專利名稱：人纖溶酶原Kringle5多克隆抗體及其制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗體，尤其是涉及一種人纖溶酶原Kringle5多克隆抗體及其制備方法及 應(yīng)用。
背景技術(shù)：
新生血管異常增生所引起的全身組織及器官的損害是目前最為棘手的醫(yī)學(xué)難題之一，是 全身許多重大疾病的病因和/或重要病理特征。人纖溶酶原Kringle5 (Human Plasminogen Kringle 5， K5)是引人注目的抑制血管生成蛋白之一，是目前發(fā)現(xiàn)抑制新生血管活性最強(qiáng)的 纖溶酶原片段，具有生物活性強(qiáng)、細(xì)胞特異性高、分子量小、副作用小、性質(zhì)比較穩(wěn)定等諸 多顯著優(yōu)點(diǎn)(1、 Cao. Y， Chen. A. An, S.S. Ji， R.W, Davidson. D and Uinas. M. Kringle 5 of plasminogen is a novel inhibitor of endothelial cell growth. J Biol Chem，272(36):22924-22928, 1997; 2、 W.R.Ji， L.G. Barrientos, M丄liMs, H.Gray， X.Villarreal, M.E. DeFord， F丄Castellino, R.A. Kramer and P.A. Trail. Selective inhibition by kringle 5 of human plasminogen on endothelial cell migration, an important process in angiogenesis. Biochem Biophys Res C.omm叫247(2):414隱419, 1998; 3、 Soff, G.A. Angiostatin and angiostatin-related proteins. Cancer Metastasis Rev, 19(1-2): 97-107, 2000)。已證實(shí)了 K5在新生血管性疾病如實(shí)體瘤(4、 Davidson DJ, Haskell C, Majest S, et al. Kringle 5 of human plasminogen induces apoptosis of endothelial and tumor cells through surface-expressed glucose-regulated protein 78. Cancer Res,65: 4663~4672 ，2005; 5、 Perri SR， Nalbantoglu J， Annabi B， et al. Plasminogen kringle 5-engineered glioma cells block migration of tumor-associated macrophages and suppress tumor vascularization and progression. Cancer Res,65:8359-8365,2005)、糖尿病性視網(wǎng)膜增生(Zhihong Zhang, Jian-xing Ma， Guoquan Gao， Chaoyang Li, Lihui Luo，Mei Zhang，Wenzhao Yang, Aihua Jiang, Wenhui Kuang, Liying Xu，Jiaqi Chen， and Zuguo Liu. Plasminogen Kringle 5 Inhibits Alkali-Burn-Induced Corneal Neovascularization. Invest Ophthalmol Vis Sci.46:4062^4071，2005)等疾病治療中具有潛在的應(yīng) 用前景。但目前尚缺乏有效、特異的人源性K5檢測抗體，嚴(yán)重制約著K5作用機(jī)制的進(jìn)一步 深入探討及其應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
