專利名稱：β－環(huán)糊精蚓纖溶酶修飾酶的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及到修飾酶的制備，尤其是β-環(huán)糊精(β-CD)修飾蚯蚓血纖蛋白溶酶(EFE)后形成的β-環(huán)糊精蚯蚓血纖蛋白溶酶修飾酶(β-CDEFE)。
血栓病、心血管疾病是一類嚴重危害人類健康的多發(fā)性常見疾病。目前市售的降纖酶、蝮蛇抗栓酶、尿激酶等藥物雖已用于臨床，但穩(wěn)定性差、易失活，體內停留時間短、不易進入病灶細胞(組織)、價格昂貴，易導致出血等臨床缺限，未及普遍推廣應用。尋找有效的治療藥物是國內外醫(yī)學界關注的熱點。蚯蚓俗稱地龍入藥在國內已有1200余年歷史，并沿用至今。蚓體內，治療上述疾病的主要有效成分是蚓纖溶酶(EFE)。目前市售的“9·12”膠囊、地龍膠囊、溶栓膠囊等在臨床同樣存在上述弊病，基于口服，療效更低。一般酶制劑用于臨床必須是(1)在體內的半衰期長；(2)無免疫原性；(3)易進入細胞和組織。為此，尋找新的溶栓藥源及其新劑型是當前國內外研究的熱點。
本發(fā)明的目的在于尋找一種來源廣泛、制備簡便、穩(wěn)定性好、應用范圍廣的溶解血纖蛋白的新藥源，以適應經濟發(fā)展的需要。
蚯蚓是世界環(huán)保動物，不僅是珍貴的藥材、優(yōu)良的新蛋白食品和飼料，而且在土壤改良、消除公害、保護生態(tài)環(huán)境上，在物質循環(huán)、生物多樣性等方面發(fā)揮特殊作用。本項發(fā)現，不僅增加了藥物新資源、新品種，而且對帶動蚯蚓養(yǎng)殖業(yè)、加工業(yè)及其研究的深入發(fā)展具有顯著的經濟和社會效益，同時對脫貧致富、培育三高農業(yè)、改良生態(tài)環(huán)境等方面也有十分重要的意義。
我們于上世紀九十年開始對蚯蚓溶纖酶進行研究。近幾年來，用β-環(huán)糊精對蚯蚓溶纖酶進行化學修飾，制備出高活力的β-環(huán)糊精蚓溶纖酶修飾酶(β-Huan hu jing xiu shi Qiu yin Xue xian dan bai rong mei)，英文名縮寫為β-CDEFE)。
本發(fā)明是這樣實現的β-環(huán)糊精蚓溶纖酶修飾酶(β-CDEFE)的制備將蚯蚓血纖蛋白溶酶加入β-環(huán)糊精溶液中，均勻后，在30～50℃恒溫水浴中，間歇攪拌40-70分鐘，再在32℃以下攪拌8-14小時，反應后的溶液即為β-環(huán)糊精蚯蚓血纖蛋白溶酶修飾酶。
反應中β-環(huán)糊精與蚯蚓血纖蛋白溶酶的比例為1∶4(體積比)。
β-環(huán)糊精濃度對修飾效果的影響將β-環(huán)糊精按濃度梯度加入到4ml一定酶濃度(如600U/ml)的蚯蚓血纖蛋白溶酶溶液中，45℃恒溫水浴1h，間歇攪拌，然后冷卻至室溫。超聲波處理10min，室溫下磁力攪拌器攪拌10s，重復此過程2-3次，再在室溫攪拌過夜，得到β-環(huán)糊精蚯蚓血纖蛋白溶酶溶液。測其相應活性變化，酶蛋白濃度為1.5mg/ml，以不加β-環(huán)糊精酶液的活力為100％。結果如下表1β-環(huán)糊精(mg/ml) 0.51 3 5 7 9修飾酶相對活力(％)86.36 86.50 85.90 86.75 86.10 85.80表1由表1可見，不同β-環(huán)糊精濃度對蚯蚓血纖蛋白溶酶的活性影響不大，以5mg/ml為最佳。
溶液酶濃度對修飾效果的影響將β-環(huán)糊精濃度為5mg/ml加入到酶濃度梯度從300-600U/ml的4ml酶液中，45℃恒溫水浴1h，間歇攪拌，然后冷卻至室溫。超聲波處理10min，室溫下磁力攪拌器攪拌10s，重復此過程2-3次，再在室溫攪拌過夜，得到β-環(huán)糊精蚯蚓血纖蛋白溶酶溶液。測其相應活性變化，以不加修飾劑的蚯蚓血纖蛋白溶酶相應濃度的酶液為100％，β-環(huán)糊精濃度為5mg/ml。結果如表2溶液酶濃度(U/ml) 300 400500600修飾酶相對活力(％) 86015 85.10 86.25 88.00表2由表2可見，溶液酶濃度對修飾效果影響不大，濃度較高，其效果較好。以下實驗的酶濃度為500U/ml。
本方法的回收率達85％。產物為液體酶制劑。凍干后，成粉末，為固體酶制劑，此制品易溶于水，水溶液為無色、透明，具有蛋白質性質。
β-環(huán)糊精蚯蚓血纖蛋白溶酶修飾酶的特性特征1.物理特性正品為無色、無味、無毒、透明水溶液，具有蛋白質性質。凍干后的固體酶制劑為白色粉末，水份和灰份(常規(guī)法)分別小于7％和5％。2.酶性質該酶穩(wěn)定性好，在室溫下活力穩(wěn)定，可在室溫下操作。
