌進(jìn)行集落雜交，產(chǎn)生一個(gè)陽性克隆pAMN913(參見圖5)。
(2)糖蛋白在酵母細(xì)胞中的表達(dá)釀酒酵母(Saccharomyces Cerevisiae)AH22〔leu2his4 Canl(Cir+)〕(FERM BP-312)接種于YPE培養(yǎng)基上(2%蛋白胨，1%酵母膏，2%葡萄糖，100ml)于30℃培養(yǎng)過夜，然后離心收集細(xì)胞。收集到的細(xì)胞用無菌水洗滌(20ml)，懸浮于1.2M山梨醇和Zymolyase-60，000(日本Seikagaku Kogyo K.K.產(chǎn)品，100μg/ml)的溶液中(5ml)，懸浮液于30℃放置30分鐘以產(chǎn)生原生質(zhì)球。將這樣制備的原生質(zhì)球用1.2M山梨醇溶液洗滌三次，然后懸浮于2M山梨醇、10mM CaCl2和10mM Tris-HCl(pH7.5)的溶液(0.6ml)中。這樣制備的懸浮液以60μl的體積分裝于小試管中。在懸浮液中加入上述制備的重組質(zhì)粒pAMN913(10μg)的溶液。充分混合后，加入0.1M CaCl2(3μg)，使其最終濃度為10mM CaCl2，使混合物在室溫下放置5至10分鐘。向得到的混合物中加入1ml 20%聚乙二醇4000，10mM CaCl2和10mM Tris-HCl(pH7.5)的溶液，使混合物在室溫下放置20分鐘。將得到的混合物(每份0.2ml)加到下述組成的培養(yǎng)基中(10ml);22%山梨醇，2%葡萄糖，0.7%酵母氮基氨基酸，2%YPD，20μg/ml組氨酸和3%瓊脂，使之保持在45℃的恒溫下。輕輕混合后，將混合物以層狀加至含有1.2M山梨醇的基本培養(yǎng)基平皿上，該培養(yǎng)基是預(yù)先由下述成分制備的0.7%酵母氮基氨基酸，2%葡萄糖，20μg/ml組氨酸和2%瓊脂，并放置備用。平皿于30℃下培養(yǎng)后，產(chǎn)生一個(gè)不需亮氨酸的酵母集落。該集落在補(bǔ)充有組氨酸(20μg/ml)的BurkHolde基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)(參見Tohe，A.等人，J.Bacteriol，113117-738，1973)，則產(chǎn)生所需的轉(zhuǎn)化釀酒酵母。
使這樣得到的轉(zhuǎn)化酵母的集落置于補(bǔ)充有組氨酸(20μg/ml)的Burk Holder基本培養(yǎng)基瓊脂平皿上，于30℃下培養(yǎng)以形成集落(以證實(shí)轉(zhuǎn)化體不需要亮氨酸)。將從集落中分離產(chǎn)生的細(xì)胞，接種在補(bǔ)充有組氨酸(20μg/ml)的Burk Holder基本培養(yǎng)基(10ml)中，并于30℃培養(yǎng)。在大約24小時(shí)后，離心收集對數(shù)生長期的細(xì)胞，并以大約4×106細(xì)胞/ml的細(xì)胞濃度懸浮于不含磷酸的基本培養(yǎng)基中(10ml)(通過用KCl代替Burk Holder基本培養(yǎng)基中的KH2PO4，并隨后補(bǔ)加20μg/ml組氨酸而制備)。在30℃下培養(yǎng)24小時(shí)后，將培養(yǎng)基以4，000rpm離心10分鐘而收集細(xì)胞。
將這樣分離的細(xì)胞懸浮于3ml1.2M山梨醇、50mM磷酸緩沖液(pH7.2)，14mM2-巰基乙醇和100μg/mlZymolyase-60，000(日本SeikagakuKogyoK.K.生產(chǎn))的溶液中，混合物于30℃輕輕搖動(dòng)30分鐘以產(chǎn)生原生質(zhì)球。離心收集原生質(zhì)球，然后充分懸浮于含有1%TritonX-100的50mM磷酸緩沖液(pH7.2，1ml)中，使混合液與玻璃珠強(qiáng)烈攪動(dòng)以破碎細(xì)胞。