4本發(fā)明的目的在于提供一種人纖溶酶原Kringle5多克隆抗體及其制備方法及應(yīng)用。 本發(fā)明所述人纖溶酶原Kringle5多克隆抗體為兔的血清免疫球蛋白Ig G，由重鏈55kDa 和輕鏈30kDa兩條鏈組成。它可以特異性識別并結(jié)合K5蛋白，可以有效應(yīng)用于檢測K5蛋白 的多種方法，如酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)、蛋白免疫印跡(WestemBlot)、免疫組織化學(xué)、免 疫熒光等檢測。
本發(fā)明所述人纖溶酶原Kringle5多克隆抗體的制備方法包括以下步驟
1) 表達(dá)和純化K5多肽
2) 制備人纖溶酶原Kringle5蛋白的多克隆抗體。
所述表達(dá)和純化K5多肽可采用以下方法將含有K5部分序列的cDNA的質(zhì)粒 pPIC9K-K5，經(jīng)測序鑒定正確后，利用限制性內(nèi)切酶S"/7線性化，通過電轉(zhuǎn)化至畢赤酵母 GS115中，通過PCR方法鑒定陽性重組子，挑取的陽性重組子經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達(dá)挑選高拷貝陽 性菌，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，收集部分酵母上清，經(jīng)三氯乙酸沉淀法濃縮蛋白后，Tricine SDS-PAGE 電泳檢測，用硫酸銨鹽沉淀法純化濃縮蛋白、透析后，陰離子交換層析過柱，用洗脫液上柱， 流出液即為純化的K5蛋白。
所述畢赤酵母GS115可購買于Invitrogen公司。進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)，為保證表達(dá)蛋白的活 性，培養(yǎng)條件最好為28 3(TC, 250rpm， 48h，按體積百分比，每24h最好補(bǔ)加甲醇至1%。 收集部分酵母上清，經(jīng)三氯乙酸沉淀法濃縮蛋白后，Tricine SDS-PAGE電泳檢測，15.0kDa 處有預(yù)期的條帶。所述用硫酸銨鹽沉淀法純化濃縮蛋白的硫酸銨鹽的濃度按質(zhì)量百分比最好 為65%。所述陰離子交換層析最好采用Bio-Rad公司出品的UNOsphere Q cartridge陰離子交 換層析。所述洗脫液最好用含0.2mol/LNaCl的洗脫液。
所述制備人纖溶酶原Kringle5蛋白的多克隆抗體可采用以下方法用純化的15 kDa的 K5蛋白與弗氏佐劑混合，免疫動(dòng)物，經(jīng)純化獲得人纖溶酶原Kringle5蛋白的多克隆抗體。
所述免疫動(dòng)物可選用家兔，小鼠或大鼠等。用純化的15kDa的K5蛋白與弗氏佐劑混合， 免疫動(dòng)物，經(jīng)純化可采用以下方法第一次用純化的K5蛋白lmg加弗氏完全佐劑，劇烈震 蕩，充分乳化后免疫新西蘭兔，每隔14天用純化的K5蛋白0.5mg加不完全弗氏佐劑，與生 理鹽水乳化，加強(qiáng)免疫兩次，用頸動(dòng)脈取血法接取兔血清，用ELISA法檢測多克隆抗體的效 價(jià)，抗體效價(jià)分析表明抗體效價(jià)達(dá)到1 : 1000。將血清總蛋白經(jīng)過50%硫酸胺沉淀后，結(jié)合 于proteinA柱上，用親和層析法分離出多克隆抗體。
本發(fā)明以畢赤酵母系統(tǒng)表達(dá)了K5蛋白的部分多肽，以純化的K5多肽為抗原，制備了抗 K5蛋白的多克隆抗體。本發(fā)明所述人纖溶酶原Kringle5蛋白的多克隆抗體有如下的應(yīng)用
51) 蛋白免疫印記實(shí)驗(yàn)證明人纖溶酶原Kringle5蛋白的多克隆抗體可以特異性與K5蛋白
妙A(yù)5口 1=1 o
2) 應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)，人纖溶酶原Kringle5蛋白的多克隆抗體可以檢測標(biāo)本中轉(zhuǎn)染表達(dá)K5蛋白質(zhì)粒的人肺腺癌細(xì)胞(A549)的K5表達(dá)分布。
3) 應(yīng)用免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)，人纖溶酶原Kringle5蛋白的多克隆抗體可以檢測標(biāo)本中轉(zhuǎn)染表達(dá)K5蛋白質(zhì)粒的人肺腺癌細(xì)胞的K5表達(dá)分布。


圖1為K5蛋白的表達(dá)(Tricine SDS-PAGE檢測，考馬斯亮藍(lán)染色)。在圖1中，條帶l.pPIC9K- K5菌株；條帶2.陰性對照pPIC9K菌株；條帶3.蛋白分子量Marker。