β-環(huán)糊精蚯蚓血纖蛋白溶酶修飾酶的Km(米氏常數，底物為酪蛋白)為0.028％(質量百分數)；是蚯蚓血纖蛋白溶酶的0.098％的1/3.5。即β-環(huán)糊精蚯蚓血纖蛋白溶酶修飾酶對底物的親和力比原蚯蚓血纖蛋白溶酶提高了3.5倍。
β-環(huán)糊精蚯蚓血纖蛋白溶酶修飾酶對pH的穩(wěn)定性和反應最適pH分別為pH5.8～10.6和pH10.0；分別較原蚯蚓血纖蛋白溶酶的pH5.8～10.6、pH7.8有所提高。
β-環(huán)糊精蚯蚓血纖蛋白溶酶修飾酶的熱穩(wěn)定性和作用最適溫度，酶活力在30～60℃范圍內活力穩(wěn)定，較原蚯蚓血纖蛋白溶酶的30-55℃有所提高；其最適溫度為60℃，也較原蚯蚓血纖蛋白溶酶的55℃有所提高。
β-環(huán)糊精蚯蚓血纖蛋白溶酶修飾酶經藥代動力學研究證明，在體內的分布相半衰期為1h，是原蚯蚓血纖蛋白溶酶的1.52倍。
β-環(huán)糊精蚯蚓血纖蛋白溶酶修飾酶活力為818U/ml，比活力為1788.8U/mg蛋白質。
β-環(huán)糊精蚯蚓血纖蛋白溶酶修飾酶和蚯蚓血纖蛋白溶酶活力測定1.以酪蛋白為底物稱取1g酪蛋白，加入約80ml 0.02mol/L pH7.8磷酸緩沖液，在60℃水浴中溶解后，用同一種緩沖液定容至100ml。吸取0.5ml酶液于37℃保溫10min，然后加入同樣保溫的酪蛋白溶液2ml，搖勻，37℃水浴準確保溫15min后，立即加2ml 10％三氯乙酸水溶液終止反應。室溫下靜置30min，過濾，濾液于280nm波長下測定吸光值。以上述條件下，吸光值(A280nm)改變0.001個單位的酶量為1個酶活力單位(U)。2.以苯甲酰-L-精氨酸己酯(BAEE)為底物稱取27.4mgBAEE溶于PBS(濃度為0.4×10-3mol/L)，取2ml BAEE于比色皿中，加待測酶液30～50μl，立即混勻，于253nm波長下測定光密度(A253nm)增加值。以在上述條件下，每min增加0.001個光密度單位的酶量為1個BAEE酶活力單位(U)。
蛋白質含量測定按Bradford法，以牛血清白蛋白為標準蛋白質。配制蛋白質從0～900μg/ml的標準水溶液，將上述所配的各濃度標準蛋白質溶液分別吸取0.1ml于試管，各加入5ml考馬斯亮藍G-250溶液，搖勻后，在595nm波長下，以蛋白質濃度為零，即以0.1ml蒸餾水代替蛋白質溶液，作空白管調零。測定各管A595nm，以蛋白質濃度為橫坐標，A595nm為縱坐標作標準曲線。以同樣方法測定樣品的A595nm，從標準曲線上查得樣品溶液的蛋白質濃度。
本發(fā)明的優(yōu)點(1)本發(fā)明的最基礎原料為蚯蚓，原料來源容易，廉價，并且會帶動蚯蚓的綜合利用；(2)工藝生產設備投資少；(3)修飾酶熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性均強于原酶；(4)修飾過程較為簡單；(5)修飾酶活力高，達1788.8U/mg蛋白質。
實例吸取1ml濃度為5mg/ml的β-環(huán)糊精溶液，加入到4ml濃度為500U/ml的蚯蚓血纖蛋白溶酶中，混勻。45℃恒溫水浴1h，間歇攪拌。然后冷卻后攪拌12h，得到β-環(huán)糊精蚯蚓血纖蛋白溶酶修飾酶液體酶制劑，活力回收86％。凍干后，成粉末，可溶于水，水溶液為無色、透明，具有蛋白質的特征。
權利要求
1.β-環(huán)糊精蚯蚓血纖蛋白溶酶修飾酶(β-CDEFE)的制備方法，其特征在于將蚯蚓血纖蛋白溶酶加入β-環(huán)糊精溶液中，均勻后，在30～50℃恒溫水浴中，間歇攪拌40-70分鐘，再在32℃下攪拌8-14小時，反應后的溶液即為β-環(huán)糊精蚯蚓血纖蛋白溶酶修飾酶。反應中β-環(huán)糊精與蚯蚓血纖蛋白溶酶的比例為1∶4(體積比)。β-環(huán)糊精的反應濃度為0.5-9mg/ml。蚯蚓血纖蛋白溶酶的反應濃度為300-600U/ml。
全文摘要
本發(fā)明以蚯蚓血纖蛋白溶酶為原材料，用β－環(huán)糊精進行化學修飾。修飾酶(β－CDEFE)的穩(wěn)定性得到提高。經藥代動力學實驗證明，β－CDEFE在體內的分布相半衰期為1h，是EFE的1.52倍。β－CDEFE對底物(酪蛋白)的親和力為EFE的3.5倍。
文檔編號A61K38/49GK1414096SQ0112775
公開日2003年4月30日 申請日期2001年8月20日 優(yōu)先權日2001年8月20日
發(fā)明者高向陽, 徐鳳彩, 詹福建, 伍曉斌, 謝曉生 申請人:華南農業(yè)大學