破碎后的混合液以5，000rpm離心10分鐘，取出上清作為酵母溶解液。對于上清，通過下述方法測量G蛋白抗原活性，即用50mM碳酸鹽緩沖液(pH9.5)稀釋作為第一抗體的抗G蛋白單克隆抗體，然后加到96孔ELISA平板上，于37℃保溫2小時(shí)或于室溫下保溫4小時(shí)，使單克隆抗體復(fù)蓋在平板上。復(fù)蓋后的平板用PBS(磷酸緩沖鹽水)/0.05%Tween20溶液(PBS-Tween)洗滌三次，并用含有1%BSA的PBS-Tween(BSA-PBS-Tween)于4℃下掩蔽過夜。然后，每個(gè)樣品用PBS-Tween適當(dāng)稀釋，加入每個(gè)孔中并于37℃保溫1小時(shí)。平板然后用PBS-Tween洗滌五次，并向其加入含有過氧化物酶標(biāo)記的抗G蛋白單克隆抗體的BSA-PBS-Tween溶液，于37℃保持一小時(shí)。平板再次用PBS-Tween洗滌五次，向平板中加入作為底物的TMBZ(N，N′-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸)的EDTA溶液(0.006%過氧化氫)進(jìn)行顯色。用自動(dòng)測定儀(OD450nm)測定顯色強(qiáng)度，結(jié)果示于表2中。作為陰性對照，對于用未摻入G-cDNA的質(zhì)粒pAM82轉(zhuǎn)化并如上述同樣處理的酵母，也作了G蛋白抗原活性的測定。
表2pAMN913pAM82OD4501.70.1從表2所示結(jié)果清楚可見，只在一種酵母中檢測到了很高的G蛋白抗原活性，該酶母中摻入了插有本發(fā)明G-cDNA的穿梭載體。
實(shí)例4豚鼠的免疫原性試驗(yàn)(1)免疫抗原的制備和免疫作用通過用具有病毒中和活性的單克隆抗體作為配體的親和層析，從用pAMN913轉(zhuǎn)化的酵母溶解液中純化用于免疫試驗(yàn)的G蛋白。在純化的G蛋白中加入氫氧化鋁凝膠，制備成每份劑量含有1μgG蛋白的免疫用抗原。使用20只重450至650克的Hartley豚鼠(雌性)。對10只豚鼠腹腔注射如上制備的免疫抗原，一星期后進(jìn)行加強(qiáng)注射。另10只豚鼠作為非免疫對照組，以同樣方式注射生理鹽水。
(2)中和試驗(yàn)
用生存于HmLu-1細(xì)胞中的狂犬病毒N·HL株作為中和病毒，如果將它注射于腦中，它具有能夠使成年小鼠致死的毒性。在第一次注射前和加強(qiáng)注射之后，從免疫組的所有動(dòng)物取血樣。以同樣方式從非免疫組動(dòng)物取血樣。然后使這些血清加熱至56℃30分鐘使之失活。將失活血清稀釋兩倍，取50μl與病毒溶液(50μl)在37℃下反應(yīng)90分鐘，病毒液中含有數(shù)量為200TCID50(50%組織培養(yǎng)感染劑量)的病毒。然后，每50μl反應(yīng)混合液在96孔微量滴定板中保溫。保溫后的反應(yīng)混合液接種于HmLu-1細(xì)胞中，于37℃下吸收1.0小時(shí)，然后加入150μl細(xì)胞維持培養(yǎng)基(Eagle MEM培養(yǎng)基)，于37℃下培養(yǎng)4天。培養(yǎng)以后，使平板與標(biāo)記有辣根過氧化物酶的抗狂犬病毒糖蛋白單克隆抗體(標(biāo)記抗體)反應(yīng)。如果血清不與標(biāo)記抗體反應(yīng)，則意味著血清未受到病毒感染，并屬于中和性抗體陽性。中和抗體的效價(jià)表示為完全抑制病毒感染的血清最大稀釋度的倒數(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，由本發(fā)明的G蛋白免疫而得到的血清具有中和性抗體。所得結(jié)果示于表3。
表3免疫組非免疫組豚鼠號中和抗體效價(jià)豚鼠號中和抗體效價(jià)注射前(0周)注射后(3周)注射前(0周)注射后(3周)1＜23211＜2＜22＜2812＜2＜23＜21613＜2＜24＜26414＜2＜25＜23215＜2＜26＜2416＜2＜27＜23217＜2＜28＜26418＜2＜29＜21619＜2＜210＜212820＜2＜2(4)病毒攻擊試驗(yàn)根據(jù)上面(2)中所述方法對豚鼠進(jìn)行加強(qiáng)注射，在加強(qiáng)注射兩周后(也即第一次注射后三周時(shí))，在咀嚼肌中接種狂犬病毒CVS株(大約10LD50/0.2ml)(即進(jìn)行攻擊)。對照組也進(jìn)行同樣的攻擊。攻擊后兩周內(nèi)觀察癥狀的出現(xiàn)。兩周內(nèi)沒有癥狀的豚鼠被稱為預(yù)防作用陽性。結(jié)果示于表4中。
表4測試組死亡數(shù)無癥狀數(shù)預(yù)防率(%)免疫組1990對照組1000由上面表4清楚可見，除了一只豚鼠外(表3中的6號)，所有用本發(fā)明的G蛋白免疫的動(dòng)物組中的豚鼠都無癥狀出現(xiàn)，而在非免疫的對照組中，所有豚鼠都死于典型的狂犬病癥狀。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，本發(fā)明的G蛋白作為狂犬病疫苗使用是極為可行的。