圖2為K5蛋白的純化(Tricine SDS-PAGE檢測，考馬斯亮藍(lán)染色)。在圖2中，1.蛋白分子量Marker; 2. K5 Q Sepharose離子交換介質(zhì)穿過液；3.同2; 4. O.lMNaCl洗脫；5.0.2 MNaCl洗脫；6.0.3 MNaCl洗脫；7.0.4 MNaCl洗脫；8.0.5 M NaCl洗脫。
圖3為K5的多克隆抗體效價(jià)的ELISA測定。在圖3中，K5兔多克隆抗體效價(jià)為1 : 1000。橫坐標(biāo)為稀釋倍數(shù)，縱坐標(biāo)OD450;令為NC，國為樣品。
圖4為K5多克隆抗體的純化(Tricine SDS-PAGE檢測，考馬斯亮藍(lán)染色)。在圖4中，條帶l.蛋白分子量Marker;條帶2.兔血清總蛋白；條帶3.硫酸銨沉淀后上清；條帶4.硫酸銨沉淀；條帶5.穿過液；條帶6.洗脫目的帶，主要為兔IgG的重鏈和輕鏈。
圖5為Western blot檢測酵母細(xì)胞表達(dá)的K5蛋白。
圖6為多克隆抗體用于免疫組化檢測K5的分布。圖6A為轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)質(zhì)粒的A549細(xì)胞，圖6B為轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-K5質(zhì)粒的A549細(xì)胞。
圖7為多克隆抗體用于免疫熒光檢測K5的分布。圖7A為轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)質(zhì)粒的A549細(xì)胞，圖7B為轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-K5質(zhì)粒的A549細(xì)胞；標(biāo)尺為20pm。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。
1. K5蛋白的構(gòu)建，表達(dá)，純化
(1) K5質(zhì)粒的構(gòu)建將含有K5的cDNA (Genbank)的質(zhì)粒pPIC9K (朱明等構(gòu)建)轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10中，在含氨芐青霉素(終濃度100ug/ml)的LB平板培養(yǎng)過夜后，用菌落PCR方法篩選陽性克隆，并進(jìn)行測序。DNA序列分析結(jié)果表明DNA序列與人纖溶酶原Kringle5的cDNA (Genebank)序列完全相同。K5的表達(dá)純化將經(jīng)限制性內(nèi)切酶Sa/ /線性化CIAP去磷酸化處理的pPIC9K-K5質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化到畢赤酵母GS115中，電轉(zhuǎn)參數(shù)電壓1.5kV;電容25^lF;電阻200Q。經(jīng)過高濃度G418抗生素(濃度3mg/ml)篩選的陽性酵母菌在28 30°C ， 250rpm，培養(yǎng)48h后離心收集菌體，換用含P/。(v/v)甲醇的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)誘導(dǎo)48h，并且每24h補(bǔ)加甲醇至1% (v/v)。離心收集酵母上清，用65%硫酸銨鹽沉淀法純化濃縮蛋白、透析后，將樣品加入U(xiǎn)NOsphere Qcartridge陰離子交換層析過柱，通過含0.2mol/LNaCl的洗脫液將K5洗脫。流出液經(jīng)TricineSDS-PAGE電泳檢測，K5的純度在98%以上。
圖1給出K5蛋白的表達(dá)(TricineSDS-PAGE檢測，考馬斯亮藍(lán)染色)。在圖1中，條帶1.pPIC9K-K5菌株；條帶2.陰性對照pPIC9K菌株；條帶3.蛋白分子量Marker。
圖2給出K5蛋白的純化(TricineSDS-PAGE檢須U，考馬斯亮藍(lán)染色)。在圖2中，1.蛋白分子量Marker; 2.K5 Q Sepharose離子交換介質(zhì)穿過液；3.同2; 4. O.lMNaCl洗脫；5.0.2 MNaCl洗脫;6.0.3 MNaCl洗脫;7.0.4 M NaCl洗脫;8.0.5 MNaCl洗脫。
2. K5蛋白的多克隆抗體制備純化及其效價(jià)測定
多克隆抗體的生產(chǎn)可用純化的K5蛋白直接注射動(dòng)物(如家兔，小鼠，大鼠等)的方法得到,多種佐劑可用于增強(qiáng)免疫反應(yīng)，包括但不限于弗氏佐劑。
用lmg上述K5蛋白加上完全弗氏佐劑加,完全乳化后,于新西蘭兔背部、腹股溝處注射5個(gè)點(diǎn)進(jìn)行初次免疫，每隔14天再用K5蛋白加不完全弗氏佐劑加強(qiáng)免疫兩次。采用經(jīng)5.4ug/mLK5蛋白包被的96孔聚苯乙烯微量滴定板做ELISA測定兔血清中抗體的滴度。ELISA實(shí)驗(yàn)的抗體效價(jià)分析表明，抗體效價(jià)達(dá)到l : 1000。將血清總蛋白經(jīng)過50%硫胺沉淀后，結(jié)合于proteinASepharose柱上，用親和層析法分離出多克隆抗體。
圖3給出K5的多克隆抗體效價(jià)的ELISA測定。在圖3中，K5兔多克隆抗體效價(jià)為1 :1000。
圖4給出K5多克隆抗體的純化(TricineSDS-PAGE檢測，考馬斯亮藍(lán)染色)。在圖4中，條帶l.蛋白分子量Marker;條帶2.兔血清總蛋白；條帶3.硫酸銨沉淀后上清；條帶4.硫酸銨沉淀；條帶5.穿過液；條帶6.洗脫目的帶，主要為兔IgG的重鏈和輕鏈。
3. K5蛋白的多克隆抗體的特異性檢測
蛋白免疫印記檢測上述制備的酵母表達(dá)上清經(jīng)TricineSDS-PAGE電泳后，電轉(zhuǎn)PVDF膜。10%小牛血清封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，加入K5蛋白的多克隆抗體(1 : 500)，于fC過夜，TBST溶液洗滌lh后，力tU : 50000稀釋的HRP標(biāo)記二抗，置于室溫振蕩2h，用TBST溶液洗滌2h后，在新鮮的ECL底物液中反應(yīng)3min,進(jìn)行醫(yī)學(xué)X-光片曝光。Westernblot實(shí)驗(yàn)證明多克隆抗體可特異性與K5蛋白結(jié)合。圖5給出Westernblot檢測酵母細(xì)胞表達(dá)的K5蛋白。4.利用K5多克隆抗體檢測K5:
對表達(dá)K5蛋白的哺乳動(dòng)物細(xì)胞標(biāo)本，經(jīng)PBS清洗，福爾馬林固定后，使用K5兔多克隆抗體包被，與HRP標(biāo)記的二抗反應(yīng)后，經(jīng)DAB顯色，蘇木素返藍(lán)，脫水，晾干后樹脂固定在顯微鏡下觀察；或加入綠色熒光標(biāo)記二抗反應(yīng)，DAPI染核，晾干后利用共聚焦顯微鏡檢測標(biāo)本。結(jié)果顯示，K5兔多克隆抗體能夠應(yīng)用于免疫組織化學(xué)及免疫熒光技術(shù)實(shí)驗(yàn)中，檢測標(biāo)本中K5蛋白和突變修飾的K5的表達(dá)和分布情況。
圖6給出多克隆抗體用于免疫組化檢測K5的分布。圖6A為轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)質(zhì)粒的A549細(xì)胞，圖6B為轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-K5質(zhì)粒的A549細(xì)胞。
圖7給出多克隆抗體用于免疫熒光檢測K5的分布。圖7A為轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)質(zhì)粒的A549細(xì)胞，圖7B為轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-K5質(zhì)粒的A549細(xì)胞。
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權(quán)利要求
1. 人纖溶酶原Kringle5多克隆抗體，其特征在于為兔的血清免疫球蛋白Ig G，由重鏈55kDa和輕鏈30kDa兩條鏈組成，以特異性識別并結(jié)合K5蛋白，有效應(yīng)用于檢測K5蛋白的多種方法。
2. 如權(quán)利要求1所述的人纖溶酶原Kringle5多克隆抗體的制備方法，其特征在于包括以 下步驟1) 表達(dá)和純化K5多肽2) 制備人纖溶酶原Kringle5蛋白的多克隆抗體。