權(quán)利要求
1.一種含有全部或部分下述編碼狂犬病毒糖蛋白的堿基順序或與其等同的堿基順序的基因片段10 20 30 40 50ATGGTTCCGC AAGCTCTTCT GCTTGTACCC ATTCTGGGTT TTTCCTCGTG60 70 80 90100TTTCGGGAAA TTCCCTATTT ACACGATACC AGACACACTT GGTCCCTGGA110120130140150GCCCGATCGA TATACATCAT CTCAGTTGCC CAAACAATTT GGTTGTAGAG160170180190200GACGAAGGAT GCACCAACCT GTCAGGGTTC TCCTACATGG AACTTAAAGT210220230240250TGGACACATC TCAGCCATAA AGGTGAACGG GTTCACTTGC ACAGGCGTTG260270280290300TAACAGAGGC AGAAACCTAC ACTAACTTTG TTGGTTATGT CACCACCACT310320330340350TTCAAAAGAA AGCATTTCCG CCCAACACCA GATGCTTGTA GAGCTGCGTA360370380390400CAACTGGAAG ATGGCCGGTG ACCCCAGATA TGAAGAGTCT CTACACAGTC410420430440450CGTACCCTGA CTACCATTGG CTTCGAACTG TAAAAACCAC AAAGGAGTCC460470480490500CTCGTTATCA TATCTCCAAG TGTGGCAGAT TTGGACCCAT ATGACAACTC510520530540550CCTTCACTCG AGGGTCTTCC CTAGCGGAAA GTGCTCAGGA ATAACAGTAT560570580590600CTTCTGTCTA CTGCTCAACT AACCACGATT ACACCGTTTG GATGCCTGAA610620630640650AGTCTGAGAC TAGGGACATC TTGTGACATT TTTACCAATA GTAGAGGGAA660670680690700GAGAGTATCC AAGGGGAGCA AGACCTGTGG CTTTGTAGAT GAAAGAGGCC710720730740750TATATAAGTC TCTAAAAGGC GCATGCAAAC TCAAGTTGTG TGGAGTTCGT760770780790800GGACTTAGAC TTATGGACGG AACATGGGTC GCGATGCAGA CATCAAAATGA810820830840850GACCAAATGG TGTCCTCCCG ATCAGTTGGT TAATCTGCAC GACCTTCGCT860870880890900CAGATGAAAT CGAGCATCTT GTTATAGAGG AGTTGGTCAA GAAAAGAGAG910920930940950GAGTGTCTGG ATGCATTAGA GTCCATCATA ACCACCAAGT CAGTGAGTTT960970980990 1000CAGACGTCTC AGTTATTTAA GAAAACTTGT CCCCGGGTTC GGAAAAGCAT1010 1020 1030 1040 1050ATACCATATT CAACAAGACC TTGATGGAGG CTGAAGCTCA CTACAAGTCA1060 1070 1080 1090 1100GTCAGGACTT GGAATGAGAT CATCCCCTCA AAAGGATGTT TGAGAGTTGG1110 1120 1130 1140 1150AGGGAGGTGT CATCCTCATG TAAACGGGGT GTTTTTCAAT GGTATAATAT1160 1170 1180 1190 1200TAGGGCCTGA CGGTCATGTT TTAATCCCAG AGATGCAATC ATCCCTCCTC1210 1220 1230 1240 1250CAGCAACATA TAGAGTTATT GGAATCCTCA GTTATTCCCC TGATGCACCC1260 1270 1280 1290 1300CCTTGCAGAC CCGTTCACAG TTTTCAAGGA CGGCGATGAG ACTGAGGATT1310 1320 1330 