3. 如權(quán)利要求2所述的人纖溶酶原Kringle5多克隆抗體的制備方法，其特征在于所述表 達(dá)和純化K5多肽采用以下方法將含有K5部分序列的cDNA的質(zhì)粒pPIC9K-K5，經(jīng)測序鑒 定正確后，利用限制性內(nèi)切酶Sfl/7線性化，通過電轉(zhuǎn)化至畢赤酵母GS115中，通過PCR方法鑒定陽性重組子，挑取的陽性重組子經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達(dá)挑選高拷貝陽性菌，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)， 收集部分酵母上清，經(jīng)三氯乙酸沉淀法濃縮蛋白后，TricineSDS-PAGE電泳檢測，用硫酸銨 鹽沉淀法純化濃縮蛋白、透析后，陰離子交換層析過柱，用洗脫液上柱，流出液即為純化的K5 蛋白。
4. 如權(quán)利要求3所述的人纖溶酶原Kringle5多克隆抗體的制備方法，其特征在于所述進(jìn) 行誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)，培養(yǎng)條件為28 3(TC， 250rpm， 48h，按體積百分比，每2411補(bǔ)加甲醇至1%。
5. 如權(quán)利要求3所述的人纖溶酶原Kringle5多克隆抗體的制備方法，其特征在于所述用 硫酸銨鹽沉淀法純化濃縮蛋白的硫酸銨鹽的濃度按質(zhì)量百分比為65%。
6. 如權(quán)利要求3所述的人纖溶酶原Kringle5多克隆抗體的制備方法，其特征在于所述洗 脫液用含0.2mol/L NaCl的洗脫液。
7. 如權(quán)利要求2所述的人纖溶酶原Kringle5多克隆抗體的制備方法，其特征在于所述制 備人纖溶酶原Kringle5蛋白的多克隆抗體采用以下方法用純化的15 kDa的K5蛋白與弗氏 佐劑混合，免疫動(dòng)物，經(jīng)純化獲得人纖溶酶原Kringle5蛋白的多克隆抗體。
8. 如權(quán)利要求7所述的人纖溶酶原Kringle5多克隆抗體的制備方法，其特征在于所述免疫動(dòng)物為家兔，小鼠或大鼠。
9. 如權(quán)利要求7所述的人纖溶酶原Kringle5多克隆抗體的制備方法，其特征在于用純化 的15kDa的K5蛋白與弗氏佐劑混合，免疫動(dòng)物，經(jīng)純化采用以下方法第一次用純化的K5 蛋白lmg加弗氏完全佐劑，劇烈震蕩，充分乳化后免疫新西蘭兔，每隔14天用純化的K5蛋白0,5mg加不完全弗氏佐劑，與生理鹽水乳化，加強(qiáng)免疫兩次，用頸動(dòng)脈取血法接取兔血清， 用ELISA法檢測多克隆抗體的效價(jià)，抗體效價(jià)分析表明抗體效價(jià)達(dá)到1 : 1000，將血清總蛋 白經(jīng)過50%硫酸胺沉淀后，結(jié)合于protein A柱上，用親和層析法分離出多克隆抗體。
10.如權(quán)利要求1所述的人纖溶酶原Kringle5多克隆抗體在以特異性與K5蛋白結(jié)合， 檢測標(biāo)本中轉(zhuǎn)染表達(dá)K5蛋白質(zhì)粒的人肺腺癌細(xì)胞的K5表達(dá)分布或檢測標(biāo)本中轉(zhuǎn)染表達(dá)K5 蛋白質(zhì)粒的人肺腺癌細(xì)胞的K5表達(dá)分布中的應(yīng)用。
全文摘要
人纖溶酶原Kringle5多克隆抗體及其制備方法及應(yīng)用，涉及一種抗體。提供一種人纖溶酶原Kringle5多克隆抗體及其制備方法及應(yīng)用。為兔的血清免疫球蛋白Ig G，由重鏈55kDa和輕鏈30kDa兩條鏈組成。先表達(dá)和純化K5多肽；再制備人纖溶酶原Kringle5蛋白的多克隆抗體。用于人纖溶酶原Kringle5蛋白的多克隆抗體可以特異性與K5蛋白結(jié)合；人纖溶酶原Kringle5蛋白的多克隆抗體可以檢測標(biāo)本中轉(zhuǎn)染表達(dá)K5蛋白質(zhì)粒的人肺腺癌細(xì)胞的K5表達(dá)分布；人纖溶酶原Kringle5蛋白的多克隆抗體可以檢測標(biāo)本中轉(zhuǎn)染表達(dá)K5蛋白質(zhì)粒的人肺腺癌細(xì)胞的K5表達(dá)分布。
文檔編號G01N33/53GK101497665SQ20091011111
公開日2009年8月5日 申請日期2009年2月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月25日
發(fā)明者洋 王, 王恩華, 慶 葛, 郭中強(qiáng), 金光輝 申請人:廈門大學(xué)