1340 1350TTATAGAAGT TCACCTTCCC GATGTGCACG AACAAGTCTC AGGGGTTGAC1360 1370 1380 1390 1400CTGGGTCTCC CGAACTGGGG GGAGTATGTA TTACTAAGTG CAGGGACCTT1410 1420 1430 1440 1450GATTGCCTTG ATGTTGATAA TTTTCCTAAT GACATGTTGT AGAAAAGTCG1460 1470 1480 1490 1500ATCGGCCAGA ATCTACACAA CGCAGTCTCA GAGGGACAGG AAGGAATGTG1510 1520 1530 1540 1550TCAGTCACCT CCCAAAGCGG GAAATTCATA CCTTCATGGG AGTCGTATAA1560 1570AAGTGGGGGT GAGACTGGAC TGTGA
2.根據(jù)權(quán)利要求1的基因片段，其特征在于，基因片段含有權(quán)利要求1編碼狂犬病毒糖蛋白的堿基順序中的腺苷酸58至腺苷酸1575的堿基順序。
3.一種重組的狂犬病毒糖蛋白，它是通過在真核細(xì)胞中表達(dá)權(quán)利要求1的基因片段而制備的。
4.一種制備狂犬病毒糖蛋白的方法，其特征在于，該方法包括將插有權(quán)利要求1的基因片段的表達(dá)載體導(dǎo)入真核細(xì)胞中，所述片段插在能在真核細(xì)胞中作用的啟動(dòng)子的下游，并培養(yǎng)所述的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，以在所述細(xì)胞的胞質(zhì)中產(chǎn)生狂犬病毒糖蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其特征在于真核細(xì)胞是酵母細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其特征在于穿梭載體是含有酵母復(fù)制原點(diǎn)、酵母中的選擇性標(biāo)記基因、來自酵母的啟動(dòng)子區(qū)、大腸桿菌的復(fù)制原點(diǎn)和大腸桿菌中的選擇性標(biāo)記基因的質(zhì)粒。
7.一種制備狂犬病毒糖蛋白的方法，其特征在于，該方法包括將插有編碼狂犬病毒G蛋白的基因片段的重組病毒導(dǎo)入培養(yǎng)細(xì)胞中，并培養(yǎng)所述的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，以在所述細(xì)胞的胞質(zhì)中產(chǎn)生狂犬病毒糖蛋白。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其特征在于重組質(zhì)粒是通過用編碼狂犬病毒G蛋白的基因片段取代SV40病毒的部分基因而制備的，并用該重組質(zhì)粒感染培養(yǎng)細(xì)胞。
9.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其特征在于重組病毒是通過將能在培養(yǎng)細(xì)胞中以質(zhì)粒狀態(tài)生長的部分病毒與編碼狂犬病毒G蛋白的基因片段相連接而制備的。
全文摘要
編碼狂犬病毒糖蛋白的基因片段，利用所述基因片段表達(dá)的重組的狂犬病毒糖蛋白，該蛋白非常適用于制備狂犬病疫苗和診斷試劑，以及一種制備狂犬病毒糖蛋白的方法，該方法包括將插有編碼狂犬病毒糖蛋白的基因片段的穿梭載體導(dǎo)入真核細(xì)胞中，所述基因片段插在能在真核細(xì)胞中作用的啟動(dòng)子的下游，以及培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化細(xì)胞，以在所述細(xì)胞的胞質(zhì)中產(chǎn)生狂犬病毒糖蛋白。由于G蛋白能在胞質(zhì)中以顆粒形式表達(dá)，而不與細(xì)胞膜結(jié)合，因此本發(fā)明的方法能以高產(chǎn)率和高純度產(chǎn)生所需的G蛋白。
文檔編號A61K39/00GK1035126SQ88105198
公開日1989年8月30日 申請日期1988年12月24日 優(yōu)先權(quán)日1987年12月26日
發(fā)明者坂本信一, 井手敏雄, 時(shí)吉幸男, 山元通孝 申請人:財(cái)團(tuán)法人化學(xué)及血清療法研究所